Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

9.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54894

⸱

19 lutego 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Streszczenie

Systemy optogenetyczne wykorzystują genetycznie kodowane białka, które zmieniają konformację w odpowiedzi na określone długości fal światła, aby zmienić procesy komórkowe. Istnieje zapotrzebowanie na systemy hodowli i pomiarów, które obejmują zaprogramowane oświetlenie i stymulację systemów optogenetycznych. Przedstawiamy protokół budowy i użytkowania aparatu do ciągłej hodowli w celu oświetlenia komórek drobnoustrojów zaprogramowanymi dawkami światła oraz automatycznego pozyskiwania i analizy obrazów komórek w ściekach. Działanie tego aparatu jako chemostatu pozwala na ścisłą kontrolę tempa wzrostu i środowiska komórkowego. Ścieki z ciągłej hodowli komórkowej są regularnie pobierane, a komórki są obrazowane za pomocą mikroskopii wielokanałowej. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje w intensywności fluorescencji i morfologii komórkowej komórek pobranych ze ścieków hodowlanych są mierzone przez wiele dni bez udziału użytkownika. Wykazujemy użyteczność tego aparatu hodowlanego poprzez dynamiczną indukcję produkcji białek w szczepie Saccharomyces cerevisiae zmodyfikowanym za pomocą systemu optogenetycznego, który aktywuje transkrypcję.

Wprowadzenie

Systemy optogenetyczne wykorzystują światło do kontrolowania rosnącej listy procesów komórkowych, w tym ekspresji genów,1,2,3,4,5 lokalizacja białka,6 aktywność białka,6,7,8 Wiązanie białek,8,9,10 i degradacja białka. 11 Metoda hodowli komórek w kontrolowanym środowisku z zaprogramowaną stymulacją optyczną i mierzenia ich reakcji w biologicznie istotnych skalach czasowych jest niezbędna, aby wykorzystać potencjał tych narzędzi do badań w biologii komórki i biotechnologii. Nasza metoda wykorzystuje chemostazę do utrzymania stałego tempa wzrostu komórek w dobrze wymieszanym, napowietrzonym i kontrolowanym temperaturze szklanym naczyniu do hodowli12,13, które jest wystawione na zaprogramowane oświetlenie. Obrazujemy poszczególne komórki w ściekach z hodowli za pomocą odwróconego mikroskopu, aby zmierzyć reakcję kultury na zaprogramowane oświetlenie. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu intensywność fluorescencji i morfologia komórkowa hodowli komórek ściekowych mogą być mierzone przez wiele dni bez udziału użytkownika.

Ten protokół może być zaimplementowany w większości laboratoriów zaznajomionych z hodowlą komórek i mikroskopią, a używany aparat jest tani i wykonany z łatwo dostępnych komponentów. Przezroczyste naczynie do hodowli umieszcza się nad matrycą diod elektroluminescencyjnych (LED) zdolnych do emitowania 1 μW/cm,2-10 mW/cm2 światła. Mikroorganizmy są stale hodowane w naczyniu hodowlanym; Jedna pompa perystaltyczna służy do dodawania pożywki z szybkością rozcieńczenia, druga służy do pobierania kultury z mniejszą szybkością do mikroskopu, a różnica ucieka przez wylot przelewowy. Poduszka grzewcza utrzymuje temperaturę. Powietrze jest stale pompowane do naczynia hodowlanego w celu utrzymania dodatniego ciśnienia, a także wymieszania i napowietrzenia kultury. Z wyjątkiem pompy powietrza, zasilanie tych urządzeń jest regulowane przez mikrokontroler, który odbiera również dane wejściowe z termometru i podłączonego komputera stacjonarnego. Hodowla komórkowa w ściekach jest pompowana do urządzenia mikroprzepływowego na stoliku mikroskopu odwróconego. Obrazy niefluorescencyjne i fluorescencyjne są rejestrowane automatycznie. Komórki na obrazach są scharakteryzowane przez algorytm, który lokalizuje każdą komórkę jako obszar zainteresowania (ROI) i mierzy właściwości każdego ROI.

Aby zademonstrować zastosowanie tego protokołu, zmierzyliśmy reakcję na różne intensywności światła komórek Saccharomyces cerevisiae zaprojektowanych za pomocą reagującego na niebieskie światło systemu optogenetycznego, który kontroluje transkrypcję białka fluorescencyjnego. S. cerevisiae, powszechnie znane jako drożdże piekarskie, zostały wybrane, ponieważ istnieje już wiele systemów optogenetycznych do kontrolowania ekspresji genów w tym systemie14,15,16. Co więcej, ten organizm modelowy jest powszechnie używany do badań z zakresu biologii systemów17 oraz jako podwozie do zastosowań biotechnologicznych18,19,20. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że protokół ten może być używany do kontrolowania transkrypcji kultury przez wiele dni poprzez zmianę intensywności światła wejściowego i pomiar produkcji reportera fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Schemat systemu mikrofluidycznego: układ do hodowli, indukcji i pomiarów z pompami, diodą LED i mikrokontrolerem.

Rycina 1: Aparatura do hodowli ciągłej. Ten uproszczony schemat przedstawia sposób montażu aparatury używanej do hodowli, oświetlania i pomiaru właściwości optycznych drobnoustrojów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat blokowy bioreaktora; proces: konfiguracja sprzętu, napełnianie pożywką, szybkość rozcieńczania, akwizycja obrazów, analiza.
Rycina 2: Przegląd protokołu. Kroki w zacieniowanym obszarze muszą być powtarzane przy każdym zastosowaniu protokołu. Możliwe jest zastosowanie sterowania w pętli zamkniętej34, jednak nie zostało ono zaimplementowane w tym protokole.

1. Montaż termometru do płytki drukowanej

Schemat obwodu elektronicznego z Arduino i termometrem do pomiaru temperatury.
Rysunek 3: Połączenia do odczytu wartości z termometru. Ten schemat pokazuje, w jaki sposób termometr cyfrowy powinien zostać podłączony do płytki PCB, aby mikrokontroler mógł otrzymywać sygnały zwrotne niezbędne do kontroli temperatury hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Przylutuj linie masy (Ground), danych (Data) i dodatniego napięcia (positive Voltage) termometru cyfrowego do odpowiednich otworów przelotowych oznaczonych jako „G D +V”.
  2. Odetnij jeden pin z żeńskiej listwy 3-pinowej i przytnij pozostałe 2 piny obcinaczkami do drutu tak, aby pasowały do dwóch otworów przelotowych oznaczonych jako „R2” i nie blokowały mikrokontrolera. Przylutuj element na miejscu. Połącz dwa przylutowane piny, wkładając w listwę pinową rezystor 4,7 kΩ.

2. Podłączenie komponentów sterowania zasilaniem do płytki drukowanej

Schemat obwodu podkładki grzewczej opartej na Arduino z przekaźnikiem i zasilaczem.
Rycina 4: Połączenia służące do sterowania zasilaniem podkładki grzewczej. Niniejszy schemat przedstawia sposób montażu płytki PCB i elementów akcesoryjnych w celu sterowania zasilaniem podkładki grzewczej. Elementy do sterowania pompami perystaltycznymi są połączone w podobny sposób. Należy zauważyć, że w celu zwiększenia przejrzystości usunięto komponenty termometru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przytnij piny pięciu żeńskich listew 3-pinowych o 1 cm. Przylutuj je w miejscach na płytce drukowanej (PCB) oznaczonych jako „#1”, „#2”, „#3”, „#4” oraz „C B E”.
  2. Przytnij piny żeńskiej listwy 6-pinowej i 8-pinowej o 1 cm. Przylutuj je obok siebie do kolumny otworów przelotowych oznaczonych od K1 do K14.
  3. Podłącz matę grzejną do płytki drukowanej.
    1. Włóż końce rezystora 100 kΩ do otworów przelotowych oznaczonych jako K1 i K2 na PCB. Włóż tranzystor polowy z izolowaną bramką (MOSFET) w miejsce oznaczone jako #1 na PCB, tak aby etykieta MOSFET była skierowana w stronę otworów przelotowych K1–K14, pin źródła (source) znajdował się najbliżej etykiety „#”, a pin drenu (drain) najdalej od etykiety „#”.
    2. Przetnij linię masy kabla zasilacza prądu stałego (DC) 5 V i podłącz ją do J2. Podłącz linię masy maty grzejnej do J1. Połącz K3 z pinem 3 za pomocą rezystora 1 kΩ. Prąd powinien teraz płynąć z J1 do J2 tylko wtedy, gdy na pinie 3 ustawione zostanie napięcie +5 V.
      UWAGA: Zestaw rezystor/MOSFET pełni funkcję przełącznika, który umożliwia przepływ prądu z pinu J1 do J2, gdy na pinie 3 mikrokontrolera ustawione jest napięcie +5 V.
  4. Podłącz wolną pompę perystaltyczną.
    1. Włóż końce rezystora 100 kΩ do otworów przelotowych oznaczonych jako K4 i K5 na PCB. Włóż MOSFET w miejsce oznaczone jako #2 na PCB, tak aby etykieta MOSFET była skierowana w stronę otworów przelotowych K1–K14, pin źródła znajdował się najbliżej etykiety „#”, a pin drenu najdalej od etykiety „#”.
    2. Przetnij linię masy kabla zasilacza 12 V DC wolnej pompy perystaltycznej. Podłącz koniec skierowany w stronę pompy perystaltycznej do J3, a koniec skierowany w stronę zasilacza sieciowego do J4. Połącz K6 z pinem 4 za pomocą rezystora 1 kΩ. Prąd powinien teraz płynąć z J3 do J4 tylko wtedy, gdy na pinie 4 ustawione zostanie napięcie +5 V.
  5. Podłącz szybką pompę perystaltyczną
    1. Włóż końce rezystora 100 kΩ do otworów przelotowych oznaczonych jako K7 i K9 na PCB. Włóż MOSFET w miejsce oznaczone jako #3 na PCB, tak aby etykieta MOSFET była skierowana w stronę otworów przelotowych K1–K14, pin źródła znajdował się najbliżej etykiety „#”, a pin drenu najdalej od etykiety „#”.
    2. Przetnij linię masy kabla zasilacza 12 V DC szybkiej pompy perystaltycznej. Podłącz koniec skierowany w stronę pompy perystaltycznej do J5, a koniec skierowany w stronę zasilacza sieciowego do J6. Połącz K9 z pinem 5 za pomocą rezystora 1 kΩ. Prąd powinien teraz płynąć z J5 do J6 tylko wtedy, gdy na pinie 5 ustawione zostanie napięcie +5 V.

3. Podłączenie macierzy LED do płytki drukowanej

Schemat konfiguracji mikrokontrolera i płytki drukowanej; połączenia przewodowe dla prototypowania elektroniki.
Rysunek 5: Połączenia do sterowania macierzą LED. Ten schemat przedstawia sposób podłączenia macierzy LED do PCB. Pokazuje on również, że PCB może zostać nałożona na mikrokontroler. Należy zauważyć, że komponenty termometru oraz układ sterowania zasilaniem DC dla innych urządzeń zostały usunięte dla przejrzystości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przylutuj 6-pinowe, 10-pinowe oraz dwa 8-pinowe żeńskie złącza pinowe do otworów przelotowych po bokach PCB w taki sposób, aby płytka mogła zostać ułożona na mikrokontrolerze.
  2. Przylutuj kondensatory 100 nF i 10 µF w wyznaczonych miejscach na PCB, pamiętając, że terminal ujemny kondensatora 10 µF (krótszy wyprowadzenie) powinien być podłączony do otworu przelotowego oznaczonego znakiem minus.
  3. Przylutuj sterownik LED do zestawu otworów przelotowych 2 na 12, tak aby wcięcie na sterowniku znajdowało się z dala od otworów przelotowych zarezerwowanych dla macierzy LED.
  4. Przylutuj 2 kolumny męskich złączy pinowych do otworów przelotowych przeznaczonych dla macierzy LED i przytnij ich końce pod płytką stykową w taki sposób, aby nie blokowały mikrokontrolera. Połącz je z dwoma 8-żyłowymi taśmami przewodów połączeniowych żeńsko-żeńskich. Drugi zestaw męskich złączy pinowych podłącz do drugiego końca przewodów połączeniowych.
  5. Umieść macierz LED na środku płytki stykowej, a następnie włóż drugi zestaw złączy pinowych w kolumny po obu stronach macierzy. Upewnij się, że połączenia elektryczne są identyczne jak w przypadku bezpośredniego połączenia macierzy LED z PCB, przy czym oznaczona strona macierzy musi odpowiadać oznaczonej kolumnie otworów przelotowych.
  6. Odetnij jeden pin z żeńskiego złącza 3-pinowego i przytnij pozostałe 2 piny obcinaczkami do drutu, tak aby pasowały do dwóch otworów przelotowych oznaczonych jako „R1” i nie blokowały mikrokontrolera. Przylutuj złącze. Połącz dwa przylutowane piny, wkładając rezystor 1 kΩ w złącze pinowe.
    Uwaga: Naczynie hodowlane zostanie umieszczone nad macierzą LED. Jeśli taśmy przewodów blokują naczynie, przesuń je w bok względem macierzy. Następnie użyj drutu jednordzeniowego, aby zmostkować przerwę między pinami macierzy a pinami taśmy przewodów, tak aby połączenia elektryczne nie uległy zmianie.

4. Instalacja oprogramowania i połączenie z urządzeniem

  1. Nałóż płytkę PCB na mikrokontroler.
  2. Korzystając z linków w liście materiałów, pobierz zintegrowane środowisko programistyczne (IDE) oraz dedykowany kod dla mikrokontrolera.
  3. Podłącz mikrokontroler do komputera sterującego mikroskopem za pomocą uniwersalnego kabla seryjnego (USB) typu A-B. Skompiluj i wgraj dedykowany kod do mikrokontrolera.
  4. Pobierz program Micro-Manager21,22 oraz FIJI23. Skonfiguruj Micro-Manager jako wtyczkę FIJI, kopiując wszystkie pliki ".dll", katalog "mmplugins" oraz katalog "mmautofocus" z folderu, w którym pobrano Micro-Manager, do katalogu "Fiji.app". Skopiuj również katalog "plugins/Micro-Manager" do katalogu "Fiji.app/plugins".
  5. Pobierz plik "BioreactorController.jar" do katalogu "Fiji.app/mmplugins".
  6. Uruchom Micro-Manager z menu FIJI> Plugins> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Użyj Kreatora Konfiguracji Sprzętu (Hardware Configuration Wizard), aby skonfigurować oprogramowanie do sterowania mikroskopem. W Kreatorze dodaj urządzenie "FreeSerialPort", wskazując port, do którego podłączono kabel USB A-B.

5. Wykonanie i charakterystyka osłony światłoszczelnej dla naczynia hodowlanego

  1. Ułóż trzy 8-pinowe gniazda układów scalonych w stosy na płytce stykowej w każdym rogu macierzy LED w taki sposób, aby naczynie hodowlane mogło spoczywać na nich nad macierzą.
  2. Przymocuj fragment papieru dyfuzyjnego pod górną warstwą gniazd, tak aby światło z macierzy LED padające na naczynie hodowlane było rozproszone.
  3. Wytnij trzy fragmenty czarnej pianki o wymiarach 8" na 6". Z dwóch pierwszych wytnij otwór o wielkości płytki stykowej (2,3" x 3,5"), a z trzeciego otwór o wielkości prostokąta utworzonego przez gniazda układów scalonych (0,9" x 1,8"). Ułóż te warstwy nad macierzą LED w taki sposób, aby ostatnia warstwa z otworem 0,9" x 1,8" znajdowała się na poziomie górnej krawędzi gniazd i otaczała macierz LED.
  4. Przetnij dodatkowy arkusz czarnej pianki na pół, aby uzyskać prostokąt o wymiarach 6" na 24". Zwiń go w pustą kolumnę z czarnej pianki, w której zmieści się naczynie hodowlane wraz z przewodami i kablami, tak aby zapewniała ona izolację termiczną i optyczną naczynia hodowlanego.
  5. Wycentruj pustą kolumnę z czarnej pianki nad macierzą LED i zaznacz obrys kolumny na warstwie czarnej pianki znajdującej się pod nią. Granica ta będzie służyć do późniejszego centrowania.
  6. Wytnij fragment czarnej pianki o wymiarach 3" x 3". Wykorzystaj go później jako pokrywę, którą można przykleić taśmą do góry kolumny, aby zablokować światło zewnętrzne.
  7. Przymocuj czujnik mocy z fotodiodą do zakrętki naczynia hodowlanego za pomocą taśmy, zakręć naczynie i włóż je do obudowy.
  8. W programie Micro-Manager przejdź do Plugins> Bioreactor Controller. Ustaw macierz tak, aby świeciła z podzbiorem możliwych intensywności w odstępach 30 s.
  9. Zapisz wartości intensywności światła wyświetlane na konsoli watomierza podłączonego do czujnika mocy. Pomiary te pozwolą określić rzeczywistą intensywność światła dla ustawionej liczby zapalonych diod LED oraz prądu sterowanego modulacją szerokości impulsu (PWM) podawanego do tych diod.

6. Przygotowanie naczynia hodowlanego

Schemat konfiguracji bioreaktora, połączenia rurek silikonowych, transfer pożywki i przepływ w naczyniu hodowlanym.
Rycina 6: Połączenia naczynia. Schemat ten przedstawia sposób połączenia naczynia i rurek aparatury przed poddaniem ich autoklawowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zaznacz wysokość odpowiadającą każdemu przyrostowi 2 mL cieczy w zakresie od 10 mL do 30 mL w naczyniu hodowlanym. Wlej 10 mL sterylnej wody dejonizowanej, zaznacz poziom wody, dodaj 2 mL, zaznacz poziom wody i powtarzaj czynność, aż do zaznaczenia poziomu 30 mL. Zaklej oznaczenia przezroczystą taśmą, aby nie zostały łatwo usunięte, a następnie wylej ciecz.
  2. Wprowadź długi koniec aluminiowego portu przez uszczelkę silikonową do naczynia hodowlanego. Przykręć nakrętkę.
  3. Zabezpiecz jedno krótkie wyjście portu aluminiowego rurką silikonową o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16". Zamknij koniec dystalny, wkładając żeński konektor Luer lock, a następnie podłączając korek z męskim konektorem Luer. Wyjście to jest dodatkowe i nie będzie używane (rurka 6 na Rysunku 6).
  4. Połącz dwa krótkie odcinki rurki silikonowej o ID 1/16" za pomocą męskich i żeńskich konektorów Luer lock. Jeden koniec podłącz do krótkiego wyjścia portu aluminiowego, a koniec dystalny zamknij korkiem z męskiego i żeńskiego konektora Luer. Przez tę rurkę zostanie wykonana inokulacja naczynia (rurka 7/7.1 na Rysunku 6).
  5. Podłącz dwie rurki o ID 1/16" do końców rurki perystaltycznej o ID 1/16" i złączy. Jeden koniec podłącz do krótkiego portu aluminiowego, a drugi zamknij (rurka 4 na Rysunku 6). Później zostanie on połączony z kolbą z pożywką.

7. Przygotowanie kolby z pożywką

  1. Podłącz silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16" do najdłuższego portu aluminiowego. Rurka powinna być wystarczająco długa, aby sięgać do kolby z pożywką. Połącz męski konektor Luer lock 1/8" ID z krótkim odcinkiem rurki 1/16" ID, podłącz go do poprzedniej rurki, a następnie wprowadź ten krótki odcinek do gumowego korka w kolbie z pożywką (rurka 3 na Rysunku 6).
  2. Zaciśnij rurkę zaciskiem. Połączenie to umożliwia przepływ powietrza z kolby z pożywką do naczynia hodowlanego. Gdy później do kolby z pożywką będzie pompowane powietrze, a rurka zostanie odciśnięta, hodowla zostanie wymieszana, napowietrzona i utrzymana pod dodatnim ciśnieniem dzięki dopływającym pęcherzykom.
  3. Wprowadź do korka rurkę 1/16" ID o długości wystarczającej do sięgnięcia dna kolby, przez którą będzie transferowana pożywka. Podłącz do niej kolejną rurkę 1/16" ID, a następnie do niej rurkę 3/16" ID. Zamknij ją za pomocą żeńskiego konektora Luer lock 3/16" ID i korka z męskim konektorem Luer lock (rurka 1/1.1 na Rysunku 6).
  4. Trzeci otwór w korku należy wypełnić krótkim odcinkiem rurki 1/16" ID, połączonym z dwoma innymi odcinkami rurek o średniej średnicy i zamkniętym na końcu dystalnym (rurka 2/2.1 na Rysunku 6). Zostanie ona podłączona do pompy próżniowej, a później do pompy akwariowej.
    UWAGA: Jeśli rurki nie dają się łatwo przeprowadzić przez otwory w gumowym korku, należy uciąć ich końce pod skosem. Wtedy ścięty koniec wprowadzony przez otwór może posłużyć do przeciągnięcia pozostałej części rurki.

8. Przygotowanie kolby z odciekiem

  1. Włóż męski konektor Luer-Lock do odcinka silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16", a następnie mocno wsuń rurkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy wewnętrznej (ID) 0,022". Oddzielnie przymocuj żeński konektor Luer-Lock do rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16". Następnie przeciągnij jeden koniec wzdłuż rurki PTFE, aby połączyć konektory, a drugi do krótkiego aluminiowego portu (rurka 5 na Rysunku 6).
  2. Połącz odsłoniętą silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej (ID) 1/50" z rurką perystaltyczną o średnicy wewnętrznej (ID) 1/50" oraz z łącznikami. Do tego elementu podłącz naprzemiennie trzy odcinki rurek o średnicy wewnętrznej (ID) 1/50" i dwa odcinki rurek PTFE o średnicy wewnętrznej (ID) 0,022". Połącz ten układ z kolbą z odpływem za pomocą rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16" (rurka 5 na Rysunku 6).
  3. Połącz jeden koniec silikonowej rurki o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16" z drugą najdłuższą rurką portu aluminiowego, a drugi koniec z kolbą z odpływem. Ta aluminiowa rurka wyznacza objętość hodowli, a nadmiar hodowli przelewa się do pojemnika z odpływem (rurka 8 na Rysunku 6).
  4. Zautoklawuj zestaw do hodowli w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 15 psi (ogólna sterylizacja) przez 30 min.
    Uwaga: Rurki, przez które napełniana jest kolba z pożywką, przez które pożywka jest odsysana próżniowo oraz przez które zaszczepiane jest naczynie hodowlane, składają się z wielu segmentów rurek, tak aby w przypadku zanieczyszczenia segmentu dystalnego można go było usunąć, odsłaniając segment sterylny.

9. Przygotowanie kanału mikrofluidycznego

  1. Wymieszać polidimetylosiloksan (PDMS) z utwardzaczem w stosunku 9:1. Odgazować i wylać na krzemową formę matrycową.
  2. Utwardzać PDMS przez 2 h w temperaturze 65 °C, a następnie odciąć go od maski za pomocą żyletki. Przecinać wokół PDMS, aż oddzieli się on od formy. Należy unikać naciskania i uszkadzania delikatnego wafla.
  3. Użyć wycinaka do biopsji o średnicy wewnętrznej 1,2 mm, aby wykonać otwory na obu końcach kanału.
  4. Połączyć PDMS ze szkłem kryjącym za pomocą wiązania plazmowego24.
  5. Przymocować taśmą długie końce szkła kryjącego do wspierającej aluminiowej ramy w taki sposób, aby kanał PDMS znajdował się w centrum ramy, a następnie ponownie wygrzać PDMS przez 2 h w temperaturze 65 °C.

10. Napełnianie kolby z pożywką

Schemat procesu filtracji próżniowej z przenoszeniem pożywki z kolby 100 ml do kolby 2 L za pomocą naczynia hodowlanego.
Rycina 7: Dodawanie pożywki. Ten schemat przedstawia sposób filtracji próżniowej pożywki do kolby z pożywką. Zapewnia to zachowanie sterylności pożywki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Przygotować odpowiednią pożywkę. Jeśli system hodowli ciągłej będzie prowadzony jako chemostat, należy użyć pożywki ograniczonej pod względem konkretnego składnika odżywczego.
    UWAGA: Przykłady standardowego składu pożywek dla badań nad S. cerevisiae zostały opublikowane wcześniej25,26,27,28,29.
  2. Przymocować filtr próżniowy do butelki o pojemności 100 ml, zdjąć osłonkę króćca, a następnie za pomocą sterylnej pęsety usunąć biały korek z króćca filtra próżniowego.
  3. Podłączyć silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 3/16" do króćca, a drugą wolną rurkę kolby z pożywką do pompy próżniowej (odpowiednio rurki 1 i 2 na Rysunku 7) i upewnić się, że rurka łącząca kolbę z pożywką z naczyniem hodowlanym jest zakleszczona (rurka 3 na Rysunku 7).
  4. Napełnić filtr pożywką, włączyć pompę próżniową, a następnie przefiltrować resztę pożywki. Zakleszczyć silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 1/16" podłączoną do próżni (rurka 2 na Rysunku 7) i wyłączyć pompę próżniową.
  5. Zdjąć złączki Luer z pośredniego segmentu rurki o średnicy wewnętrznej 1/16" podłączonej do pompy próżniowej, aby uzyskać dostęp do nieskażonego końca rurki. Wsunąć niebieski koniec sterylnego filtra powietrznego do strzykawki do tej rurki.
  6. Zakleszczyć silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 3/16" (rurka 1 na Rysunku 7) i odłączyć od niej złączkę Luer męską. Odłączyć korek ze złączki Luer żeńskiej rurki wlotowej pożywki naczynia hodowlanego. Połączyć te złączki Luer męską i żeńską, aby umożliwić pompowanie pożywki do naczynia hodowlanego.
  7. Zdjąć filtr próżniowy i zakapslować butelkę z pożywką o pojemności 100 mL, która była przymocowana do filtra próżniowego.
  8. Na dzień przed inokulacją naczynia hodowlanego, zaszczepić pojedynczą kolonię mikroba optogenetycznego w probówce z 4 mL pożywki zebranej w poprzednim kroku i pozostawić do wzrostu przez noc w temperaturze 30 °C lub optymalnej temperaturze wzrostu danej kultury, z wytrząsaniem.

11. Montaż aparatury wokół mikroskopu

  1. Ustaw zestaw do ciągłego hodowania w pobliżu mikroskopu, umieszczając kolbę z pożywką powyżej naczynia hodowlanego, a kolbę z effluentem poniżej naczynia hodowlanego, tak aby rurka złożona z segmentów rurek PTFE o średnicy wewnętrznej 0.022" (rurka 5 na Rysunku 6) mogła sięgnąć stolika mikroskopu. Mocno przyklej taśmą korki gumowe w kolbie z pożywką i pojemniku na effluent.
  2. Odłącz końce rurek PTFE o średnicy wewnętrznej 0.022" od łączącej je rurki silikonowej o średnicy wewnętrznej 1/50" (rurka 5 na Rysunku 6), a następnie wsuń te końce do wlotu i wylotu urządzenia mikroprzepływowego.
  3. Podłącz biały koniec filtra powietrza strzykawkowego do pompy akwariowej. Ciśnienie powietrza będzie tłoczyć pożywkę do naczynia hodowlanego.
  4. Gdy pożywka osiągnie poziom portu wylotowego, owiń rurkę wlotową z pożywką o średnicy wewnętrznej 1/16" wraz ze złączkami wokół wolnej pompy perystaltycznej (rurka 4 na Rysunku 6), a rurkę wylotową dla próbek o średnicy wewnętrznej 1/50" wraz ze złączkami wokół szybkiej pompy perystaltycznej (rurka 5 na Rysunku 6).
  5. Napowietrz pożywkę, odpinając zacisk rurki powietrznej między kolbą z pożywką a naczyniem hodowlanym.
  6. Przyklej taśmą matę grzewczą i termometr do naczynia hodowlanego, aby można było kontrolować jego temperaturę. Zwiń rurkę z pożywką wokół naczynia hodowlanego, aby wpływająca pożywka miała taką samą temperaturę jak naczynie.
    UWAGA: Prąd PWM doprowadzany do maty grzewczej jest regulowany przez mikrokontroler, który wykorzystuje dane z termometru, aby utrzymać naczynie hodowlane w zadanej temperaturze.
  7. Wsuń naczynie hodowlane do czarnej piankowej obudowy nad matrycę LED i upewnij się, że rurki nie są przyciśnięte.
  8. W programie Micro-Manager przejdź do Plugins> Bioreactor Controller. Ustaw pole „Media pump ratio on” na 0.1, a pole „Sample pump ratio on” na 0. Szybkość przepływu będzie bardzo niska, ale wyższa niż tempo parowania.
  9. Zaciśnij rurkę doprowadzającą powietrze między kolbą z pożywką a naczyniem hodowlanym. Wyjmij zatyczkę z rurki do inokulacji (rurka 7 na Rysunku 6) i zaszczep naczynie hodowlane 1 mL kultury startowej za pomocą pipety serologicznej. Zaciśnij i zatkaj dalszy koniec tej rurki, aby zapobiec dostaniu się zanieczyszczeń do naczynia hodowlanego, a następnie odepnij zacisk rurki doprowadzającej powietrze.
  10. Przykryj obudowę tak, aby nie wpadało do niej światło, i pozostaw kulturę do wzrostu przez noc.

12. Kalibracja szybkości pompowania

  1. W programie Micro-Manager przejdź do sekcji Plugins> Sterownik bioreaktora. W polu „Media pump ratio on” ustaw wartość 0,5, a w polu „Sample pump ratio on” wartość 0.
  2. Odłącz rurkę przelewową od kolby z odciekiem (rurka 8 w Rysunek 6) oraz rurkę pobierającą z kolby z odciekiem (rurka 8 w Rysunek 6) i zbierać odciek do oddzielnych naczyń. Odciek należy zbierać przez 1 h, rozpoczynając po 15 min od uruchomienia pomp.
  3. Oblicz prędkość przepływu pożywki do naczynia hodowlanego na podstawie objętości zebranej w naczyniu według wzoru:
    wzór na szybkość przepływu medium, odpływ w czasie, równanie procesu chromatografii, schemat edukacyjny
  4. Dostosuj wartość w polu „Media pump ratio on” zgodnie z poniższą estymacją liniową:
    Równanie ilustrujące stosunek pomp mediów; stosunek prędkości przepływu; zwięzły wzór chemiczny.
    gdzie
    Równanie dla pożądanej szybkości przepływu pożywki; pożądana szybkość rozcieńczania w stosunku do objętości naczynia hodowlanego; formuła.
  5. Powtarzaj tę procedurę kalibracji do momentu, aż różnica między żądanym a zmierzonym natężeniem przepływu wyniesie < 0,2 ml/h, gdzie szybkość przepływu jest wartością uśrednioną w okresie 1 h.
  6. Zwiększ wartość w polu „sample ratio on” i kalibruj go w podobny sposób, aż osiągnie ona około 4/5.th pompa do pobierania próbek wypompowuje ciecz z naczynia hodowlanego, usuwając około 1/5 objętościth część objętości wypływa przez otwór przelewowy.
  7. Pozostawić kulturę w aparaturze do hodowli ciągłej w celu wyrównania gęstości w tych warunkach przez noc.
    UWAGA: Jeśli nie można osiągnąć docelowych szybkości przepływu, należy wymienić dren pompy perystaltycznej. Płyn jest pompowany z większą szybkością przy zastosowaniu drenu o większej średnicy. Należy wykonać krok 14, a następnie powrócić do kroku 8.4.

13. Pozyskiwanie obrazów mikroskopowych hodowli drobnoustrojów

  1. Wypełnij listę pozycji stolika (Stage Position List) w programie Micro-Manager zestawem niezachodzących na siebie pozycji, w których obrazy komórek wpompowanych do kanału mikrofluidycznego będą znajdować się w płaszczyźnie ogniskowania.
  2. Otwórz wtyczkę „Bioreactor Controller”. Z dostępnych opcji wybierz pożądany przebieg czasowy macierzy LED, kanały obrazowania oraz inne ustawienia eksperymentalne. Pozyskaj i przeanalizuj obrazy.
  3. W trakcie trwania eksperymentu upewnij się, że pożywka w kolbie pozostaje klarowna. Jeśli jest mętna, oznacza to, że doszło do kontaminacji.

14. Po zakończeniu eksperymentu

  1. Zutylizować pożywkę, nadmiar hodowli komórkowej oraz effluent.
  2. Napełnić kolbę z pożywką 200 mL 20% EtOH zmieszanego z wodą dejonizowaną. Uruchomić chemostat w takich samych warunkach, w jakich pracował podczas eksperymentu, aby wypłukać resztki komórkowe i pożywkę.
  3. Po całkowitym spłynięciu roztworu alkoholu z kolby z pożywką, całkowicie zdemontować chemostat.
  4. Umyć szkło laboratoryjne i rurki w ciepłej wodzie z łagodnym detergentem, a następnie dokładnie opłukać wodą dejonizowaną. Pozostawić do wyschnięcia.
  5. Otworzyć plik „microcontrollerRecords.csv”, aby przejrzeć status temperatury i matrycy LED w trakcie eksperymentu, plik „Summary.csv”, aby przejrzeć dane podsumowujące z każdego zestawu obrazów oraz pliki „Results.csv”, aby przejrzeć dane podsumowujące każdy ROI z każdego przedziału czasowego, gdzie n oznacza nty zestaw danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aparaturę tę wykorzystano do stymulacji hodowli S. cerevisiae wykazującej ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w odpowiedzi na światło niebieskie za pomocą indukowalnego optogenetycznego systemu transkrypcyjnego opartego na parze białek CRY2/CIB130. Komórki hodowano chemostatycznie w pożywce z ograniczoną zawartością fosforanów przy średnim współczynniku rozcieńczenia 0,2 ± 0,008. Ograniczenie fosforanów jest powszechnie stosowane w eksperyment...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaprojektowaliśmy to urządzenie z myślą o elastyczności. Cały użyty kod jest darmowy i open-source. Domyślny proces analizy obrazu w celu segmentacji komórek jest prosty i przebiega szybko. Analizę niestandardową można zaimplementować, rejestrując dane wejściowe użytkownika podczas analizowania reprezentatywnego obrazu za pomocą graficznego interfejsu użytkownika FIJI, konwertując dane wejściowe na skrypt beanshell, a następnie ustawiając wtyczkę tak, aby wywoływała skrypt. Po wywołaniu skryptowi temu zostanie wysłana ta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Molly Lazar i Verónice Delgado za pomoc w testowaniu protokołu, Kieranowi Sweeneyowi za pomocne dyskusje i redakcję, oraz Taylor Scott, My An-adirekkun i Stephanie Geller za krytyczną lekturę rękopisu. Megan Nicole McClean, Ph.D. otrzymała nagrodę Career Award w Scientific Interface przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obszerny podręcznik laboratoryjnyGitHubNAObszerny, regularnie aktualizowany podręcznik laboratoryjny jest dostępny w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Obejmuje to również opis formy mikroprzepływowej użytej do wygenerowania reprezentatywnych wyników.
Fritzing Design ViewerFritzingNADarmowe oprogramowanie typu open source do przeglądania i edycji projektów płytek drukowanych typu .fzz jest dostępne pod adresem "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - zmontowany)Mikrokontroler Adafruit50. 1 wymagane.
Zestaw nagłówków Arduino StackableSparkFun Electronics10007Żeńskie złącza pinowe do podłączenia płytki drukowanej do mikrokontrolera. 1 wymagane.
Lutownica regulowana 30W 110V - XY-258 110VAdafruit180Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką PCB. Wymagane 1.
Podstawka pod lutownicęAdafruit150Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką drukowaną. Wymagane 1.
Mini szpula lutownicza - 60/40 ołowiowa kalafonia do 0,031" średnica - 100gAdafruit145Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką drukowaną. 1 wymagane.
0,1 μ Kondensator FSparkFun ElectronicsCOM-08375Stabilizuje napięcie na płytce drukowanej. Wymagane 1.
10 μ Kondensator FSparkFun ElectronicsCOM-00523Stabilizuje napięcie na płytce drukowanej.
MAX7219CNG Sterownik wyświetlacza LED Matrix/Digit - sterownik LED MAX7219MaximMAX7219CNG. Wymagane 1.
Wymagane 8-pinowe gniazdo ICMouser Electronics575-14430816. Zostaną one ułożone jeden na drugim, aby podeprzeć naczynie hodowlane nad matrycą LED.
24-pinowe gniazdo ICMouser Electronics535-24-3518-10Opcjonalnie. Użyj tego, aby odwracalnie podłączyć sterownik MAXIM 7219CNG do płytki drukowanej.
Multimetr cyfrowyAdafruit2034Do rozwiązywania problemów z elektroniką. Wymagane 1.
Złącza header typu break away - 40-pin męskie (długo centrowane, PTH, 0.1")SparkFun ElectronicsPRT-12693Męskie złącza pinowe do podłączenia matrycy LED do płytki drukowanej. Końce można przycinać za pomocą przecinaków do drutu. Wymagany 1 zestaw. 
Przecinaki do drutu ukośnegoAdafruit152Do przycinania długich listew pinowych i cięcia zasilających. 1 wymagane.
Przewody połączeniowe Premium żeńskie/żeńskie - 40 x 12" (300mm)Adafruit793Taśma przewodząca do podłączenia płytki stykowej do matrycy LED. Może być łączony od końca do końca za pomocą męskich listew pinowych, aby był dłuższy. 1 Argument wymagany.
Półwymiarowa płytka do krojenia chlebaAdafruit64Matryca LED połączy się z tym, a naczynie do hodowli będzie spoczywać nad nią.
Miniaturowe źródło światła LED 8x8 Blue MatrixAdafruit956. Dominująca długość fali to 470nm (niebieska). 1 Argument wymagany. Alternatywne miniaturowe matryce LED tego samego dostawcy są dostępne z dominującymi długościami fal: 624 nm (czerwony), 588 nm (żółty), 525 nm (zielony), 572 nm (żółto-zielony) i biały.
Wymagane 3-pinowe złącze headerSparkFun Electronics138758.
Zestaw rezystorów - 1/4W (łącznie 500)SparkFun Electronics10969Do elektroniki. 1 wymagany.
  IRL520NMiędzynarodowy prostownikIRL520NPrzełącznik regulacji napięcia do sterowania prądem DC. 4 Wymagane.
Przewód połączeniowy - asortyment (Solid Core, 22 AWG)SparkFun ElectronicsPRT 11367Przewód do elektroniki. 1 wymagany.
Zasilacz impulsowy 5V 2A (2000mA) - Adafruit276Zasilacz do poduszki grzewczej i Arduino. Wymagane 2.
Regulowany zasilacz impulsowy 12 VDC 1000mA - na liście ULAdafruit798Do pomp perystaltycznych. 2 wymagane.
Elektryczna Poduszka Grzewcza - 10cm x 5cmAdafruit1481Do podgrzewania bioreaktora. Wymagana 1.
Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie o niskim przepływieFisher Scientific13-876-1Do pompowania mediów. Wymagana 1
Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie o średnim przepływieFisher Scientific13-876-2Do pompowania kultur. 1 wymagane.
Regulowany zasilacz impulsowy 9 VDC 1000mA - z certyfikatem ULAdafruit63Do zasilania mikrokontrolera. Zamówienie 1.
Wodoodporny DS18B20 wysokotemperaturowy Cyfrowy czujnik temperatury + dodatkiAdafruit642Termometr do bioreaktora. 1 wymagany.
MicromanagerMicromanagerNABezpłatne oprogramowanie sterujące mikroskopem o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNABezpłatne oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "http://fiji.sc/"
Zintegrowane środowisko programistyczne ArduinoNABezpłatne IDE o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Niestandardowy kodGitHubNANiestandardowy kod mikrokontrolera i wtyczka "Kontroler bioreaktora" są dostępne w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB A do B - 6 stópSparkFun ElectronicsCAB-00512Służy do pobierania danych do mikrokontrolera. 1 wymagane.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNAZaletą ładowania wartości matrycy LED z pliku CSV jest to, że wtyczka może wywołać program w celu zaktualizowania tych wartości na podstawie wyników analizy obrazu, a wartości te można ponownie załadować do mikrokontrolera, umożliwiając sterowanie zwrotne. Jest on dostępny w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Żele Tota-frost (papier dyfuzyjny)B& HB& H # LOFSFTL
MFR # T1-72		Do matrycy LED. 1 wymagane.
Arkusz montażowy Crosslink 1/4x12x24inGrainger, inc20JL37pianka do obudowy naczynia do hodowli. Wymagane 4.
Standardowy czujnik mocy fotodiody, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW ThorlabsS120VCDo pomiaru natężenia światła. Wymagane 1.
Taśma opisowaFisher Scientific159015NDo etykietowania i zabezpieczania elementów sypkich. 1 wymagane.
Kompaktowa konsola miernika mocy i energii, cyfrowy 4-calowy wyświetlacz LCDPM100DDo pomiaru natężenia światła. Wymagane 1.
100 ml szklana butelka do hybrydyzacji GL45Bellco Glass, Inc.(7910-40150)Zbiornik bioreaktora. 1 wymagany.
Sześcioportowy montażBellco Glass, Inc.Niestandardowe Do zbiornika bioreaktora. Specyfikacja rurki: .125 "OD x .055" ID. Port A: 1,0 "długości nad ślimakiem nasadki i do dna rury. Porty B, C, E, F: 1,0 cala długości powyżej ślimaka nasadki, 33 mm długości poniżej. Port D: 1,0" długości nad ślimakiem kołpaka, 65 mm  długo poniżej. 1 Argument wymagany. Zawiera polipropylenową nakrętkę o średnicy 45 mm i białą silikonową uszczelkę, aby zapewnić szczelne uszczelnienie między nakrętką a naczyniem.
Magiczna taśma klejąca 3105, 3/4 x 300 cali, opakowanie 3 sztukAmazonB0009F3P3Uprzezroczysta taśma klejąca. Jest to dostępne u wielu innych dostawców. Służy do zakrycia oznaczeń na naczyniu hodowlanym oraz do mocowania szkła nakrywkowego z kanałem PDMS do aluminiowej ramy nośnej.
1/16 "ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitarne rurki silikonoweUnited States Plastic Corp.57288Przewody. Wymagane ~25'.
Zatyczka z białej gumy Cole-Parmer Twistit, rozmiar 10Cole-ParmerEW-62992-32Korek do kolby na pożywkę i korek do kolby ścieków. 2 Wymagane.
Kolba laboratoryjna 2LPyrex4980Kolba na podłoża i kolba ściekowa. Wymagane 2.
Szczypta dziennaFisher Scientific5867Do zaciskania rurek. 3 wymagane.
Wymienny zespół przewodów 1/16" IDTraceable Products3372Pompy perystaltyczne są dostarczane z zestawem rurek, ale zużywają się one po tygodniach użytkowania.
Wymienny zespół przewodów 1/50" IDTraceable Products3371Pompy perystaltyczne są dostarczane z zestawem rurek, ale zużywają się one po tygodniach użytkowania.
Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/16" króciec węża, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-00Złącza. Wymagane jest ~10 luerów.
Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8" króciec węża, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-04Złącza. 5 wymaganych, po jednym dla każdego gumowego otworu korka do wypełnienia rurką.
Żeński adapter króćca do węża luer x 1/16", nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-00Złącza. Wymagane ~10 luerów.
Żeński adapter luer x 3/16" z króćcem wężaCole-ParmerEW-45502-08Złącza. Wymagane ~10 luerów.
Cole-Parmer Luer Akcesorium, żeńska nasadka Luer, nylon, 25/opkCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, męska wtyczka Luer Lock, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-56
Rurka PTFE z mikrootworem, 0,022"ID x 0,042"OD, 100 ft/rolkaCole-ParmerEW-06417-21Rurka. Wymagana 1 rolka.
Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex, L/S 13, 25 ftCole-ParmerEW-96410-13Rurka. Wymagane ~25'.
3/16 "ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitarne rurki silikonoweUnited States Plastic Corp.57293Przewody. Wymagane ~1'
Filtr próżniowyFisher Scientific974107Filtr próżniowy Nalgene do sterylnych mediów filtracyjnych.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200Pompa powietrza o regulowanym przepływie z podwójną membraną do napowietrzania i mieszania mediów. 1 wymagany. 
0,2 μ Filtr strzykawkowy m porówCorning International431229Gwarantuje to, że powietrze z pompy akwariowej nie zanieczyszcza aparatu. 1 wymagane.
Zestaw elastomerów silikonowych Slygard 184Dow CorningSlygard 184Do urządzenia mikroprzepływowego. 1 wymagany.
Amerykańska maszynka do golenia GEM Scientific Jednoostrzowe żyletkiFisher Scientific17989000Do cięcia rur i PDMS. Wymagane 1 ostrze.
Dziurkacz Harris Uni-Core 1,2 mm IDSigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICHDo wykrawania wlotu/wylotu w urządzeniu mikroprzepływowym. 1 wymagany.
Szklosz mikroskopu 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-GDo urządzenia mikroprzepływowego. 1 wymagane.
Prostokątna aluminiowa rama z kwadratowym oknemNiestandardoweDoobsługi kanału mikroprzepływowego. Wymiary zewnętrzne: 3 cale x 1,25 cala.
Wymiary wewnętrzne (część wycięta): 7/8 cala x 7/8 cala
Grubość: ~1/32 cala
MOSFET z certyfikatem UL .

Bibliografia

  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Systemy optogenetyczneciągła hodowlakomórki drobnoustrojoweprogramowane oświetlanieautomatyczne pobieranie próbekmikroskopia wielokanałowapraca w chemostacieintensywność fluorescencjiSaccharomyces cerevisiaetranskrypcja optogenetyczna
Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.