Artykuł metodologiczny

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

DOI:

10.3791/54881

⸱

23 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Miami

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tetramery peptydowo-głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (pMHC-I) były nieocenionym narzędziem do badania odpowiedzi limfocytów T CD8+. Ponieważ odczynniki te bezpośrednio wiążą się z receptorami limfocytów T na powierzchni limfocytów T CD8 +, tetramery pMHC-I znakowane fluorochromem umożliwiają dokładne wykrywanie limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu (Ag) bez konieczności ponownej stymulacji in vitro. Co więcej, w połączeniu z wielokolorową cytometrią przepływową, barwienie tetramerem pMHC-I może ujawnić kluczowe aspekty limfocytów T CD8 + specyficznych dla Ag, w tym etap różnicowania, fenotyp pamięci i stan aktywacji. Tego typu analizy okazały się szczególnie przydatne w dziedzinie immunologii HIV, gdzie limfocyty T CD8+ mogą wpływać na progresję do AIDS. Eksperymentalne zakażenie makaków rezusów małpim wirusem niedoboru odporności (SIV) stanowi nieocenione narzędzie do badania odporności komórkowej przeciwko wirusowi AIDS. W rezultacie poczyniono znaczne postępy w definiowaniu i charakteryzowaniu odpowiedzi limfocytów T w tym modelu zwierzęcym. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół zliczania limfocytów T CD8 + specyficznych dla SIV u makaków rezusów poprzez barwienie tetramerem pMHC-I. Nasz test pozwala na jednoczesną kwantyfikację i fenotypowanie pamięci dwóch populacji limfocytów T pMHC-I tetramer+ CD8+ na test, co może być przydatne do śledzenia odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla SIV generowanych przez szczepienie lub zakażenie SIV. Biorąc pod uwagę znaczenie naczelnych innych niż ludzie w badaniach biomedycznych, metodologia ta ma zastosowanie do badania odpowiedzi limfocytów T CD8 + w wielu warunkach chorobowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty T CD8+ stanowią kluczowy składnik adaptacyjnego układu odpornościowego, ponieważ uczestniczą w nadzorze immunologicznym nad nowotworem i przyczyniają się do eliminacji patogenów wewnątrzkomórkowych1. Mówiąc prościej, limfocyty T CD8 + wyrażają receptory komórek T (TCR), które specyficznie rozpoznają cząsteczki peptydowego głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (pMHC-I) obecne na błonie komórkowej komórek gospodarza. Ponieważ peptydy te pochodzą z proteolizy endogennie syntetyzowanych białek, kompleksy pMHC-I na powierzchni komórki zapewniają okno na środowisko wewnątrzkomórkowe. Na przykład po zakażeniu wirusem zakażone komórki będą wykazywać cząsteczki MHC-I zawierające peptydy pochodzące z wirusa, które mogą służyć jako ligandy dla TCR wyrażanych przez patrolowanie limfocytów T CD8+. W przypadku, gdy specyficzny dla wirusa limfocyt T CD8 + napotka zakażoną komórkę prezentującą swój ligand pMHC-I, zaangażowanie TCR spowoduje aktywację limfocytów T CD8 + i ostatecznie doprowadzi do lizy komórek docelowych. Biorąc pod uwagę krytyczny charakter tych interakcji TCR / pMHC-I, określenie wielkości, swoistości i fenotypu reagujących limfocytów T CD8 + może często ujawnić ważne wskazówki dotyczące chorób ludzkich.

Do początku lat 90. kwantyfikacja limfocytów T CD8+ specyficznych dla Ag opierała się na technicznie wymagającym teście granicznego rozcieńczenia (LDA)2,3. Nie dość, że LDA potrzebował kilku dni na ukończenie, to jeszcze nie udało mu się wykryć komórek, które nie miały potencjału proliferacyjnego. W rezultacie, LDA znacznie zaniżył rzeczywistą częstość udziału limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu (Ag) w odpowiedzi immunologicznej. Chociaż opracowanie ELISPOT i wewnątrzkomórkowych testów barwienia cytokin znacznie poprawiło zdolność pomiaru odporności komórkowej, metody te nadal wymagały stymulacji in vitro w celu ilościowego określenia limfocytów T specyficznychdla Ag 4. Dopiero w 1996 roku Altman, Davis i współpracownicy opublikowali swój przełomowy artykuł opisującyrozwój technologii tetramerów pMHC-I5. Kluczowe znaczenie dla powodzenia tej techniki miała multimeryzacja cząsteczek pMHC-I, która wydłużyła okres półtrwania oddziaływań TCR/pMHC-I, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo odpadnięcia tetramerów pMHC-I podczas etapów płukania testów cytometrii przepływowej. Główną przewagą tetramerów pMHC-I nad wyżej wymienionymi testami jest możliwość dokładnego wykrywania limfocytów T CD8+ specyficznych dla Ag bezpośrednio ex vivo, bez konieczności ponownej stymulacji in vitro. Co więcej, połączenie barwienia tetramerem pMHC-I z wielobarwną cytometrią przepływową umożliwiło szczegółowe analizy etapu różnicowania, fenotypu pamięci i stanu aktywacji limfocytów T CD8 + swoistych dla Ag2-4. W świetle najnowszych osiągnięć technicznych w zakresie charakteryzowania repertuaru limfocytów T CD8 + za pomocą barwienia multimerem pMHC-I6, zakres zastosowań tej metodologii prawdopodobnie będzie się nadal rozszerzał.

Niewiele dziedzin badań biomedycznych skorzystało bardziej z barwienia tetramerów pMHC-I niż dziedzina immunologii HIV7. Chociaż limfocyty T CD8 + były czasowo związane z początkową kontrolą wiremii HIV do czasu publikacji Altmana, Davisa i współpracowników8,9, zastosowanie tetramerów pMHC-I w kolejnych latach znacznie poszerzyło naszą wiedzę na temat odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznej dla HIV. Na przykład barwienie tetramerem pMHC-I pomogło potwierdzić solidny rozmiar specyficznych dla wirusa odpowiedzi limfocytów T CD8 + u większości osób zakażonych wirusem HIV10-12. Metodologia ta ułatwiła również scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla HIV i SIV ograniczonych przez cząsteczki MHC-I związanych ze spontaniczną kontrolą replikacji wirusa przy braku terapii antyretrowirusowej - zjawisko znane jako "kontrola elitarna"13-15. Ponadto tetramery pMHC-I odegrały zasadniczą rolę w ustaleniu osi programowanej śmierci 1 (PD-1)/liganda PD 1 (PD-L1) jako odwracalnego szlaku dla dysfunkcyjnego fenotypu limfocytów T CD8 + specyficznych dla HIV w niekontrolowanym przewlekłym zakażeniu16,17. Podsumowując, badania te podkreślają przydatność tetramerów pMHC-I do monitorowania odpowiedzi limfocytów T CD8 + na wirusa AIDS.

Eksperymentalne zakażenie SIV makaków rezusów (Macaca mulatta) pozostaje najlepszym modelem zwierzęcym do oceny interwencji immunologicznych przeciwko HIV/AIDS18,19. W ciągu ostatnich 25 lat poczyniono znaczne postępy w identyfikacji i charakterystyce limfocytów T CD8 + specyficznych dla SIV u tego gatunku małp, w tym odkrycie alleli MHC-I i zdefiniowanie motywów wiążących peptydy13,20-27. W rezultacie opracowano tetramery pMHC-I do analizy specyficznych dla SIV odpowiedzi limfocytów T CD8 + w tym modelu zwierzęcym28. Większość tych odczynników składa się z produktów genowych czterech alleli MHC-I makaka rezusa: Mamu-A1*001, Mamu-A1*002:01, Mamu-B*008:01 i Mamu-B*017:01. Warto zauważyć, że makaki rezusy nie wyrażają locus29 MHC-C. Zdecydowana większość tetramerów pMHC-I użytych w obecnych eksperymentach została wyprodukowana w NIH Tetramer Core Facility na Uniwersytecie Emory. Niemniej jednak niektóre z tych odczynników, w tym tetramery Mamu-A1*001 związane z immunodominującym epitopem Gag CM9, można uzyskać tylko ze źródeł komercyjnych na podstawie umów licencyjnych. Używając tetramerów pMHC-I czterech alleli makaków rezusów wymienionych powyżej, z powodzeniem wyliczyliśmy limfocyty T CD8 + przeciwko łącznie 21 epitopom SIV (Tabela 1), które zostały wywołane przez szczepienie lub pierwotne zakażenie SIV30,31 (Martins i wsp., niepublikowane obserwacje).

Niniejszy manuskrypt dostarcza zoptymalizowany protokół barwienia tetramerów pMHC-I do określania częstotliwości i fenotypu pamięci limfocytów T CD8+ specyficznych dla SIV u makaków rezusów. Test rozpoczyna się od planowej 30-minutowej inkubacji z inhibitorem kinazy białkowej (PKI; w tym przypadku stosuje się dazatynib) w celu zmniejszenia internalizacji TCR, a tym samym poprawy barwienia tetrameru pMHC-I32. Jak opisano poniżej, zabieg ten jest szczególnie przydatny w przypadku stosowania tetramerów Mamu-B*017:01. Podano również instrukcje, jak znakować komórki tetramerami pMHC-I sprzężonymi z fluorochromem i przeciwciałami monoklonalnymi (mAb). Protokół ten obejmuje również etap przenikania komórek w celu wewnątrzkomórkowego wykrywania cząsteczki związanej z cytolizą granzymu B (Gzm B). Na tym etapie dodaje się również mAb przeciwko CD3, aby poprawić wykrywanie tej cząsteczki sygnałowej TCR. Jako odniesienie wymieniono wszystkie fluorochromy użyte w tym panelu barwienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) wykorzystane w tym manuskrypcie zostały uzyskane od indyjskich makaków rezusów trzymanych w Wisconsin National Primate Research Center. Zwierzęta te były pod opieką zgodnie z raportem Weatherall na podstawie protokołu zatwierdzonego przez University of Wisconsin Graduate School Animal Care and Use Committee33. Wszystkie zabiegi na zwierzętach były wykonywane w znieczuleniu i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować potencjalne cierpienie.

1. Leczenie PKI

UWAGA: Jest to opcjonalne, ale zalecane dla tetramerów Mamu-B*017:01. Zobacz sekcje Wyniki i Dyskusja.

  1. Zawiesić PBMC w pożywce R10 w stężeniu 1,6 x 107 komórek/ml.
  2. Dodać 50 μl tej zawiesiny komórkowej do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Do każdej probówki dodać 50 μl roztworu PKI o stężeniu 100 nM.
  3. Wiruj każdą rurkę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Pod koniec tego kroku każda probówka powinna mieć 100 μl zawiesiny komórki zawierającej 8,0 x 105 PBMC i 50 nM PKI.
  4. Przejdź do etapu barwienia tetramerem pMHC-I.

2. Barwienie tetramerami pMHC-I znakowanymi fluorochromem

  1. Przed przygotowaniem głównej mieszanki tetrameru pMHC-I należy odwirować probówki tetrameru pMHC-I o stężeniu 20 000 x g przez co najmniej 15 minut w temperaturze 4 °C. Celem tego etapu jest osadzenie agregatów białkowych w roztworze tetrameru pMHC-I, które mogą zwiększać barwienie tła. Po zakończeniu etapu wirowania należy unikać pipetowania od dna probówki, w której nagromadzą się agregaty białkowe.
  2. Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki tetramerów pMHC-I, aby zabarwić wszystkie probówki eksperymentalne. Przygotować nadmiar 15% całkowitej objętości tej mieszanki wzorcowej, aby uwzględnić błąd pipetowania.
  3. Rozcieńczyć tetramery pMHC-I w buforze barwiającym (np. Brilliant Stain Buffer) tak, aby do każdego badania dodać 25 μl głównej mieszaniny tetrameru pMHC-I.
    1. Oznaczyć PBMC dwoma tetramerami pMHC-I na test; jeden sprzężony z allofikocyjaniną (APC), a drugi z fioletem brylantowym (BV) 421.
  4. Dodać 8,0 x 105 PBMC do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej w końcowej objętości 100 μl. Jeśli komórki zostały poddane opisanej powyżej obróbce infrastrukturą kluczy publicznych, na tym etapie powinny być już ponownie zawieszone w 100 μl.
  5. Dodać 25 μl głównej mieszanki tetrameru pMHC-I do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Pod koniec tego etapu końcowa objętość w każdej probówce powinna wynosić 125 μl.
  6. Wirować każdą probówkę w celu homogenizacji zawiesiny komórek.
  7. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Przygotować koktajl mAb barwiący powierzchnię podczas tej 45-minutowej inkubacji.

3. Barwienie powierzchni

  1. Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki mAb, aby zabarwić wszystkie probówki eksperymentalne. Przygotować nadmiar 15% całkowitej objętości tej mieszanki wzorcowej, aby uwzględnić błąd pipetowania.
  2. Dostosuj objętość mieszanki wzorcowej z buforem barwiącym tak, aby dodać 50 μl na test.
  3. W celu prawidłowego wykluczenia limfocytów T innych niż CD8 + i wyznaczenia podzbiorów pamięci, należy użyć miareczkowanych ilości mAb skierowanych przeciwko następującym cząsteczkom w mieszance głównej barwienia powierzchni.
    UWAGA: Fluorochromy sprzężone z każdym mAb są podane jako odniesienie: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 i CCR7 FITC. Zauważ, że mAb przeciwko CD14, CD16 i CD20 są sprzężone z tym samym fluorochromem (tj. BV 510), ponieważ zostaną włączone do bramki "zrzutu".
  4. Dołączyć barwnik utrwalający do rozróżniania martwych komórek w głównej mieszance barwienia powierzchni [tj. barwnik reaktywny aminami (ARD)]. Upewnij się, że odczynnik ARD jest sprzężony z fluorochromem o podobnym widmie emisyjnym, jak te używane w bramce "zrzutowej". W takim przypadku użyj ARD Aqua.
  5. Dodać 50 μl wzorcowej mieszanki barwiącej opisanej w ppkt 3.1-3.4 do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Pod koniec tego etapu końcowa objętość w każdej probówce powinna wynosić 175 μl.
  6. Wiruj każdą rurkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
  7. Przemyć komórki buforem do przemywania (roztwór PBS zawierający 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,45 g/l NaN3).
    UWAGA: Azydek sodu jest substancją toksyczną. Narażenie nawet na niewielkie ilości może powodować objawy. Z tą substancją należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi określonymi przez Biuro ds. Bezpieczeństwa i Higieny Pracy (EHS) w instytucji, w której przeprowadzane są te eksperymenty.
  8. Probówki wirówkowe o masie 510 x g przez 5 min. Ostrożnie zdekantować supernatant do oddzielnego pojemnika na odpady. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
    UWAGA: Nie należy dekantować supernatantu buforowego do zbiorników zawierających wybielacz, ponieważ może on reagować z azydkiem sodu obecnym w buforze do płukania i powodować powstanie toksycznego gazu34. Skontaktuj się z Biurem BHP w instytucji, w której przeprowadzane są te eksperymenty, aby uzyskać wskazówki dotyczące utylizacji azydku sodu.
  9. Po zdekantacji zwiruj komórki w pozostałej cieczy zatrzymanej w każdej probówce.

4. Utrwalenie komórek

  1. Dodać 250 μl 2% roztworu paraformaldehydu (PFA) do wszystkich probówek, aby utrwalić komórki.
    UWAGA: PFA jest substancją toksyczną. Narażenie nawet na niewielkie ilości może powodować objawy. Z substancją tą należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi określonymi przez Biuro BHP w instytucji, w której przeprowadzane są te eksperymenty.
    1. Ponieważ 2% roztwór PFA musi być izotoniczny dla komórek, do przygotowania tego roztworu należy użyć PBS. Sto mililitrów 2% roztworu PFA wystarcza do wielu eksperymentów. Natychmiast po dodaniu 2% PFA należy dokładnie wywirować wszystkie probówki, aby zapobiec tworzeniu się agregatów komórkowych.
  2. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  3. Umyj komórki, powtarzając kroki 3.7-3.9. Po zakończeniu tego etapu ogniwa można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24-48 godzin. Przed przystąpieniem do fazy permeabilizacji dokładnie wymieszaj rurki.

5. Przepuszczalność komórek

  1. Dodać 500 μl buforu przepuszczalnego. Zwiruj wszystkie rurki.
  2. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  3. Umyj komórki, powtarzając kroki 3.7-3.9.

6. Barwienie wewnątrzkomórkowe

  1. Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki mAb, aby zabarwić wszystkie probówki eksperymentalne.
  2. Dostosuj objętość za pomocą PBS lub buforu barwiącego tak, aby dodać 50 μl wewnątrzkomórkowej mieszanki głównej mAb na test.
  3. Przygotować główną mieszaninę mAb opisaną w ppkt 6.1 i 6.2, stosując domiarkowane ilości mAb skierowane przeciwko CD3 i Gzm B.
    UWAGA: Zaangażowanie TCR przez tetramery pMHC-I może powodować internalizację CD3, która może zakłócać wykrywanie limfocytów T tetrameru + CD3 + CD8 +, jeśli mAb anty-CD3 zostanie dodany do głównej mieszanki barwienia powierzchniowego. Aby tego uniknąć, dodaj mAb anty-CD3 na tym etapie, czyli po przepuszczalności komórek. Fluorochromy sprzężone z każdym mAb są wymienione jako odniesienie: CD3 PerCP Cy5.5 i Gzm B PE.
  4. Dodaj 50 μl koktajlu mAb do odpowiednich probówek. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Umyj komórki, powtarzając kroki 3.7-3.9. Probówki są gotowe do pobrania w cytometrze przepływowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół został wykorzystany do określenia wielkości i fenotypu pamięci wywołanych szczepionką, specyficznych dla Gag CM9 odpowiedzi limfocytów T CD8+ u makaka rezusa Mamu-A1*001+. Do tej analizy użyto tetrameru Mamu-A1*001/Gag CM9 sprzężonego z APC w 8-kolorowym panelu do barwienia cytometrycznego przepływowego. Rysunek 1A-F przedstawia strategię bramkowania zastosowaną do analizy danych, którą należy zastosować dla obu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka kroków w tej procedurze zasługuje na omówienie, ponieważ mają one kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnych wyników. Po pierwsze, ponieważ jakość próbek biologicznych jest silnym predyktorem powodzenia każdego testu cytometrii przepływowej38, należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić, że komórki są zdolne do życia i znajdują się w zawieszeniu podczas procedury barwienia. Jest to szczególnie istotne podczas pracy z próbkami kriokonserwowanymi, ponieważ są one bardziej podatne na zbrylanie się i zaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Davidowi Watkinsowi za wsparcie eksperymentów, które umożliwiły optymalizację obecnej metodologii. Badania opisane w tej publikacji były częściowo wspierane przez pilotażowy grant przyznany przez Miami Center for AIDS Research of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30AI073961. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DazatynibAxon medchemAxon  1392Musi być ponownie zawieszony w DMSO i natychmiast przechowywany w temperaturze -20 ° C
RPMI w/ Glutamaxgibco/ Life Technologies61870-036Musi być przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C 
Inaktywowany termicznie FBSgibco/ Life Technologies10082-147Musi być przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C 
Penicylina-Streptomycyna-Amfoterycyna BLonza17-745ENależy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C 
DMSO, AnhydrousLife TechnologiesD12345Przechowywać w temperaturze pokojowej.
5 ml probówki polipropylenowe z okrągłym dnemVWR60819-728
Tetramery fluorochromowe pMHC-IRdzeń tetramerowy NIH lub MBL, Inc.Musi być przechowywany i konserwowany w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 20 000 x g przez 15 minut przed użyciem. Nie zamrażać.
MAb sprzężone z fluorochromemRóżne firmyMuszą być przechowywane i konserwowane w  4 &stopnie C. Nie zamrażać.
ŻYWE/MARTWE  Mocowana woda  Nie żyje  Zestaw do barwienia komórekLife Technologiesl34957Musi być przechowywany w temperaturze -20 °C. Ponownie zawiesić każdą podwielokrotność w 50 μ l DMSO przed użyciem.
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563794Musi być przechowywany w  4 &stopnie; C 
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiVWR97064-158Przechowywać w temperaturze pokojowej
Albumina bydlęcaVWR700011-230Musi być przechowywana w  4 stopniach; C 
Azydek soduVWR97064-646Przechowywać w temperaturze pokojowej. Substancja toksyczna. Nie mieszać z wybielaczem.
WybielaczVWR89501-620substancja chemiczna, nie można mieszać z azydkiem sodu. Zachowaj ostrożność
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15714-SŁatwopalny, i toksyczny odczynnik. Zachowaj ostrożność
Polysorbate 20 (Tween-20)Alfa AesarL15029Przechowywać w temperaturze pokojowej
Roztwór do przepuszczalności 2 BD Biosciences340973Odczynnik toksyczny i. Ostrożne obchodzenie się z
probówkami Sarsdet 1,5 ml zakręcana nakrętkaVWR72.692.005
2,0 ml probówki DNA/RNA o niskim poziomie wiązaniaEppendorf22431048Preferowane jest stosowanie sterylnych mikroprobówek 
Mieszalnik wirowyDo uznania naukowca
Gabinet Bezpieczeństwa Biologicznego Według uznania naukowca
Milli Q Intergral System oczyszczania wodyEMD MilliporeZRXQ010WWBiologia molekularna Woda klasy od dowolnego dostawcy może być używana
MikrowirówkaDo uznania naukowca
WirówkaDo uznania naukowca
4 & stopnie; C  lodówkaWedług uznania naukowca
BD LSR IIBD BiosciencesCytometr przepływowy musi zawierać lasery i filtry, które są kompatybilne z zastosowanym panelem barwiącym.
dejonizowana
Folia aluminiowaVWR SCIENTIFIC INC.89068-738
InkubatorMusi być w stanie utrzymać 37 & stopni; C  temperatura wewnętrzna
Oprogramowanie FACS DivaBD Biosciences
Oprogramowanie Flowjo w wersji 9.6FlowjoSłuży do analizy plików FCS generowanych przez oprogramowanie FACS Diva
Końcówki
Woda mikropipet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. The Immune System, 3rd ed. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).
  2. Doherty, P. C. The tetramer transformation. J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).
  3. Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. A brief history of CD8 T cells. Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).
  4. Murali-Krishna, K., et al. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).
  5. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  6. Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).
  7. Walker, B., McMichael, A. The T-cell response to HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  8. Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).
  9. Koup, R. A., et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).
  10. Gray, C. M., et al. Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART). J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).
  11. Papagno, L., et al. Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors. Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).
  12. Spiegel, H. M., et al. Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells. J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).
  13. Loffredo, J. T., et al. Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).
  14. Migueles, S. A., et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).
  15. Valentine, L. E., et al. Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques. J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).
  16. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).
  17. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).
  18. Mudd, P. A., Watkins, D. I. Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses. Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).
  19. Valentine, L. E., Watkins, D. I. Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques. Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).
  20. Allen, T. M., et al. Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus. J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).
  21. Allen, T. M., et al. CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing. J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).
  22. Kaizu, M., et al. Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes. Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).
  23. Loffredo, J. T., et al. Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition. J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).
  24. Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses. HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).
  25. Loffredo, J. T., et al. Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity. J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).
  26. Mothe, B. R., et al. Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins. J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).
  27. Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys. J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).
  28. Kuroda, M. J., et al. Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex. J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).
  29. Otting, N., et al. Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).
  30. Martins, M. A., et al. Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection. J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).
  31. Mudd, P. A., et al. Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication. Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).
  32. Lissina, A., et al. Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers. J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).
  33. Weatherall, D. The use of non-human primates in research. A working group report. , 152(2006).
  34. Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution. J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).
  35. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  36. Dolton, G., et al. More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers. Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).
  37. Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).
  38. Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).
  39. Colantonio, A. D., et al. KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif. PLoS Pathog. 7 (3), e1001316(2011).
  40. Schafer, J. L., et al. Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides. PLoS Pathog. 11 (9), 1005145(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CD8 limfocyty T specyficzne dla SIVanaliza cytometrycznamodel makaka rezusadetekcja limfocyt w T specyficznych dla antygenufenotypowanie kom rek pami cibarwienie wewn trzkom rkoweizolacja PBMCmiareczkowanie tetramer wwi zanie MHC klasy I

Powiązane artykuły