Artykuł metodologiczny

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

DOI:

10.3791/54900

⸱

8 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cognitive Neurosciences, Radboudumc, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University, 3Department of Human Genetics, Radboudumc, 4Department of Molecular Developmental Biology, Radboud University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) stanowią obiecujące nowe narzędzie do badania zaburzeń neurologicznych. W ciągu ostatniej dekady opracowano wiele protokołów różnicowania hiPSC w neurony. Jednak protokoły te są często powolne, charakteryzują się dużą zmiennością, niską odtwarzalnością i niską wydajnością. Ponadto neurony uzyskane za pomocą tych protokołów są często niedojrzałe i brakuje im odpowiedniej aktywności funkcjonalnej zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i sieci, chyba że neurony są hodowane przez kilka miesięcy. Częściowo ze względu na te ograniczenia, właściwości funkcjonalne sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC nadal nie są dobrze scharakteryzowane. W tym miejscu adaptujemy niedawno opublikowany protokół, który opisuje wytwarzanie ludzkich neuronów z hiPSC poprzez wymuszoną ekspresję czynnika transkrypcyjnego neurogeniny-212. Protokół ten jest szybki (daje dojrzałe neurony w ciągu 3 tygodni) i jest skuteczny, z prawie 100% wydajnością konwersji transdukowanych komórek (>95% komórek DAPI-dodatnich ma dodatni MAP2). Co więcej, protokół daje jednorodną populację neuronów pobudzających, która pozwoliłaby na zbadanie specyficznego dla typu komórki wkładu w zaburzenia neurologiczne. Zmodyfikowaliśmy oryginalny protokół, generując stabilnie transdukowane komórki hiPSC, co dało nam wyraźną kontrolę nad całkowitą liczbą neuronów. Komórki te są następnie wykorzystywane do generowania sieci neuronowych pochodzących z hiPSC na układach mikroelektrod. W ten sposób można zmierzyć i scharakteryzować spontaniczną aktywność elektrofizjologiczną sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC, zachowując przy tym międzyeksperymentalną spójność pod względem gęstości komórek. Przedstawiony protokół ma szerokie zastosowanie, szczególnie w badaniach mechanistycznych i farmakologicznych nad ludzkimi sieciami neuronowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój protokołów różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) do generowania ludzkich neuronów in vitro dostarczył potężnego nowego narzędzia do badania zaburzeń neurologicznych. Do niedawna badania nad tymi zaburzeniami były poważnie utrudnione ze względu na brak systemów modelowych wykorzystujących ludzkie neurony. Chociaż gryzonie mogą być wykorzystywane do badania zaburzeń neurologicznych, wyników takich badań nie można łatwo przełożyć na ludzi1. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, neurony pochodzące z hiPSC są obiecującym modelem alternatywnym, który można wykorzystać do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych oraz do badań przesiewowych leków in vitro.

W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka protokołów do przekształcania hiPSC w neurony2-8. Jednak protokoły te są nadal ograniczone pod wieloma względami. Po pierwsze, protokoły są często czasochłonne: generowanie neuronów o odpowiedniej dojrzałości (tj. tworzeniu synaps) i aktywności funkcjonalnej wymaga miesięcy procedur hodowlanych, co utrudnia badania na dużą skalę9. Ponadto wydajność konwersji hiPSC do neuronów jest niska. Protokoły często dają niejednorodną populację neuronów, a zatem nie pozwalają na badania określonych podzbiorów komórek neuronalnych. Co więcej, protokoły nie są powtarzalne, co daje różne wyniki dla różnych linii iPSC10,11. Wreszcie, etap dojrzewania i właściwości funkcjonalne powstałych neuronów są również zmienne 10.

Aby rozwiązać te problemy, Zhang et al. (2013)12 opracowali protokół, który szybko i powtarzalnie generuje ludzkie neurony z hiPSC poprzez nadekspresję czynnika transkrypcyjnego neurogeniny-2. Jak podają autorzy, różnicowanie zachodzi stosunkowo szybko (zaledwie 2-3 tygodnie po indukowaniu ekspresji neurogeniny-2), protokół jest powtarzalny (właściwości neuronalne są niezależne od wyjściowej linii hiPSC), a konwersja hiPSC do neuronu jest wysoce wydajna (prawie 100%). Populacja neuronów generowanych za pomocą ich protokołu jest jednorodna (przypominająca neurony korowe górnej warstwy), co pozwala na badanie specyficznego dla typu komórki wkładu w zaburzenia neuronalne. Co więcej, ich neurony pochodzące z hiPSC wykazywały dojrzałe właściwości (np. zdolność do tworzenia synaps i silną aktywność funkcjonalną) już po 20 dniach.

Scharakteryzowanie właściwości elektrofizjologicznych neuronów pochodzących z hiPSC na poziomie sieci jest ważnym warunkiem wstępnym, zanim technologia hiPSC będzie mogła zostać wykorzystana do badania chorób ludzkich. Z tego powodu wiele grup badawczych rozpoczęło ostatnio badania neuronów pochodzących z komórek macierzystych na poziomie sieci za pomocą urządzeń z matrycą mikroelektrod (MEA) (Multichannel Systems, Reutlingen, Niemcy)13-16. Elektrody MEA są osadzone w podłożu, na którym można hodować komórki neuronalne. MEA mogą być wykorzystywane do badania właściwości elektrofizjologicznych sieci neuronalnych i rozwoju ich aktywności in vitro. Obecnie MEA są używane tylko w połączeniu z protokołami różnicowania, które potrzebują kilku miesięcy, aby uzyskać dojrzałe sieci. W związku z tym połączenie MEA z protokołem szybkiego różnicowania powinno ułatwić wykorzystanie tej technologii w badaniach zaburzeń neurologicznych na dużą skalę.

Tutaj prezentujemy modyfikację protokołu Zhang et al. (2013)12 i dostosowujemy go do użytku na MEA. W szczególności, zamiast polegać na ostrej transdukcji lentiwirusowej, zamiast tego stworzyliśmy linie hiPSC stabilnie wyrażające rtTA/Ngn2 przed wywołaniem różnicowania. Zrobiliśmy to przede wszystkim po to, aby mieć powtarzalną kontrolę nad gęstością komórek neuronalnych, ponieważ gęstość komórek neuronalnych ma kluczowe znaczenie dla tworzenia sieci neuronalnej i dobrego kontaktu między neuronami a elektrodami MEA17,18. Chociaż protokół Zhang i wsp. jest bardzo skuteczny w odniesieniu do konwersji transdukowanych hiPSC, jest z natury zmienny w odniesieniu do końcowej wydajności neuronów z liczby początkowo posianych hiPSC (patrz rysunek 2E w Zhang i wsp.).12. Dzięki stabilnej linii eliminujemy wiele problemów powodujących zmienność, takich jak toksyczność lentiwirusowa i skuteczność infekcji. Następnie zoptymalizowaliśmy parametry, które niezawodnie wytwarzają sieci neuronowe pochodzące z hiPSC na MEA, uzyskując dojrzewanie sieci (np. zdarzenia synchroniczne obejmujące większość kanałów) do trzeciego tygodnia. Ten szybki i niezawodny protokół powinien umożliwić bezpośrednie porównania neuronów pochodzących z różnych (tj. specyficznych dla pacjenta) linii hiPSC, a także zapewnić solidną spójność w badaniach farmakologicznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystaniem Zwierząt, Radboud University Medical Center, Holandia, (RU-DEC-2011-021, numer protokołu: 77073).

1. Izolacja i hodowla komórek glejowych

UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół jest oparty na pracy McCarthy'ego i de Vellisa19, a bardzo podobny szczegółowy protokół dla astrocytów myszy jest dostępny20. Aby wytworzyć pierwotne kultury astrocytów korowych z embrionalnych (E18) mózgów szczurów, ciężarna szczur musi zostać złożona w ofierze, zarodki muszą zostać pobrane z macicy, a mózgi muszą zostać odizolowane od zarodków. Aby napełnić kolbę T75, należy połączyć korę z 2 embrionalnych mózgów. Alternatywnie można kupić dostępne w handlu oczyszczone i zamrożone astrocyty.

  1. Przygotować kolbę hodowlaną T75
    1. Rozcieńczyć poli-D-lizynę (PDL) w sterylnej, ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 10 μg/ml. Dodać 5 ml rozcieńczonego PDL do kolby hodowlanej T75. Delikatnie przesuwaj, aby zwilżyć całą powierzchnię wzrostu. Umieścić kolbę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 godziny.
    2. Odessać PDL z kolby. Przepłukać kolbę 3 razy 5 ml sterylnej wody, aby usunąć niezwiązany PDL. Całkowicie zassać wodę. Pozostawić kolbę do wyschnięcia w okapie z przepływem laminarnym lub natychmiast zużyć.
  2. Rozwarstwienie kory mózgowej
    1. Przygotuj 50 ml pożywki preparyjnej: Pożywka L-15 Lebovitz z 2% (v/v) suplementem B-27. Trzymaj na lodzie.
    2. Znieczulić szczura głęboko izofluranem w komorze indukcyjnej (małe pudełko z pleksiglasu) do momentu ustania oddychania (~5 - 8 min). Wyjmij szczura z komory indukcyjnej i natychmiast poddaj eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Spryskaj brzuch szczura 70% EtOH i zetrzyj nadmiar. Odsłoń macicę i usuń ją z matki przez cesarskie cięcie za pomocą nożyczek21.
    4. Wyciąć nożyczkami pojedyncze zarodki z worków owodniowych, przenieść na sterylną szalkę Petriego wypełnioną zimnym podłożem preparacyjnym i trzymać na lodzie.
    5. Ponownie przenieść zarodki na nową, sterylną 6 cm szalkę Petriego wypełnioną zimnym podłożem preparacyjnym. Ekstrakcja mózgów z zarodków pod mikroskopem stereoskopowym. Aby odsłonić mózg, delikatnie oderwij skórę i czaszkę za pomocą kleszczy. Delikatnie zgarnij cały mózg i przenieś na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze świeżym, zimnym podłożem preparacyjnym.
      nuta: Całe mózgi wypreparowane z zarodków mogą być przechowywane w pożywce separacyjnej na lodzie przez wiele godzin bez utraty żywotności komórek.
    6. Oddziel dwie półkule każdego mózgu, przecinając linię środkową nożyczkami sprężynowymi z cienką końcówką lub skalpelem. Ostrożnie zdjąć opony mózgowe prostymi kleszczami z cienką końcówką.
      nuta: Bardzo ważne jest całkowite usunięcie opon mózgowych. Zapobiega to zanieczyszczeniu hodowli astrocytów przez fibroblasty. Fibroblasty są szybko dzielącymi się komórkami i ostatecznie wypierają inne komórki.
    7. Usuń śródmózgowie/prążkowie i opuszkę węchową za pomocą nożyczek sprężynowych lub skalpela. Upewnij się również, że usunąłeś hipokamp (strukturę w kształcie litery C, która jest okołoprzyśrodkowa i ogonowa w stosunku do kory) za pomocą nożyczek sprężynowych lub skalpela. Zebrać półkule korowe w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wypełnionej 5 ml pożywki preparyjnej. Trzymaj na lodzie.
  3. Dysocjacja kory mózgowej
    1. Przygotuj 2 ml Ca2 + / Mg2+ wolnego od Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) z 0,25% trypsyny (pożywka dysocjacyjna). Przygotuj 50 ml zmodyfikowanego podłoża orła Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy (DMEM) z 15% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny (pożywka hodowlana) i wysterylizuj filtr.
    2. Pozwól tkance osiądnąć na dnie probówki wirówkowej. Ostrożnie odessać jak najwięcej podłoża preparacyjnego znad tkanki. Umyj chusteczkę 5 ml HBSS bez Ca2+/Mg2+ (bez trypsyny) i pozwól chusteczce osiąść na dnie probówki.
    3. Ostrożnie zassać HBSS. Dodaj 2 ml pożywki dysocjacyjnej i delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać enzym wokół tkanki. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Przesuń probówkę kilka razy podczas inkubacji, aby poruszyć tkankę.
    4. Natychmiast roztarć tkankę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl. Ustawić objętość pipety na około 800 μl. Zassać kawałki i mocno wysunąć na bok rurki, bezpośrednio nad przewodem płynu. Staraj się jednak zminimalizować bąbelki lub pienienie. Powtarzaj, aż tkanka zostanie wystarczająco zdysocjowana, około 15 - 20 razy. Dodaj 8 ml pożywki hodowlanej, aby dezaktywować trypsynę. Delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.
    5. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na górze probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przepłukać probówkę o pojemności 15 ml pożywką hodowlaną i przefiltrować pożywkę przez sitko do komórek, aby zebrać pożywkę w probówce o pojemności 50 ml z zawiesiną komórek. Przepłucz sitko komórkowe kilka razy pożywką hodowlaną. Po spłukaniu końcowa objętość powinna wynosić około 20 - 25 ml.
    6. Osadzać komórki w granulkach o gramaturze 200 x g przez 10 minut. Ostrożnie zassać jak najwięcej podłoża, nie dotykając osadu komórkowego. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej o pojemności 1 ml za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Dodać 11 ml podgrzanej pożywki hodowlanej i delikatnie wymieszać (aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków) za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    7. Przepłukać kolbę T75 pokrytą PDL jednorazowo 5 ml pożywki hodowlanej. Odessać pożywkę i przenieść zawiesinę komórek do kolby. Wszystkie komórki znajdujące się w zawiesinie są platerowane i uważamy, że na ogół nie ma potrzeby ich liczenia, ponieważ astrocytów nie można odróżnić od innych komórek w zawiesinie. Umieścić kolbę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 na dwa dni.
  4. Ekspansja i utrzymanie astrocytów
    1. Wymień całe podłoże po raz pierwszy 2 d po wstępnym poszyciu. Następnie wymieniaj całe podłoże co 3 dni. Zawsze podgrzewaj świeżą pożywkę do 37 °C przed dodaniem do komórek.
      nuta: Astrocyty potrzebują 7 - 10 d, aby osiągnąć około 90% konfluencji (astrocyty pojawiają się jako gęsto upakowana mozaikowa monowarstwa, z mikroglejem i oligodendrocytami leżącymi na wierzchu i zmieszanymi).
    2. Gdy astrocyty osiągną około 90% zbieżności, potrząśnij kolbą, aby usunąć zanieczyszczające komórki glejowe:
      1. Wyjąć kolbę z inkubatora i dokręcić nakrętkę (fenolową) lub przykryć port (z filtrem). Aby usunąć mikroglej, należy wstrząsnąć kolbą na platformie orbitalnej z prędkością 180 obr./min przez 1 godzinę. Zassać pożywkę. Przepłukać raz 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, odessać i zastąpić 12 ml pożywki hodowlanej.
      2. W celu usunięcia oligodendrocytów należy umieścić kolbę z powrotem na platformie orbitalnej i wstrząsać z prędkością 250 obr./min, w temperaturze 37 °C przez co najmniej 7 godzin, ale najlepiej O/N.
      3. Zassać pożywkę. Przepłukać raz 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, odessać i zastąpić 12 ml pożywki hodowlanej. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze.
      4. Gdy w 100% się zlewa, podziel astrocyty za pomocą standardowych procedur w stosunku 1:3 do 1:2 z 0,05% kwasem trypsyna-etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Kolba T75 o 100% zbiegu zwykle daje w sumie około 4,0 x 106 komórek. Zgodnie z tym harmonogramem kultury można zazwyczaj dzielić raz w tygodniu.
        nuta: Gdy astrocyty osiągną konfluencję, można je zebrać i wykorzystać do różnicowania hiPSC, jak opisano poniżej w kroku 3.4 protokołu. Astrocyty można podzielić co najmniej raz bez zauważalnej utraty żywotności. Można je utrzymywać w kulturze do 2 miesięcy. Z doświadczenia wynika, że pierwszorzędowe astrocyty szczurów w wieku 18 dnia stopniowo stają się terminalnie zróżnicowane i/lub tracą żywotność po wielokrotnym poszczepieniu. Chociaż możliwe jest zamrożenie astrocytów do wykorzystania w przyszłości, wolimy izolować astrocyty ze świeżych mózgów embrionalnych, gdy jest to wymagane.

2. Generowanie rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC

UWAGA: Wirusy hiPSC użyte w naszych eksperymentach zostały wygenerowane we własnym zakresie przez transdukcję lentiwirusową ludzkich fibroblastów z czynnikami przeprogramowującymi cMYC, SOX2, OCT4 i KLF4.

UWAGA: Do generowania rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC stosuje się wektory lentiwirusowe do stabilnej integracji transgenów z genomem hiPSC. Protokół produkcji lentiwirusa został opublikowany wcześniej22. Szczegółowe informacje na temat wektorów opakowaniowych lentiwirusa, które są używane do produkcji cząstek lentiwirusa rtTA i Ngn2, znajdują się w Tabeli materiałów/wyposażenia. Wektorem przenoszenia używanym dla lentiwirusa rtTA jest pLVX-EF1α-(Tet-On-Advanced)-IRES-G418(R); tj. wektor ten koduje transaktywator Tet-On Advanced pod kontrolą konstytutywnego promotora EF1α i nadaje oporność na antybiotyk G418. Wektorem transferowym stosowanym dla lentiwirusa Ngn2 jest pLVX-(TRE-thight)-(MOUSE)Ngn2-PGK-Puromycyna(R); tj. wektor ten koduje gen mysiej neurogeniny-2 pod kontrolą promotora kontrolowanego przez Tet oraz gen oporności na puromycynę pod kontrolą konstytutywnego promotora PGK. W związku z tym, używając tych dwóch wektorów przenoszenia, można utworzyć linię hiPSC, dla której ekspresja mysiej neurogeniny-2 może być indukowana przez uzupełnienie pożywki doksycykliną. Do transdukcji hiPSC stosuje się supernatant z cząstkami lentiwirusa (określany jako "zawiesina lentiwirusa" w dalszej części tekstu), tj. bez zagęszczania cząstek za pomocą ultrawirowania.

  1. Umieść na talerzu hiPSC (dzień 1)
    nuta: Objętości wymienione w tym protokole zakładają, że hiPSC są hodowane na płytce 6-dołkowej i że komórki z jednego dołka są zbierane. Ponadto zakłada się, że komórki są następnie siane w 12 dołkach na płytce 12-dołkowej.
    1. Przygotować 10 ml zimnego DMEM/F12 z 1% (v/v) matrycą membrany podstawnej (BMM), aby uzyskać rozcieńczony BMM. Dodać 800 μl rozcieńczonego BMM do dołka na płytce 12-dołkowej. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Przed użyciem inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Ogrzać 15 ml pożywki Essential 8 (E8) z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny, 9 ml DMEM/F12 i 1 ml roztworu do oddzielania komórek (CDS) do temperatury pokojowej. Uzupełnij pożywkę E8 w inhibitor kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK).
    3. Odessać zużytą pożywkę z hiPSC i dodać 1 ml CDS do hiPSC. Inkubować 3 - 5 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki odłączają się od siebie.
    4. Dodać 2 ml DMEM/F12 do studzienki, delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 7 ml DMEM/F12 do zawiesiny komórek. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
    5. Odessać supernatant i dodać 2 ml przygotowanej pożywki E8. Uzyskać zawiesinę komórek, w której hiPSC są dysocjowane (nie tworzą grudek komórek), przykładając końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl do boku probówki o pojemności 15 ml i delikatnie zawieszając komórki. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są zdysocjowane.
    6. Określ liczbę komórek (komórek/ml) za pomocą komory hemocytometru.
      nuta: Studzienka 6-dołkowa przy zbiegu 80 - 90% zwykle daje w sumie 3,0 - 4,0 x 106 komórek.
    7. Odessać rozcieńczony BMM z dołków płytki 12-dołkowej. Rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek 3,0 x 104 komórki/ml. Płytka: 1 ml zawiesiny komórek na dołek płytki 12-dołkowej. Umieścić 12-dołkową płytkę O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  2. Transdukcja komórek iPS za pomocą lentiwirusa rtTA i Ngn2 (dzień 2)
    1. Ogrzej 12 ml pożywki E8 z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do temperatury pokojowej. Uzupełnij pożywkę E8 inhibitorem ROCK i polibrenem do końcowego stężenia 8 μg/ml do pożywki E8.
    2. Rozmrozić podwielokrotności zawiesiną lentiwirusa. Dodać polibren do końcowego stężenia 8 μg/ml do zawiesiny lentiwirusa. Odessać zużyte podłoże i dodać 1 ml przygotowanego podłoża E8 do każdej studzienki.
    3. Przeprowadzić transdukcję z różnymi ilościami zawiesin lentiwirusa rtTAi Ngn2. Na przykład transdukować hiPSC, dodając 100 μl zarówno zawiesiny lentiwirusa rtTA, jak i lentiwirusa Ngn2-lentivirus do jednego dołka z 12-dołkowej płytki. W przypadku pozostałych studzienek należy użyć zawiesiny 200 μl, 300 μl, 400 μl i 500 μl lentiwirusa zamiast 100 μl. Nie należy dokonywać transdukcji hiPSC z dwóch studzienek płytki 12-dołkowej; Będą one służyć jako kontrolki podczas wyboru.
      nuta: Zaleca się, aby transdukcje były wykonywane dwukrotnie, tak aby można było dokładniej oszacować skuteczność transdukcji po rozpoczęciu selekcji (patrz krok 2.2.4 protokołu). Ilość zawiesiny lentiwirusa, która jest wymagana do skutecznej transdukcji większości hiPSC, zależy od miana zawiesiny lentiwirusa i użytej linii hiPSC. W tym badaniu zwykle używamy 100 - 500 μl zawiesiny lentiwirusa do transdukcji hiPSC.
    4. Umieścić 12-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 na 6 godzin. Przed końcem 6-godzinnego okresu inkubacji ogrzać 12 ml pożywki E8 z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny i 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) do RT. Uzupełnij pożywkę E8 inhibitorem ROCK.
    5. Zassać zużytą pożywkę E8. Umyj każdą studzienkę 1 ml DPBS. Dodaj 1 ml przygotowanej pożywki E8 do każdej studzienki. Umieścić 12-dołkową płytkę O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  3. Odśwież podłoże E8 (dzień 3)
    1. Ogrzać 12 ml pożywki E8 z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do RT. Odessać zużytą pożywkę z dołków płytki 12-dołkowej i dodać 1 ml przygotowanej pożywki E8 do każdej studzienki. Umieścić 12-dołkową płytkę O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  4. Przeprowadzić selekcję z puromycyną i G418 (dzień 4 - 8)
    nuta: W zależności od szybkości podziału komórek linii hiPSC i skuteczności transdukcji lentiwirusowej, komórki mogą osiągnąć 70-80% konfluencji w okresie selekcji, w którym to momencie kultury muszą zostać podzielone. Ponieważ nie można z góry przewidzieć czasu podziału, nie zostanie on wymieniony w protokole. Jednak zamiast odświeżać pożywkę E8 uzupełnioną wspomnianymi stężeniami puromycyny i G418, można podzielić hodowlę hiPSC jak normalną hodowlę hiPSC (w tym posiać komórki na płytkach pokrytych witronektyną). Jedynym wyjątkiem jest to, że pożywka E8 powinna być uzupełniona o wspomniane stężenia antybiotyków, aby kontynuować selekcję.
    1. Ogrzej 12 ml pożywki E8 z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do temperatury pokojowej. Dodaj puromycynę i G418 do wyboru; w okresie selekcji dodaje się różne ilości antybiotyków (tabela 1).
    2. Oszacuj wydajność transdukcji, szacując procent komórek opornych na G418 i puromycynę. Aby oszacować odsetek komórek opornych, należy oszacować odsetek martwych komórek (komórek nieopornych) dla różnych warunków (kultury transdukowane różnymi ilościami zawiesiny lentiwirusa) i dla komórek nietransdukowanych (komórki, które służą jako kontrola selekcji). Oblicz procent opornych komórek jako [100% - (procent martwych komórek)].
      nuta: Jeśli transdukcje z różnymi ilościami zawiesiny lentiwirusa zostały wykonane w dwóch egzemplarzach, skuteczność transdukcji można dokładniej oszacować. Warunek z komórkami nietransdukowanymi służy jako kontrola selekcji; Odsetek martwych komórek w hodowlach transdukowanych różnymi ilościami zawiesiny lentiwirusa powinien być niższy. Szacowany odsetek opornych komórek służy do wyboru hiPSC, które są prawdopodobnie dodatnie dla obu transgenów. Ogólnie rzecz biorąc, wybieramy hiPSC na podstawie warunków transdukcji, w których >90% komórek przeżywa okres selekcji 5 dni.
    3. Odessać zużytą pożywkę z hiPSC i dodać 1 ml przygotowanej pożywki E8 do studzienek. Umieścić 12-dołkową płytkę O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
Końcowe stężenie G418 Końcowe stężenie puromycyny Dzień 4 250 μg/ml 2 μg/ml Dzień 5 250 μg/ml 2 μg/ml Dzień 6 250 μg/ml 1 μg/ml Dzień 7 250 μg/ml 1 μg/ml Dzień 8 250 μg/ml 1 μg/ml

Tabela 1: Stężenia antybiotyków w okresie selekcji. Stężenia puromycyny i G418 w ciągu 5 dni okresu selekcji.

  1. Przerwij selekcję i rozpocznij regularną hodowlę (dzień 9 i później)
    1. Po 5-dniowym okresie selekcji hodować rtTA/Ngn2-dodatnie hiPSC jako normalne hiPSC, z wyjątkiem pożywki E8 komórek uzupełnionej G418 do końcowego stężenia 50 μg/ml i puromycyną do końcowego stężenia 0,5 μg/ml.
      nuta: Komórki można teraz zamrozić (zgodnie ze standardowymi protokołami kriokonserwacji komórek), aby służyły jako kopia zapasowa. Jest to ważny krok w kierunku odtwarzalności protokołu różnicowania, ponieważ pozwala na użycie tej samej partii rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC w wielu przyszłych eksperymentach różnicowania.

3. Różnicowanie rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC do neuronów na 6-dołkowych MEA i szklanych szkiełkach nakrywkowych

UWAGA: W niniejszym protokole podano szczegóły dotyczące różnicowania rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC na dwóch różnych podłożach, tj. 6-dołkowych MEA (urządzenia składające się z 6 niezależnych dołków z 9 zapisującymi i 1 referencyjnym wbudowanymi mikroelektrodami na studzienkę) oraz szklanych szkiełek nakrywkowych w dołkach 24-dołkowej płytki. Protokoły można jednak łatwo dostosować do większych podłoży (np. do studzienek z płytkami 12- lub 6-dołkowymi), skalując podane wartości w górę w zależności od powierzchni.

  1. Przygotuj MEA lub szklane szkiełka nakrywkowe (dzień 0 i dzień 1)
    1. Dzień przed rozpoczęciem różnicowania MEA należy wysterylizować zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Rozcieńczyć białko adhezyjne poli-L-ornitynę (PLO) w sterylnej ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 50 μg/ml. Pokryj obszar elektrody aktywnej 6-dołkowych MEA, umieszczając 100 μl kropli rozcieńczonego PLO w każdym dołku. Umieść szkiełka nakrywkowe w dołkach płytki 24-dołkowej za pomocą sterylnej pęsety. Dodać 800 μl rozcieńczonego PLO do każdej studzienki. Zapobiegaj unoszeniu się szkiełek nakrywkowych, dociskając je w dół za pomocą końcówki do pipet o pojemności 1000 μl.
    3. Inkubować 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę O/N w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 . Następnego dnia odessać rozcieńczony PLO. Umyć szklane powierzchnie 6-dołkowych MEA i szkiełka nakrywkowe dwukrotnie sterylną ultraczystą wodą.
    4. Rozcieńczyć lamininę w zimnym DMEM/F12 do końcowego stężenia 20 μg/ml (dla 6-dołkowych MEA) i 10 μg/ml (dla szklanych szkiełek nakrywkowych). Natychmiast pokryj aktywny obszar elektrody 6-dołkowych MEA, umieszczając kroplę 100 μl w każdym dołku. Podobnie, dodać 400 μl rozcieńczonej lamininy do każdego dołka 24-dołkowej płytki, aby pokryć szkiełka nakrywkowe. Zapobiegaj unoszeniu się szkiełek nakrywkowych, dociskając je w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 000 μl.
    5. Inkubować 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny.
  2. Umieść na talerzu hiPSC (dzień 1)
    nuta: Objętości wymienione w krokach 3.2.1 - 3.2.4 zakładają, że rtTA/Ngn2-dodatnie hiPSC są hodowane na płytce 6-dołkowej i że komórki z jednego dołka są zbierane. Objętości wymagane do posiewu komórek na 6-dołkowych MEA i/lub szkiełkach nakrywkowych zależą od liczby 6-dołkowych MEA i/lub liczby szkiełek nakrywkowych, które są używane w doświadczeniu; Liczby określone w krokach 3.2.6 - 3.2.8 umożliwiają skalowanie do różnych rozmiarów eksperymentu.
    1. Ciepłe podłoże DMEM/F12, CDS i E8 z 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną do R/T. Dodać doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml i inhibitor ROCK do pożywki E8.
    2. Odessać zużytą pożywkę rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC i dodać 1 ml CDS do hiPSC. Inkubować 3 - 5 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki odłączają się od siebie.
    3. Dodać 2 ml DMEM/F12 do studzienki, delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 7 ml DMEM/F12 do zawiesiny komórek. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
    4. Odessać supernatant i dodać 2 ml przygotowanej pożywki E8. Oddziel hiPSC, przykładając końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl do boku probówki o pojemności 15 ml i delikatnie zawieszając komórki. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są zdysocjowane.
    5. Określ liczbę komórek (komórek/ml) za pomocą komory hemocytometru.
      nuta: Studzienka 6-dołkowa przy zbiegu 80 - 90% zwykle daje w sumie 3,0 - 4,0 x 106 komórek.
    6. Odessać rozcieńczoną lamininę. W przypadku 6-dołkowych MEA rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórkową 7,5 x 105 komórek/ml. Płytkie ogniwa należy dodać, dodając kroplę 100 μl zawiesiny ogniw na obszar elektrody aktywnej w każdym dołku z 6-dołkowych MEA. W przypadku szkiełek nakrywkowych rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórek 4,0 x 104 komórki/ml. Płytkie komórki należy pokryć, dodając 500 μl zawiesiny komórek do dołków płytki 24-dołkowej.
      nuta: Końcowa gęstość komórek na MEA jest wyższa niż na szkiełkach nakrywkowych (ryc. 1A i B). Odkryliśmy, że tak duże zagęszczenie komórek było wymagane do prawidłowego rejestrowania aktywności sieci. W protokole podane są liczby, które okazały się optymalne dla testów.
    7. Umieścić 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 przez 2 godziny (MEA) lub O/N (płytka 24-dołkowa).
    8. Po 2 godzinach ostrożnie dodać 500 μl przygotowanej pożywki E8 do każdego dołka z 6-dołkowych MEA. Umieścić 6-dołkowe MEA O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
  3. Zmień medium (dzień 2)
    1. Następnego dnia przygotuj DMEM/F12 z 1% (v/v) suplementem N-2, 1% (v/v) aminokwasami endogennymi i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać ludzką rekombinowaną neurotrofinę-3 (NT-3) do końcowego stężenia 10 ng/ml, ludzki rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
    2. Dodać lamininę do końcowego stężenia 0,2 μg/ml do pożywki. Przefiltruj powstałe medium. Odessać zużytą pożywkę z dołków 6-dołkowych MEA i płytki 24-dołkowej i zastąpić ją przygotowanym podłożem. Inkubować 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę O/N w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
  4. Dodaj astrocyty szczura (dzień 3)
    nuta: Objętości wymienione w tym protokole zakładają, że astrocyty szczurów są hodowane w kolbach hodowlanych T75. Bardzo ważne jest, aby astrocyty szczurów dodawane do kultur były dobrej jakości. Używamy dwóch kryteriów, aby sprawdzić, czy astrocyty szczurów są dobrej jakości. Po pierwsze, hodowla astrocytów szczurów powinna być w stanie zlać się w ciągu dziesięciu dni po izolacji od embrionalnych mózgów szczurów. Po drugie, po podzieleniu kultury astrocytów szczurów, astrocyty szczurów powinny być w stanie utworzyć zlewającą się, mozaikową monowarstwę (ryc. 1C). Jeśli hodowla astrocytów szczurów nie spełnia tych dwóch kryteriów, radzimy nie używać tej kultury do eksperymentów różnicujących.
    1. Podgrzej 0,05% trypsyny-EDTA do RT. Ogrzej DPBS i DMEM/F12 z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do 37 °C.
    2. Odessać zużytą pożywkę z hodowli astrocytów szczura. Umyj kulturę, dodając 5 ml DPBS i delikatnie ją rozetrząśnij.
    3. Odessać DPBS i dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie przetrząśnij trypsyną-EDTA. Inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 - 10 minut.
    4. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są odłączone. Odłączyć ostatnie komórki, uderzając kilka razy w kolbę.
    5. Dodać 5 ml DMEM/F12 do kolby. Delikatnie roztrzeć komórki wewnątrz kolby za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wirować probówkę o masie 200 x g przez 8 minut.
    6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM/F12. Określ liczbę komórek (komórek/ml) za pomocą komory hemocytometru.
    7. Dodaj 7,5 x 104 astrocyty na dołek 6-dołkowych MEA. Dodaj 2,0 x 104 astrocyty na dołek 24-dołkowej płytki. Inkubować MEA i 24-dołkową płytkę O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  5. Zmień podłoże (dzień 4)
    1. Przygotuj pożywkę neuropodstawową z 2% (v/v) suplementem B-27, 1% (v/v) L-alanylo-L-glutaminą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać NT-3 do końcowego stężenia 10 ng/ml, BDNF do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Ponadto dodać cytozynę β-D-arabinofuranozyd do stężenia 2 μM.
      nuta: Cytozyna β-D-arabinofuranozyd jest dodawana do pożywki w celu zahamowania proliferacji astrocytów i zabicia pozostałych hiPSC, które nie różnicują się w neurony.
    2. Przefiltrować pożywkę i ogrzać ją do temperatury 37 °C. Odessać zużyte podłoże z dołków 6-dołkowych MEA i płytki 24-dołkowej i zastąpić je przygotowanym podłożem. Utrzymywać 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
  6. Odśwież podłoże (dzień 6 - 28)
    nuta: Począwszy od 6 dnia, odświeżaj połowę podłoża co dwa dni. Od 10 dnia pożywka jest uzupełniana FBS, aby wspierać żywotność astrocytów.
    1. Przygotuj pożywkę neuropodstawową z 2% (v/v) suplementem B-27, 1% (v/v) L-alanylo-L-glutaminą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać NT-3 do końcowego stężenia 10 ng/ml, BDNF do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Począwszy od 10 dnia, należy również uzupełnić pożywkę o 2,5% (v/v) FBS. Przefiltrować powstałe podłoże i ogrzać do temperatury 37 °C.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl usunąć połowę zużytego podłoża z dołków 6-dołkowych MEA i płytki 24-dołkowej i zastąpić ją przygotowanym podłożem. Utrzymywać 6-dołkowe MEA i 24-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .

4. Ustal profil neurofizjologiczny neuronów pochodzących z hiPSC

UWAGA: Dwa do trzech tygodni po indukcji różnicowania, neurony pochodzące z hiPSC mogą być wykorzystane do różnych dalszych analiz. W tej sekcji podano przykłady niektórych dalszych analiz, które można przeprowadzić w celu ustalenia profilu neurofizjologicznego neuronów pochodzących z hiPSC.

  1. Scharakteryzowanie aktywności sieci neuronalnej za pomocą MEA
    1. Zapisz 20 minut aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z hiPSC hodowanych na MEA. Podczas rejestracji należy utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C i zapobiegać parowaniu i zmianom pH pożywki poprzez nadmuchiwanie stałego, powolnego przepływu nawilżonego gazu (5%CO2, 20%O2, 75% N2) do MEA.
    2. Po wzmocnieniu 1200X (MEA 1060, MCS) próbkuj sygnał z częstotliwością 10 kHz za pomocą karty akwizycji danych MCS. Analizuj dane (wykrywanie skoków i serii) za pomocą niestandardowego pakietu oprogramowania23.
  2. Scharakteryzować aktywność elektrofizjologiczną pojedynczej komórki
    1. Przenieść szkiełka nakrywkowe zawierające kultury neuronów pochodzące z hiPSC do zanurzonej komory zapisu ze stałym stopniem w mikroskopie pionowym. Zapisz 20 minut spontanicznych prądów postsynaptycznych wywołanych potencjałem czynnościowym (sEPSC) 24. Wykryj zdarzenie synaptyczne za pomocą programu neuronaukowego.
  3. Scharakteryzuj morfologię neuronów i ekspresję synapsyn
    1. Napraw i wybarwij neurony pochodzące z hiPSC dla MAP2, synapsyny-1/2 i PSD-9522, 24, 25. Określ ilościowo liczbę punktów synapsyny-1/2 i PSD-95 za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj udało nam się zmodyfikować protokół, w którym hiPSC są różnicowane bezpośrednio w neurony korowe poprzez nadmierną ekspresję czynnika transkrypcyjnego neurogeniny-212 i dostosowaliśmy go do stosowania MEA. Takie podejście jest szybkie i skuteczne, co pozwala nam uzyskać funkcjonalne neurony i aktywność sieci już w trzecim tygodniu po indukcji różnicowania.

W trakcie procesu różnicowania, komórki morfologicznie zaczęły przypominać neurony: powstały małe procesy i neurony zaczęły się ze sobą łączyć (Rysunek 1A). Ustaliliśmy profil neurofizjologiczny neuronów pochodzących z zdrowej linii kontrolnej hiPSC, mierząc ich morfologię neuronów i właściwości synaptyczne podczas rozwoju. Neurony pochodzące z hiPSC wybarwiono pod kątem MAP2 i synapsyny-1/2 w różnych dniach po rozpoczęciu różnicowania (Figura 2A). Pozyskane neurony wykazują dojrzałą morfologię neuronów już 3 tygodnie po indukcji różnicowania. Liczbę synapsyny-1/2 puncta (miara liczby synaps) określono ilościowo na podstawie barwień immunocytochemicznych synapsyny-1/2. Liczba synapsyny-1/2 puncta wzrosła z czasem, co sugeruje, że poziom połączeń neuronalnych również wzrasta (ryc. 2B). Liczba synapsyny-1/2 puncta 23 dni po indukcji różnicowania była podobna w dwóch niezależnych liniach IPS (ryc. 2C). W 23 DIV większość punktów synapsyny1/2 zestawiono z punktami PSD-95, co wskazuje na funkcjonalne synapsy (ryc. 2D).

Zgodnie z wynikami opisanymi przez Zhanga i wsp., wygenerowaliśmy populację pobudzających neuronów korowych górnej warstwy, potwierdzonych przez panneuronalne i specyficzne dla podtypu markery korowe, takie jak BRN2 i SATB2 (warstwa II/III). Nie zaobserwowaliśmy neuronów, które były dodatnie dla neuronów głębokiej warstwy CTIP2 (warstwa V) lub Foxp2 (warstwa VI) (ryc. 2E i F)

Aby scharakteryzować aktywność elektrofizjologiczną neuronów pochodzących z hiPSC, użyliśmy zapisów cęgów prądu i napięcia całych komórek, tj. podczas rozwoju mierzono wewnętrzne właściwości i bodźce pobudzające te neurony. Neurony były w stanie generować potencjały czynnościowe już tydzień po różnicowaniu, a odsetek komórek wybijających się wzrastał z czasem (ryc. 2G i H). Co więcej, neurony otrzymały pobudzające wejście synaptyczne już tydzień po indukcji różnicowania: zarówno częstotliwość, jak i amplituda pobudzającego wejścia synaptycznego wzrosły podczas rozwoju (ryc. 2I - K).

Aby lepiej zrozumieć, jak aktywność pojedynczej komórki łączy się, tworząc funkcje na poziomie sieci, konieczne jest zbadanie, jak neurony działają razem. Sieci neuronalne hodowane in vitro na MEA stanowią cenny model eksperymentalny do badania dynamiki neuronalnej. Zarejestrowaliśmy 20 minut aktywności sieci elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z zdrowej linii kontrolnej hiPSC hodowanej na 6-dołkowych MEA (Figura 2M). Kilka tygodni po indukcji różnicowania neurony pochodzące z hiPSC z grupy kontrolnej utworzyły funkcjonalnie aktywne sieci neuronowe, wykazując spontaniczne zdarzenia (0,62 ± 0,05 skoku/s; Rysunek 2N). Na tym etapie rozwoju (tj. 16 dni po rozpoczęciu różnicowania) nie wykrywa się żadnych zdarzeń synchronicznych obejmujących wszystkie kanały MEA (ryc. 2O). Poziom aktywności sieci wzrósł w trakcie rozwoju: w czwartym tygodniu po indukcji różnicowania sieci neuronalne wykazywały wysoki poziom spontanicznej aktywności (2,5 ± 0,1 skoku/s; Rysunek 2N) we wszystkich studzienkach urządzenia. Sieci wykazywały również synchroniczne impulsy sieciowe (4,1 ± 0,1 impulsu/min, rysunek 2O) o długim czasie trwania (2100 ± 500 ms).

figure-results-1
Rycina 1: Różnicowanie hiPSC w neurony. A. Trzy punkty czasowe różnicowania hiPSC w neurony na szkiełkach nakrywkowych. Ur. Powlekanie hiPSC na MEA. C. Astrocyty przy 100% zbieganiu się w kolbie T75 (należy zauważyć, że komórki tworzą mozaikową monowarstwę). Podziałka skali: 150 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2. Charakterystyka neuronów pochodzących z hiPSC. Neurony pochodzące z hiPSC zostały wybarwione pod kątem MAP2 (zielony) i synapsyny-1/2 (czerwony) w różnych dniach po rozpoczęciu różnicowania. Pasek skali: 10 μm. B. Kwantyfikacja punktacji synapsyny w dwóch niezależnych eksperymentach. W każdym eksperymencie analizowano co najmniej 10 komórek. C. Kwantyfikacja synapsyny puncta w DIV23 w neuronach pochodzących z dwóch niezależnych linii IPS. D. Neurony pochodzące z hiPSC wybarwiono pod kątem PSD-95 (kolor zielony) i synapsyny-1/2 (kolor czerwony) 23 dni po rozpoczęciu różnicowania. Synapsin puncta zestawiono z punktami PSD-95. E. neurony pochodzące z hiPSC wybarwiono pod kątem MAP2 (zielony) i BRN2 (czerwony) lub SATB2 (czerwony) 23 d po rozpoczęciu różnicowania. Fot. Odsetek komórek MAP2 dodatnich, które były dodatnie dla wskazanych markerów. G. Reprezentatywne zapisy cęgów prądowych pokazujące, że potencjały czynnościowe mogą być generowane już po 7 dniach od rozpoczęcia różnicowania. H. Odsetek komórek w różnych dniach po indukcji różnicowania, które wykazują jeden lub więcej potencjałów czynnościowych. ja. Reprezentatywne ślady pobudzających prądów postsynaptycznych (EPSC) odbieranych przez neurony pochodzące z hiPSC w różnych dniach po różnicowaniu. J. Częstość występowania pobudzających prądów postsynaptycznych podczas rozwoju. K. Amplituda pobudzających prądów postsynaptycznych podczas rozwoju. L. Reprezentatywne ślady nagrań EPSC bez (kontrola) i z CNQX (CNQX). M. Neurony pochodzące z jednej linii hiPSC hodowano na 6-dołkowym MEA, a aktywność sieci wykazano dla sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC 16 i 23 d po indukcji różnicowania. Aktywność zarejestrowana z każdej studzienki (częstotliwość próbkowania 10 kHz) jest oznaczona innym kolorem (pokazano 5 minut z 20 minut nagrywania). n. Szybkość zapłonu 16 i 23 d po indukcji różnicowania. O. Szybkość rozerwania 16 i 23 d po indukcji różnicowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Biorąc pod uwagę wyniki, jakość powstałych neuronów pochodzących z hiPSC można ocenić, tworząc profil neurofizjologiczny komórek. Oznacza to, że trzy do czterech tygodni po rozpoczęciu różnicowania można ocenić morfologię, ekspresję synapsyny-1/2 i elektrofizjologię neuronów. Oczekuje się, że w tym momencie neurony pochodzące z hiPSC będą wykazywać morfologię podobną do neuronalnej, będą MAP2, synapsyna/PSD-95 dodatnie podczas wykonywania immunocytochemii i będą wykazywać spontaniczną aktywność elektrofizjologiczną (zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i sieci).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu wdrożyliśmy skuteczny protokół różnicowania hiPSC opublikowany przez Zhang et al. (2013)12 do pomiaru aktywności sieciowej sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC na MEA. Dostosowaliśmy oryginalny protokół, tworząc linię rtTA/Ngn2-dodatnią hiPSC przed wywołaniem różnicowania neuronów. Ten dodatkowy krok pozwala nam kontrolować gęstość komórek neuronalnych na MEA. Kontrola nad gęstością neuronów była ważnym warunkiem wstępnym dostosowania protokołu do MEA i zapewnienia spójności. Aby zmierzyć aktywność sieci neuronalnych za pomocą MEA, neurony muszą tworzyć gęste sieci bezpośrednio na elektrodach MEA17,18. To z konieczności wymaga ścisłej kontroli gęstości posiewu neuronów. Linia rtTA/Ngn2-dodatnia hiPSC pozwala na kontrolę gęstości neuronów, ponieważ taktyka ta nie opiera się na ostrych transdukcjach lentiwirusowych hiPSC przed różnicowaniem; linia rtTA/Ngn2-dodatnia hiPSC prawie eliminuje wszelkie różnice w końcowej wydajności, wynikające na przykład z toksyczności lentiwirusowej i zmiennej skuteczności infekcji.

Kolejnym krytycznym etapem procedury eksperymentalnej jest liczba astrocytów szczurów, które są współhodowane z różnicującymi się hiPSC. Astrocyty aktywnie przyczyniają się do udoskonalania rozwijających się obwodów nerwowych poprzez kontrolowanie tworzenia, utrzymywania i eliminowania synaps, z których wszystkie są ważnymi procesami dla funkcjonowania neuronów. Protokół przedstawiony w tym artykule jest wysoce zależny od astrocytów: aby w pełni dojrzeć i utworzyć funkcjonalne synapsy, neurony wymagają wsparcia ze strony astrocytów. Doświadczyliśmy, że liczba astrocytów powinna być w przybliżeniu równa liczbie neuronów pochodzących z hiPSC, aby wspierać dojrzewanie neuronów i tworzenie sieci neuronalnych wykazujących spontaniczną aktywność. Ponieważ nasz protokół astrocytów daje pierwotne hodowle komórek o ograniczonej żywotności, izolacja astrocytów szczurów musi być przeprowadzana regularnie.

Nasza adaptacja protokołu opublikowanego przez Zhang et al. (2013)12 do użytku z technologią MEA prawdopodobnie znacznie poprawi naszą zdolność do badania aktywności sieciowej sieci pochodzących z hiPSC. Wcześniej protokoły stosowane do badania sieci neuronalnych pochodzących z hiPSC za pomocą MEA opierały się na czasochłonnych procedurach różnicowania13-16. Protokół z Zhang et al. (2013) zapewnia szybką alternatywę, a nasza modyfikacja usuwa źródło zmienności, co sprawia, że obecnie bardziej wykonalne jest stosowanie neuronów pochodzących z hiPSC w połączeniu z technologią MEA, zwłaszcza w badaniach wysokoprzepustowych lub farmakologicznych. Ponadto, ponieważ metoda opublikowana przez Zhang i in. (2013)12 daje jednorodną populację neuronów korowych górnej warstwy, nasz dostosowany protokół umożliwia ukierunkowane badania nad aktywnością sieci tego konkretnego podzbioru neuronów.

Niemniej jednak takie podejście ma również kilka ograniczeń. Po pierwsze, jednorodność kultur można również uznać za wadę, ponieważ jest mniej prawdopodobne, że kultury będą przypominać sieci in vivo , w których różne klasy neuronów (tj. neurony hamujące i pobudzające) tworzą sieć heterogeniczną. Aby jeszcze bardziej zwiększyć wykorzystanie neuronów pochodzących z hiPSC za pomocą technologii MEA, ważne będzie opracowanie protokołów szybkiego różnicowania (opartych na transgenach) dla innych populacji komórek neuronalnych. Jeśli protokoły staną się dostępne, sieci in vitro będą bardziej naśladować sieci in vivo . Po drugie, obecnie astrocyty szczurów muszą być dodawane do neuronów pochodzących z hiPSC w celu wsparcia wzrostu, a zatem powstała sieć neuronalna nie jest ludzką siecią neuronalną sensu stricto. Wiarygodne protokoły różnicowania hiPSC w astrocyty mogą w przyszłości rozwiązać ten problem26. Po trzecie, dwuwymiarowe sieci neuronowe, jak opisano tutaj, są ograniczonym modelem do badania złożonych trójwymiarowych sieci neuronalnych in vivo . Na szczęście dostępne są już protokoły opisujące trójwymiarowe hodowle pierwotnych neuronów szczurów w połączeniu z technologią MEA27,28. Perspektywicznie, połączenie protokołów szybkiego różnicowania w celu uzyskania neuronów i astrocytów pochodzących z hiPSC z technikami hodowli trójwymiarowej i technologią MEA powinno dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów biologicznych leżących u podstaw zaburzeń neurologicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Jessice Classen za przeprowadzenie eksperymentów z klamrą na całej komórce. Detektory hiPSC użyte w naszych eksperymentach zostały dostarczone dzięki uprzejmości Huiqing Zhou i Willema van den Akkera z Uniwersytetu Radboud w Nijmegen. Wektory transferu użyte w tym protokole zostały udostępnione dzięki uprzejmości Olivera Brüstle, Philippa Kocha i Julii Ladewig z Centrum Medycznego Uniwersytetu w Bonn.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lebovitz's L-15 mediumGibco11415-064
B-27 suplementGibco0080085SA
Poli-D-Lizyna (PDL)Sigma-AldrichP6407
Ca2+/Mg2+-free HBSS Gibco14175-095
0,05% Trypsyna-EDTA Gibco25300-054
2,5% TrypsynaGibco15090-046
DMEM o wysokiej zawartości glukozyGibco11965-092
FBS (surowica bydlęca płodu)Sigma-AldrichF2442-500ML
Penicylina/StreptomycynaSigma-AldrichP4333
70 &mikro; m sitko komórkoweBD Falcon352350
DPBSGibco14190-094
wektor pakowania lentiwirusowego psPAX2Addgene Plasmid #12260
pMD2.G wektor pakowania lentiwirusaAddgene Plazmid#12259
Macierz błony podstawnejGibcoA1413201
DMEM/F12Gibco11320-074
Roztwór do odrwadniania komórekSigma-AldrichA6964
E8 mediumGibcoA1517001
inhibitor ROCKGibcoA2644501 Alternatywnie można zastosować inhibitory ROCK, takie jak tiazowiwina.
PolybreneSigma-AldrichH9268-5G
G418Sigma-AldrichG8168-10ML
PuromycinSigma-AldrichP9620-10ML
VitronectinGibcoA14700
6-dołkoweMEA Wielokanałowe systemy60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
Szkiełka nakrywkowe szklaneVWR631-0899
Poli-L-Ornityna (PLO)Sigma-AldrichP3655-10MG
LamininSigma-AldrichL2020-1MG
DoksycyklinaSigma-AldrichD9891-5G
Suplement N-2Gibco17502-048
Aminokwasy endogenneSigma-AldrichM7145
NT-3, ludzki rekombinantPromokineC66425
BDNF, ludzka rekombinowanaPromokineC66212
Trypsyna-EDTAGibco25300-054
L-alanylo-L-glutaminaGibco35050-038
Pożywka neuropodstawowaGibco21103-049
Cytozyna β-D-arabinofuranozyd Sigma-AldrichC1768-100MG
Proste kleszcze z cienką końcówkąFine Science Tools11251
Nożyczki sprężynowe z cienką końcówką Narzędzia Fine Science91500-09

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. Studying human disease using human neurons. Brain Res. , (2016).
  2. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  3. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  4. Wu, H., et al. Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).
  5. Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  6. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  7. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  8. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  9. Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture. J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).
  10. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  11. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).
  12. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  13. Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).
  14. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Sci Rep. 6, 26181(2016).
  15. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Front Neurosci. 10, (2016).
  16. Heikkila, T. J., et al. Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro. Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).
  17. Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays. Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).
  18. Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J Neural Eng. 9 (2), (2012).
  19. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  20. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J. Vis. Exp. (71), e50079(2013).
  21. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J Vis Exp. (63), e3965(2012).
  22. Ba, W., et al. ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function. Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).
  23. Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer. Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).
  24. Ba, W., et al. TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function. Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).
  25. Benevento, M., et al. Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling. Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).
  26. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  27. Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology. Sci Rep. 4, 5489(2014).
  28. Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model. J Vis Exp. (104), e53080(2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja neurogeniny 2aktywno elektrofizjologicznapomiar aktywno ci siecineurony pochodz ce z hiPSCprotok szybkiej dyferencjacjikontrola g sto ci kom rektworzenie funkcjonalnych synaps

Powiązane artykuły