Połączenie mokrych i suchych technik laboratoryjnych w celu kierowania krystalizacją dużych zwiniętych cewek białkowych

Summary

Opisujemy strukturę obejmującą prostą analizę biochemiczną i obliczeniową, aby kierować charakterystyką i krystalizacją dużych domen o zwiniętych zwojach. Struktura ta może być dostosowana do białek globularnych lub rozszerzona w celu uwzględnienia różnych technik wysokoprzepustowych.

Abstract

Uzyskanie kryształów do określenia struktury może być trudnym i czasochłonnym zadaniem dla każdego białka. Białka i domeny zwinięte występują w całej przyrodzie, jednak ze względu na ich właściwości fizyczne i tendencję do agregacji, są tradycyjnie postrzegane jako szczególnie trudne do krystalizacji. Tutaj wykorzystujemy szereg szybkich i prostych technik zaprojektowanych w celu zidentyfikowania szeregu możliwych granic domen dla danego białka zwiniętego zwoju, a następnie szybko scharakteryzujemy zachowanie tych białek w roztworze. Dzięki dodatkowi silnie fluorescencyjnego znacznika (mRuby2) charakterystyka białka jest prosta i nieskomplikowana. Białko docelowe można łatwo zwizualizować w normalnym oświetleniu i określić ilościowo za pomocą odpowiedniego imagera. Celem jest szybka identyfikacja kandydatów, którzy mogą zostać usunięci z procesu krystalizacji, ponieważ jest mało prawdopodobne, że odniosą sukces, dając więcej czasu najlepszym kandydatom i mniej funduszy wydanych na białka, które nie wytwarzają kryształów. Proces ten może być iterowany w celu uwzględnienia informacji uzyskanych podczas wstępnych badań przesiewowych, może być dostosowany do wysokoprzepustowych procedur ekspresji i oczyszczania, a także jest wspomagany przez robotyczne badania przesiewowe w kierunku krystalizacji.

Introduction

Określanie struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej wniosło fundamentalny wkład w każdą dziedzinę współczesnej biologii; dostarczając atomowego spojrzenia na makrocząsteczki, które podtrzymują życie i jak oddziałują one ze sobą w różnych kontekstach; pozwalając nam zrozumieć mechanizmy powodujące choroby i dając możliwości racjonalnego projektowania leków do leczenia chorób. Krystalografia od dawna jest dominującą techniką eksperymentalną do określania struktury makromolekularnej i obecnie stanowi 89,3% strukturalnej bazy danych (www.rcsb.org). Technika ta ma wiele zalet, w tym potencjał bardzo wysokiej rozdzielczości, możliwość wizualizacji makrocząsteczek o szerokim zakresie rozmiarów, stosunkowo łatwe gromadzenie danych oraz możliwość wizualizacji, w jaki sposób makrocząsteczka oddziałuje z rozpuszczalnikiem, a także ligandami.

Pomimo licznych ulepszeń technologicznych w ekspresji białek rekombinowanych^1,2, oczyszczaniu³ i biologii molekularnej używanej do generowania tych systemów⁴, największą przeszkodą w procesie krystalograficznym pozostaje możliwość hodowania kryształów o jakości dyfrakcyjnej. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku białek, które zawierają duże domeny zwinięte cewki. Szacuje się, że aż 5% wszystkich aminokwasów znajduje się w zwiniętych zwojach^5,6, co czyni tę cechę bardzo powszechną cechą strukturalną⁷, jednak białka te są często trudniejsze do oczyszczenia i krystalizacji niż białka kuliste^8-10. Jest to dodatkowo spotęgowane przez fakt, że domeny zwinięte często znajdują się w kontekście większego białka, dlatego prawidłowe przewidywanie granic tych domen ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia włączenia nieustrukturyzowanej lub elastycznej sekwencji, która często jest szkodliwa dla krystalizacji.

Tutaj prezentujemy ramy koncepcyjne łączące internetowe analizy obliczeniowe z danymi eksperymentalnymi z laboratorium, aby pomóc użytkownikom przejść przez początkowe etapy procesu krystalograficznego, w tym: jak wybrać fragment(y) białka do badań strukturalnych oraz jak przygotować i scharakteryzować próbki białek przed próbami krystalizacji. Skupiamy się na dwóch białkach zawierających duże domeny zwinięte cewki, Shroom (Shrm) i Rho-kinase (Rock). Białka te zostały wybrane, ponieważ oba zawierają domeny zwinięte i wiadomo, że tworzą biologicznie istotny kompleks^11-16. Przewiduje się, że grzyb i kinaza Rho (skała) zawierają odpowiednio ~200 i 680 reszt zwiniętej cewki, z których wiele części scharakteryzowano strukturalnie^17-20. Opisana tutaj metoda zapewnia usprawniony przepływ pracy w celu szybkiej identyfikacji fragmentów zwiniętej cewki zawierającej białko, które będą podatne na krystalizację, jednak opisane techniki można łatwo dostosować do większości białek lub kompleksów białkowych lub zmodyfikować w celu włączenia podejść o wysokiej przepustowości, jeśli są dostępne. Wreszcie, metody te są na ogół niedrogie i mogą być wykonywane przez użytkowników na prawie wszystkich poziomach doświadczenia.

Protocol

UWAGA: Diagram struktury koncepcyjnej lub przepływu pracy jest opisany na rysunku 1 w celach informacyjnych. Protokół można podzielić na cztery etapy: przewidywania obliczeniowe lub oparte na sekwencjach, ekspresja i oczyszczanie białek, charakterystyka biochemiczna i krystalizacja. Pokazane przykłady analizują domeny Shroom SD2 i/lub kompleksy Shroom-Rock, ale mogą być wykorzystane z dowolnym białkiem.

1. Korzystaj z uznanych narzędzi internetowych do generowania obliczeniowych prognoz granic domen zwojów

1. Zbierz ewolucyjnie zróżnicowany zestaw homologów sekwencji.
   1. Przejdź do www.uniprot.org i wpisz Shroom w górnym pasku wyszukiwania.
   2. Wybierz sekwencje do pobrania, zaznaczając pole obok ich numeru dostępu. Sekwencje oznaczone gwiazdką oznaczają sekwencje sprawdzone przez Uniprot i są na ogół bardziej wiarygodne. Upewnij się, że wszystkie sekwencje są kompletne i dokładne.
   3. Zapisz wybrane sekwencje, klikając przycisk Pobierz.
   4. Dopasuj kolekcję sekwencji grzybów za pomocą Clustal-Omega²¹ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Kliknij przycisk "Przeglądaj", aby wybrać plik z sekwencjami grzybów, a następnie naciśnij Prześlij.
   5. Po zakończeniu wyrównywania kliknij przycisk "Pobierz plik wyrównania".
   6. Otwórz wyrównanie wielu sekwencji wygenerowane w wersji 1.1.5 za pomocą Jalview (Plik|Wyrównanie danych wejściowych|Z pliku). W nowym oknie wyrównania pokoloruj według tożsamości (Kolor|Procent tożsamości).
2. Obliczanie przewidywań struktury drugorzędowej, przewidywań elastycznej lub nieuporządkowanej sekwencji oraz przewidywanych regionów zwiniętych cewek w obrębie białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania.
   1. Przejdź do http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, aby obliczyć przewidywania dotyczące zwojów. Skopiuj i wklej sekwencję w polu Sekwencja, a następnie kliknij przycisk Prześlij.
      UWAGA: Ta analiza może potrwać kilka godzin. Ponieważ sekwencje grzybów są dość duże, może być konieczne podzielenie ich na bloki mniejsze niż 1000 aminokwasów, aby zmieścić się w ograniczeniach rozmiaru serwera internetowego. Podczas analizy Shrm2 zaleca się użycie C-końcowego 1,000 aminokwasów, ponieważ ta sekcja zawiera domenę Shrm SD2, o której wiadomo, że zawiera regiony zwiniętych cewek. Podczas powtarzania tej analizy z innymi białkami zaleca się stosowanie pełnych sekwencji białkowych, jeśli to możliwe. Jeśli nie jest to możliwe, użyj największego możliwego fragmentu lub przeanalizuj sekwencję na podstawie znanych danych biochemicznych lub funkcjonalnych.
   2. Przejdź do http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, aby obliczyć przewidywania dotyczące zwojów. Skopiuj i wklej sekwencję w polu Sekwencja, a następnie kliknij przycisk Prześlij.
3. Połącz wyniki kroków od 1.1 do 1.2.2 w jedną obszerną adnotację sekwencji grzybów.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się dołączenie na tym etapie wszelkich istotnych informacji, które można uzyskać z literatury lub innych źródeł na temat funkcji białka lub oczyszczania.
4. Korzystając z tej kompleksowej sekwencji z adnotacjami, przewiduj granice domen (lub serię możliwych granic) dla białka, starając się zmaksymalizować zachowanie i przewidywane cechy strukturalne, jednocześnie minimalizując ilość nieuporządkowanej lub elastycznej sekwencji. Jeśli jest to znane, otrzymane białko powinno zachować interesujące go właściwości funkcjonalne.

2. Ekspresja i oczyszczanie białek z granicami domen określonymi w sekcji 1

UWAGA: Celem tej sekcji jest użycie serii szybkich i łatwo mierzalnych testów do przesiewania hipotetycznych granic domen wygenerowanych w sekcji 1.

1. Korzystając ze standardowych technik biologii molekularnej, wygeneruj plazmid ekspresyjny z pożądaną sekwencją kodującą w ramce w plazmidzie His 10-mRuby2-XH2 (patrz rysunek 3 dla mapy wektorowej i dodatkowych szczegółów).
2. Zbadaj poziomy ekspresji dla każdego plazmidu ekspresyjnego przy użyciu BL21(DE3) E. coli lub innego odpowiedniego szczepu ekspresyjnego w pożywce autoindukcyjnej¹ w temperaturze pokojowej przez 18-24 godziny.
   1. Przekształć plazmidy ekspresyjne, a także pustą kontrolę plazmidu w BL21 (DE3) postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi z komórkami lub przy użyciu solidnego protokołu transformacji, takiego jak ten tutaj (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial-transformation/).
   2. Ze świeżo przekształconej płytki wybierz pojedynczą rodzinę i wyhoduj 5 ml kultury starterowej w temperaturze 37 °C przez noc w pożywce Lysography Bulion (LB) z 34 μg/ml kanamycyny.
   3. Następnego dnia osadzaj kulturę i myj osad świeżym LB.
   4. Dodać kulturę starterową do 50 ml pożywki autoindukcyjnej o stężeniu 34 μg/ml kanamycyny. Pozwól kulturze urosnąć do nasycenia w temperaturze pokojowej lub 37 °C. Zazwyczaj rośnie przez ~ 18-24 godziny.
   5. Osadzać komórki i zamrażać powstałe granulki komórkowe w temperaturze -80 °C na czas nieokreślony przed oczyszczeniem.
   6. Porównaj ekstrakty z całych komórek z każdego szczepu ekspresyjnego i kontroli pustego wektora za pomocą SDS-PAGE, aby określić szczep, który najefektywniej wytwarza pożądane białko fuzyjne. W przypadku białek fuzyjnych 10-mRuby2-Shroom SD2 uruchom 10% żele SDS-PAGE pod napięciem 180 V przez ~50 minut lub do momentu, gdy przód barwnika dotrze do dna żelu ²².
   7. Barwnik w żelu z Coomassie Blue, aby uwidocznić całkowitą ilość białek komórkowych w każdym szczepie²³.
3. Wykonaj wstępny etap chromatografii powinowactwa na każdym szczepie, który pomyślnie eksprymował białko fuzyjne mRuby2. Zazwyczaj etapy oczyszczania 2.3.2-2.3.7 należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że białko skorzysta na zmienionych warunkach, takich jak oczyszczanie w temperaturze 4 °C.
   1. Rozmrozić granulki komórkowe z kroku 2.2.5.
   2. Zawiesić każdą komórkę w 1,5 ml buforu do lizy (10% glicerolu, 500 mM NaCl, 40 mM imidazolu, 20 mM Tris pH8,0, 1 mM beta-merkaptoetanolu). W razie potrzeby uzupełnić bufor do lizy inhibitorami proteazy.
   3. Dodać 30 μl 10 mg/ml lizozymu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Sonicate postępując zgodnie z instrukcją dla używanego instrumentu.
   4. Przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować w wirówce stołowej przez 30 minut przy 14 000 x g w celu osadzenia nierozpuszczalnego materiału lub niezlizowanych komórek. Zapisz zarówno supernatant, jak i osad do późniejszej analizy za pomocą SDS-PAGE.
   5. Przeprowadzić oczyszczanie powinowactwa do niklu, inkubując rozpuszczalną frakcję ze 100 μl kulek Ni-NTA. Inkubuj kulki z rozpuszczalnym lizatem przez 5-10 minut, kilkakrotnie odwracając, aby wymieszać kulki.
   6. Wirować przy 800 x g przez 30 sekund w wirówce stołowej w celu granulowania kulek. Następnie przemyj granulat 3-5 razy buforem do lizy, aby usunąć niespecyficzne zanieczyszczenia.
   7. Elute rubinowe białko fuzyjne z kulek z buforem do lizy uzupełnionym 1 M imidazolem.
   8. Użyj SDS-PAGE, aby porównać zachowanie białek His-mRuby2-Shroom w "szybkim i brudnym" oczyszczaniu powyżej.

3. Scharakteryzuj próbkę białka, aby zidentyfikować te o korzystnych właściwościach

1. Za pomocą spektrofotometru ustawionego na 280 nm zmierz stężenie białka fuzyjnego Ruby, a następnie oceń jednorodność próbki, ładując 1-5 μg białka fuzyjnego na natywny żel PAGE²⁴. Uruchom żel 10% Native PAGE w temperaturze 4 °C przez 140 minut przy napięciu 175 V.
   1. Zobrazuj natywną PAGE za pomocą imagera wyposażonego w wizualizację fluorescencji, obserwując, gdzie migruje fuzja oznaczona mRuby w tym teście.
      UWAGA: Uważaj, aby obserwować białko fuzyjne, które utknęło w studzience, ponieważ białko to jest prawdopodobnie zagregowane. Jeśli imager fluorescencyjny nie jest dostępny, często można wizualizować i obrazować skoncentrowane próbki białka znakowanego Ruby w czarnym świetle lub w lampie UV.
2. Wykonaj ograniczoną proteolizę, aby zidentyfikować stabilnie pofałdowane domeny. Inkubować 95 μl fuzji Ruby-Shrm SD2 w temperaturze ~1 mg/ml z 5 μl 0,025% subtylizyny A.
   1. Pobrać próbkę reakcji w punktach czasowych 0, 0,5, 2, 5, 15, 60 i 120 min, usuwając 10 μl z reakcji dla każdego punktu czasowego i wizualizując postęp reakcji za pomocą SDS-PAGE przy użyciu 15% żelu akrylowego.
   2. Wybarwić Coomassie Blue jak w kroku 2.2.7 i ocenić, czy można zidentyfikować gatunek odporny na proteazę.
3. Zintegruj dane z wydajności oczyszczania, zachowania w natywnym PAGE i ograniczonej proteolizy na częściowo oczyszczonych białkach fuzyjnych mRuby2-Shroom w kompleksową ocenę ogólnego zachowania tych białek w roztworze.
   1. (Opcjonalnie) Jeśli dostępny jest odpowiedni test funkcjonalny, należy w tym momencie sprawdzić aktywność.

4. Produkcja wysokiej jakości kryształów domeny SD2 z grzybów

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w sekcji 4.1 są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że białko skorzystałoby na oczyszczeniu w innej temperaturze, zwykle 4 °C.

1. Wykorzystując narośla o objętości 50 ml jako przybliżone oszacowanie potencjału ekspresji i oczyszczania, wykonaj ekspresję mRuby2-Shroom SD2 na dużą skalę w celu uzyskania 5-20 mg całkowicie oczyszczonej próbki. Zazwyczaj 2 litry kultury zapewniają odpowiedni materiał wyjściowy. Po wzroście komórki osadu przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 min.
   1. Zawiesić osad z 2 l wzrostu w buforze do lizy, jak poprzednio, używając ~ 2 ml lizy na gram osadu zamrożonych komórek, jeśli do lizy używa się lizozymu. Alternatywnie, zawiesić ponownie przy ~ 8 ml/g granulatu, jeśli używasz homogenizatora lub prasy francuskiej. Osadzanie resztek komórkowych przez odwirowanie przy 30 000 x g przez 30 min.
   2. Frakcję rozpuszczalną z ppkt 4.1.1 związać partiami za pomocą 10 ml żywicy Ni-NTA. Wlać do odpowiedniej kolumny grawitacyjnej i pozwolić niezwiązanym białkom odpłynąć.
   3. Przemyć żywicę 3-5 razy 40 ml buforu do lizy, a następnie przepłukać buforem do lizy uzupełnionym do 1 M NaCl.
   4. Przemyć żywicę 40 ml buforu do lizy uzupełnionego 80 mM imidazolem.
   5. Eluować białko fuzyjne rubinowo-grzybowe za pomocą 40 ml buforu do lizy uzupełnionego do 1 M imidazolu. Ręcznie frakcjonować eluowane białko na frakcje o objętości 4-10 ml.
   6. Potwierdź frakcje zawierające białko fuzyjne Ruby-Shroom za pomocą 10% SDS-PAGE.
   7. Dializuj odpowiednie frakcje (zwykle frakcje 2-4) do 8% glicerolu, 250 mM NaCl, 15 mM imidazolu, 20 mM Tris pH8,0, 1 mM β-ME, za pomocą rurki do dializy MWCO 6-8 kDa. Dodać 1 mg proteazy TEV na każde 25-50 mg białka fuzyjnego. Dializować przez noc w temperaturze pokojowej, powoli mieszając.
   8. Powtórzyć etapy oczyszczania powinowactwa do niklu 4.1.2-4.1.6. Domena Shroom SD2 powinna teraz pozostać we frakcji niezwiązanej, podczas gdy His 10-mRuby2 pozostanie związana z żywicą i znajdzie się we frakcjach elucyjnych. Potwierdź to za pomocą 12% barwienia SDS-PAGE za pomocą Coomassie Blue.
   9. Frakcje zawierające domenę Shroom SD2 dializować na 8% glicerolu, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM bufor beta-merkaptoetanolu przez noc.
   10. Przeprowadzić chromatografię anionowymienną²⁵ przy użyciu FPLC i elucji z gradientem NaCl od 0,1-1,0 M NaCl. Analizuj ułamki za pomocą 12% SDS-PAGE.
   11. Używając koncentratora spinowego (MWCO 10 kDa lub więcej w zależności od badanego białka), zagęścić frakcje pików do ~ 0 mg / ml, a następnie przeprowadzić chromatografię wykluczania wielkości²⁶, analizując frakcje pików za pomocą 12% SDS-PAGE.
   12. Zebrać frakcje szczytowe i dializować do 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glicerolu, 1 mM β-ME i stężyć do 10 mg/ml przed krystalizacją.
       Fakultatywnie: Na tym etapie należy pobrać 5 μl próbek o stężeniach 1, 2, 5 i 10 mg/ml w trakcie zagęszczania próbki. Uruchom natywną STRONĘ, ładując 2-5 μl każdej próbki, aby przyjrzeć się zachowaniu próbki na tym etapie.
2. Przesiewaj niewielką liczbę 12 warunków, aby określić optymalne stężenie białka do prób krystalizacji. Skład tych warunków opisano na rysunku 7.
   1. Korzystając z 24-dołkowych tacek do krystalizacji z kroplami siedzącymi, należy przeprowadzić próby krystalizacji metodą dyfuzji parowej, pipetując 500 μl każdego z 12 warunków do oddzielnych studzienek, a następnie kropli, które początkowo zawierają 1 μl roztworu studzienki i 1 μl próbki białka na szkiełkach nakrywkowych. Więcej informacji na temat tej techniki można znaleźć w^{punkcie 27}.
   2. Szybko zamknij tackę przezroczystą taśmą i przenieś tackę do odpowiedniego środowiska o kontrolowanej temperaturze, które jest wolne od wibracji. Stosowana temperatura może się różnić, ale 4 °C, 16 °C i 20 °C są dość powszechne.
   3. Zbadaj krople w tackach przez następne 3 dni za pomocą mikroskopu przy powiększeniu do 100X. Pod koniec 3-dniowego okresu oceń każdą kroplę jako niezawierającą opadów (bezbarwny), lekkie opady, obfite opady (brązowy) lub kryształy. Odpowiednie stężenie białka powinno zawierać nie więcej niż 6 silnych opadów.
   4. Korzystając ze stężenia białka określonego w ppkt 4.2, należy przeprowadzić badania przesiewowe szerokiego zakresu dostępnych na rynku badań przesiewowych krystalizacji. Zastosowanie robota do obsługi cieczy lub krystalizacji znacznie przyspiesza ten proces, jednocześnie minimalizując błędy w kroplach. Wymaga również znacznie mniej białka, co pozwala użytkownikowi na badanie przesiewowe większej liczby warunków za pomocą jednej próbki.
   5. Popraw warunki początkowe zidentyfikowane na podstawie szerokich ekranów poprzez systematyczne zmienianie każdej ze zmiennych w kropli krystalizacji za pomocą 24-dołkowych tacek sitowych, tak jak poprzednio.

Results

Diagram przedstawiający przepływ pracy wykorzystywany w tym systemie jest pokazany na rysunku 1 i obejmuje trzy główne etapy. Analiza obliczeniowa sekwencji jest wykorzystywana do opracowania hipotez dotyczących granic domen białka zwiniętego zwoju. Przykład analizy domeny Shrm2 SD2 z adnotacjami przedstawiono na rysunku 2. Na tym diagramie celem było zidentyfikowanie możliwych granic domeny dla konserwatywnej domeny na C-końcu regulatora cytoszkieletu Sh...

Discussion

Opisany tutaj protokół ma na celu pomóc użytkownikowi zidentyfikować granice domen w dużych białkach o zwiniętej cewce, aby ułatwić ich krystalizację. Protokół opiera się na holistycznym włączeniu różnych danych z prognoz obliczeniowych i innych źródeł w celu wygenerowania szeregu potencjalnych granic domen. Po nich następuje zestaw eksperymentów biochemicznych, które są szybkie i niedrogie, i są wykorzystywane do dalszego udoskonalania tych początkowych hipotez. Korzystając z tego podejścia, użytkownik mógłby szybko wye...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21(DE3) Rosetta	Emd Millipore	70954-3
BL21(DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003
BL21(DE3) Codon Plus	Agilent Technologies	230245
Lysozyme	Spectrum Chemical Mfg Corp	L3008-5GM
Żywica Ni-NTA	Life Technologies	25216
SubtilisinA	Spectrum Chemical Mfg Corp	S1211-10ML
24-dołkowa płytka Cryschem Hampton	research	HR3-160
INTELLI-PLATE   96:	Art Robbins Instruments	102-0001-03
PEG 3350	Hampton research	HR2-591
PEG 8000	Hampton research	HR2-515
PEG 400	Hampton research	HR2-603
PEG 4000	Hampton research	HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2	Addgene	49089
Overnight Express Autoinduction System 1	Emd Millipore	71300
Lysogeny Bulion w proszku	ThermoFisher Scientific	12795027