Method Article

Projekt i wdrożenie zautomatyzowanego systemu oświetlenia, hodowli i pobierania próbek do zastosowań optogenetycznych drobnoustrojów

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowaliśmy aparat do ciągłej hodowli do użytku z systemami optogenetycznymi do oświetlania kultur mikrobów i regularnego obrazowania komórek w ściekach za pomocą mikroskopu odwróconego. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje na oświetlenie mogą być mierzone przez kilka dni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy optogenetyczne wykorzystują genetycznie kodowane białka, które zmieniają konformację w odpowiedzi na określone długości fal światła, aby zmienić procesy komórkowe. Istnieje zapotrzebowanie na systemy hodowli i pomiarów, które obejmują zaprogramowane oświetlenie i stymulację systemów optogenetycznych. Przedstawiamy protokół budowy i użytkowania aparatu do ciągłej hodowli w celu oświetlenia komórek drobnoustrojów zaprogramowanymi dawkami światła oraz automatycznego pozyskiwania i analizy obrazów komórek w ściekach. Działanie tego aparatu jako chemostatu pozwala na ścisłą kontrolę tempa wzrostu i środowiska komórkowego. Ścieki z ciągłej hodowli komórkowej są regularnie pobierane, a komórki są obrazowane za pomocą mikroskopii wielokanałowej. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu dynamiczne reakcje w intensywności fluorescencji i morfologii komórkowej komórek pobranych ze ścieków hodowlanych są mierzone przez wiele dni bez udziału użytkownika. Wykazujemy użyteczność tego aparatu hodowlanego poprzez dynamiczną indukcję produkcji białek w szczepie Saccharomyces cerevisiae zmodyfikowanym za pomocą systemu optogenetycznego, który aktywuje transkrypcję.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy optogenetyczne wykorzystują światło do kontrolowania rosnącej listy procesów komórkowych, w tym ekspresji genów,1,2,3,4,5 lokalizacja białka,6 aktywność białka,6,7,8 Wiązanie białek,8,9,10 i degradacja białka. 11 Metoda hodowli komórek w kontrolowanym środowisku z zaprogramowaną stymulacją optyczną i mierzenia ich reakcji w biologicznie istotnych skalach czasowych jest niezbędna, aby wykorzystać potencjał tych narzędzi do badań w biologii komórki i biotechnologii. Nasza metoda wykorzystuje chemostazę do utrzymania stałego tempa wzrostu komórek w dobrze wymieszanym, napowietrzonym i kontrolowanym temperaturze szklanym naczyniu do hodowli12,13, które jest wystawione na zaprogramowane oświetlenie. Obrazujemy poszczególne komórki w ściekach z hodowli za pomocą odwróconego mikroskopu, aby zmierzyć reakcję kultury na zaprogramowane oświetlenie. Hodowla, pobieranie próbek, obrazowanie i analiza obrazu są w pełni zautomatyzowane, dzięki czemu intensywność fluorescencji i morfologia komórkowa hodowli komórek ściekowych mogą być mierzone przez wiele dni bez udziału użytkownika.

Ten protokół może być zaimplementowany w większości laboratoriów zaznajomionych z hodowlą komórek i mikroskopią, a używany aparat jest tani i wykonany z łatwo dostępnych komponentów. Przezroczyste naczynie do hodowli umieszcza się nad matrycą diod elektroluminescencyjnych (LED) zdolnych do emitowania 1 μW/cm,2-10 mW/cm2 światła. Mikroorganizmy są stale hodowane w naczyniu hodowlanym; Jedna pompa perystaltyczna służy do dodawania pożywki z szybkością rozcieńczenia, druga służy do pobierania kultury z mniejszą szybkością do mikroskopu, a różnica ucieka przez wylot przelewowy. Poduszka grzewcza utrzymuje temperaturę. Powietrze jest stale pompowane do naczynia hodowlanego w celu utrzymania dodatniego ciśnienia, a także wymieszania i napowietrzenia kultury. Z wyjątkiem pompy powietrza, zasilanie tych urządzeń jest regulowane przez mikrokontroler, który odbiera również dane wejściowe z termometru i podłączonego komputera stacjonarnego. Hodowla komórkowa w ściekach jest pompowana do urządzenia mikroprzepływowego na stoliku mikroskopu odwróconego. Obrazy niefluorescencyjne i fluorescencyjne są rejestrowane automatycznie. Komórki na obrazach są scharakteryzowane przez algorytm, który lokalizuje każdą komórkę jako obszar zainteresowania (ROI) i mierzy właściwości każdego ROI.

Aby zademonstrować zastosowanie tego protokołu, zmierzyliśmy reakcję na różne intensywności światła komórek Saccharomyces cerevisiae zaprojektowanych za pomocą reagującego na niebieskie światło systemu optogenetycznego, który kontroluje transkrypcję białka fluorescencyjnego. S. cerevisiae, powszechnie znane jako drożdże piekarskie, zostały wybrane, ponieważ istnieje już wiele systemów optogenetycznych do kontrolowania ekspresji genów w tym systemie14,15,16. Co więcej, ten organizm modelowy jest powszechnie używany do badań z zakresu biologii systemów17 oraz jako podwozie do zastosowań biotechnologicznych18,19,20. Nasze reprezentatywne wyniki pokazują, że protokół ten może być używany do kontrolowania transkrypcji kultury przez wiele dni poprzez zmianę intensywności światła wejściowego i pomiar produkcji reportera fluorescencyjnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1

Rysunek 1: Aparatura do ciągłej hodowli. Ten uproszczony schemat pokazuje, w jaki sposób należy zmontować aparat, gdy jest używany do hodowli, oświetlenia i pomiaru właściwości optycznych drobnoustrojów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Omówienie protokołu. Kroki w zacienionym regionie muszą być powtarzane za każdym razem, gdy używany jest protokół. Sterowanie w pętli zamkniętej jest możliwe34, ale nie jest zaimplementowane w tym protokole.

1. Zamontuj termometr na płytce drukowanej

figure-protocol-3
Rysunek 3: Połączenia do odczytu wartości termometru. Ten schemat pokazuje, w jaki sposób termometr cyfrowy powinien być podłączony do płytki drukowanej, aby mikrokontroler mógł uzyskać informacje zwrotne w celu kontrolowania temperatury kultury. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. uziemienie, dane i dodatnią objętośćtage linie termometru cyfrowego do odpowiednich otworów przelotowych oznaczonych "GD + V".
  2. Odetnij jeden pin z żeńskiego 3-pinowego złącza header i przytnij pozostałe 2 piny obcinaczami do drutu, tak aby zmieściły się w dwóch otworach przelotowych oznaczonych "R2" i nie zasłaniały mikrokontrolera. to na miejscu. Połącz dwa przylutowane piny, wkładając rezystor 4,7 kΩ do listwy pinowej.

2. Podłącz komponenty sterujące zasilaniem do płytki drukowanej

figure-protocol-4
Rysunek 4: Połączenia do sterowania zasilaniem poduszki grzewczej. Ten schemat pokazuje, w jaki sposób należy zmontować płytkę drukowaną i akcesoria, aby sterować mocą poduszki grzewczej. Części sterujące pompami perystaltycznymi są połączone w podobny sposób. Należy pamiętać, że elementy termometru zostały usunięte dla przejrzystości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Odetnij 1 cm od styków pięciu żeńskich złączy 3-pinowych. je do pozycji na płytce drukowanej (PCB) oznaczonych jako "#1", "#2", "#3", "#4" i "CBE".
  2. Odetnij 1 cm od styków żeńskiego 6-pinowego i 8-pinowego złącza. je obok siebie do kolumny otworów przelotowych oznaczonych od K1 do K14.
  3. Podłącz poduszkę grzewczą do płytki drukowanej.
    1. Włóż końce rezystora 100 kΩ do otworów przelotowych oznaczonych K1 i K2 na płytce drukowanej. Włóż tranzystor polowy (MOSFET) z tlenkiem metalu i półprzewodnika w miejsce oznaczone #1 na płytce drukowanej, z etykietą tranzystora MOSFET skierowaną w stronę otworów przelotowych K1 przez K14, tak aby pin źródłowy znajdował się najbliżej etykiety "#", a pin spustowy znajdował się najdalej od etykiety "#".
    2. Przetnij przewód uziemiający zasilającego prądem stałym (DC) 5 V i podłącz go do J2. Podłącz przewód uziemiający poduszki grzewczej do J1. Podłącz K3 do pinu 3 za pomocą rezystora 1 kΩ. Prąd powinien teraz płynąć z J1 do J2 tylko wtedy, gdy pin 3 jest ustawiony na +5V.z
      UWAGA: Zestaw rezystor/MOSFET działa jako przełącznik, który umożliwia przepływ prądu z pinu J1 do J2, gdy pin 3 mikrokontrolera jest ustawiony na +5 V.
  4. Podłączyć powolną pompę perystaltyczną.
    1. Włóż końce rezystora 100 kΩ do otworów przelotowych oznaczonych K4 i K5 na płytce drukowanej. Włóż tranzystor MOSFET w pozycji oznaczonej #2 na płytce drukowanej, z etykietą tranzystora MOSFET skierowaną w stronę otworów przelotowych K1 przez K14, tak aby pin źródłowy znajdował się najbliżej etykiety "#", a pin odpływu znajdował się najdalej od etykiety "#".
    2. Przeciąć przewód uziemiający zasilającego 12 V DC powolnej pompy perystaltycznej. Podłącz koniec pompy perystaltycznej skierowany w stronę do J3, a koniec brodawki ściennej do J4. Podłącz K6 do pinu 4 za pomocą rezystora 1 kΩ. Prąd powinien teraz płynąć z J3 do J4 tylko wtedy, gdy pin 4 jest ustawiony na +5 V.
  5. Podłącz szybką pompę perystaltyczną
    1. Włóż końce rezystora 100 kΩ do otworów przelotowych oznaczonych K7 i K9 na płytce drukowanej. Włóż tranzystor MOSFET w pozycję oznaczoną #3 na płytce drukowanej, tak aby etykieta tranzystora MOSFET była skierowana w stronę otworów przelotowych K1 przez K14, tak aby pin źródłowy znajdował się najbliżej etykiety "#", a pin odpływu był najdalej od etykiety "#".
    2. Przeciąć przewód uziemiający zasilającego 12 V DC szybkiej pompy perystaltycznej. Podłącz koniec pompy perystaltycznej skierowany w stronę do J5, a koniec brodawki ściennej do J6. Podłącz K9 do pinu 5 za pomocą rezystora 1 kΩ. Prąd powinien teraz płynąć z J5 do J6 tylko wtedy, gdy pin 5 jest ustawiony na +5 V.

3. Podłącz matrycę LED do płytki drukowanej

figure-protocol-5
Rysunek 5: Połączenia do sterowania matrycą LED. Ten schemat pokazuje, w jaki sposób matryca LED powinna być podłączona do płytki drukowanej. Pokazuje również, że płytkę PCB można układać w stos na mikrokontrolerze. Należy pamiętać, że elementy termometru i sterowania zasilaniem prądem stałym innych urządzeń zostały usunięte dla przejrzystości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. 6-pinowe, 10-pinowe i dwa 8-pinowe żeńskie złącza pinowe w otworach przelotowych po bokach płytki drukowanej, tak aby można je było ułożyć na górze mikrokontrolera.
  2. kondensatory 100 nF i 10 μF do ich oznaczonych pozycji na płytce drukowanej, zwracając uwagę, że ujemny zacisk kondensatora 10 μF (krótszy przewód) powinien być podłączony do otworu przelotowego oznaczonego znakiem ujemnym.
  3. sterownik LED do zestawu otworów przelotowych 2 na 12, tak aby wgłębienie na sterowniku znajdowało się daleko od otworów przelotowych zarezerwowanych dla matrycy LED.
  4. 2 kolumny męskich listew pinowych do otworów przelotowych oznaczonych dla matrycy LED i przytnij ich końce pod płytką stykową tak, aby nie zasłaniały mikrokontrolera. Podłącz je do dwóch 8-żyłowych pasków żeńskich/żeńskich przewodów połączeniowych. Podłącz drugi zestaw męskich złączy pinowych do drugiego końca przewodów połączeniowych.
  5. Włóż matrycę LED nad medianę płytki stykowej, a następnie włóż drugi zestaw nagłówków pinów do kolumn po obu stronach matrycy. Upewnij się, że połączenia elektryczne są takie same, jak gdyby matryca LED była bezpośrednio podłączona do płytki drukowanej, przy czym oznaczona strona matrycy odpowiada oznaczonej kolumnie otworów przelotowych.
  6. Odetnij jeden pin z żeńskiego 3-pinowego złącza header i przytnij pozostałe 2 piny obcinaczami do drutu, tak aby zmieściły się w dwóch otworach przelotowych oznaczonych "R1" i nie zasłaniały mikrokontrolera. to. Połącz dwa przylutowane piny, wkładając rezystor 1 kΩ do listwy pinowej.
    Uwaga: Naczynie do hodowli zostanie ułożone na matrycy LED. Jeśli druciane wstęgi zasłaniają naczynie, odsuń je od matrycy. Następnie użyj drutu z litym rdzeniem, aby wypełnić szczelinę między kołkami matrycy a kołkami taśmy drucianej, tak aby połączenia elektryczne się nie zmieniały.

4. Zainstaluj oprogramowanie i połącz się ze sprzętem

  1. Ułóż płytkę PCB na mikrokontrolerze.
  2. Skorzystaj z linków na liście materiałów, aby pobrać zintegrowane środowisko programistyczne (IDE) i niestandardowy kod dla mikrokontrolera.
  3. Podłącz mikrokontroler do komputera mikroskopu za pomocą uniwersalnej magistrali szeregowej (USB) A-B. Skompiluj i prześlij niestandardowy kod do mikrokontrolera.
  4. Pobierz Micro-Manager21,22 i FIJI23. Skonfiguruj Micro-Manager jako wtyczkę FIJI, kopiując wszystkie pliki ".dll", katalog "mmplugins" i katalog "mmautofocus" z katalogu, z którego Micro-Manager został pobrany, do katalogu "Fiji.app". Skopiuj również katalog "plugins/Micro-Manager" do katalogu "Fiji.app/plugins".
  5. Pobierz plik "BioreactorController.jar" do katalogu "Fiji.app/mmplugins".
  6. Otwórz Micro-Manager z FIDŻI> Wtyczki> Micro-Manager> Micro-Manager Studio. Użyj Kreatora konfiguracji sprzętu, aby skonfigurować oprogramowanie do sterowania mikroskopem. Dołącz urządzenie "FreeSerialPort" do kreatora wraz z etykietą portu, do którego podłączony jest USB AB.

5. Wykonaj i scharakteryzuj światłoszczelne pomieszczenie dla naczynia do hodowli

  1. Ułóż trzy 8-pinowe gniazda IC jako bloki konstrukcyjne na płytce stykowej w każdym rogu matrycy LED tak, aby naczynie do hodowli mogło spoczywać na nich nad matrycą.
  2. Przymocuj porcję papieru dyfuzyjnego pod górną warstwą gniazd, tak aby światło padające z matrycy LED na naczynie hodowlane było rozproszone.
  3. Wytnij trzy porcje czarnej pianki o wymiarach 8 na 6 cali. Wytnij część o tym samym rozmiarze co elektroniczna płytka stykowa (2.3 "x 3.5") od wewnętrznej strony pierwszych dwóch i część o rozmiarze prostokąta utworzonego przez gniazda IC (0.9 "x 1.8") od wewnętrznej strony trzeciej. Ułóż te warstwy na matrycy LED tak, aby ostatnia warstwa zawierająca otwór 0.9" x 1.8" leżała nawet z górną częścią gniazd IC i otaczała matrycę LED.
  4. Przetnij dodatkowy arkusz czarnej pianki na pół, aby uzyskać prostokąt o wymiarach 6 na 24 cale. Rozwałkuj to w wydrążoną kolumnę z czarnej pianki, w której naczynie do hodowli może się zmieścić, z miejscem na rurki i druty, tak aby izolowało termicznie i optycznie naczynie do hodowli.
  5. Wyśrodkuj pustą kolumnę czarnej pianki nad matrycą LED i zaznacz granicę kolumny na warstwie czarnej pianki pod nią. Ta granica będzie oznaczać miejsce, w którym powinna być wyśrodkowana w przyszłości.
  6. Wytnij porcję czarnej pianki o wymiarach 3 x 3 cale. Użyj tego później jako pokrywy, którą można przykleić taśmą do górnej części kolumny, aby zablokować światło zewnętrzne.
  7. Przymocuj czujnik mocy fotodiody do nasadki naczynia do hodowli za pomocą taśmy, zamocuj nasadkę i włóż naczynie do hodowli do obudowy.
  8. W Micro-Manager przejdź do Wtyczki> Kontroler bioreaktora. Ustaw matrycę tak, aby świeciła w podzbiorze zakresu możliwych intensywności w odstępach 30 s.
  9. Zapisz natężenie światła wyświetlane na konsoli miernika mocy podłączonej do czujnika mocy. Pomiary te umożliwią poznanie rzeczywistego natężenia światła po ustawieniu liczby świecących diod LED i prądu modulowanego szerokością impulsu (PWM) do tych diod LED.

6. Przygotuj naczynie do hodowli

figure-protocol-6
Rysunek 6: Połączenia zbiorników. Ten schemat pokazuje, w jaki sposób naczynie i rurki urządzenia powinny być podłączone przed autoklawowaniem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Oznaczyć wysokość odpowiadającą każdemu przyrostowi 2 ml płynu w zakresie od 10 ml do 30 ml w naczyniu do hodowli. Wlej 10 ml sterylnej wody dejonizowanej, zaznacz poziom wody, dodaj 2 ml, zaznacz poziom wody i powtarzaj, aż zostanie oznaczony poziom 30 ml. Przykryj oznaczenia przezroczystą taśmą, aby nie były łatwe do usunięcia, i wyrzuć płyn.
  2. Umieść długi koniec aluminiowego portu przez silikonową uszczelkę w naczyniu do hodowli. Przykręć nakrętkę.
  3. Zakryj jeden krótki aluminiowy wylot portu silikonową rurką 1/16" ID. Podłącz dystalny koniec, wkładając żeńską wtyczkę luer lock, a następnie podłączając męską wtyczkę luer lock. Ten wylot jest dodatkowy i nie będzie używany (rura 6 na rysunku 6).
  4. Połącz dwa krótkie odcinki silikonowej rurki ID 1/16" z męskimi i żeńskimi zamkami luer. Podłącz jeden koniec do krótkiego aluminiowego gniazdka portu i podłącz dystalny koniec za pomocą męskiej wtyczki luer i żeńskiej wtyczki luer lock. Naczynie zostanie zaszczepione przez tę probówkę (probówka 7/7.1 na rysunku 6).
  5. Podłącz dwie rurki ID 1/16" do końców rurki perystaltycznej 1/16" ID i złączy. Podłącz jeden koniec do krótkiego aluminiowego portu i podłącz drugi (rurka 4 na rysunku 6). Później zostanie on podłączony do kolby z mediami.

7. Przygotuj kolbę z mediami

  1. Podłącz silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 1/16" (ID) do najdłuższego aluminiowego portu. Rurka powinna być wystarczająco długa, aby dotrzeć do kolby z pożywką. Podłącz męski zamek luer 1/8" ID do krótkiego odcinka rurki ID 1/16", podłącz go do poprzedniej rurki, a następnie włóż ten krótki segment do gumowego korka na kolbie z pożywką (rurka 3 na rysunku 6).
  2. Zacisnąć rurkę. To połączenie umożliwia przepływ powietrza z kolby pożywki do naczynia hodowlanego. Kiedy kolba pożywki jest później pompowana powietrzem i ta rurka jest odblokowywana, kultura zostanie wymieszana, napowietrzona i utrzymywana pod dodatnim ciśnieniem przez napływające pęcherzyki.
  3. Włóż rurkę identyfikacyjną 1/16" wystarczająco długą, aby sięgała dna kolby, do korka, przez który będzie przenoszony nośnik. Podłącz kolejną rurkę ID 1/16" do tej, a następnie rurkę ID 3/16" do tamtego. Podłącz to za pomocą żeńskiej blokady luer lock 3/16" ID i męskiej wtyczki luer lock (rurka 1/1.1 na rysunku 6).
  4. Trzeci otwór w korku powinien być wypełniony krótkim odcinkiem rurki ID 1/16", połączonym z dwoma innymi segmentami rurki o średniej średnicy i zatkanym na dystalnym końcu (rurka 2/2.1 na rysunku 6). Zostanie on podłączony do pompy próżniowej, a później do pompy akwariowej.
    UWAGA: Jeśli rurka nie mieści się łatwo przez otwory w gumowym korku, odetnij końce rurki pod kątem. Następnie skośny koniec, który jest przepychany przez otwór, można użyć do przeciągnięcia reszty.

8. Przygotuj kolbę na ścieki

  1. Włóż męski luer lock do segmentu silikonowej rurki 1/16" ID, a następnie mocno włóż rurkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) 0,022" ID. Oddzielnie przymocuj żeński luer lock do rurki ID 1/16". Następnie przeciągnij jeden koniec wzdłuż rurki PTFE, aby połączyć zamki, a drugi z krótkim aluminiowym portem (rurka 5 na rysunku 6).
  2. Podłącz odsłoniętą rurkę silikonową 1/50" ID do rurki perystaltycznej 1/50" ID i złączy. W tym celu połącz trzy segmenty rurki ID 1/50" i dwa segmenty rurki PTFE ID 0,022", naprzemiennie je. Podłącz to do kolby ściekowej za pomocą rurki ID 1/16" (rurka 5 na rysunku 6).
  3. Podłącz jeden koniec silikonowej rurki ID 1/16" do drugiej najdłuższej rurki aluminiowego portu, a drugi koniec do kolby ściekowej. Ta aluminiowa rurka ustawia objętość hodowli, a nadmiar kultury przelewa się do pojemnika na ścieki (rura 8 na rysunku 6).
  4. Autoklaw zestawu do hodowli w temperaturze 121 °C i 15 psi (sterylizacja ogólna) przez 30 minut
    Uwaga: Probówki, przez które napełniana jest kolba z pożywką, przez którą odsysa się kolbę z pożywką i przez którą zaszczepia się naczynie do hodowli, mają wiele segmentów rurek, tak że w przypadku zanieczyszczenia dystalnego segmentu można go usunąć w celu odsłonięcia sterylnego segmentu.

9. Przygotuj kanał mikroprzepływowy

  1. Wymieszaj polidimetylosiloksan (PDMS) i utwardzacz w stosunku 9:1. Odgazuj i wlej na silikonową formę główną.
  2. Utwardź PDMS przez 2 godziny w temperaturze 65 °C, a następnie odetnij go od maski żyletką. Ciąć wokół PDMS, aż uwolni się z formy. Unikaj dociskania i łamania delikatnej płytki.
  3. Użyj dziurkacza do biopsji o średnicy wewnętrznej 1,2 mm, aby wybić otwory na obu końcach kanału.
  4. Plazma łączy PDMS ze szkłem nakrywkowym24.
  5. Przyklej długie końce szkła nakrywkowego do nośnej ramy aluminiowej tak, aby kanał PDMS był wyśrodkowany na aluminiowej ramie, a następnie ponownie piecz PDMS przez 2 godziny w temperaturze 65 °C.

10. Napełnij kolbę z mediami

figure-protocol-7
Rysunek 7: Dodawanie nośnika. Ten schemat pokazuje, w jaki sposób media powinny być filtrowane próżniowo do kolby pożywki. Zapewnia, że podłoże pozostaje sterylne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotuj odpowiednie media. Jeśli system hodowli ciągłej będzie działał jako chemostat, należy użyć pożywki ograniczonej dla określonego składnika odżywczego.
    UWAGA: Przykłady standardowego składu podłoża dla badań z S. cerevisiae zostały wcześniej opublikowane25,26,27,28,29.
  2. Podłącz filtr próżniowy do butelki o pojemności 100 ml, zdejmij osłonę smoczka, a następnie wyjmij białą zatyczkę ze złączki filtra próżniowego za pomocą sterylnej pęsety.
  3. Podłącz silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 3/16" do smoczka, drugą wolną rurkę kolby z pożywką do pompy próżniowej (odpowiednio rurki 1 i 2 na rysunku 7) i upewnij się, że rurka łącząca kolbę z naczyniem do hodowli jest zaciśnięta (rurka 3 na rysunku 7).
  4. Napełnij filtr mediami, włącz pompę próżniową, a następnie przefiltruj resztę mediów. Clamp silikonową rurkę 1/16" ID podłączoną do podciśnienia (rura 2 na rysunku 7) i wyłącz pompę próżniową.
  5. Usuń leurs z pośredniego segmentu rurki ID 1/16" podłączonej do pompy próżniowej, tak aby dostępny był niezanieczyszczony koniec rurki. Włóż niebieską końcówkę sterylnego filtra powietrza strzykawkowego do tej probówki.
  6. Clamp silikonową rurkę 3/16" ID (rurka 1 na rysunku 7) i odłącz od niej męski luer. Odłączyć wtyczkę od żeńskiego luera rurki wlotowej pożywki naczynia do hodowli. Połącz te męskie i żeńskie luery, aby umożliwić pompowanie pożywki do naczynia hodowlanego.
  7. Wyjmij filtr próżniowy i zakręć butelkę o pojemności 100 ml z mediami, która była przymocowana do filtra próżniowego.
  8. Na dzień przed inokulacją naczynia hodowlanego należy zaszczepić pojedynczą kolonię drobnoustroju optogenetycznego w probówce z 4 ml pożywki zebranej w poprzednim kroku i pozostawić ją na noc w temperaturze 30 °C lub optymalnej temperatury wzrostu kultury z mieszaniem.

11. Ustaw aparaturę wokół mikroskopu

  1. Ustawić zestaw do ciągłej hodowli w pobliżu mikroskopu, tak aby kolba z pożywką znajdowała się wyżej niż naczynie do hodowli, a kolba ściekowa znajdowała się niżej niż naczynie do hodowli, tak aby rurka złożona z segmentów rurki PTFE o średnicy wewnętrznej 0,022 cala (rurka 5 na rysunku 6) mogła dotrzeć do stolika mikroskopu. Bezpiecznie przyklej taśmą gumowe korki do kolby na pożywkę i pojemnika na ścieki.
  2. Odłącz końce rurki PTFE 0,022" ID od łączącej je silikonowej rurki 1/50" ID (rurka 5 na rysunku 6) i podłącz te końce do wlotu i wylotu urządzenia mikroprzepływowego.
  3. Podłącz biały koniec filtra powietrza strzykawki do pompy akwariowej. Ciśnienie powietrza wepchnie pożywkę do naczynia do hodowli.
  4. Gdy media osiągną poziom portu ściekowego, owiń rurkę wlotową i złączki mediów o średnicy wewnętrznej 1/16" wokół powolnej pompy perystaltycznej (rura 4 na rysunku 6) oraz rurkę wylotową próbki 1/50" ID i łączniki wokół szybkiej pompy perystaltycznej (rura 5 na rysunku 6).
  5. Napowietrzyć pożywkę, odkręcając rurkę powietrzną między kolbą pożywki a naczyniem do hodowli.
  6. Przyklej poduszkę grzewczą i termometr do naczynia hodowlanego, aby można było kontrolować jego temperaturę. Owiń rurki pożywki wokół naczynia do hodowli tak, aby wprowadzane podłoże miało tę samą temperaturę co naczynie.
    UWAGA: Prąd PWM do poduszki grzewczej jest regulowany przez mikrokontroler, który wykorzystuje dane wejściowe z termometru do utrzymywania naczynia do hodowli w zadanej temperaturze.
  7. Włóż naczynie do hodowli do czarnej piankowej obudowy nad matrycą LED i upewnij się, że rurki nie są ściśnięte.
  8. W Micro-Manager przejdź do Wtyczki> Kontroler bioreaktora. Ustaw pole "Współczynnik pompy mediów włączony" na 0,1, a pole "Współczynnik pompy próbki włączone" na 0. Natężenie przepływu będzie bardzo niskie, ale większe niż szybkość parowania.
  9. Zacisknąć rurkę powietrza doprowadzającego między kolbą z pożywką a naczyniem do hodowli. Wyjąć zatyczkę z probówki do zaszczepiania (probówka 7 na rysunku 6) i zaszczepić naczynie hodowlane 1 ml kultury starterowej za pomocą pipety serologicznej. Clamp i zatkaj dystalny koniec tej rurki, aby upewnić się, że zanieczyszczenia nie dostaną się do naczynia hodowlanego, a następnie odkręć rurkę doprowadzającą powietrze.
  10. Przykryj obudowę, aby nie wpadało światło, i pozwól kulturze rosnąć przez noc.

12. Kalibracja prędkości pompowania

  1. W Micro-Manager przejdź do Wtyczki> Kontroler bioreaktora. Ustaw pole "Współczynnik pompy mediów włączony" na 0,5, a pole "Współczynnik pompy próbki włączone" na 0.
  2. Odłączyć rurkę przelewową od kolby ściekowej (rura 8 na rysunku 6) oraz rurkę do pobierania próbek od kolby ściekowej (rurka 8 na rysunku 6) i zebrać ścieki do oddzielnych zbiorników. Zbieraj ścieki przez 1 godzinę, rozpoczynając po włączeniu pomp przez 15 minut.
  3. Obliczyć natężenie przepływu pożywki do naczynia do hodowli na podstawie objętości zgromadzonej w naczyniu jako:
    figure-protocol-8
  4. Dostosuj wartość pola "Współczynnik pompy mediów włączony" według tego liniowego oszacowania:
    figure-protocol-9
    gdzie
    figure-protocol-10
  5. Powtarzaj tę procedurę kalibracji, aż różnica między pożądanym natężeniem przepływu a zmierzonym natężeniem przepływu wyniesie < 0,2 ml/h, gdzie natężenie przepływu jest uśredniane w okresie 1 godziny.
  6. Zwiększyć wartość "proporcji próbki na" pole i skalibrować ją w podobny sposób, aż około 4/5 objętości opuszczającej naczynie do hodowli zostanie wypompowane przez pompę do pobierania próbek, a około 1/5 objętości będzie opuszczana przez otwór przelewowy.
  7. Niech gęstość hodowli w aparacie do ciągłej hodowli zrównoważy się w tych warunkach przez noc.
    UWAGA: Jeśli nie można osiągnąć docelowych natężeń przepływu, wymień rurkę pompy perystaltycznej. Ciecz jest pompowana z większą prędkością, gdy używane są rurki o większej średnicy. Wykonaj krok 14, a następnie wróć do kroku 8.4.

13. Zbieraj obrazy mikroskopowe hodowanych mikroorganizmów

  1. Wypełnij listę pozycji stołu montażowego w Micro-Manager zestawem nienakładających się pozycji, w których obrazy komórek pompowanych do kanału mikroprzepływowego będą znajdować się w płaszczyźnie ogniskowej.
  2. Otwórz wtyczkę "Sterownik bioreaktora". Wybierz żądany przebieg czasowy matrycy LED, kanały obrazowania i inne ustawienia eksperymentalne z podpowiedzi. Zbieraj i analizuj obrazy.
  3. Podczas trwania eksperymentu upewnij się, że podłoże w kolbie pożywki pozostaje czyste. Jeśli jest mętny, oznacza to, że został zanieczyszczony.

14. Okres po eksperymencie

  1. Usunąć pożywkę, nadmiar hodowli komórkowych i ścieki.
  2. Napełnij kolbę pożywki 200 ml 20% EtOH zmieszanego z wodą dejonizowaną. Uruchom chemostat tak, jak został uruchomiony wcześniej podczas eksperymentu, aby wypłukać resztki komórek i pożywkę.
  3. Po spuszczeniu roztworu alkoholu z kolby pożywki, należy całkowicie zdemontować chemostat.
  4. Umyj szklane naczynia i rurki ciepłą wodą z łagodnym detergentem i dokładnie spłucz wodą dejonizowaną. Pozostaw do wyschnięcia.
  5. Otwórz plik "microcontrollerRecords.csv", aby przejrzeć temperaturę i stan matrycy LED w trakcie eksperymentu, plik "Summary.csv", aby przejrzeć dane podsumowujące z każdego zestawu obrazów oraz pliki "Wyniki.csv", aby przejrzeć dane podsumowujące każdy zwrot z inwestycji z każdego okresu, gdzie n jestn-tym zestawem danych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To urządzenie zostało użyte do stymulowania hodowli S. cerevisiae wykazującego ekspresję białka żółtej fluorescencji (YFP) w odpowiedzi na światło niebieskie za pomocą indukowalnego systemu transkrypcji optogenetycznej opartego na parze białek CRY2/CIB130. Komórki hodowano chemostatycznie w pożywkach o ograniczonej zawartości fosforanów ze średnim stopniem rozcieńczenia 0,2 ± 0,008. Ograniczenie fosforanów jest powszechnie stosowane w eksperymentach z ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaprojektowaliśmy to urządzenie z myślą o elastyczności. Cały użyty kod jest darmowy i open-source. Domyślny proces analizy obrazu w celu segmentacji komórek jest prosty i przebiega szybko. Analizę niestandardową można zaimplementować, rejestrując dane wejściowe użytkownika podczas analizowania reprezentatywnego obrazu za pomocą graficznego interfejsu użytkownika FIJI, konwertując dane wejściowe na skrypt beanshell, a następnie ustawiając wtyczkę tak, aby wywoływała skrypt. Po wywołaniu skryptowi temu zostanie wysłana ta...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Molly Lazar i Verónice Delgado za pomoc w testowaniu protokołu, Kieranowi Sweeneyowi za pomocne dyskusje i redakcję, oraz Taylor Scott, My An-adirekkun i Stephanie Geller za krytyczną lekturę rękopisu. Megan Nicole McClean, Ph.D. otrzymała nagrodę Career Award w Scientific Interface przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Obszerny podręcznik laboratoryjnyGitHubNAObszerny, regularnie aktualizowany podręcznik laboratoryjny jest dostępny w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Obejmuje to również opis formy mikroprzepływowej użytej do wygenerowania reprezentatywnych wyników.
Fritzing Design ViewerFritzingNADarmowe oprogramowanie typu open source do przeglądania i edycji projektów płytek drukowanych typu .fzz jest dostępne pod adresem "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - zmontowany)Mikrokontroler Adafruit50. 1 wymagane.
Zestaw nagłówków Arduino StackableSparkFun Electronics10007Żeńskie złącza pinowe do podłączenia płytki drukowanej do mikrokontrolera. 1 wymagane.
Lutownica regulowana 30W 110V - XY-258 110VAdafruit180Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką PCB. Wymagane 1.
Podstawka pod lutownicęAdafruit150Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką drukowaną. Wymagane 1.
Mini szpula lutownicza - 60/40 ołowiowa kalafonia do 0,031" średnica - 100gAdafruit145Do wykonywania połączeń elektrycznych z płytką drukowaną. 1 wymagane.
0,1 μ Kondensator FSparkFun ElectronicsCOM-08375Stabilizuje napięcie na płytce drukowanej. Wymagane 1.
10 μ Kondensator FSparkFun ElectronicsCOM-00523Stabilizuje napięcie na płytce drukowanej.
MAX7219CNG Sterownik wyświetlacza LED Matrix/Digit - sterownik LED MAX7219MaximMAX7219CNG. Wymagane 1.
Wymagane 8-pinowe gniazdo ICMouser Electronics575-14430816. Zostaną one ułożone jeden na drugim, aby podeprzeć naczynie hodowlane nad matrycą LED.
24-pinowe gniazdo ICMouser Electronics535-24-3518-10Opcjonalnie. Użyj tego, aby odwracalnie podłączyć sterownik MAXIM 7219CNG do płytki drukowanej.
Multimetr cyfrowyAdafruit2034Do rozwiązywania problemów z elektroniką. Wymagane 1.
Złącza header typu break away - 40-pin męskie (długo centrowane, PTH, 0.1")SparkFun ElectronicsPRT-12693Męskie złącza pinowe do podłączenia matrycy LED do płytki drukowanej. Końce można przycinać za pomocą przecinaków do drutu. Wymagany 1 zestaw. 
Przecinaki do drutu ukośnegoAdafruit152Do przycinania długich listew pinowych i cięcia zasilających. 1 wymagane.
Przewody połączeniowe Premium żeńskie/żeńskie - 40 x 12" (300mm)Adafruit793Taśma przewodząca do podłączenia płytki stykowej do matrycy LED. Może być łączony od końca do końca za pomocą męskich listew pinowych, aby był dłuższy. 1 Argument wymagany.
Półwymiarowa płytka do krojenia chlebaAdafruit64Matryca LED połączy się z tym, a naczynie do hodowli będzie spoczywać nad nią.
Miniaturowe źródło światła LED 8x8 Blue MatrixAdafruit956. Dominująca długość fali to 470nm (niebieska). 1 Argument wymagany. Alternatywne miniaturowe matryce LED tego samego dostawcy są dostępne z dominującymi długościami fal: 624 nm (czerwony), 588 nm (żółty), 525 nm (zielony), 572 nm (żółto-zielony) i biały.
Wymagane 3-pinowe złącze headerSparkFun Electronics138758.
Zestaw rezystorów - 1/4W (łącznie 500)SparkFun Electronics10969Do elektroniki. 1 wymagany.
  IRL520NMiędzynarodowy prostownikIRL520NPrzełącznik regulacji napięcia do sterowania prądem DC. 4 Wymagane.
Przewód połączeniowy - asortyment (Solid Core, 22 AWG)SparkFun ElectronicsPRT 11367Przewód do elektroniki. 1 wymagany.
Zasilacz impulsowy 5V 2A (2000mA) - Adafruit276Zasilacz do poduszki grzewczej i Arduino. Wymagane 2.
Regulowany zasilacz impulsowy 12 VDC 1000mA - na liście ULAdafruit798Do pomp perystaltycznych. 2 wymagane.
Elektryczna Poduszka Grzewcza - 10cm x 5cmAdafruit1481Do podgrzewania bioreaktora. Wymagana 1.
Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie o niskim przepływieFisher Scientific13-876-1Do pompowania mediów. Wymagana 1
Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie o średnim przepływieFisher Scientific13-876-2Do pompowania kultur. 1 wymagane.
Regulowany zasilacz impulsowy 9 VDC 1000mA - z certyfikatem ULAdafruit63Do zasilania mikrokontrolera. Zamówienie 1.
Wodoodporny DS18B20 wysokotemperaturowy Cyfrowy czujnik temperatury + dodatkiAdafruit642Termometr do bioreaktora. 1 wymagany.
MicromanagerMicromanagerNABezpłatne oprogramowanie sterujące mikroskopem o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNABezpłatne oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "http://fiji.sc/"
Zintegrowane środowisko programistyczne ArduinoNABezpłatne IDE o otwartym kodzie źródłowym jest dostępne pod adresem "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Niestandardowy kodGitHubNANiestandardowy kod mikrokontrolera i wtyczka "Kontroler bioreaktora" są dostępne w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
USB A do B - 6 stópSparkFun ElectronicsCAB-00512Służy do pobierania danych do mikrokontrolera. 1 wymagane.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNAZaletą ładowania wartości matrycy LED z pliku CSV jest to, że wtyczka może wywołać program w celu zaktualizowania tych wartości na podstawie wyników analizy obrazu, a wartości te można ponownie załadować do mikrokontrolera, umożliwiając sterowanie zwrotne. Jest on dostępny w " Pliki chemostatu optogenetycznego" Repozytorium GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Żele Tota-frost (papier dyfuzyjny)B& HB& H # LOFSFTL
MFR # T1-72		Do matrycy LED. 1 wymagane.
Arkusz montażowy Crosslink 1/4x12x24inGrainger, inc20JL37pianka do obudowy naczynia do hodowli. Wymagane 4.
Standardowy czujnik mocy fotodiody, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW ThorlabsS120VCDo pomiaru natężenia światła. Wymagane 1.
Taśma opisowaFisher Scientific159015NDo etykietowania i zabezpieczania elementów sypkich. 1 wymagane.
Kompaktowa konsola miernika mocy i energii, cyfrowy 4-calowy wyświetlacz LCDPM100DDo pomiaru natężenia światła. Wymagane 1.
100 ml szklana butelka do hybrydyzacji GL45Bellco Glass, Inc.(7910-40150)Zbiornik bioreaktora. 1 wymagany.
Sześcioportowy montażBellco Glass, Inc.Niestandardowe Do zbiornika bioreaktora. Specyfikacja rurki: .125 "OD x .055" ID. Port A: 1,0 "długości nad ślimakiem nasadki i do dna rury. Porty B, C, E, F: 1,0 cala długości powyżej ślimaka nasadki, 33 mm długości poniżej. Port D: 1,0" długości nad ślimakiem kołpaka, 65 mm  długo poniżej. 1 Argument wymagany. Zawiera polipropylenową nakrętkę o średnicy 45 mm i białą silikonową uszczelkę, aby zapewnić szczelne uszczelnienie między nakrętką a naczyniem.
Magiczna taśma klejąca 3105, 3/4 x 300 cali, opakowanie 3 sztukAmazonB0009F3P3Uprzezroczysta taśma klejąca. Jest to dostępne u wielu innych dostawców. Służy do zakrycia oznaczeń na naczyniu hodowlanym oraz do mocowania szkła nakrywkowego z kanałem PDMS do aluminiowej ramy nośnej.
1/16 "ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitarne rurki silikonoweUnited States Plastic Corp.57288Przewody. Wymagane ~25'.
Zatyczka z białej gumy Cole-Parmer Twistit, rozmiar 10Cole-ParmerEW-62992-32Korek do kolby na pożywkę i korek do kolby ścieków. 2 Wymagane.
Kolba laboratoryjna 2LPyrex4980Kolba na podłoża i kolba ściekowa. Wymagane 2.
Szczypta dziennaFisher Scientific5867Do zaciskania rurek. 3 wymagane.
Wymienny zespół przewodów 1/16" IDTraceable Products3372Pompy perystaltyczne są dostarczane z zestawem rurek, ale zużywają się one po tygodniach użytkowania.
Wymienny zespół przewodów 1/50" IDTraceable Products3371Pompy perystaltyczne są dostarczane z zestawem rurek, ale zużywają się one po tygodniach użytkowania.
Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/16" króciec węża, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-00Złącza. Wymagane jest ~10 luerów.
Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8" króciec węża, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-04Złącza. 5 wymaganych, po jednym dla każdego gumowego otworu korka do wypełnienia rurką.
Żeński adapter króćca do węża luer x 1/16", nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-00Złącza. Wymagane ~10 luerów.
Żeński adapter luer x 3/16" z króćcem wężaCole-ParmerEW-45502-08Złącza. Wymagane ~10 luerów.
Cole-Parmer Luer Akcesorium, żeńska nasadka Luer, nylon, 25/opkCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Luer Accessory, męska wtyczka Luer Lock, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-56
Rurka PTFE z mikrootworem, 0,022"ID x 0,042"OD, 100 ft/rolkaCole-ParmerEW-06417-21Rurka. Wymagana 1 rolka.
Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex, L/S 13, 25 ftCole-ParmerEW-96410-13Rurka. Wymagane ~25'.
3/16 "ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitarne rurki silikonoweUnited States Plastic Corp.57293Przewody. Wymagane ~1'
Filtr próżniowyFisher Scientific974107Filtr próżniowy Nalgene do sterylnych mediów filtracyjnych.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200Pompa powietrza o regulowanym przepływie z podwójną membraną do napowietrzania i mieszania mediów. 1 wymagany. 
0,2 μ Filtr strzykawkowy m porówCorning International431229Gwarantuje to, że powietrze z pompy akwariowej nie zanieczyszcza aparatu. 1 wymagane.
Zestaw elastomerów silikonowych Slygard 184Dow CorningSlygard 184Do urządzenia mikroprzepływowego. 1 wymagany.
Amerykańska maszynka do golenia GEM Scientific Jednoostrzowe żyletkiFisher Scientific17989000Do cięcia rur i PDMS. Wymagane 1 ostrze.
Dziurkacz Harris Uni-Core 1,2 mm IDSigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICHDo wykrawania wlotu/wylotu w urządzeniu mikroprzepływowym. 1 wymagany.
Szklosz mikroskopu 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-GDo urządzenia mikroprzepływowego. 1 wymagane.
Prostokątna aluminiowa rama z kwadratowym oknemNiestandardoweDoobsługi kanału mikroprzepływowego. Wymiary zewnętrzne: 3 cale x 1,25 cala.
Wymiary wewnętrzne (część wycięta): 7/8 cala x 7/8 cala
Grubość: ~1/32 cala
MOSFET z certyfikatem UL .

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  2. Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. Light-mediated control of DNA transcription in yeast. Methods. 58 (4), 385-391 (2012).
  3. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  4. Polstein, L. R., Gersbach, C. a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  5. Polstein, L. R., Gersbach, C. a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  6. Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast. Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).
  7. Lee, S., Park, H., et al. Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells. Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).
  8. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  9. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).
  10. Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).
  11. Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function. Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).
  12. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).
  13. Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).
  14. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).
  15. Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7, 973-975 (2010).
  16. Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).
  17. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: An experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  18. Galanie, S., Smolke, C. D. Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids. Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).
  19. Gerngross, T. U. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).
  20. van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status. Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).
  21. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).
  22. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of biological methods. 1 (2), (2014).
  23. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  25. Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast. Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).
  26. Boer, V. M., Tai, S. L., et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures. FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).
  27. Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).
  28. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast. Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).
  29. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  30. Liu, H., Yu, X., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  31. McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast. Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).
  32. McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway. Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).
  33. McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae. Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).
  34. Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  35. Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  36. Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  37. Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast. Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).
  38. Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses. Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).
  39. Shimizu, K. Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses. Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).
  40. Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals. Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic SystemsContinuous CulturingMicrobial CellsProgrammed IlluminationAutomated SamplingMulti channel MicroscopyChemostat OperationFluorescence IntensitySaccharomyces cerevisiaeOptogenetic Transcription

Related Articles