Charakterystyka biomechaniczna tkanek miękkich człowieka za pomocą prób wgnieceń i rozciągania

Summary

Biomechanika tkanek jest ważna dla utrzymania kształtu i funkcji komórki oraz dla określenia fenotypu. W niniejszym raporcie przedstawiono nieniszczące protokoły mechaniczne do charakteryzowania elastycznych i lepkosprężystych właściwości ludzkich tkanek miękkich, które można bezpośrednio zastosować do podłoży inżynierii tkankowej, aby umożliwić ścisłe dopasowanie materiałów inżynieryjnych do tkanek natywnych.

Abstract

Medycyna regeneracyjna ma na celu inżynierię materiałów do zastępowania lub przywracania uszkodzonych lub chorych narządów. Właściwości mechaniczne takich materiałów powinny naśladować tkanki ludzkie, które mają zastąpić; Aby zapewnić wymagany kształt anatomiczny, materiały muszą być w stanie wytrzymać siły mechaniczne, których doświadczą po wszczepieniu w miejsce ubytku. Chociaż właściwości mechaniczne rusztowań inżynierii tkankowej mają ogromne znaczenie, wiele tkanek ludzkich, które są poddawane odbudowie za pomocą materiałów inżynieryjnych, nie zostało w pełni scharakteryzowanych biomechanicznie. Opisano kilka protokołów ściskania i rozciągania do oceny materiałów, ale przy dużej zmienności trudno jest porównać wyniki między badaniami. Dodatkowym utrudnieniem badań jest często destrukcyjny charakter testów mechanicznych. Chociaż zrozumienie uszkodzenia tkanek jest ważne, ważne jest również, aby mieć wiedzę na temat właściwości elastycznych i lepkosprężystych w bardziej fizjologicznych warunkach obciążenia.

Ten raport ma na celu dostarczenie minimalnie destrukcyjnego protokołu do oceny właściwości ściskania i rozciągania tkanek miękkich człowieka. Jako przykłady tej techniki opisano próbę rozciągania skóry oraz próbę ściskania chrząstki. Protokoły te można również bezpośrednio zastosować do materiałów syntetycznych, aby zapewnić, że właściwości mechaniczne są podobne do tkanki natywnej. Protokoły oceny właściwości mechanicznych rodzimej tkanki ludzkiej pozwolą na stworzenie odpowiednich substytutów inżynierii tkankowej.

Introduction

Pacjenci coraz częściej czekają na różne przeszczepy narządów, które leczą uszkodzone lub niewydolne lub uszkodzone narządy. Jednak ze względu na niedobór odpowiednich narządów dawców, medycyna regeneracyjna ma na celu stworzenie alternatywnych rozwiązań dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością narządów. Medycyna regeneracyjna ma na celu zaspokojenie tej potrzeby klinicznej poprzez inżynierię materiałów, które działają jako substytuty tkanek, w tym tkanek miękkich, takich jak chrząstki i skóra. Aby stworzyć udany materiał do odbudowy uszkodzonych tkanek, materiał zastępczy powinien naśladować właściwości natywnej tkanki, którą ma zastąpić^1-2. Po chirurgicznym wszczepieniu materiał będzie musiał nadać anatomiczny kształt ubytkowi tkanki, a zatem właściwości mechaniczne materiału mają kluczowe znaczenie¹. Na przykład materiał zastępujący chrząstkę uszną powinien mieć odpowiednie właściwości mechaniczne, aby zapobiec uciskowi przez leżącą nad nim skórę². Podobnie materiał, który ma zastąpić chrząstkę nosową, będzie musiał mieć odpowiednie właściwości mechaniczne, aby zapobiec zapadaniu się podczas oddychania³. Jednak pomimo znaczenia właściwości mechanicznych przy wytwarzaniu materiałów do implantacji, niewiele dowodów koncentruje się na charakterystyce właściwości mechanicznych różnych tkanek ludzkich.

Schematy testów mechanicznych mogą być używane do ustalenia właściwości tkanki przy ściskaniu, rozciąganiu, zginaniu lub ścinaniu. Skóra jest wysoce anizotropowym, lepkosprężystym i prawie nieściśliwym materiałem^4-9. Powszechnie wycinana skóra jest badana przy użyciu jednoosiowych metod rozciągania, w których odpowiednio ukształtowany pasek skóry jest chwytany na obu końcach i rozciągany, podczas gdy obciążenie i wydłużenie są rejestrowane^{w skali 4-9}.

Ponieważ głównym składnikiem wszystkich tkanek miękkich jest woda śródmiąższowa, mechaniczna reakcja chrząstki jest silnie związana z przepływem płynu przez tkankę^10-11. Tkanki miękkie, takie jak chrząstki, były tradycyjnie testowane za pomocą testów kompresji. Metody testowania kompresji są dość zróżnicowane, przy czym najbardziej rozpowszechnione są ograniczone, nieograniczone i wcięcia (rysunek 1). W ramach zamkniętego ucisku próbkę chrząstki umieszcza się w nieprzepuszczalnej, wypełnionej płynem studzience i umieszcza przez porowatą płytkę. Ponieważ studnia jest nieporowata, przepływ przez chrząstkę odbywa się w kierunku pionowym^12-13. W przypadku nieograniczonego ucisku chrząstka jest ładowana za pomocą nieporowatej płytki na nieporowatą komorę, zmuszając przepływ płynu do przeważnie promieniowego^12-13. Wgłębienie jest najczęściej stosowaną metodą oceny właściwości biomechanicznych chrząstki^12-13. Składa się z wgłębnika, mniejszego niż powierzchnia badanej próbki, który jest sprowadzony na próbkę. Wgniecenie ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami kompresji, w tym fakt, że wgniecenie można wykonać in situ, dzięki czemu test jest bardziej fizjologiczny (Rysunek 1)^12-13.

Aby zrozumieć właściwości tkanki na ściskanie i rozciąganie, moduł sprężystości Younga jest zazwyczaj obliczany poprzez analizę liniowej części krzywej naprężenie-odkształcenie, wskazując na odporność sprężystości na ściskanie lub rozciąganie, niezależnie od wielkości próbki¹². Zarówno reżimy prób rozciągania, jak i ściskania mogą się różnić w zależności od przyłożonego obciążenia lub odkształcenia oraz szybkości obu tych parametrów. Obecnie istnieje wiele różnych protokołów badawczych do oceny mechaniki tkanek, co sprawia, że niezwykle trudno jest interpretować lub porównywać wyniki różnych badań^6-13. Ponadto wiele metod mechanicznych koncentruje się obecnie na charakterystyce właściwości mechanicznych tkanki poprzez badanie próbki pod kątem zniszczenia. Naszym celem jest zademonstrowanie protokołu wgłębiania i rozciągania, który zapewnia bezpośrednie, nieniszczące porównanie ludzkich tkanek miękkich i konstruktów inżynierii tkankowej.

Pokazujemy metodę, która ogranicza testy mechaniczne do naprężeń, a jednocześnie uzyskuje moduł sprężystości Younga przy ściskaniu i rozciąganiu. Próbka jest naprężana pod wpływem rozciągania lub ściskania do określonej wartości, a po osiągnięciu wybranej wartości naprężenia próbka może się rozluźnić, podczas gdy wszystkie dane są rejestrowane. Metoda ta pozwala uchwycić zarówno właściwości lepkosprężyste, jak i relaksacyjne tkanki w ramach tego samego testu, który można zastosować bezpośrednio do materiału syntetycznego. Zastosowaliśmy protokół wgłębienia do oceny ludzkich tkanek miękkich, w tym skóry i chrząstek^14-16. Chrząstka jest oceniana za pomocą testu wgłębienia, a skóra jest oceniana za pomocą próby rozciągania^14-16. Naukowcy, których celem jest opracowanie materiałów o właściwościach podobnych do ludzkich tkanek miękkich, mogą rozważyć wdrożenie tych protokołów.

Protocol

Ten protokół jest zgodny z etycznymi wytycznymi komitetu etyki badań na ludziach naszej instytucji w sprawie używania, przechowywania i usuwania tkanek ludzkich. Próbki tkanek ludzkich mogą być wycinane ze zwłok, które uzyskały zgodę do celów badawczych z odpowiednimi zezwoleniami etycznymi. Próbki mogą być również odrzucane tkanki od pacjentów, którzy wyrazili zgodę na zabiegi chirurgiczne, z odpowiednią aprobatą etyczną.

1. Przygotowanie skóry

1. Przygotuj próbki, ręcznie wycinając tkankę tłuszczową i cienką warstwę głębokiej skóry właściwej za pomocą ostrza skalpela i kleszczy. Ten etap jest ważny dla zapewnienia spójności między próbkami¹⁴.
2. Pociąć otrzymany arkusz skóry o podzielonej grubości na próbkę o znormalizowanej wielkości (np. próbki 1 cm × 5 cm). Określić rozmiar próbki na podstawie wymiarów aparatury badawczej. Jeżeli badany jest również konstrukt wykonany metodą inżynierii tkankowej, wielkość próbki powinna być odpowiednia do materiału będącego przedmiotem zainteresowania¹⁴. Wyrzuć ostrza skalpela do odpowiednich pojemników na ostre przedmioty.
3. Aby umożliwić wykonanie obliczeń mechanicznych, należy zmierzyć grubość badanej skóry za pomocą suwmiarki elektronicznej przed i po testach mechanicznych.

2. Próba rozciągania

UWAGA: Wszystkie maszyny do testowania materiałów powinny być skalibrowane zgodnie z wytycznymi producenta przed testowaniem.

1. Próbki skóry należy badać przy jednoosiowym naprężeniu za pomocą maszyny do badania materiałów (rysunek 2A) w temperaturze pokojowej (22 °C)¹⁴.
2. Próbki skóry należy ustawić w tym samym kierunku dla wszystkich próbek (np. prostopadle lub w linii z liniami Langera (linie topologiczne narysowane na mapie ciała ludzkiego i odnoszące się do naturalnej orientacji włókien kolagenowych w skórze właściwej)⁾¹⁴.
3. Unieruchomić próbkę między dwoma zaciskami (komercyjnym przyrządem), z których jeden jest przymocowany do ogniwa obciążnikowego 98,07 N, a drugi do nieruchomej płyty podstawy¹⁴. Wynikowa powierzchnia między zaciskami badanymi przy rozciąganiu jednoosiowym powinna wynosić 1 cm x 4 cm (rysunek 2).
   UWAGA: Zastosowano komercyjny przyrząd, aby uniknąć nierównomiernego chwytania i uszkodzenia próbki przed badaniem. Próbka jest mocowana do szczelności "palcami".
4. Przykryj obszar próbki (po umieszczeniu w aparacie) z obu stron wazeliną, aby zapobiec wysuszeniu próbki.
5. Zaprogramuj reżim prób rozciągania i relaksacji w oprogramowaniu jako listę działań, w następujący sposób: Zerowe obciążenie | Pozycja zerowa | Znajdź kontakt (obciążenie rozciągające) | Czekaj (Relaks).
6. Rozpocznij test za pomocą oprogramowania. Załadować próbkę pod napięciem do 29,42 N z prędkością 1 mm/s. Stosować szybkość i obciążenie, które nie powodują uszkodzenia skóry (np. 29,42 N przy 1 mm/s).
7. Po osiągnięciu obciążenia 29,42 N, pozwól tkance zrelaksować się przez 1,5 godziny, w momencie, w którym następuje minimalna zmiana w zachowaniu relaksacyjnym, kontrolowanym przez oprogramowanie komputerowe¹⁴,
   Uwaga: W fazie relaksacji utrzymywane jest stałe przemieszczenie, a nie obciążenie.
8. Oblicz właściwości sprężyste i lepkosprężyste zgodnie ze wskazówkami w sekcji analiza. Badane właściwości mechaniczne będą reprezentować średnie właściwości składników skóry o podzielonej grubości (naskórka i skóry właściwej)¹⁴,
   Uwaga: Nie ma zdefiniowanego obciążenia własnego, ponieważ z danych surowych jasno wynika, kiedy występuje odkształcenie, a zatem uwzględniane są tylko te punkty danych.

3. Przygotowanie chrząstki

1. Usunąć skórę i powięź z próbki chrząstki za pomocą ostrza skalpela i kleszczyków^15,16.
2. Podziel próbki chrząstki na próbkę o standardowej wielkości (np. bloki 1,5 cm) za pomocą ostrza skalpela i kleszczy. Do wszystkich próbek należy użyć wgłębnika w kształcie półkolistego (rysunek 2B), którego średnica i grubość są co najmniej 8 razy większe niż rozmiar próbki chrząstki. Współczynnik ten zapewnia, że wgłębnik nie jest narażony na żadne efekty krawędziowe wynikające z przygotowania próbki¹⁵. Wyrzuć ostrza skalpela do odpowiednich pojemników na ostre przedmioty.
3. Aby umożliwić wykonanie obliczeń mechanicznych, należy zmierzyć grubość chrząstki, która ma być obciążona, za pomocą suwmiarki elektronicznej przed i po badaniu mechanicznym^15,16.

4. Testowanie wcięć kompresyjnych

1. Ściskać próbki chrząstki za pomocą maszyny do badania materiałów w uwodnionym środowisku w temperaturze pokojowej. Przykryj próbkę chrząstki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przed i w trakcie próby ściskania, aby upewnić się, że próbka jest uwodniona.
   UWAGA: PBS nie do końca odpowiada środowisku fizjologicznemu, ale pozwala na równe porównanie zarówno materiałów, jak i tkanek^15,16.
2. Ustawić próbkę chrząstki tak, aby powierzchnia była prostopadła do wgłębnika. Pozwala to na ściskanie jednoosiowe i ogranicza wszelkie obciążenia ścinające¹⁵.
3. Zaprogramuj reżim testowania obciążenia ściskającego i relaksacji w oprogramowaniu jako listę działań, w następujący sposób: Zerowe obciążenie | Pozycja zerowa | Znajdź kontakt (obciążenie ściskające) | Czekaj (Relaks).
4. Rozpocznij test za pomocą oprogramowania. Załadować próbkę pod ściskaniem do 2,94 N przy 1 mm/s^15,16,
   UWAGA: Stwierdzono, że jest to obciążenie nieniszczące, które jest wystarczająco czułe, aby zidentyfikować zarówno elastyczne, jak i lepkosprężyste właściwości chrząstki¹⁵.
5. Po osiągnięciu limitu 2,94-N pozwól chrząstce rozluźnić się przez 15 minut, w momencie, w którym następuje minimalna zmiana w zachowaniu relaksacyjnym, korzystając z oprogramowania komputerowego^15,16.
   UWAGA: Rysunek 2C-D przedstawia typową konfigurację do prób ściskania i rozciągania próbek tkanek ludzkich. Te same protokoły można następnie zastosować do syntetycznych biomateriałów, aby dopasować właściwości biomechaniczne do analizowanej tkanki natywnej. Na przykład rysunek 2E-F przedstawia próby ściskania i rozciągania tkanki ludzkiej, ściśle dopasowane do właściwości biomechanicznych materiału syntetycznego.

5. Obliczanie modułu sprężystości Younga dla prób wgnieceń i rozciągania

1. Zbierz surowe dane, w tym czas (s), przemieszczenie (mm) i obciążenie (N) z urządzenia do testowania materiałów^14-16.
2. Obliczyć naprężenie (MPa) i odkształcenie (%), korzystając ze wzorów pokazanych na rysunku 3.
   UWAGA: Jeśli podczas próby ściskania użyto wgłębnika półkulistego, podzielenie siły przez pole przekroju poprzecznego daje naprężenie nominalne (średnie), ale nie naprężenie szczytowe.
3. Użyj liniowego wykresu punktowego, aby wykreślić naprężenie MPa (oś y) w stosunku do odkształcenia (oś x). Określ dopasowanie krzywej liniowej. Dopasowanie krzywej liniowej jest równe y = mx + b z odpowiednią wartością R.
   UWAGA: Wszystkie punkty danych są uwzględniane, aby osiągnąć minimalną wartość R >0,98. Wartość m to nachylenie, które odpowiada modułowi naprężenia nad odkształceniem, wskazując na wytrzymałość na ściskanie lub wytrzymałość na rozciąganie w MPa (tj. Moduł Younga). Jeśli wartość R nie wynosi >0,98, to założenie charakterystyki liniowego zachowania lepkosprężystego jest nieprawidłowe.
4. Aby określić właściwości lepkosprężyste, w których przepływ płynu pod wpływem odkształcenia osiągnął równowagę, oblicza się stosunek naprężeń w czasie w ciągu ostatnich 200 s testów mechanicznych do końcowego poziomu naprężenia na końcu eksperymentu.
   UWAGA: Wraz z upływem czasu poziom stresu zmniejszy się (rozluźni), gdy przepływ płynu osiągnie równowagę^17,18. Szybka reakcja stresowo-relaksacyjna wskazuje, że trudno jest utrzymać wysokie naprężenia w próbie ^17,18.

6. Właściwości relaksacyjne

1. Wykreśl naprężenie w MPa (oś y) w funkcji czasu w s (oś x) na liniowym wykresie punktowym.
2. Określ dopasowanie krzywej liniowej, aby obliczyć szybkość relaksacji. Dopasowanie krzywej liniowej jest równe y = mx + b z odpowiednią wartością z ostatnich 200 s. Wartość m to szybkość relaksacji.
3. Uwzględnij wszystkie punkty danych, aby uzyskać minimalną wartość R >0,98. Naprężenie końcowe (MPa) po 1,5 h dla skóry i 15 min dla chrząstki jest końcową bezwzględną wartością relaksacji.

Results

Rysunki 4 i 5 przedstawiają przykłady danych uzyskanych za pomocą prób wgłębień i rozciągania. Rysunek 4 przedstawia typowe wartości uzyskane po badaniu wgłębień chrząstki ludzkiej. Rysunek 4A jest przykładem typowego wykresu odkształcenia w stosunku do naprężenia uzyskanego po próbie wgniecenia. Aby uzyskać moduł Younga, wszystkie wartości są uwzględniane do momentu, gdy dopasowanie krzywej liniowej będzie miało minimalną wartość R równą 0,98 (Rysunek 4B). Wartość m jest wskaźnikiem modułu Younga w MPa; na przykład w tych danych chrząstka ma moduł 1,76 MPa. Rysunek 4C przedstawia typowy wykres naprężeń w czasie w celu oceny właściwości relaksacyjnych chrząstki. Tempo relaksacji oblicza się z ostatnich 200 s. Podobnie, aby uzyskać szybkość relaksacji, stosuje się wartość m dopasowania krzywej liniowej w MPa. Na przykład w tych danych chrząstka ma szybkość relaksacji 8,78 x ^10-6 MPa/s (ryc. 4D). Absolutny końcowy poziom relaksacji jest ostatnim punktem naprężenia w MPa. Na przykład w tym zbiorze danych bezwzględny końcowy poziom relaksacji wynosiłby 0,028 MPa (rysunek 4D).

Rysunek 5 pokazuje, jak ocenić lepkosprężystość tkanki skórnej po próbie rozciągania. Analiza jest przeprowadzana zgodnie z testami ściskania. Rysunek 5A przedstawia typowy wykres odkształcenia w stosunku do naprężenia uzyskany na podstawie protokołu próby rozciągania. Aby uzyskać moduł Younga przy rozciąganiu, wszystkie wartości są uwzględniane do momentu, gdy dopasowanie krzywej liniowej będzie miało minimalną wartość R równą 0,98 (Rysunek 5B). Wartość m jest wskaźnikiem modułu Younga w MPa; na przykład w tych danych skóra ma moduł 0,62 MPa. Rysunek 5C przedstawia typowy wykres stresu w czasie w celu oceny właściwości relaksacyjnych skóry. Tempo relaksacji oblicza się z ostatnich 200 s. Podobnie, aby uzyskać szybkość relaksacji, stosuje się wartość m dopasowania krzywej liniowej w MPa. Na przykład w tych danych szybkość relaksacji skóry wynosi 3,1 x ^10-5 MPa/s (ryc. 5D). Absolutny końcowy poziom relaksacji jest ostatnim punktem naprężenia w MPa. Na przykład w tym zestawie danych poziom wynosiłby 0,64 MPa (rysunek 5D). Ta sama analiza może być następnie wykorzystana do analizy biomateriałów poddanych próbom ściskania i rozciągania w celu dopasowania ich właściwości biomechanicznych do tkanki rodzimej.

Rysunek 1: Schemat ideowy ilustrujący różne metodologie kompresji. ZA. Testowanie wgnieceń. Obciążenie przykłada się do niewielkiego obszaru chrząstki za pomocą nieporowatego wgłębnika. Ur. Ograniczona kompresja. Próbkę chrząstki umieszcza się w nieprzepuszczalnej studzience wypełnionej płynem. Chrząstka jest następnie ładowana przez porowatą płytkę. Ponieważ studnia jest nieprzepuszczalna, przepływ przez chrząstkę odbywa się tylko w kierunku pionowym. C. Nieograniczona kompresja. Chrząstka jest ładowana za pomocą nieporowatej płytki na nieporowatą komorę, zmuszając przepływ płynu głównie promieniowy.

Rysunek 2: Konfiguracja mechanicznej maszyny wytrzymałościowej. ZA. Ilustracja maszyny wytrzymałościowej. B. Ilustracja wgłębnika użytego do analizy próby ściskania. C. Chrząstka analizowana za pomocą testu wgnieceń kompresyjnych. D. Tkanka skórna analizowana w próbach rozciągania. E. Próba rozciągania biomateriału syntetycznego. Fot. Próba ściskania biomateriału syntetycznego.

Rysunek 3: Wzory używane do obliczania właściwości mechanicznych tkanki lub konstruktu inżynierii tkankowej przy ściskaniu i rozciąganiu. Wzory używane do obliczania siły (N), naprężenia (MPa) i odkształcenia (%).

Ryc. 4: Przykład analizy ucisku chrząstki ludzkiej. ZA. Analiza naprężenie w stosunku do odkształcenia. Ur. Wartość m równania dopasowania krzywej liniowej to moduł sprężystości Younga w MPa. C. Analiza stresu w stosunku do czasu w celu wykazania właściwości relaksacyjnych. D. Wartość m równania dopasowania krzywej liniowej wskazuje współczynnik relaksacji. Ostateczny kurs bezwzględny to ostatni punkt na wykresie.

Rysunek 5: Przykład analizy rozciągania ludzkiej skóry. ZA. Analiza naprężenie w stosunku do odkształcenia. Ur. Wartość m równania dopasowania krzywej liniowej to moduł sprężystości Younga w MPa. C. Analiza stresu w stosunku do czasu w celu wykazania właściwości relaksacyjnych. D. Wartość m równania dopasowania krzywej liniowej jest równa współczynnikowi relaksacji. Ostateczny kurs bezwzględny to ostatni punkt na wykresie.

Discussion

Opublikowano kilka protokołów rozciągania i wgniatania w celu scharakteryzowania ludzkich tkanek miękkich. Przedstawiliśmy inną metodę, która ma być bardziej diagnostyczna i nieniszcząca. Próbki poddawane testom mechanicznym w tym protokole są ograniczone obciążeniem, a nie przemieszczeniem, ponieważ przetworniki są bardziej wrażliwe na obciążenie niż na przemieszczenie. W związku z tym reprodukcje eksperymentu mogą być bardziej precyzyjne w przypadku tkanek i materiałów syntetycznych. Korzystając z tej techniki, zademonstrowaliśmy protokół rozciągania do oceny tkanki skórnej oraz protokół wgłębienia do analizy tkanki chrzęstnej. Oba protokoły są łatwe i proste do wdrożenia i mogą być brane pod uwagę przy charakterystyce ludzkich tkanek miękkich i konstruktów inżynierii tkankowej.

Jednym z kluczowych etapów metodologii mającej na celu uzyskanie krzywej relaksacji naprężeń odpowiednich do analizy jest zapewnienie, że próbka nie ślizga się podczas badania. Wymagane jest odpowiednie mocowanie, ale musi być ono zrównoważone pod kątem powodowania jakichkolwiek naprężeń na próbkach i upewnienia się, że wgłębnik jest prostopadły do powierzchni, aby zapobiec obciążeniu ścinającemu. Bardzo ważne jest, aby skład, a także rozmiar i kształt tkanki były podobne między próbkami. W przypadku chrząstki ważne jest stosowanie powtarzalnego protokołu preparacji i wymiarów próbki. W przypadku próbek skóry konieczne jest usunięcie całej tkanki podskórnej w celu uzyskania powtarzalnej próbki. Ważne jest również, aby upewnić się, że dla wszystkich próbek warunki próbki są identyczne, w tym uwodnienie, temperatura pokojowa i proces rozmrażania, jeśli jest to właściwe.

Istnieją pewne ograniczenia dotyczące prezentowanych protokołów. Badania sugerują, że charakterystyka deformacji skóry i chrząstki zależy od orientacji próbki¹³. Już w XIX^wieku uznano, że skóra jest anizotropowa, a Langer wykazał w 1861 roku, że skóra ma naturalne linie napięcia, określane jako linie Langera⁴. W związku z tym, podczas charakteryzowania próbek skóry, ważne jest, aby ustawić wszystkie próbki równolegle lub prostopadle do linii Langera, aby uniknąć wprowadzenia błędu metodologicznego⁴. Chrząstka wykazuje również właściwości anizotropowe i zawiera linie Hultkrantza, które są równoważne liniom Langera, więc chrząstka może odkształcać się w różny sposób w zależności od kierunku, w którym jest obciążona^12,19. Dlatego ważne jest, aby zwiększyć wielkość próbki, aby umożliwić badanie chrząstki w różnych kierunkach. Ponieważ właściwości biomechaniczne tkanek różnią się również w zależności od wieku i płci, badania należy przeprowadzać na reprezentatywnej kohorcie pacjentów, aby zachować ważność w warunkach klinicznych. Ponadto niektóre protokoły mechaniczne zalecają kondycjonowanie wstępne, w którym tkanka jest poddawana cyklicznemu obciążeniu, aby zapewnić, że tkanka jest w stanie stabilnym do późniejszych testów mechanicznych²⁰. Jednak dokładny mechanizm kondycjonowania wstępnego jest niejasny, a dokładna liczba cykli potrzebnych do uzyskania spójnej i powtarzalnej odpowiedzi różni się w różnych badaniach²⁰. Badacz powinien rozważyć, czy włączyć kondycjonowanie wstępne po ocenie powodu przeprowadzenia określonego testu biomechanicznego²⁰.

Skóra jest złożonym, wielowarstwowym materiałem, podzielonym na trzy główne warstwy: naskórek, skórę właściwą i tkankę podskórną⁴. Właściwości mechaniczne tkanki skórnej zostały niedawno ocenione za pomocą ocen in vivo ⁴. Jednak protokoły prób rozciągania mogą być wykorzystane do zrozumienia biomechaniki skóry wyciętej skóry⁴. Takie testy mogą dostarczyć informacji do modelowania zależności naprężenie-odkształcenie, ponieważ warunki brzegowe można zdefiniować⁴. Zazwyczaj w systemach badań in vitro wykorzystuje się wysokie odkształcenia w celu scharakteryzowania materiału do uszkodzenia, podczas gdy systemy in vivo wykorzystują niskie zakresy odkształceń⁴. Porównując wartości biomechaniczne dla wyciętej skóry w napięciu, istnieje duża zmienność między różnymi badaniami, w zakresie od 2,9 do 150 MPa⁴. Oczekuje się, że duże różnice między osobami będą wynikać z naturalnej zmienności biologicznej, ale różnice w reżimach protokołów mogą również potęgować te naturalne różnice biologiczne. Na przykład różnice w szybkościach ładowania między protokołami będą powodować różnice, ponieważ większe szybkości ładowania powodują krótszy czas na wypływ płynu, co skutkuje większą sztywnością. Protokoły przygotowania, wycinania i obchodzenia się z tkanką skórną również spowodują różnice we właściwościach mechanicznych⁴. Ten protokół zademonstrowany do badania skóry stanowi alternatywną metodę dla badaczy do charakteryzowania tkanki skórnej. Ma kilka zalet, w tym możliwość identyfikacji właściwości elastycznych i lepkosprężystych tkanki skórnej w jednym teście mechanicznym, co pozwala na lepsze zrozumienie skóry w krótkim czasie. Co więcej, ten sam test można zastosować do zamienników inżynierii tkankowej w celu wytworzenia konstruktów o podobnych właściwościach biomechanicznych jak skóra rodzima.

Próba wgniecenia stanowi atrakcyjną opcję w porównaniu z testami ograniczonej kompresji w celu zrozumienia biomechaniki chrząstki²¹. Wgłębienie ma zdolność zachowania fizjologicznej struktury chrząstki, a tym samym zapewnia wartości, które naśladują te z otoczenia klinicznego. Za pomocą wgłębienia możliwe jest również przetestowanie chrząstki, gdy jest ona nadal przyczepiona do leżącej poniżej kości. Wgłębienie pozwala również na fizjologiczne badanie chrząstki jak in vivo. Gdy dwie powierzchnie chrząstki zbliżają się do siebie, krawędzie otaczające obszar kontaktu "wybrzuszają się" z powodu przemieszczenia wody pod powierzchnią styku na boki po odkształceniu ściskającym^17,21. Wgłębienie chrząstki należy przeprowadzić za pomocą wgłębnika o mniejszym promieniu niż próbka chrząstki, aby umożliwić podobne wybrzuszenie. Wielkość wgłębnika powinna być również co najmniej 8 razy większa od wielkości próbki, aby zapewnić, że chrząstka reaguje tak, jakby była częścią próbki nieokreślonej²². Użycie wgłębnika znacznie mniejszego niż promień średnicy próbki eliminuje wszelkie efekty krawędzi występujące podczas tworzenia próbki. Ponadto wgłębienie pozwala uniknąć ewentualnych błędów eksperymentalnych spowodowanych badaniem wad chrząstki uszkodzonych w wyniku ekstrakcji próbki. Wgłębienie nie wymaga również głębokiego przygotowania próbki, takiego jak ciasna kompresja, co pozwala na badanie małych, cienkich kawałków chrząstki^17,21. Ponadto nieniszcząca metoda wgłębiania oznacza, że ma ona potencjalne zastosowanie w warunkach klinicznych jako narzędzie diagnostyczne po przeprowadzeniu badań walidacyjnych i weryfikacyjnych.

Istnieją kluczowe założenia dotyczące wcięć, które użytkownik musi zapewnić, aby uzyskać odpowiednie wyniki. Krytyczny warunek brzegowy w obciążeniu wgłębieniem wymaga stałego kontaktu między wgłębnikiem a powierzchnią chrząstki (tj. aby powierzchnia nie odkształcała się od wgłębnika)^23,24. Obciążenie wgłębieniem obejmuje również założony warunek brzegowy, że kontakt między powierzchnią chrząstki a wgłębnikiem jest nieniszczący (tj. wgłębnik styka się z powierzchnią, ale nie przechodzi przez powierzchnię; powierzchnia chrząstki nie powinna ulec uszkodzeniu pod wgłębnikiem)^25-26. Badania wykazały, że ten warunek brzegowy można zweryfikować za pomocą tuszu indyjskiego, który po nałożeniu na powierzchnię chrząstki zabarwi uszkodzone obszary^25,26. Kolejny warunek brzegowy zakłada, że wgłębnik ściska chrząstkę prostopadle do powierzchni próbki. Prostopadła orientacja ściskania jest ważnym warunkiem brzegowym, ponieważ ściskanie pod kątem, zwłaszcza przy użyciu obciążenia cyklicznego, może powodować poślizg, który może powodować ścinanie elementów i zmianę obciążenia mechanicznego. Ten warunek można zapewnić poprzez staranne ustawienie sprzętu testowego.

Po tym, jak podsumowane protokoły zostaną zoptymalizowane pod kątem tkanki miękkiej będącej przedmiotem zainteresowania, przydatne byłoby, aby naukowcy przyjrzeli się dynamicznym testom tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Odpowiednie cykliczne obciążanie próbek powinno naśladować normalne fizjologiczne granice i zachowanie, takie jak naśladowanie chodzenia lub innych powtarzających się ruchów²⁷. Podsumowując, raport ten przedstawia proste protokoły testów mechanicznych do oceny tkanek ludzkich. Wdrożenie tych protokołów dostarczy kluczowych informacji na temat charakterystyki biomechanicznej tkanek, umożliwiając konstruktom inżynierii tkankowej lepsze naśladowanie tkanki natywnej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suwmiarka z noniuszem cyfrowym	Mart	40218046	Suwmiarka z noniuszem cyfrowym służy do pomiaru grubości próbki.
Kąpiel wodna	Cole Parmer	UY-12504-94	Cyfrowy uchwyt na termos do kąpieli wodnej StableTemp służy do rozmrażania próbek tkanek, jeśli są zamrożone.
Maszyna do badania materiałów Mach-1	Biomomentum	V500c	służy do testowania właściwości mechanicznych tkanek.
Ostrze skalpela	VWR	233-5335	Ostrza skalpela służące do cięcia i preparowania tkanek.
Kleszcze	VWR	470007-554	Kleszcze używane do preparowania tkanek.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,2	Life Technologies	20012019	PBS służy do napowietrzania próbek tkanek