Analiza kinematyczna podziału i ekspansji komórek: ilościowe określanie komórkowych podstaw wzrostu i pobieranie próbek stref rozwojowych w liściach Zea mays

Summary

Kwantyfikacja podziału i ekspansji komórek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia wzrostu całej rośliny. W tym miejscu przedstawiamy protokół obliczania parametrów komórkowych określających tempo wzrostu liści kukurydzy i podkreślamy wykorzystanie tych danych do badania molekularnych mechanizmów regulacji wzrostu poprzez kierowanie strategiami pobierania próbek specyficznymi dla danego etapu rozwoju.

Abstract

Analizy wzrostu są często używane w nauce o roślinach do badania kontrastujących genotypów i wpływu warunków środowiskowych. Aspekt komórkowy tych analiz ma kluczowe znaczenie, ponieważ wzrost jest napędzany przez podział i wydłużanie komórek. Analiza kinematyczna stanowi metodologię ilościowego określania tych dwóch procesów. Co więcej, technika ta jest łatwa w użyciu w niewyspecjalizowanych laboratoriach. W niniejszej pracy przedstawiono protokół przeprowadzania analizy kinematycznej w liściach kukurydzy jednoliściennej (Zea mays). Przedstawiono dwa aspekty: (1) kwantyfikację parametrów podziału i ekspansji komórek oraz (2) określenie lokalizacji stref rozwojowych. Może to służyć jako podstawa do projektowania próbek i/lub może być przydatne do interpretacji danych z pomiarów biochemicznych i molekularnych z wysoką rozdzielczością przestrzenną w strefie wzrostu liści. Strefa wzrostu liści kukurydzy jest zbierana w stanie ustalonym. Poszczególne liście są używane do oznaczania długości merystemów za pomocą barwienia DAPI, a profile długości komórek za pomocą mikroskopii DIC. Protokół jest odpowiedni dla pojawiających się liści jednoliściennych zbieranych w stanie ustalonym, ze strefami wzrostu rozciągającymi się na co najmniej kilka centymetrów. Aby lepiej zrozumieć regulację wzrostu roślin, należy połączyć dane dotyczące wzrostu i badania molekularne. Dlatego istotną zaletą analizy kinematycznej jest możliwość skorelowania zmian na poziomie molekularnym z dobrze zdefiniowanymi etapami rozwoju komórkowego. Co więcej, pozwala na bardziej skoncentrowane próbkowanie określonych etapów rozwoju, co jest przydatne w przypadku ograniczonego budżetu lub czasu.

Introduction

Analiza wzrostu zależy od zestawu narzędzi, które są powszechnie używane przez naukowców zajmujących się roślinami do opisywania różnic wzrostu determinowanych przez genotyp i/lub fenotypowych reakcji na czynniki środowiskowe. Obejmują one pomiary wielkości i masy całej rośliny lub narządu oraz obliczenia tempa wzrostu w celu zbadania podstawowych mechanizmów wzrostu. Wzrost narządów jest determinowany przez podział i ekspansję komórki na poziomie komórkowym. W związku z tym uwzględnienie kwantyfikacji tych dwóch procesów w analizach wzrostu jest kluczem do zrozumienia różnic we wzroście całych narządów¹. W związku z tym kluczowe jest posiadanie odpowiedniej metodologii określania parametrów wzrostu komórek, która jest stosunkowo łatwa do wykorzystania przez niewyspecjalizowane laboratoria.

Analiza kinematyczna została już uznana za podejście zapewniające potężne ramy dla rozwoju modeli wzrostu narządów². Technika została zoptymalizowana dla systemów liniowych, takich jak korzenie Arabidopsis thaliana i liście jednoliścienne, ale także dla systemów nieliniowych, takich jak liście dwuliścienne³. Obecnie metodologia ta jest coraz częściej stosowana do badania, w jaki sposób czynniki genetyczne, hormonalne, rozwojowe i środowiskowe wpływają na podział i ekspansję komórek w różnych narządach (tabela 1). Co więcej, zapewnia również ramy do powiązania procesów komórkowych z ich podstawowymi regulacjami biochemicznymi, molekularnymi i fizjologicznymi (Tabela 2), chociaż ograniczenia mogą być nałożone przez rozmiar narządów i organizację przestrzenną w przypadku technik, które wymagają większych ilości materiału roślinnego (np. pomiary metabolitów, proteomika itp.).

Liście jednoliścienne, takie jak liść kukurydzy (Zea mays), reprezentują systemy liniowe, w których komórki przemieszczają się od podstawy liścia w kierunku końca, kolejno przechodząc przez merystem i strefę wydłużenia, aby dotrzeć do strefy dojrzałej. To sprawia, że jest to idealny system modelowy do ilościowych badań przestrzennych wzorców wzrostu⁴. Ponadto liście kukurydzy mają duże strefy wzrostu (merystem i strefa wydłużenia o rozpiętości kilku centymetrów⁾ i dają możliwości badań na innych poziomach organizacyjnych. Pozwala to na badanie (przypuszczalnych) mechanizmów regulacyjnych kontrolujących podział i ekspansję komórek, określonych ilościowo za pomocą analizy kinematycznej za pomocą szeregu technik molekularnych, pomiarów fizjologicznych i podejść do biologii komórki (Tabela 2).

Tutaj udostępniamy protokół do przeprowadzania analizy kinematycznej w liściach jednoliściennych. W pierwszej kolejności wyjaśniamy, jak przeprowadzić prawidłową analizę zarówno podziału komórek, jak i wydłużenia komórek w funkcji położenia wzdłuż osi liścia oraz jak obliczyć parametry kinematyczne. Po drugie, pokazujemy również, w jaki sposób można to wykorzystać jako podstawę do projektowania próbek. W tym miejscu omówiono dwa przypadki: próbkowanie w wysokiej rozdzielczości i skoncentrowane próbkowanie, umożliwiające odpowiednio lepszą interpretację danych i oszczędność czasu i pieniędzy.

Tabela 1. Przegląd metod analiz kinematycznych do ilościowego oznaczania podziału i ekspansji komórek w różnych narządach.

organy	odniesienie
liście jednoliścienne	16, 20, 21, 22
Końcówki korzeni	2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
liście dwuliścienne	21, 30, 31
Strzelaj do merystema wierzchołkowego	Rozdział 32

Tabela 1. Przegląd metod analiz kinematycznych do ilościowego oznaczania podziału i ekspansji komórek w różnych narządach.

Tabela 2. Związek między procesami komórkowymi określonymi ilościowo za pomocą analizy kinematycznej a ich regulacją na poziomie molekularnym. Odniesienia do różnych badań łączących kwantyfikację procesów komórkowych z wynikami testów biochemicznych i molekularnych u różnych gatunków i narządów. Endoglukozylaza ksyloglukanu (XET), dialdehyd malonowy (MDA), kinazy zależne od cyklin (CDK). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

Protocol

UWAGA: Poniższy protokół analizy kinematycznej jest ważny tylko dla liści podczas wzrostu w stanie ustalonym. Oznacza to stabilne tempo wydłużania się liści oraz przestrzenne wzorce długości i ekspansji komórek w liściu przez okres kilku dni⁶.

1. Wzrost roślin i pomiary szybkości wydłużania liści (LER)

1. Wybierz liść w stanie ustalonym wzrostu i interesującym go etapie rozwoju.
   UWAGA: Istnieje różnica między wzrostem w stanie ustalonym a wzrostem powtarzalnym, co implikuje podobne wzorce przestrzenne na kolejnych liściach na tej samej osi. We wczesnych stadiach wzrostu siewek kolejne liście zazwyczaj rosną coraz szybciej ze względu na zwiększający się rozmiar strefy wzrostu⁷. Chociaż kilka wyższych pozycji liści może mieć podobny wzorzec wzrostu⁸, jest to faza przejściowa, na którą mogą mieć wpływ badane zabiegi. Dlatego ważne jest, aby porównywać linie i zabiegi ściśle na tej samej pozycji liści, nawet jeśli rozwijają się one w innym czasie. Nawet przy stałym tempie wydłużania profil tempa wzrostu niekoniecznie jest taki sam na różnych etapach rozwoju. Dlatego ważne jest, aby analizować liście w tym samym stadium rozwojowym⁸, zwykle definiowanym przez liczbę dni po wzejściu.
2. Aby przeprowadzić pełną analizę kinematyczną wzrostu liści u roślin jednoliściennych, należy wyhodować co najmniej 15 roślin dla każdego zabiegu i genotypu w kontrolowanych warunkach w pomieszczeniu wzrostowym.
3. W momencie pojawienia się interesującego nas liścia (wyłonienia się z okółka otaczających liści), zacznij codziennie mierzyć długość liścia linijką, aż liść zostanie w pełni rozwinięty (ryc. 1i). Długość liścia oznacza długość od poziomu gleby do czubka liścia. Uważaj, aby nie złamać ani nie uszkodzić liścia, ponieważ może to zmienić jego wzrost.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd analizy kinematycznej liści kukurydzy. Interesujący liść mierzy się linijką przez trzy kolejne dni, aby obliczyć współczynnik wydłużania liści (LER). Następnie liść jest zbierany, a trzycentymetrowy segment jest używany do określenia wielkości merystemu. Odbywa się to poprzez pomiar długości od podstawy do najbardziej dystalnej figury mitotycznej po barwieniu DAPI. (A) Przykłady proliferacyjnych figur mitotycznych i (B) kształtujących figur mitotycznych. Pierwsze jedenaście centymetrów od podstawy liścia po drugiej stronie nerwu środkowego służy do wycięcia dziesięciu jednocentymetrowych segmentów do pomiarów długości komórek. Pomiary te stanowią podstawę do stworzenia profilu długości komórki, który służy do określenia długości dojrzałej komórki (l_mat) oraz długości komórek opuszczających merystem (l_div). LER i l_mat służą do obliczania szybkości produkcji komórek (P), podczas gdy l_div i L_mer służą do obliczania liczby komórek w merystemie (N_mer). Z kolei P i N_mer służą do obliczenia średniego tempa podziału komórki (D), który jest odwrotnością czasu trwania cyklu komórkowego (T_c). Strzałki tego samego koloru wskazują parametry, które są używane do obliczania parametru następującego po tych strzałkach. Podziałka = 40 μm. Liczby rzymskie są używane w odniesieniu do konkretnych procedur eksperymentalnych opisanych w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Żniwa

1. W fazie rozwojowej będącej przedmiotem zainteresowania (np. w trzecim dniu po wzejściu) należy wybrać z partii co najmniej pięć reprezentatywnych roślin, na których zostanie przeprowadzona analiza kinematyczna. Kontynuuj pomiar pozostałych roślin, jak wyjaśniono w kroku 1.3, aby określić ostateczną długość liści.
2. Wytnij nadziemną część rośliny. Aby część merystematyczna pozostała nienaruszona, przytnij jak najbliżej korzeni (ryc. 1ii).
3. Zaczynając od zewnętrznych liści, usuń wszystkie liście, aż do interesującego Cię liścia, delikatnie rozwijając je jeden po drugim. W razie potrzeby usuń kilka dodatkowych milimetrów od podstawy, aby oderwać liście. Usuń również wierzchołek i małe liście otoczone interesującym Cię liściem (ryc. 1iii).
4. Wytnij 3-centymetrowy segment, zaczynając od podstawy po jednej stronie żyły środkowej, i przechowuj go w probówce o pojemności 1,5 ml wypełnionej absolutnym roztworem etanolu i kwasu octowego w proporcji 3:1 (v:v) (UWAGA: nosić rękawice) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny do kilku miesięcy (ryc. 1iv). Ten segment zostanie później wykorzystany do określenia długości merystemu.
5. Z drugiej strony żyły odciąć 11-centymetrowy odcinek od podstawy (rysunek 1 v) i umieścić go w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej absolutnym etanolem w temperaturze 4 °C na co najmniej 6 godzin w celu usunięcia pigmentów (rysunek 1 vi).
   UWAGA: Później użyj tylko pierwszych 10 cm, aby określić profil długości komórki (patrz Dyskusja).
6. Odnowić absolutny etanol do kolejnej rundy czyszczenia w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny (Rysunek 1vi).
7. Na koniec należy zastąpić absolutny etanol czystym kwasem mlekowym (UWAGA: nosić rękawice) w celu czyszczenia i przechowywania w temperaturze 4 °C przez 24 godziny lub do dalszego użycia (Rysunek 1vi).

3. Pomiary długości merystemów

1. Przygotować bufor płuczący zawierający 50 mM chlorku sodu (NaCl), 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; UWAGA: nosić rękawice) i 10 mM kwasu solnego tris(hydroksymetylo)aminometanowego (TRIS-HCl; pH 7).
2. Pobrać 3 cm segment z sekcji 2.4 i zanurzyć go w buforze na 20 minut (Rysunek 1vii).
3. Czekając, użyj buforu do płukania, aby przygotować roztwór barwiący 4',6-diamidyno-2-fenyloindolowy (DAPI) o stężeniu 1 μg/ml, trzymając go na lodzie i w ciemności.
4. Wybarwić jądra, umieszczając segment merystemu na 2-5 minut w roztworze barwiącym DAPI. Pracuj na lodzie i w ciemności (rysunek 1vii).
5. Sprawdź sygnał fluorescencji, szybko montując segment na szkle mikroskopowym i przykrywając go szkłem nakrywkowym. Komórki naskórka powinny wykazywać fluorescencję, podczas gdy leżące pod nimi warstwy komórkowe nie.
6. Jeśli barwienie nie jest wystarczające, umieść segment z powrotem w roztworze barwiącym DAPI na kilka dodatkowych minut.
7. Aby zatrzymać barwienie, zamontuj segmenty w kropli buforu do płukania na szkiełku mikroskopowym i przykryj szkłem nakrywkowym.
8. Użyj mikroskopu wyposażonego w fluorescencję UV przy 20-krotnym powiększeniu, co pozwala na wizualizację około 1000 komórek naskórka jednocześnie. Przewiń segment i poszukaj proliferacyjnych figur mitotycznych (metafaza, anafaza, telofaza i cytokineza), ale unikaj formacyjnego podziału komórek rozwijających się aparatów szparkowych (ryc. 1viii)⁹. Określ, gdzie znajduje się najbardziej dystalna figura mitotyczna.
9. Określ długość merystemu, mierząc odległość między podstawą liścia a najbardziej dystalną mitotyczną figurą naskórka. Użyj oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ), aby zmierzyć pełną długość klatki obrazu.
   1. Policz liczbę ramek, które pokrywają pełną długość merystemu (od podstawy liścia do najbardziej dystalnej figury mitotycznej) i pomnóż tę liczbę przez długość jednej ramki, aby uzyskać pełną długość merystemu (ryc. 1ix).

4. Profil długości komórki

1. Weź segment przechowywany w kwasie mlekowym (krok 2.5) i ostrożnie umieść go na ławce. Przetnij segmenty skalpelem na 10 segmentów po 1 cm każdy (Rysunek 1x).
2. Zamontuj kolejne segmenty liści na szkiełku mikroskopowym w małej kropli kwasu mlekowego. Upewnij się, że konsekwentnie jesteś zwrócony stroną adaksjalną lub aosijalną. W zasadzie nie ma preferencji dla konkretnej strony.
3. Użyj mikroskopu wyposażonego w optykę z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC), aby przeanalizować segmenty, zaczynając od podstawy liścia. Zmierz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu długość co najmniej 20 replikowanych komórek naskórka w plikach bezpośrednio przylegających do plików szparkowych, aby konsekwentnie wybierać ten sam typ komórek.
   1. Zrób to w równych odstępach wzdłuż każdego z segmentów (wystarczą 4 pozycje na segment) i upewnij się, że zapisałeś odpowiednią pozycję dla każdego pomiaru na całym skrzydle (Rysunek 1xi).
4. Określ średnią długość komórki na każdym mm wzdłuż osi liścia za pomocą lokalnej procedury wygładzania wielomianowego, zaimplementowanej w skrypcie R (Rysunek 1xii; Plik uzupełniający 1).
   UWAGA: Skrypt języka R udostępnia serię danych z rosnącym wygładzaniem. Wymagana ilość wygładzania jest nieco arbitralna i najlepiej powinna po prostu usunąć lokalny szum, ale nie wpływać na ogólną krzywą. Upewnij się, że używasz tej samej ilości wygładzania dla wszystkich próbek w jednym eksperymencie.
5. Uśrednij długość komórek w każdym miejscu między roślinami i oblicz błąd standardowy, aby utworzyć profil długości komórki wzdłuż osi liścia.

5. Obliczenia parametrów kinematycznych (patrz plik uzupełniający 2)

1. Obliczyć LER, biorąc pod uwagę zmianę długości liścia między dwoma kolejnymi punktami czasowymi (np. 24 godziny, jak w kroku 1.3) i dzieląc ją przez przedział czasu.
2. Obliczyć długość strefy wzrostu (L_gz) odpowiadającą położeniu dystalnemu od podstawy, w którym komórki osiągają 95% długości swoich dojrzałych komórek na wygładzonym profilu długości komórek.
   1. Dla każdej pozycji w wygładzonym profilu długości komórki należy przyjąć 95% średniej ze wszystkich długości komórek następujących po tej pozycji (rysunek 2).
   2. Porównaj wygładzone długości komórek (krok 4.4) z obliczoną długością komórki 95% w każdej pozycji. Zaczynając od podstawy liścia, strefa wzrostu kończy się w miejscu, w którym rzeczywista długość komórek jest równa 95% kolejnych długości komórek (ryc. 2; patrz dane uzupełniające 2).

Rysunek 2: Wyznaczanie końca strefy wzrostu. Merystem: W miejscu oznaczonym czerwoną gwiazdą rzeczywisty rozmiar komórki jest mniejszy niż 95% (czerwona przerywana linia) średniego rozmiaru komórki wszystkich komórek znajdujących się po tej pozycji (czerwona linia ciągła). Koniec strefy wzrostu (L_gz; oznaczony niebieską gwiazdą) znajduje się w miejscu, w którym 95% (przerywana niebieska linia) średniego rozmiaru komórki wszystkich komórek następujących po tej pozycji (ciągła niebieska linia) jest równe rzeczywistemu rozmiarowi komórki. Strefa podziału (D), strefa wydłużenia (E) i strefa dojrzałości (M). Przerywane strzałki wskazują zbieżność między rozmiarem lokalnym a 95% średniej wielkości nad dystalną częścią liścia podczas przemieszczania się z pozycji podstawowej do końca liścia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Obliczyć długość strefy wydłużenia (L_el) jako różnicę między długością strefy wzrostu (L_gz) a wielkością merystemu (L_mer; określoną w kroku 3).
4. Obliczyć długość dojrzałej komórki (_{l mat}) jako średnią długość komórki w strefie dojrzałej.
5. Podziel LER przez l_mat, aby uzyskać szybkość produkcji komórek (P).
6. Obliczyć liczbę komórek w strefie wydłużenia (N_el) jako różnicę między N_gz i N_mer. Liczba komórek w merystemie (N_mer) jest równa skumulowanej liczbie komórek znajdujących się w przedziałach odpowiadających merystemowi. Liczba komórek w strefie wzrostu (N_gz) jest równa skumulowanej liczbie komórek znajdujących się w przedziałach odpowiadających strefie wzrostu.
7. Oblicz średnią szybkość podziału komórek (D) jako P/N_mer. Czas trwania cyklu komórkowego (T_c) wynosi ln(2)/D.
8. Oblicz czas w strefie wydłużenia (T_el), dzieląc N_el przez P. Czas w strefie podziału jest równy logarytmowi₂(N_mer)*T_c. Długość komórek opuszczających merystem (l_div) jest równa długości komórki od wygładzonego profilu długości komórki na końcu merystemu.
9. Oblicz średnią szybkość rozszerzania się komórki (R_el) za pomocą następującego wzoru: ln(l_mat)-ln(l_div)]/T_el.

Results

Tutaj pokazujemy porównanie między roślinami dobrze nawodnionymi (kontrola, 54% zawartości wody w glebie, (SWC)) a roślinami narażonymi na warunki stresu suszy (susza, 34% SWC) pod względem wzrostu liści. Wszystkie rośliny uprawiano w komorze wzrostowej w kontrolowanych warunkach (16 godzin w dzień / 8 godzin w nocy, 25 °C / 18 °C w dzień / w nocy, 300-400 ^{μEm-2 sec-1} promieniowanie fotosyntetycznie aktywne (PAR). Warunki suszy ustalono poprzez wstrzymanie wody do mo...

Discussion

Pełna analiza kinematyczna liści kukurydzy umożliwia określenie komórkowych podstaw wzrostu liści i pozwala na zaprojektowanie skutecznych strategii pobierania próbek. Chociaż protokół jest stosunkowo prosty, zaleca się pewną ostrożność w następujących krytycznych krokach: (1) Ważne jest, aby oderwać młodsze, zamknięte liście (krok 2.3) bez uszkodzenia merystemu, ponieważ określenie długości merystemu (krok 3) wymaga obecności całego merystemu. Może być potrzebna wcześniejsza praktyka. (2) Wyznaczanie długości merystemat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doniczki	Dowolne	Używamy	doniczek o następujących wymiarach, ale mogą się różnić w zależności od zabiegu/badania: średnica dna: 11 cm, średnica otworu: 15 cm, wysokość: 12 cm. Uprawiamy jedną roślinę kukurydzy w doniczce.
Podłoże do sadzenia	Dowolne	Używamy	podłoża doniczkowego (Jiffy, Holandia), ale można użyć innych substratów, w zależności od zabiegu/badania.
Linijka		Dowolna Dowolna	Linijka przedłużająca, która obejmuje co najmniej 1,5 metra, jest potrzebna do zmierzenia końcowej długości liści roślin.
Nasiona	Dowolne		nasiona NA można zamówić u hodowcy.
Skalpel	dowolny		Skalpel jest używany podczas zbioru liści w celu oddzielenia interesującego liścia od otaczających go liści i zaraz po zbiorach do wycięcia odpowiedniej próbki do pomiaru długości komórek i długości merystemu.
Probówki Falcon 15 ml	Dowolne		Probówki Falcon o pojemności 15 ml służą do przechowywania próbek używanych do pomiarów długości komórek podczas oczyszczania próbki za pomocą bezwzględnego etanolu i kwasu mlekowego.
Probówki Eppendorfa	Dowolne	Dowolne	Probówki Eppendorfa służą do przechowywania próbek używanych do pomiaru długości merystemów w roztworze etanolu:kwasu octowego 3:1 (v:v).
Rękawice		Dowolne	rękawice lateksowe, które chronią przed odczynnikami.
Kwas octowy	Dowolna	Dowolna	UWAGA: Działa żrąco na metale, kategoria 1 Działanie na skórę, kategorie 1A,1B,1C Poważne uszkodzenie oczu, kategoria 1; Ciecze łatwopalne, kategorie 1,2,3
Alkohol etylowy	Dowolny	OSTRZEŻENIE	: Stwarza zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą (działanie drażniące), kontaktu z oczami (działanie drażniące), lub wdychania. Lekko niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą (przenikacz), spożycia
Kwas mlekowy  >98%	Dowolne	Dowolna	UWAGA: Działa żrąco na metale, kategoria 1 Działanie na skórę, kategorie 1A,1B,1C Poważne uszkodzenie oczu, kategoria 1
Chlorek sodu (NaCl)	Dowolna	Kwas
etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)		Dowolny OSTRZEŻENIE	: Toksyczność ostra (doustna, skórna, wziewna), kategoria 4 Działanie drażniące na skórę, kategoria 2 Działanie drażniące na oczy, kategoria 2 Działanie uczulające na skórę, kategoria 1 Działanie toksyczne na narządy docelowe – Jednorazowe narażenie, kategoria 3
Chlorowodorek tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl)	Dowolny		Ten materiał może działać drażniąco, należy unikać kontaktu z oczami i skórą. Wdychanie pyłu może działać drażniąco na drogi oddechowe.
Dichlorowodorek 4&-prime;,6-diamidyno-2′-fenyloindolu (DAPI)	Dowolna		przepuszczalna dla komórek fluorescencyjna sonda do wiązania rowków dla DNA. Działa drażniąco na skórę. Może powodować reakcję alergiczną skóry. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych.
Lód	Dowolny	NA	Roztwór DAPI musi być przechowywany na lodzie.
Mikroskop fluorescencyjny	AxioScope A1, Axiocam ICm1 firmy Zeiss lub inny		Do określenia długości merystemów można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego.
Szkiełko mikroskopowe	Dowolne
szkło nakrywkowe	Dowolna
pęseta	Dowolna		Pęseta jest potrzebna do rozłożenia zwijanego liścia kukurydzy zaraz po zbiorach w celu wycięcia odpowiedniej próbki do pomiaru długości komórek i długości merystemu.
Oprogramowanie do analizy obrazu	Axiovision (wydanie 4.8) firmy Zeiss	NA	Oprogramowanie można pobrać ze strony: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Można również użyć innego oprogramowania, takiego jak ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
Mikroskop wyposażony w DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 firmy Zeiss lub inny		Do pomiaru długości komórek można użyć dowolnego mikroskopu wyposażonego w różnicowy kontrast interferencyjny (DIC).
R oprogramowanie do analizy statystycznej	R Foundation for Statistical Computing	NA	Open source; Można pobrać ze strony https://www.r-project.org/
R SCRIPT	NA	NA Używamy	funkcji wygładzania jądra locpoly z pakietu Kern Smooth (Wand MP, Jones MC.  Wygładzanie jądra: Chapman & Hall/CRC (1995)). Skrypt jest dostępny dla komputerów Mac i Windows po zapytaniu u odpowiedniego autora.