Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Transmisyjna Mikroskopia Elektronowa (TEM) jest niezwykłym narzędziem do badania ultrastruktury komórek, w celu lokalizacji białek i wizualizacji kompleksów makromolekularnych w bardzo wysokiej rozdzielczości. Jednak, aby zbliżyć się jak najbardziej do stanu rodzimego, wymagane jest doskonałe zachowanie próbki. Na przykład konwencjonalna fiksacja za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) za pomocą aldehydów nie zapewnia dobrego zachowania ultrastrukturalnego. Powolna penetracja utrwalaczy indukuje reorganizację komórek i utratę różnych składników komórek. Dlatego konwencjonalne utrwalanie EM nie pozwala na natychmiastową stabilizację i zachowanie struktur i antygenowości. Najlepszym wyborem do badania zdarzeń wewnątrzkomórkowych jest zastosowanie kriofiksacji, a następnie metody utrwalania przez zamrożenie, która utrzymuje komórki w ich naturalnym stanie. Zamrażanie/zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, które zachowuje integralność ultrastruktury komórkowej, jest najczęściej stosowaną metodą, ale wymaga drogiego sprzętu. W tym miejscu przedstawiono łatwą w użyciu i tanią metodę utrwalania przez zamrażanie, a następnie substytucję przez zamrożenie w hodowlach komórek zawiesinowych.

Wprowadzenie

Przygotowanie próbki jest kluczowe dla powodzenia każdego badania mikroskopowego elektronowego. Konwencjonalna fiksacja EM była podstawową metodą utrwalania tkanek lub komórek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)¹. Po pierwsze, aldehydy i tetratlenek osmu są używane do chemicznego utrwalania materiału w temperaturze pokojowej. Następnie materiał jest odwadniany rozpuszczalnikami organicznymi, infiltrowany i zatapiany w żywicy epoksydowej. Ta metoda jest zależna od szybkości przenikania utrwalików do komórki. W związku z tym zwykle obserwuje się artefakty i ekstrakcję zawartości komórkowej².

Kriofiksacja jest zdecydowanie lepszą alternatywą dla zachowania struktur komórkowych³, zachowując je w stanie nienaruszonym. Najwyższą jakość obrazów TEM⁴ w cienkich skrawkach żywicy można uzyskać metodą kriofiksacji/substytucji przez zamrożenie. Celem tej techniki jest uzyskanie zeszklonych próbek biologicznych bez tworzenia się kryształków lodu lub zawierających kryształki lodu na tyle małe, aby nie uszkodzić ultrastruktury komórek. Zamrażanie wysokociśnieniowe (HPF) i ultraszybka kriofiksacja, która jest również nazywana zamrażaniem wgłębnym (PF), to dwie metody kriofiksacji próbek. HPF natychmiast unieruchamia cząsteczki w komórce i pozwala uniknąć uszkodzeń spowodowanych konwencjonalnym utrwalaniem EM. Opracowano kilka typów zamrażarek i automatycznych urządzeń zastępczych⁵. Zamrażarki i materiały eksploatacyjne (ciekły azot, nośniki próbek itp.) są drogie, ale pozwalają na wytwarzanie wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych^6,7. PF to technika, która była używana na początku lat pięćdziesiątych XX wieku i jest opisywana w literaturze jako prosta i tania⁸. Podczas procedury PF przygotowana próbka jest zamrażana w szybkim tempie w celu uzyskania kryształków lodu o wielkości mniejszej niż 3 do 5 nm. W tym celu próbkę zanurza się w ciekłym kriogenie, takim jak etan, propan lub mieszanina etanu i propanu. Od 1950 roku wprowadzono ulepszenia PF, aby uczynić tę technikę dostępną dla większej liczby użytkowników. Zamrażanie wysokociśnieniowe jest obecnie jedynym realnym sposobem zamrażania dużej liczby próbek grubszych niż 50 μm (do grubości 200 μm dla próbek w kształcie dysku)⁵, podczas gdy PF jest szeroko stosowany do obrazowania małych obiektów (<100 nm), takich jak kompleksy makromolekularne zawieszone w cienkiej warstwie amorficznego lodu⁹. Większe próbki, na przykład komórki eukariotyczne, mogą być kriofiksowane przez PF, ale wymagają uchwytów na próbki, takich jak kapilarne rurki miedziane lub systemy warstwowe^8,10,11.

Tutaj prezentowana jest szybka, łatwa w użyciu i tania technologia zamrażania/zamrażania przez zamrożenie, która jest używana do różnych hodowli komórek zawiesinowych.

Protokół

1. Przygotowanie filmu Formvar Grid

UWAGA: Wykonaj manipulację chloroformem pod wyciągiem za pomocą środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary). Użyj miedzianych siatek mikroskopii elektronowej o siatce 400. W przypadku innych typów siatek (inne rozmiary oczek, siatki złote i niklowe) jakość zamrażania jest gorsza.

1. Przygotować 100 ml roztworu 0,3% formwaru w chloroformie. Pozostaw do rozpuszczenia przez noc bez mieszania.
2. Umieść 400 siatek (liczba otworów na cal kwadratowy)mikroskopia elektronowasiatki miedziane (średnica 3,05 mm) w szklanej fiolce (wysokość 3 cm i średnica 2 cm) zawierającej aceton. Wymieszać szklaną fiolkę okrężnymi ruchami ręki. Usuń aceton za pomocą plastikowej pipety transferowej. Pozostawić rozpuszczalnik do odparowania na 5 minut. Przenieś kratki, wylewając je na bibułę filtracyjną i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.
3. Wypoleruj szkiełko o wymiarach 76 x 26 mm², przecierając je niestrzępiącą się szmatką, aż będzie błyszczące/śliskie.
4. Weź krystalizator (średnica 15 cm, wysokość: 7 cm i pojemność 1200 ml) i napełnij go po brzegi wodą destylowaną. Oczyść powierzchnię wody, dwukrotnie przesuwając szklaną listwę po powierzchni, aby usunąć kurz.
5. Trzymaj szkiełko między dwoma palcami i zanurz je w roztworze formvar na kilka sekund. Trzymaj go pionowo do wyschnięcia pod odwróconą zlewką przez 5 minut.
6. Gdy folia wyschnie, naciąć krawędzie szklanego szkiełka ostrą żyletką, aby określić granice folii, która ma zostać usunięta ze szkiełka.
7. Weź głęboki wdech i mocno wydychaj powietrze na szkiełko, aby warstwa pary wodnej znalazła się na folii i pod nią, aby folia była lekko nieprzezroczysta i poprawiła jej widoczność.
   1. Natychmiast wypuść folię na powierzchnię wody krystalizatora, dotykając dna szkiełka pod kątem około 30°. Pozwól, aby folia uwolniła się od szkiełka i oderwij ją od powierzchni wody krystalizatora. W razie potrzeby delikatnie ściągnij folię pęsetą.
8. Delikatnie połóż kratki stroną do dołu na folii unoszącej się na powierzchni wody w obszarach o odpowiedniej grubości (około 10 nm) i bez zmarszczek.
9. Podnieś folię, przykrywając siatki papierem Joseph, gdy unoszą się na powierzchni wody krystalizatora.
   1. Trzymając jedną ręką papier Józefa, przyłóż jeden koniec papieru Józefa do jednego końca folii. Poczekaj, aż papier Josepha będzie całkowicie mokry. Wyjmij papier Joseph z przyklejonymi kratkami.
10. Umieść kratki na 24 godziny na przykrytej szalce Petriego w celu ostatecznego wysuszenia i przechowywania przed użyciem w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie podłoża do zamrażania

UWAGA: Tetroksynek osmu (OsO₄) i octan uranylu są niebezpiecznymi substancjami chemicznymi. Należy obchodzić się z nimi pod wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym fartuch laboratoryjny i rękawice. Postępuj zgodnie z ostrzeżeniami dotyczącymi obchodzenia się z (OsO₄) i octanem uranylu. Użyj kriowialiów O-ring, aby uniknąć wycieku OsO₄.

1. Badania ultrastrukturalne
   1. Umieścić szklaną ampułkę OsO₄ w szklanej kolbie.
   2. Rozbić ampułkę, potrząsając kolbą.
   3. Dodać odpowiednią objętość acetonu 100%, aby uzyskać 4% stężenie końcowe.
   4. Wymieszaj i dozuj 1,5 ml porcji do 1,8 ml kriowialiów.
2. Znakowanie immunologiczne białek
   1. Umieścić 0,05 g octanu uranylu w szklanej kolbie.
   2. Dodaj 50 ml 100% acetonu.
   3. Wymieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego. Gdy roztwór stanie się klarowny, przefiltruj go za pomocą filtra 0,2 μm.
   4. Dozować 1,5 ml porcji do 1,8 ml kriowialików.
      UWAGA: Przed procesem zamrażania wgłębnego należy przygotować kriowiale zawierające pożywkę do zamrażania przez zamrożenie i przechowywać je w zamrażarce o temperaturze -84 °C. Odwrócić szklaną kolbę, aby wyrzucić ampułkę OsO₄ wraz z odpadami niebezpiecznymi.

3. Przygotowanie komórek

UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla powodzenia metody. Dla wszystkich typów komórek hoduj komórki, aby uzyskać wskazaną liczbę komórek. Odwirować we wskazanej probówce o określonej porze i prędkości.

1. Aby uzyskać odpowiednią konsystencję granulek z różnych typów komórek, hoduj komórki w następujący sposób:
   1. W przypadku Saccharomyces cerevisiae i Schizosaccharomyces pombe należy zaszczepić drożdże w 5 ml minimalnej lub pełnej płynnej pożywki. Inkubować przez noc w temperaturze 28 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) kultury przez noc. Rozcieńczyć komórki drożdży do OD₆₀₀ 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 28 °C, obracając się, aby uzyskać 1 x 10⁹ komórek drożdży⁷.
   2. W przypadku wici Leishmania należy zaszczepić pasożyty w 5 ml pożywki AM z 7,5% FCS (płodowa surowica cielęca). Inkubować przez noc w temperaturze 24 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierz OD₆₀₀ w nocnej hodowli. Rozcieńczyć komórki pasożyta do OD₆₀₀ 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 24 °C, obracając się, aby uzyskać 5 x 10⁸ komórek pasożyta¹².
   3. W przypadku Trypanosoma brucei należy zaszczepić pasożyty w 5 ml pożywki SDM-79 z 10% FCS i 30 μg/ml higromycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 27 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierz OD₆₀₀ w nocnej hodowli. Rozcieńczyć komórki pasożyta do OD₆₀₀ 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 27 °C, obracając się, aby uzyskać 5 x 10⁸ komórek pasożyta¹³.
   4. W przypadku Escherichia coli należy zaszczepić bakterie w 5 ml pożywki DYT za pomocą 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, obracając się (180 obr./min). Zmierz OD₆₀₀ w nocnej hodowli. Rozcieńczyć komórki bakteryjne do OD₆₀₀ 0,2 w 50 ml świeżej pożywki selektywnej. Kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37 °C, obracając się, aby uzyskać 5 x 10¹⁰ komórek bakteryjnych¹⁴.
      UWAGA: Po całonocnej inkubacji komórki w hodowli mogą znajdować się w logarytmicznej lub stacjonarnej fazie wzrostu. Bardzo wolno rosnące szczepy komórkowe mogą wymagać inkubacji dłuższej niż jedna noc lub inokulacji większej liczby komórek, jak określono empirycznie.
2. Dla wszystkich typów komórek przenieść pożywkę hodowlaną zawierającą komórki do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml i odwirować przez 3 minuty przy 1 500 x g.
3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad wszystkich typów komórek w 1 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych.
4. Odwirować wszystkie typy komórek w probówce do mikrowirówek przez 1 minutę przy 3 900 x g. Całkowicie usunąć supernatant.
5. Utrzymuj komórki na lodzie.

4. Skraplanie propanu

Uwaga: Z ciekłym azotem należy obchodzić się ostrożnie. Używaj środków ochrony osobistej, w tym rękawic kriogenicznych i gogli. Propan jest potencjalnie wybuchowy, dlatego skraplanie należy przeprowadzić w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem. Nie wolno używać otwartego ognia.

1. Umieść około 150 ml ciekłego azotu w tacce styropianowej. Umieść mosiężny kubek (wysokość 3,6 cm, średnica 2 cm i grubość 1,5 mm) w ciekłym azocie, aby go zamrozić. Nie pozwól, aby ciekły azot wniknął do mosiężnego kubka.
2. Poczekaj, aż bąbelki opadną, aby upewnić się, że mosiężny kubek jest zamrożony.
3. Umieść wąż podłączony do butli z propanem w kontakcie z mosiężną ścianką kubka.
4. Delikatnie otwórz zawór butli z propanem.
   UWAGA: Na tym etapie propan skrapla się w mosiężnym kubku.
5. Zatrzymaj skraplanie, zamykając zawór butli z propanem i szybko wyjmując wąż gazowy.
6. Napełnij tackę styropianową ciekłym azotem do 5 mm od górnej części mosiężnego kubka. Nie pozwól, aby ciekły azot wniknął do mosiężnego kubka.

5. Zamrażanie próbki metodą wgłębną

1. Umieść około 200 ml ciekłego azotu w tacce styropianowej. Zamroź małe mosiężne kubki (wysokość 1,5 cm, średnica 2,5 cm i grubość 1 mm), wkładając je do ciekłego azotu. Umieść jedną filiżankę na jedną próbkę komórki zawiesiny. Uważaj, aby nie mieszać próbek. W tym celu umieść próbkę 1 w filiżance 1, próbkę 2 w filiżance 2 itd.
2. Zamroź pęsetę, zanurzając jej końcówkę w ciekłym azocie.
3. Zanurz igłę preparacyjną o podwójnej krawędzi w granulce otrzymanej w 3,5.
4. Za pomocą pęsety weź miedzianą siatkę mikroskopową o oczkach 400 pokrytą formvarem przygotowanym w sekcji 1.
5. Za pomocą igły preparacyjnej umieść kroplę granulki uzyskanej w 3,5 na siatce. Wypróbuj różne wielkości kropli (np. 2, 5 i 10 μl).
6. Bardzo szybko zanurz siatkę trzymaną przez pęsetę w ciekłym propanu wytworzonym w sekcji 4 i mieszaj siatkę okrężnymi ruchami przez kilka sekund.
7. Szybko przenieś zamrożoną siatkę za pomocą pęsety do małego mosiężnego kubka zamrożonego w sekcji 5.1.
   UWAGA: Dla każdej próbki wykonaj co najmniej 3 siatki. Zawsze zamrażaj pęsetę przed wzięciem miedzianej siatki.

6. Zamiana zamrożenia

UWAGA: Tetroxide osmu jest potencjalnie lotny, więc użyj respiratora oczyszczającego powietrze z wkładami oparowymi. Rozwiązaniem jest również zamrożenie utrwalacza w ciekłym azocie przed zamrożeniem wgłębnym.

1. W celu przeprowadzenia badań ultrastrukturalnych otworzyć probówki kriowialne o pojemności 1,8 ml zawierające pożywkę do substytucji przez wymrażanie, przygotowane w sekcji 2.1. W celu przeprowadzenia badań immunolokalizacyjnych należy otworzyć probówki kriowialne o pojemności 1,8 ml zawierające pożywkę do substytucji przez zamrażanie, przygotowane w sekcji 2.2. Umieść nakrętkę na kriowialach.
2. Zamroź pęsetę, zanurzając jej końcówkę w ciekłym azocie.
3. Szybko zdejmij nakrętkę i przenieś zamrożone siatki do kriowiali za pomocą pęsety.
4. Załóż nakrętkę z powrotem na kriowialisty.
5. Powtórzyć operację dla każdej siatki każdej próbki.
6. Zamknij wszystkie nakrętki i wymieszaj kriowiale okrężnymi ruchami ręki, aby upewnić się, że próbki znajdują się w pożywce do zamrażania.
7. Umieść kriowiale w hermetycznym pudełku na 3 dni w zamrażarce o temperaturze -84 °C podczas procesu substytucji przez zamrożenie.

7. Ocieplenie próbki

1. Badania ultrastruktury
   1. Kriowiale należy przenieść w polistyrenowej tacce (aby uniknąć nagłego wzrostu temperatury) do zamrażarki o temperaturze -30 °C. Umieść je w zamrażarce w temperaturze -30 °C na 1 godzinę.
   2. Umieścić kriowiale w zamrażarce o temperaturze -15 °C na 2 godziny. Umieścić próbki w temperaturze 4 °C na 2 godziny, a następnie na 30 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Usunąć pożywkę podstawiania przez zamrażanie za pomocą plastikowej pipety transferowej. Dodać około 500 μl 100% acetonu.
   4. Wymieszać 1,8 ml kriowialu okrężnymi ruchami ręki i szybko wlać aceton (1,5 ml) zawierający kratki do szklanej fiolki (wysokość 3 cm i średnica 2 cm).
   5. Opłucz ten sam kriowial 1 ml 100% acetonu, aby upewnić się, że wszystkie siatki zostały przeniesione. Wymieszaj kriowial okrężnymi ruchami ręki i wlej zawartość kriowialu do szklanej fiolki.
   6. Przepłukać każdą szklaną fiolkę 3 ml 100% acetonu 3 razy przez 10 minut.
   7. Postępuj zgodnie z procedurami osadzania i dołączania zgodnie z opisem w reference¹⁵. Zaimpregnować próbkę rosnącym stężeniem żywicy epoksydowej w acetonie (25%, 50% i 75%) i zatopić próbkę w 100% żywicy epoksydowej w kapsułkach żelatynowych.
2. Badania znakowania immunologicznego
   1. Kriowiale o pojemności 1,8 ml należy przenieść w tacce z polistyrenu (aby uniknąć nagłego wzrostu temperatury) do zamrażarki o temperaturze -30 °C.
   2. Umieść kriowiale na 2 godziny w zamrażarce o temperaturze -30 °C.
   3. W zamrażarce o temperaturze -30 °C wymieszać kriowial okrężnymi ruchami ręki i szybko wlać pożywkę do zamrażania do polipropylenowej fiolki (wysokość 5 cm i średnica 1,5 cm).
   4. Zastąp pożywkę do zamrażania 2 ml świeżej pożywki do zamrażania.
   5. Umieść fiolkę z polipropylenu na 2 godziny w zamrażarce w temperaturze -30°C.
   6. Przepłukać fiolkę z polipropylenu przez 1 godzinę 2 ml 100% acetonu i trzy razy przez 1 godzinę 2 ml 100% etanolu.
   7. Postępuj zgodnie z procedurami osadzania i dołączania zgodnie z opisem w reference¹⁵. Zaimpregnować próbkę rosnącym stężeniem żywicy akrylowej (25%, 50% i 75% acetonu) i zanurzyć próbkę w 100% żywicy akrylowej w kapsułkach żelatynowych.

8. Wizualizacja próbek

1. Po zatopieniu należy wykonać ultracienkie skrawki próbek o długości fali 80 nm za pomocą ultramikrotomu. Porównaj skrawki z 2% cytrynianem ołowiu w temperaturze pokojowej przez 1 min¹⁵.
2. Użyj mikroskopu elektronowego 80 kV lub 120 kV, aby obserwować sekcje¹⁵.

Wyniki

W tym artykule przedstawiono łatwą w użyciu i tanią metodę zamrażania wgłębnego dla badań ultrastrukturalnych (Rysunki 1 i Rysunek 2) i immunoznakujących (Rysunek 3). Wykazujemy, że nie jest konieczne posiadanie specjalnego sprzętu do procedury zamrażania-substytucji i że procedura podgrzewania trwa krócej niż 6 godzin zamiast 24 godzin przy użyciu dedykowanego systemu.

Dyskusja

TEM to potężna metoda obserwacji ultrastrukturalnej organelli, komórek i tkanek. Kriofiksacja/substytucja przez wymrażanie jest obecnie najlepszą metodą zachowania zarówno ultrastruktury, jak i antygenowości białek. Utrwalacze chemiczne wnikają i działają bardzo powoli, umożliwiając w ten sposób przegrupowania strukturalne przed całkowitą stabilizacją ultrastruktury². I odwrotnie, kriofiksacja/substytucja przez zamrożenie natychmiast stabilizuje struktury komórkowe⁴. Techni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siatki	Mikroskopia elektronowa Nauki	T400-Cu
Mikroskopia elektronowa	Formvar	15800
Propan N35
Ciekły azot
Igła preparcyjna z podwójną	krawędzią Nauki o mikroskopii elektronowej	72947
Kriowiale	Nauki o mikroskopii elektronowej	61802-02
Tetroksynek osmu	Mikroskopia elektronowa Nauki	19130
Szklana fiolka 8,5 ml	Mikroskopia elektronowa Nauki	64252
Octan uranylu	Mikroskopia elektronowa Nauki	48851
Aceton	Sigma	32201
Etanol 100%	Sigma	32221
Szkło	Prowadnice VWR international	631-9439
Pęseta
Żywica akrylowa	Mikroskopia elektronowa Nauki	104371
Żywica epoksydowa M	Sigma	10951
Żywica epoksydowa M utwardzacz	Sigma	10953
Ftalan dibutylu	Sigma	80102
Żywica epoksydowa M akceler	Sigma	10952
Krystalizator	Fischer scientific	08-762-9
Papier Joseph	VWR international	111-5009
Kubki mosiężne			zrób to sam sklep lub wykonane samodzielnie
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Hermetyczne pudełko	Fischer scientific	7135-0001
Maska oczyszczająca powietrze	Fischer scientific	3M 7502
Wkład do respiratora	Fischer scientific	3M 6001
Filtr cząstek stałych	Fischer scientific	3M 5N11