Artykuł metodologiczny

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

44.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54903

⸱

26 grudnia 2016

 ,  , 
1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology, Oregon Health and Science University

W tym artykule

Podsumowanie

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Streszczenie

Rak piersi jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem wśród kobiet na całym świecie. Przerzuty do wątroby są zaangażowane w ponad 30% przypadków z przerzutami raka piersi i skutkują słabymi wynikami z medianą przeżycia wynoszącą zaledwie 4,8 - 15 miesięcy. Obecne modele gryzoni z przerzutami raka piersi, w tym ksenoprzeszczep pierwotnych komórek nowotworowych i spontaniczne modele nowotworów, rzadko dają przerzuty do wątroby. Modele iniekcji dosercowej i dośledzionowej powodują przerzuty do wątroby, jednak modele te mogą być mylone przez współistniejące przerzuty do miejsca wtórnego lub przez osłabioną odporność z powodu usunięcia śledziony, aby uniknąć wzrostu guza w miejscu wstrzyknięcia. Aby zaspokoić zapotrzebowanie na ulepszone modele przerzutów do wątroby, opracowano metodę wstrzykiwania żyły wrotnej myszy, która dostarcza komórki nowotworowe najpierw i bezpośrednio do wątroby. Model ten dostarcza komórki nowotworowe do wątroby bez powikłań związanych z równoczesnymi przerzutami do innych narządów lub usunięciem śledziony. Zoptymalizowany protokół żyły wrotnej wykorzystuje małe objętości iniekcji 5 - 10 μl, ≥ igieł o rozmiarze 32 i gazę hemostatyczną w miejscu wstrzyknięcia w celu kontroli utraty krwi. Przetestowano metodę iniekcji żyły wrotnej u samic myszy Balb/c przy użyciu trzech syngenicznych linii guza sutka o różnym potencjale przerzutowym; komórki 4T1 o wysokich przerzutach, komórki D2A1 o umiarkowanych przerzutach i komórki D2.OR o niskim przerzutach. Stężenie ≤ 10 000 komórek/wstrzyknięcie powoduje opóźnienie ~ 20 - 40 dni w przypadku rozwoju przerzutów do wątroby z wyższymi przerzutami linii 4T1 i D2A1 oraz > 55 dni w przypadku mniej agresywnej linii D2.OR. Model ten stanowi ważne narzędzie do badania przerzutów raka piersi do wątroby i może mieć zastosowanie do innych nowotworów, które często dają przerzuty do wątroby, w tym gruczolakoraka jelita grubego i trzustki.

Wprowadzenie

Rak piersi z przerzutami do wątroby

Wątroba jest częstym miejscem przerzutów raka piersi, wraz z kośćmi i płucami1-3. Przerzuty do wątroby u pacjentek z rakiem piersi są niezależnym czynnikiem prognostycznym dla bardzo złych wyników4,5, ponieważ mediana przeżycia pacjentek z rakiem piersi z przerzutami do wątroby wynosi od 4,8 do 15 miesięcy6-9. Natomiast u pacjentek z rakiem piersi z przerzutami do płuc lub kości mediana przeżycia wynosi odpowiednio od 9 do 27,4 miesiąca (8,9 i od 16,3 do 56 miesięcy) (8,10-12 miesięcy). Przerzuty to wieloetapowy proces, określany jako kaskada przerzutowa, który rozpoczyna się od rozsiewu komórek nowotworowych w guzie pierwotnym, a kończy się śmiertelnością pacjenta z powodu wysiewu i wyrastania krążących komórek nowotworowych w odległym narządzie13-15. Modele przerzutów u gryzoni ujawniły, że kaskada przerzutów jest wyjątkowo nieefektywna, a tylko 0,02 - 10% krążących komórek nowotworowych tworzy jawne przerzuty16,17. Jednym z głównych wąskich gardeł nieskuteczności przerzutów są unikalne mikrośrodowiska tkankowe w miejscach wtórnych, zwane niszami przerzutowymi18, co podkreśla znaczenie zrozumienia przerzutów specyficznych dla danego miejsca. Nisza przerzutowa jest unikalna dla miejsca nawrotu i częściowo charakteryzuje się odkładaniem się odrębnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej19,20, infiltracją różnych populacji komórek odpornościowych21-23 i zmienioną homeostazą tkanek, w tym rozregulowaną produkcją licznych cytokin, chemokin i czynników wzrostu15,18,24,25. W ten sposób zrozumienie specyficznej tkankowo niszy przerzutów poprzedza zrozumienie, jak celować w chorobę przerzutową. Brakuje jednak solidnych modeli przerzutów do wątroby. Co więcej, ulepszone modele przerzutów do wątroby będą miały zasadnicze znaczenie dla identyfikacji nowych celów i skutecznych metod leczenia pacjentek z rakiem piersi z przerzutami do wątroby.

Sprawdzone modele do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Obecnie dostępne modele do badania przerzutów raka piersi do wątroby obejmują ksenografty ludzkich komórek rakowych u myszy z obniżoną odpornością. Modele te zazwyczaj wykorzystują dobrze zbadane linie komórkowe ludzkiego raka piersi, takie jak MCF-7 i MDA-MB-231 oraz mysi gospodarze Nude, Rag1-/- lub SCID z obniżoną odpornością26-29. Modele ksenoprzeszczepów mają tę zaletę, że obejmują linie komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego, jednak biorąc pod uwagę niedawne uznanie dla komórek odpornościowych w przerzutach30-32 i oporności terapeutycznej33-35, badanie przerzutów u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza ma kluczowe znaczenie. Modele do badania przerzutów raka piersi do wątroby u gospodarzy kompetentnych immunologicznie obejmują ortotopowe wstrzykiwanie syngenicznych komórek nowotworowych (np. linii komórkowych 4T1 i D2A1) do poduszeczki tłuszczowej sutka, z chirurgiczną resekcją guza pierwotnego lub bez niej, a następnie ocenę przerzutów36-38. Warto zauważyć, że częstość przerzutów do wątroby z modeli przeszczepów ortotopowych jest bardzo niska lub nie występuje wcale w porównaniu z innymi miejscami przerzutów, takimi jak płuca39,40, lub występuje po ustaleniu przerzutów do płuc, co komplikuje badanie przerzutów specyficznych dla wątroby37,39.

Eksplantaty guza ze spontanicznie genetycznie modyfikowanych modeli raka piersi mogą być ponownie wstrzykiwane do poduszeczek tłuszczowych ssaków naiwnych gospodarzy jako syngeniczne komórki nowotworowe. Na przykład niedawno doniesiono, że spontaniczne guzy myszy K14CreECadf / fP53f / f, które modelują inwazyjnego raka zrazikowego piersi, rozwijają guzy po ortotopowym wstrzyknięciu do gospodarzy typu dzikiego. Po chirurgicznej resekcji tych guzów po osiągnięciu 15 mm2, u 18% myszy doszło do przerzutów do wątroby40,41. Trzecie podejście do modelowania przerzutów do wątroby wykorzystuje spontaniczne przerzuty u genetycznie zmodyfikowanych myszy. Do tej pory doniesienia o spontanicznych mysich modelach przerzutów raka piersi, które łatwo rozprzestrzeniają się do wątroby, są rzadkie. Wyjątki obejmują H19-IGF2, p53fp/fp MMTV-Cre Wap-Cre i K14CreECadf/fP53f/f genetycznie modyfikowane modele myszy, w których przerzuty do wątroby rozwijają się u niewielkiego odsetka myszy38,41-43. Tak więc, podczas gdy genetycznie modyfikowane modele myszy ułatwiają badanie wszystkich etapów kaskady przerzutowej, dostarczając potężnych i klinicznie istotnych modeli, są one ograniczone ze względu na niskie wskaźniki przerzutów do wątroby38.

Kilka modeli przerzutów omija początkowe etapy kaskady przerzutowej, w tym rozsiewanie komórek nowotworowych z guza pierwotnego i wewnątrznaczynienie. Modele te pozwalają na badanie późniejszych etapów kaskady przerzutowej, od wynaczynienia do powstania guzów w miejscach wtórnych. Model iniekcji dosercowej dostarcza komórki nowotworowe do lewej komory, która rozprowadza komórki nowotworowe do układu krążenia przez aortę. Wstrzyknięcie dosercowe wymaga obrazowania miejsca wstrzyknięcia pod kontrolą USG lub innych metod obrazowania, takich jak bioluminescencja komórek znakowanych lucyferazy, w celu potwierdzenia udanego wstrzyknięcia. Wstrzyknięcie komórek nowotworowych przez lewą komorę może spowodować przerzuty do kości, mózgu, płuc i/lub wątroby, między innymi44-48. Z powodu przerzutów wielonarządowych, myszy te często muszą zostać poddane eutanazji przed rozwojem jawnych przerzutów do wątroby, negując zdolność do pełnego zbadania wzrostu przerzutów w wątrobie. Alternatywnym podejściem, które znacznie minimalizuje rozwój przerzutów wielomiejscowych, jest model iniekcji dośledzionowej. Wstrzyknięcie dośledzionowe dostarcza komórki nowotworowe przez żyłę śledzionową, która łączy się z żyłą krezkową górną, tworząc żyłę wrotną49,50. Zwierzęta mogą być monitorowane pod kątem rozrostu zmian przerzutowych w wątrobie, ponieważ powstawanie przerzutów w innych miejscach jest rzadkie, w wyniku czego ogólny stan zdrowia zwierzęcia jest utrzymany49,50. Należy jednak zauważyć, że model wewnątrzśledzionowy wymaga splenektomii, aby uniknąć guzów śledziony49,50, procedury, która wpływa na funkcje odpornościowe. Na przykład uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne mięśnia sercowego charakteryzuje się naciekaniem podzbiorów monocytów Ly6C +, które pochodzą ze śledziony i są odpowiedzialne za aktywność fagocytarną i proteolityczną podczas gojenia się ran po niedokrwieniu51,52. W przypadku splenektomii obserwuje się zmniejszenie populacji monocytów, które pomagają w gojeniu się ran52. Ponadto wykazano, że splenektomia zmniejsza wzrost guza pierwotnego i przerzuty do płuc w modelu niedrobnokomórkowego raka płuca, w szczególności poprzez zmniejszenie liczby krążących i wewnątrzguzowych komórek monocytowych mieloidalnych CCR2 + CD11b + Ly6C + 53. Ponadto splenektomia po wstrzyknięciu dośledzionowym komórek raka jelita grubego spowodowała obniżenie poziomu przeciwnowotworowych komórek NK w krezkowych węzłach chłonnych i zwiększenie przerzutów do wątroby54. Podsumowując, odkrycia te sugerują, że splenektomia upośledza rolę układu odpornościowego, co z kolei ma konsekwencje dla losu komórek przerzutowych.

Model iniekcji żyły wrotnej z przerzutami do wątroby

Aby zbadać przerzuty raka piersi do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w warunkach, w których myszy nie są zagrożone z powodu przerzutów wielonarządowych, opracowano model iniekcji żyły wrotnej. Modele iniekcji wewnątrzwrotnej były wcześniej wykorzystywane do badania przerzutów do wątroby linii komórkowychjelita grubego 55,56 i czerniaka16; W tym miejscu opisano zastosowanie iniekcji wewnątrzwrotnej do modelowania przerzutów do komórek nowotworowych sutka. Model ten może być wykorzystany do badania późniejszych etapów kaskady przerzutów, w tym wynaczynienia i wysiewu komórek raka piersi, decyzji o losie komórek nowotworowych dotyczących śmierci/proliferacji/uśpienia oraz wzrostu do jawnych zmian. W tym modelu syngeniczne linie komórkowe guza sutka są wstrzykiwane przez żyłę wrotną kompetentnych immunologicznie samic myszy Balb / c, metoda, która dostarcza komórki nowotworowe najpierw i bezpośrednio do wątroby bez usuwania śledziony. Aby opracować ten model, wykorzystano cztery linie komórek guza sutka, które mają zdolność przerzutową od niskiej do wysokiej: D2.OR, D2A1 i 4T1, a także wykorzystano D2A1 znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (D2A1-GFP) w celu zbadania wczesnych punktów czasowych po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. 4T1 to wysoce przerzutowa linia komórkowa pochodząca z guza 410.4, która spontanicznie powstała u samicy myszy MMTV+ Balb / c36,37 i daje przerzuty do płuc, wątroby, mózgu i kości z guzów pierwotnych poduszeczki tłuszczowej sutka39,57,58. Komórki nowotworowe D2A1 również pierwotnie pochodziły z spontanicznego guza sutka powstającego w gospodarzu Balb / c po przeszczepie hiperplastycznych komórek guzków pęcherzykowych D2 i potwierdzono, że są przerzutowe z guza pierwotnego do płuc59,60. Komórki nowotworowe D2.OR są nieprzerzutową linią siostrzaną do linii D2A1 i chociaż uciekają z guza pierwotnego i docierają do miejsc wtórnych, rzadko tworzą odległe przerzuty60,61.

Dodatkowo, ważne jest, aby unikać powszechnie stosowanych leków przeciwbólowych, w tym niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) podczas lub po zabiegu chirurgicznym. NLPZ mają działanie przeciwnowotworowe w niektórych nowotworach piersi62-65, a niektóre klasy NLPZ zwiększają ryzyko hepatotoksyczności66,67, potencjalnie zagrażając badaniu przerzutów do wątroby i niszy przerzutów do wątroby. Ponadto badania sugerują, że NLPZ bezpośrednio wpływają na mikrośrodowisko tkanek, redukując proprzerzutowe białka macierzy zewnątrzkomórkowej tenascynę-C68 i kolagen fibrylarny62,65. Alternatywnie, zastosowanie pochodnej opioidów, buprenorfiny, zastosowano ze względu na jej skuteczność w leczeniu bólu u gryzoni69 oraz ze względu na brak dowodów na to, że opioidy mają działanie przeciwnowotworowe70. Ten model iniekcji żyły wrotnej został zoptymalizowany pod kątem mniejszych objętości wstrzyknięć wynoszących 5 - 10 μl, aby uniknąć niepotrzebnego uszkodzenia wątroby. Model został również zoptymalizowany pod kątem igieł o mniejszej średnicy (≥ 32 mm) i użycia gazy hemostatycznej bezpośrednio po wstrzyknięciu, aby zminimalizować utratę krwi podczas zabiegu. W przeciwieństwie do tych zoptymalizowanych parametrów iniekcji, liczba komórek powinna być określana indywidualnie, w oparciu o potencjał rakotwórczy linii komórkowej. Jednak w przypadku badań długoterminowych zaleca się rozpoczęcie od ≤ 10 000 komórek/wstrzyknięcie. W przypadku krótszych punktów końcowych (np. 24 godziny po wstrzyknięciu) można użyć znacznie więcej komórek nowotworowych (np. 1 x 105 - 1 x 106), jeśli jest to uzasadnione. Podsumowując, opisany tutaj model iniekcji żyły wrotnej stanowi przydatne narzędzie do badania przerzutów raka piersi do wątroby i omija szereg ograniczeń innych modeli przerzutów do wątroby. Model ten ułatwia badania nad wynaczynieniem komórek nowotworowych, siewem, wczesnymi decyzjami losu dotyczącymi przeżycia, proliferacji i spoczynku oraz przerzutowym wzrostem u mysich gospodarzy kompetentnych immunologicznie.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym artykule zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zdrowia i Nauki w Oregonie.

1. Przygotowanie pola operacyjnego i narzędzi

  1. Przygotować nożyczki, kleszcze i hemostat przez autoklawowanie w temperaturze 124 °C przez 30 minut, 1 - 2 dni przed planowanymi operacjami. Zapewnij dostęp do autoklawowanej lub sterylnej ściółki, klatek i żywności do rekonwalescencji pooperacyjnej.
  2. Przygotuj aseptyczne pole operacyjne, najlepiej w okapie z przepływem laminarnym.
    1. Przetrzyj wszystkie powierzchnie obszaru operacyjnego 10% wybielaczem, w tym poduszkę grzewczą, źródło światła, rurkę anestezjologiczną i stożek nosowy oraz wszelkie inne części sali operacyjnej, które będą znajdować się w bliskiej odległości od zabiegu chirurgicznego podczas jego wykonywania.
    2. W aseptycznym obszarze operacyjnym umieścić oczyszczoną poduszkę grzewczą ze sterylną serwetarą, źródłem światła, rurką anestezjologiczną i nosem, strzykawkami insulinowymi, strzykawkami 1 ml, bupiwakainą, sztucznymi łzami, sterylną solą fizjologiczną, 2 x 2" sterylne gąbki z gazy, 4 x 4" sterylna gaza, gaza hemostatyczna pocięta na 0,5 - 1 cm2 sztuki, nożyczki, kleszcze, hemostat, 4-0 szwy vicryl ze stożkową igłą, i 50 ml 2% glukonianu chlorheksydyny w autoklawowanym pojemniku.
    3. Upewnij się, że w tej przestrzeni jest miejsce na przygotowane komórki nowotworowe przechowywane na lodzie.
    4. Na stole przylegającym do pola operacyjnego przygotuj obszar rekonwalescencji za pomocą drugiej poduszki grzewczej i wyczyść klatki sterylnym posłaniem.
      UWAGA: W tym obszarze można również przechowywać przedmioty, takie jak sterylizator koralików.

2. Wstrzyknięcie żyły wrotnej

  1. Na godzinę przed planowanym wstrzyknięciem należy potraktować samice myszy Balb/c w wieku 8 - 15 tygodni 100 μl 0,015 mg/ml buprenorfiny podskórnie w celu leczenia bólu.
    UWAGA: Ten protokół wstrzyknięcia może być zastosowany do dowolnego szczepu samicy lub samca myszy w każdym wieku, przy użyciu odpowiednich linii komórkowych do zmian w szczepie.
  2. Przygotuj komórki nowotworowe do wstrzyknięcia w oparciu o protokoły dla wybranej linii komórkowej lub eksplantatu guza. Przed podaniem należy przetestować wszystkie linie komórek nowotworowych pod kątem obecności mysich patogenów, aby zmniejszyć ryzyko wprowadzenia takich patogenów do kolonii zwierząt.
    1. W przypadku syngenicznych linii komórek nowotworowych Balb / c, w tym komórek nowotworowych D2A1, D2.OR i 4T1, rozmrozić komórki na 10 cm płytce do hodowli tkankowej 3 dni przed wstrzyknięciem, tak aby następnego dnia komórki osiągnęły ~ 90 - 100% konfluencji.
    2. 1 dzień po rozmrożeniu komórek nowotworowych przemyć komórki raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i trypsynizować zbiegające się komórki nowotworowe za pomocą 2 ml 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 min. Dodać 8 ml kompletnej pożywki (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy i 1x penicylina/streptomycyna) i przejść 1:10 do świeżego 10 cm naczynia z 10 ml kompletnej pożywki.
    3. W dniu wstrzyknięć przemyj komórki raz 1x PBS i trypsynizuj zgodnie z powyższym opisem.
    4. Zawiesić trypsynizowane komórki w 8 ml kompletnej pożywki, wirować przez 5 minut w temperaturze 1 500 x g, usunąć pożywkę i ponownie zawiesić w 5 ml 1x PBS.
    5. Policz komórki na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego w celu oceny żywotności. Zawiesić komórki do wstrzykiwań w 1x PBS o określonym stężeniu i objętości.
      UWAGA: Zalecane jest 5 - 10 μl, ponieważ mniejsze objętości iniekcji zapobiegają niepotrzebnemu uszkodzeniu wątroby.
    6. Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas trwania wstrzyknięć. Po zakończeniu wstrzykiwań należy zwrócić próbkę komórek do laboratorium i umieścić w hodowli w kompletnych pożywkach na 1 dzień, aby zapewnić żywotność.
  3. Umieść mysz w znieczuleniu z 2 - 2,5% izofluranem (2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etanem) podawanym w tlenie. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej. Zapewnij całkowite znieczulenie, oceniając reakcję na uszczypnięcie palca u nogi, a następnie utrzymuj znieczulenie na poziomie 2 - 2,5% izofluranu.
    UWAGA: Ważne jest, aby monitorować częstość oddechów zwierząt i odpowiednio dostosowywać natężenie przepływu izofluranu przez cały czas trwania zabiegu.
  4. Umieść niewielką ilość sztucznych łez lub maści weterynaryjnej na każdym oku, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia oczu podczas zabiegu chirurgicznego.
  5. Ułóż mysz w pozycji leżącej, na plecach z odsłoniętym brzuchem.
  6. Usuń włosy z brzusznej lewej strony gryzonia od drugiego żebra w dół do 4. pachwinowego brodawki sutkowej, przecierając ten obszar depilacją chemiczną. Pozostaw depilator na 1-2 minuty, a następnie całkowicie usuń za pomocą gazy iH2O. Ten krok można wykonać 1-2 dni wcześniej, aby zaoszczędzić czas, jeśli planowane są liczne operacje.
  7. Weź jedną sterylną gąbkę z gazy 2 x 2" (nasączoną 2% chlorheksydyną) i wytrzyj mysz w miejscu depilacji. Wysterylizuj całe otoczenie, w tym ogon, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne narzędzi.
  8. Przetrzyj miejsce depilacji i okolice wacikiem nasączonym alkoholem.
  9. Powtórz jeszcze raz kroki z 2% chlorheksydyną i alkoholem, a na koniec przetrzyj je ostatnim wycieraniem chlorheksydyną, co daje w sumie trzy razy 2% chlorheksydynę i dwa płyny nasączone alkoholem. Wykonaj ostatnie przetarcie chlorheksydyną tak, aby substancja chemiczna nie kapała wokół pola operacyjnego, aby uniknąć dostania się chlorheksydyny na narządy wewnętrzne. UWAGA: Stosowanie dużych ilości chlorheksydyny i alkoholu na skórę i otaczającą sierść może spowodować znaczny spadek temperatury ciała. Nie wycieraj nadmiarem głośności podczas czynności 2.7-2.9. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej.
  10. Używając sterylnych rękawiczek i wysterylizowanego skalpela ze sterylnym ostrzem, wykonaj pojedyncze 1-calowe nacięcie w skórze między płaszczyzną środkową i strzałkową po lewej stronie myszy, zaczynając tuż poniżej żeber i kończąc tuż nad płaszczyzną czwartego smoczka pachwinowego gruczołu sutkowego.
  11. Używając autoklawowanych lub sterylizowanych koralikami nożyczek i kleszczy, wykonaj podobne 1-calowe nacięcie w otrzewnej. Unikaj wrzynania się w poduszeczkę tłuszczową sutka i upewnij się, że nie przecinasz jelit, wątroby ani przepony.
  12. Umieść gazik o wymiarach 4 x 4 cale nasączony sterylną solą fizjologiczną po lewej stronie myszy, w miejscu, w którym wykonano nacięcie, tak aby narządy wewnętrzne można było umieścić na gazie i nie stykać się z otaczającą skórą lub obszarem operacyjnym.
  13. Przygotuj komórki nowotworowe, pipetując kilka razy w górę iw dół, ponieważ komórki nowotworowe osiądą podczas przygotowania myszy. Przygotuj strzykawkę z wyjmowaną igłą o pojemności 25 μl i igłę o rozmiarze 32 z komórkami nowotworowymi. Wcisnąć strzykawkę, aż komórki nowotworowe znajdą się na końcu igły, a tłok znajdzie się w objętości odpowiedniej do wstrzyknięcia; Unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza.
  14. Przetrzeć zewnętrzną stronę igły sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszelkie zewnętrzne komórki nowotworowe. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć ukłuć igłą.
  15. Przytrzymaj środkową stronę nacięcia, w tym skórę i wyściółkę otrzewnej, na bok za pomocą kleszczy i za pomocą sterylnego bawełnianego wacika ostrożnie wyciągnij jelito grube i cienkie, umieszczając je na sterylnej gazie nasączonej sterylną solą fizjologiczną. Wyciągnij jelito grube i cienkie, aż zostanie uwidoczniona żyła wrotna.
  16. Przykryj narządy wewnętrzne gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby utrzymać wewnętrzną wilgotność i sterylność.
  17. Poproś asystenta, również w sterylnych rękawiczkach, aby delikatnie przytrzymał jelita owinięte gazą nasączoną solą fizjologiczną za pomocą sterylnego wacika z bawełnianą końcówką, aby całkowicie odsłonić żyłę wrotną. Dodatkowo może być konieczne użycie autoklawowanego hemostatu lub kleszczy, aby odsunąć tkankę na bok po środkowej stronie nacięcia.
  18. Wbić igłę załadowaną komórkami nowotworowymi ~ 3 - 5 mm do żyły wrotnej ~ 10 mm poniżej wątroby pod kątem < 5° do żyły, skosem skierowanym do góry. Powoli wstrzyknąć pełną objętość zawierającą komórki nowotworowe. Pozwól, aby krew przepływała przez główkę igły przez kilka sekund, aby uniknąć cofania się komórek nowotworowych z żyły. Należy zminimalizować przesuwanie igły w żyle podczas wstrzyknięcia. Również w tym przypadku należy zachować ostrożność, aby uniknąć ukłucia igłą.
    UWAGA: Wizualizacja żyły wrotnej odbywa się bez powiększenia, jednak w razie potrzeby można użyć mikroskopu stereoskopowego.
  19. Wyjmij igłę, jednocześnie umieszczając sterylny aplikator z bawełnianą końcówką na żyle z naciskiem. Gdy asystent nadal trzyma jelita na boku, umieść jeden kawałek gazy hemostatycznej o grubości 0,5 - 1cm2 na miejscu wstrzyknięcia na żyle.
    UWAGA: Próbowano również zastosować proszek hemostatyczny na tym etapie protokołu, ale nie był skuteczny w zatrzymywaniu utraty krwi żylnej po wstrzyknięciu.
  20. Przytrzymaj gazę hemostatyczną w miejscu wstrzyknięcia, uciskając aplikator z jałową bawełnianą końcówką przez 5 minut.
  21. Oceń zamknięcie żyły, ostrożnie podnosząc gazę hemostatyczną, jeśli gaza przyklei się do otaczającej tkanki, można użyć niewielkiej ilości sterylnej soli fizjologicznej do namoczenia i podniesienia gazy.
  22. Jeśli w tym czasie nastąpi utrata krwi, umieść dodatkowy kawałek gazy hemostatycznej w miejscu pod ciśnieniem na dodatkowe 5 minut. Gdy przepływ krwi całkowicie ustaje, usuń gazę z myszy.
    UWAGA: Utrata krwi podczas zabiegu chirurgicznego musi być dokładnie oceniona, a jeśli całkowita dopuszczalna objętość utraty krwi zostanie osiągnięta lub przekroczona (w oparciu o standardowe procedury operacyjne dla instytucjonalnych komisji rewizyjnych badacza), mysz musi zostać poddana eutanazji w znieczuleniu przez perfuzję serca.
  23. Gdy miejsce wstrzyknięcia zostanie uznane za nienaruszone, a krew nie opuszcza miejsca wstrzyknięcia, należy delikatnie umieścić narządy wewnętrzne z powrotem w jamie brzusznej.
  24. Zszyj wyściółkę otrzewnej, a następnie skórę sterylnym szwem vicryl 4-0 i igłą stożkową, używając prostego ciągłego lub przerywanego wzoru szwów. Zazwyczaj zamknięcie nacięcia wymaga założenia 10-15 szwów.
  25. Wstrzyknąć 100 μl bupiwakainy (5 mg/ml) w miejsce nacięcia w celu miejscowego leczenia bólu za pomocą strzykawki insulinowej. Wstrzyknąć podskórnie 0,5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26 w celu nawodnienia. Operacje trwają 15 - 25 minut.
  26. Aby utrzymać sterylne warunki przez cały czas trwania zabiegu, należy upewnić się, że wszystkie narzędzia i materiały mające kontakt z myszą, w tym dłonie w rękawiczkach, są odpowiednio czyszczone przed kontaktem. Jeśli to możliwe, używaj sterylnych materiałów i rękawic lub minimalnie używaj 70% roztworu etanolu lub 10% roztworu wybielacza do czyszczenia.
  27. Jeśli w jednej sesji planowanych jest wiele operacji, należy przerobić początkowy obszar operacyjny za pomocą świeżej sterylnej serwety, strzykawek insulinowych, strzykawek 1 ml, sterylnej soli fizjologicznej, 2 x 2" sterylnych gąbek z gazy, 4 x 4" sterylnej gazy, gazy hemostatycznej pociętej na 0,5 - 1 cm2 części, 4-0 szwów vicryl z igłą stożkową i 2% chlorheksydyny. Wysterylizuj nożyczki, kleszcze i hemostat koralikami między operacjami i pozwól im odpowiednio ostygnąć przed ponownym użyciem.

3. Rekonwalescencja, monitorowanie zdrowia gryzoni i analizy punktów końcowych

  1. Po zakończeniu zabiegu chirurgicznego utrzymuj myszy na poduszce grzewczej w celu powrotu do zdrowia w czystych klatkach bez ściółki przez co najmniej 20 minut. Myszy zwykle potrzebują 2-4 minut, aby obudzić się ze znieczulenia.
  2. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do wspólnego zamieszkiwania z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, gdy odzyskuje przytomność i monitoruj, dopóki zwierzę nie odzyska zdolności do utrzymania się w pozycji leżącej mostka.
  3. Podawać myszom 0,05 - 0,1 mg/kg buprenorfiny w celu leczenia bólu co 6-12 godzin po operacji, do 72 godzin.
  4. Codziennie sprawdzaj szwy, aby upewnić się, że pozostają nienaruszone podczas gojenia. W przypadku, gdy szwy się odczepią, umieść mysz pod narkozą, usuń pozostałe szwy i wymień. W przypadku infekcji lub stanu zapalnego skonsultuj się z personelem weterynaryjnym.
    UWAGA: W przypadku tego protokołu nie wystąpiła infekcja ani stan zapalny.
  5. W przypadku badań nad przerzutami należy wykonywać codzienne kontrole stanu zdrowia, dopóki nie zaobserwuje się zewnętrznych objawów choroby z przerzutami, w tym między innymi: >10% utraty/przyrostu masy ciała, niechlujstwa, utraty uwagi do otoczenia, obrzęku brzucha/wodobrzusza, bladych oczu i uszu lub zgarbionej pozycji.
    UWAGA: Codzienne kontrole stanu zdrowia są szczególnie ważne podczas opracowywania modelu do użytku z nową linią komórkową lub stężeniem komórek, dopóki oś czasu przerzutów nie zostanie dobrze poznana.
  6. W punkcie końcowym badania poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Można zastosować alternatywne metody eutanazji zatwierdzone przez komisję nadzorczą badaczy, w tym perfuzję z 1x PBS w znieczuleniu. Perfuzja wątroby odbywa się poprzez kaniulowanie żyły wrotnej, przecięcie żyły głównej dolnej i przepchnięcie 1x PBS przez naczynia krwionośne wątroby z szybkością 4 ml / min przez 1 - 2 minuty w celu usunięcia krążącej krwi i leukocytów.
    UWAGA: W zależności od punktu końcowego badania, linii komórkowej i zastosowanego stężenia, jawne przerzuty do wątroby mogą, ale nie muszą być widoczne podczas sekcji zwłok. Zmiany mikroprzerzutowe mogą ujawnić się w analizie histologicznej wątroby. Punkty końcowe będą się różnić w zależności od projektu badania.
  7. Wyciągnij wątrobę nożyczkami i kleszczami, najpierw usuwając woreczek żółciowy, a następnie przecinając żyłę główną dolną górną nad wątrobą. Przeciąć żyłę główną, żyłę wrotną i tętnicę wątrobową dolną do wątroby.
  8. Delikatnie wyjmij całą wątrobę i umyj 5x w 1x PBS.
  9. Podziel wątrobę na lewy, prawy, środkowy i ogoniasty płat.
  10. Formalina utrwala wątrobę w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 48 godzin, wstrząsając w temperaturze pokojowej. Przetwarzaj tkanki za pomocą szeregu alkoholi o rosnącym stężeniu i ksylenu; Parafina zatapia utrwaloną tkankę71,
    UWAGA: Alternatywnie, wątroba może zostać zamrożona błyskawicznie, umieszczając tkankę w formule kriomoldu o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrażając na granulkach suchego lodu zanurzonych w 95% etanolu.
    1. Za pomocą mikrotomu pociąć blok tkanki zatopionej w parafinie tak, aby ujawnił się rozmiar tkanki przypominającej główkę zapałki.
    2. Wytnij pięć odcinków szeregowych o grubości 4 mikronów, co stanowi pierwszy poziom analizy.
    3. Przetnij 250 mikronów tkanki, wyrzuć te skrawki do odpadów.
    4. Przy 250 mikronach wytnij drugi poziom pięciu 4-mikronowych sekcji szeregowych.
    5. W razie potrzeby powtórz czynność, aby przeciąć całą wątrobę. Hematoksylina i eozyna barwią pierwszą sekcję każdego poziomu w celu oceny przerzutów72,
      UWAGA: W przypadku tkanek zamrożonych metodą zatrzaskową należy użyć kriostatu do cięcia skrawków.
      UWAGA: Wykrycie choroby mikroprzerzutowej będzie wymagało barwienia specyficznego dla komórek nowotworowych.
  11. Usuń myszy z badania, jeśli w miejscu nacięcia występuje wzrost guza, ponieważ wskazuje to na wyciek komórek nowotworowych do jamy otrzewnej po wstrzyknięciu.
    UWAGA: Ten problem nie został zaobserwowany.

Wyniki

Model wstrzyknięcia do żyły wrotnej, w którym komórki nowotworowe są dostarczane bezpośrednio do wątroby za pomocą procedury chirurgicznej, umożliwia iniekcję komórek nowotworowych do żyły wrotnej. W warunkach antyseptycznych, u znieczulonej myszy, wykonuje się nacięcie chirurgiczne o długości ok. 1 cala po lewej stronie myszy między płaszczyzną pośrodkową a strzałkową, rozpoczynając tuż powyżej poziomu smoczka czwartej gruczołu piersiowego pachwinowego i kończąc tuż poniżej żeber. Jelito grube i cienkie są delikatnie wyciągane przez nacięcie, aby umożliwić wizualizację żyły wrotnej (Ryc. 1A). Prawidłową identyfikację anatomiczną żyły wrotnej oraz skuteczność wstrzyknięcia wewnątrzportowego można potwierdzić, ćwicząc protokół iniekcji z użyciem tuszu chińskiego lub podobnego barwnika. Prawidłowe wstrzyknięcie do żyły wrotnej spowoduje natychmiastowe i specyficzne dostarczenie tuszu do wątroby i nie doprowadzi do rozprzestrzenienia się tuszu chińskiego do płuc (Ryc. 1B). Ponadto, przy użyciu komórek guza piersi myszy D2A1 znakowanych GFP, dyspersja komórek nowotworowych w całej wątrobie jest widoczna dziewięćdziesiąt minut po wstrzyknięciu, co potwierdza dostarczenie komórek do wątroby drogą żyły wrotnej (Ryc. 1C). Przy większym powiększeniu staje się jasne, że 90 min po wstrzyknięciu komórki nowotworowe znajdują się w sinusoidach, a także w miąższu wątroby w bliskim sąsiedztwie triad wrotnych, gdzie krew z żyły wrotnej wpływa do wątroby (Ryc. 1C). Dane te sugerują, że 90 min po wstrzyknięciu komórek nowotworowych zachodzi aktywna ekstrawasacja komórek nowotworowych. Podsumowując, dane te potwierdzają, że model wstrzyknięcia do żyły wrotnej dostarcza objętość iniekcji bezpośrednio do wątroby, przy czym tusz lub komórki nowotworowe rozprzestrzeniają się w całej wątrobie, bez znaczącego transportu objętości iniekcji do płuc.

Aby ocenić odporność modelu wstrzykiwania do żyły wrotnej, przetestowano trzy oddzielne syngeneiczne linie komórek guza piersi myszy u dorosłych samic myszy Balb/c. Linie te wybrano na podstawie ich scharakteryzowanego zachowania w modelach poduszki tłuszczowej piersi i obejmują one wysoce agresywną i przerzutową linię komórkową 4T1, mniej agresywną linię przerzutową D2A1 oraz linię o niskim potencjale przerzutowym lub nieprzerzutową D2.OR37,61,73,74. Przetestowano dawki 2 000 i 10 000 komórek na wstrzyknięcie, nie stwierdzając istotnych różnic w czasie rozwoju jawnych przerzutów przy tych niskich stężeniach komórek. W badaniach tych, aby uzasadnić przeprowadzenie sekcji, stosowano zastępcze markery przerzutów, takie jak brak pielęgnacji, bladość i utrata masy ciała; podczas sekcji obecność lub brak przerzutów do wątroby potwierdzano poprzez ocenę wizualną wątroby i innych narządów w celu potwierdzenia podania wewnątrzwrotnego. Dane te potwierdzają wcześniejsze doniesienia, że linie komórkowe 4T1 i D2A1 reprezentują bardziej agresywne linie guzów piersi, ponieważ obserwuje się krótszy czas przeżycia bez przerzutów w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto mniej agresywną linię D2.OR (Rysunek 2A). U myszy, którym wstrzyknięto komórki nowotworowe 4T1 lub D2A1, jawne przerzuty do wątroby rozwinęły się około 30–40 dni po wstrzyknięciu, a u niektórych już w 18. dniu po wstrzyknięciu (Rysunek 2A), podczas gdy tylko jedna mysz, której wstrzyknięto komórki D2.OR, rozwinęła jawne przerzuty do wątroby do końca badania, które trwało 60–65 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Przerzuty potwierdzono następnie poprzez wykonanie seryjnych cięć wątroby w odstępach 250 µm i analizę przekrojów barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) (Rysunek 2B-D).

Oprócz wykrywania jawnych zmian przerzutowych w wątrobie myszy, model żyły wrotnej może być również wykorzystywany do badania wcześniejszych zdarzeń w kaskadzie przerzutowej, w tym wykrywania pojedynczych komórek/zbiorów komórek po ekstrawazacji oraz tworzenia się zmian mikroprzerzutowych. Do wykrywania komórek guza piersi 4T1, D2A1 i D2.OR w wątrobie, gdy występują one jako pojedyncze komórki lub zmiany mikroprzerzutowe, zastosowano multipleksowe barwienie immunofluorescencyjne, ponieważ barwienie H&E nie jest wystarczające do potwierdzenia obecności małych zmian. Rycina 3A przedstawia reprezentatywną wątrobę myszy Balb/c z domniemanym ogniskiem mikroprzerzutowym komórek nowotworowych D2A1, które są dodatnie pod kątem keratyny nabłonkowej CK18, ujemne pod kątem pan-immunologicznego markera CD45 oraz ujemne pod kątem markera hepatocytów Heppar-1. Hepatocyty również barwią się dodatnio na CK18, co sprawia, że użycie Heppar-1 w tym panelu barwienia jest niezbędne. Ważną uwagą jest to, że nabłonek przewodów żółciowych i komórki progenitorowe wątroby barwią się dodatnio na CK18, co wymaga starannego odróżnienia komórek nowotworowych od przewodów żółciowych, szczególnie podczas oceny obszarów okołowrotnych (Rycina 3A). Alternatywą dla multipleksowej immunofluorescencji w celu identyfikacji pojedynczych komórek rozsianych i ognisk mikroprzerzutowych jest wykorzystanie syngeneicznych linii guzów piersi znakowanych ulepszonym zielonym białkiem fluorescencyjnym (eGFP) i/lub lucyferazą oraz wykonanie IHC dla danego znacznika (Rycina 1C). Ze względu na immunogenność eGFP, lucyferazy i innych białek, niezbędne jest stosowanie modeli mysich tolerancyjnych na te białka, takich jak nowa immunokompetentna mysz „glowing head”, która ekspresuje eGFP i lucyferazę w przednim płacie przysadki mózgowej75. Do identyfikacji zmian makroprzerzutowych nieznakowanych linii syngeneicznych, takich jak linia nowotworowa D2A1, idealna jest multipleksowa immunofluorescencja CK18/Heppar-1/CD45 (Rycina 3B).

Schemat iniekcji do żyły wrotnej wątroby oraz wyniki dla PBS i tuszu chińskiego w wątrobie, analiza histologiczna wątroby.
Rycina 1: Iniekcja do żyły wrotnej dostarcza komórki nowotworowe bezpośrednio do wątroby. A) Iniekcja do żyły wrotnej; nacięcie wykonuje się między płaszczyzną pośrodkową a lewym sagittalem, od miejsca powyżej płaszczyzny czwartej sutka gruczołu piersiowego pachwinowego, kończąc tuż poniżej klatki piersiowej. B) Wątroba myszy Balb/c po iniekcji PBS (lewo). Po iniekcji tuszu chińskiego przez żyłę wrotną, wątroba (środek), a nie płuco (prawo), przyjmuje tusz. C) Reprezentatywne obrazy cienkich przekrojów komórek nowotworowych gruczołu piersiowego myszy D2A1 oznaczonych GFP w wątrobie myszy Balb/c 90 min po iniekcji 1 x 106 komórek nowotworowych przez żyłę wrotną. Wątroby utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie, wykonano sekcje i barwiono przeciwciałem anty-GFP w celu wykrycia komórek nowotworowych. Górny panel pokazuje ciemnobrązowe zabarwione komórki nowotworowe (strzałki) rozproszone w całej wątrobie, gwiazdka oznacza nieswoiste barwienie hepatocytów wokół żył centralnych; pasek skali = 300 µm. Dolne panele pokazują reprezentatywne obrazy komórek nowotworowych 90 min po iniekcji, które wciąż ściśle przylegają do naczyń krwionośnych; pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres Kaplana-Meiera, obrazy histologiczne; przeżycie bez przerzutów, analiza guzów 4T1, D2A1 i D2.OR.
Rycina 2: Wzrost mysich linii komórkowych raka piersi w wątrobie po wstrzyknięciu do żyły wrotnej. A) Krzywa Kaplana-Meiera przedstawiająca wskaźniki przeżycia bez przerzutów u myszy, którym wstrzyknięto 2 000-10 000 komórek mysiego raka piersi linii 4T1, D2A1 lub D2.OR. Myszy po wstrzyknięciu komórek nowotworowych monitorowano pod kątem objawów przerzutowania, w tym braku pielęgnacji, bladości oczu oraz zmian masy ciała. Przerzuty potwierdzono podczas sekcji zwłok oraz za pomocą barwienia H&E na przekrojach histologicznych wątroby. N= 2 4T1 2 000 komórek; 2 4T1 10 000 komórek. N= 2 D2A1 2 000 komórek; 3 D2A1 10 000 komórek. N= 3 D2.OR 2 000 komórek; 3 D2.OR 10 000 komórek. Reprezentatywne obrazy H&E przedstawiające B) zmiany 4T1 w 21. dniu po wstrzyknięciu 10 000 komórek, C) zmiany D2A1 w 26. dniu po wstrzyknięciu 10 000 komórek nowotworowych oraz D) zmiany D2.OR w 59. dniu po wstrzyknięciu 10 000 komórek; skala = 75 µm. Podobne zmiany zaobserwowano po wstrzyknięciu 2 000 komórek nowotworowych 4T1 lub D2A1. Nie wykryto zmian po wstrzyknięciu 2 000 komórek D2.OR. W żadnej z myszy biorących udział w badaniach nie stwierdzono dowodów na przerzutowanie do innych narządów ani w miejscu nacięcia chirurgicznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna tkanki wątroby; markery DAPI, CD45, Heppar-1, CK18; identyfikacja komórek.
Rycina 3: Detekcja pojedynczych komórek i ognisk przerzutowych w wątrobie myszy z użyciem multipleksowej immunofluorescencji. A) Reprezentatywna multipleksowa immunofluorescencja komórek nowotworowych D2A1 w wątrobie myszy Balb/c w 90 min po wstrzyknięciu w modelu podania przez żyłę wrotną. Barwienie wykonano przy użyciu zestawu multipleksowego. Od lewej do prawej: DAPI; CD45 do znakowania leukocytów; Heppar-1 do znakowania hepatocytów oraz CK18 do znakowania komórek nowotworowych, hepatocytów i nabłonka przewodów żółciowych. Obraz złożony przedstawia domniemany skupisk komórek nowotworowych D2A1 CK18+Heppar-1-CD45- ściśle związanych z triadą wrotną. Strzałka = komórki nowotworowe D2A1, gwiazdka = nabłonek przewodów żółciowych; pasek skali = 25 µm. B) Reprezentatywne, wyraźne ognisko przerzutowe D2A1 z użyciem tego samego panelu barwień co w A. Komórki nowotworowe są CK18+, podczas gdy sąsiadujące hepatocyty są CK18+Heppar-1+; pasek skali = 25 µm. Obrazy zarejestrowano za pomocą mikroskopu z obiektywami 20 x 0,8, 40 x 1,3 i 60 x 1,4 oraz kamery CCD, przy użyciu oprogramowania mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Model iniekcji żyły wrotnej myszy Balb/c pozwala na badanie zmian w raku sutka w wątrobie przy braku zakłócających przerzutów wielonarządowych i u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza. Nasz protokół jest postępem w stosunku do wcześniej opublikowanych procedur chirurgicznych, które umożliwiają dostęp do żyły wrotnej w celu wstrzyknięcia komórek nowotworowych bezpośrednio do wątroby16,55,56. Jednym z postępów, które poczyniliśmy, jest znaczne zmniejszenie liczby wstrzykiwanych komórek nowotworowych z ≥ 1 x 105 komórek/wstrzyknięcie16,55,56 do ≤ 10 000 komórek nowotworowych/wstrzyknięcie. Rozszerzyliśmy również model do badania przerzutów raka piersi do wątroby. Korzystając z tego protokołu, dwie linie komórkowe raka sutka o znanym potencjale przerzutowym rozwijają przerzuty do wątroby z krótszym opóźnieniem niż bardziej spokojna linia komórkowa guza sutka. Ponadto, we wczesnych punktach czasowych, komórki nowotworowe są rozmieszczone w miąższu wątroby jako pojedyncze lub małe grupy pojedynczych komórek po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Model jest gotowy, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące skuteczności przerzutów, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, przeżycia komórek, uśpienia i proliferacji – wszystkich fenotypów, które przyczyniają się do rozwoju choroby mikroprzerzutowej i jawnej przerzutowej w wątrobie.

Ważne jest, aby przed rozpoczęciem badań wziąć pod uwagę wiele aspektów protokołu iniekcji żyły wrotnej. Zdecydowanie zaleca się staranne decydowanie o liniach komórkowych, koncentracji komórek, całkowitej liczbie komórek i punktach końcowych zainteresowania w oparciu o mniejsze badania eksploracyjne. Co więcej, wykorzystanie kompetentnych immunologicznie gospodarzy i syngenicznych linii komórkowych ma ogromne znaczenie dla zrozumienia interakcji gospodarz-komórka nowotworowa. Nowo opracowana mysz ze "świecącą głową", która wyraża eGFP i lucyferazy z przedniego płata przysadki mózgowej, jest ważnym narzędziem do eliminowania odpowiedzi gospodarza na egzogenne eGFP i lucyferazę, białka często używane do oznaczania linii guza sutka75. Użycie myszy ze "świecącą głową" i syngenicznie znakowanych komórek nowotworowych ułatwi łatwą identyfikację pojedynczych komórek rozsianych i ognisk mikroprzerzutowych przez IHC bez obaw o reakcje zapalne na eGFP lub lucyferazy. Podobnie, zdecydowanie zaleca się staranne wybieranie strategii leczenia bólu, aby zapewnić minimalny wpływ leczenia przeciw- lub pronowotworowego. Kluczowe kroki w tym protokole obejmują utrzymanie sterylnych warunków podczas operacji, aby upewnić się, że nie dojdzie do infekcji, ponieważ zakłóci to wszelkie wyniki. Ważne jest również, aby igła była prawidłowo umieszczona w żyle wrotnej, aby zapewnić dostarczenie komórek nowotworowych do wątroby. Praktykowanie protokołu z barwnikami, takimi jak atrament indyjski, pomoże w rozwiązaniu tego problemu. Wzrost guza w miejscu nacięcia skóry jest najlepszym wskaźnikiem, że doszło do nieprawidłowego umieszczenia igły. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby utrata krwi z żyły wrotnej była odpowiednio kontrolowana i całkowicie ustała przed zszyciem zwierzęcia. Stosowanie gazy hemostatycznej znacznie zmniejsza ryzyko niekontrolowanej utraty krwi z żyły wrotnej po wstrzyknięciu. W naszych rękach śmiertelność związana z procedurą z powodu utraty krwi z żyły wrotnej po wstrzyknięciu została zmniejszona z 30% do 2% myszy przy użyciu gazy hemostatycznej.

Ważne jest, aby pamiętać, że model iniekcji żyły wrotnej nie replikuje pełnej kaskady przerzutowej, ale ogranicza się do badania wynaczynienia komórek nowotworowych, interakcji komórka nowotworowa - nisza po wynaczynieniu i wzroście guza. Pilnie potrzebne są modele, które dokładnie odwzorowują pełną kaskadę przerzutów do wątroby, taką jak ma to miejsce u pacjentów. Dodatkowym ograniczeniem modelu iniekcji żyły wrotnej jest to, że jest on zaburzony przez wpływ operacji na gospodarza, przy czym gojenie się ran wpływa na postęp choroby76,77.

Model iniekcji żyły wrotnej stanowi ulepszenie w stosunku do innych modeli iniekcji do badania przerzutów do wątroby, w tym modeli wewnątrzsercowych i wewnątrzśledzionowych. W szczególności model iniekcji żyły wrotnej pozwala na badanie szerszego zakresu progresji choroby niż model wewnątrzsercowy, który często jest ograniczony przez współistniejące przerzuty w innych tkankach. Co więcej, model żyły wrotnej nie jest skomplikowany przez usunięcie śledziony, jak ma to miejsce w modelu wewnątrzśledzionowym.

Model iniekcji żyły wrotnej może okazać się użytecznym narzędziem do badania przerzutów do wątroby w ogóle. Przerzuty do wątroby są najczęstszym miejscem przerzutów w gruczolakorakach ogółem, ze szczególnie wysokimi wskaźnikami w przypadku raka trzustki (85% przerzutów do wątroby), gruczolakoraka jelita grubego i odbytnicy (>70%), a także żołądka i przełyku (>30%)1. Chociaż spontaniczne i ortotopowe modele guzów pierwotnych gruczolakoraka trzustki i jelita grubego łatwiej dają przerzuty do wątroby78,79, model iniekcji żyły wrotnej może okazać się przydatny do zrozumienia procesu przerzutowego tych nowotworów, ponieważ kontrolowane dostarczanie komórek nowotworowych pozwala na ocenę biochemiczną, molekularną i histologiczną w określonym czasie po przybyciu komórek nowotworowych. Podsumowując, model iniekcji żyły wrotnej stanowi istotną poprawę w stosunku do dostępnych modeli przerzutów raka piersi do wątroby i może mieć również zastosowanie do pola przerzutów do wątroby w ogóle.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Alexandrze Quackenbush za pomoc w zabiegach chirurgicznych podczas kręcenia protokołu wideo, Hadley Holden za wsparcie histologiczne, Sonali Jindal za wkład w temat nowotworów i patologii wątroby podczas opracowywania metody oraz Breannie Caruso za krytyczną recenzję manuskryptu. Komórki guza sutka D2A1 i D2.OR były prezentem od dr Ann Chambers, komórki nowotworowe D2A1-GFP były prezentem od dr Jeffreya Greena, a komórki nowotworowe 4T1 były prezentem od dr Heide Ford. Do obrazowania wykorzystano rdzeń do zaawansowanej mikroskopii świetlnej OHSU w Jungers Center. Praca zawarta w tym manuskrypcie jest finansowana przez NIH/NCI NRSA F31CA186524 (do ETG) i NIH/NCI 5R01CA169175 (do PS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 ml z igłą o rozmiarze 26Strzykawka BD309597Do podskórnego wstrzykiwania buprenorfiny; zachowaj ostrożność, ostre
Pady nasączone alkoholemFisher Scientific06-669-62Do czyszczenia brzucha przed nacięciem chirurgicznym
Gąbki uniwersalne, sterylneKendall80444 "x 4", użyj zanurzone w sterylnym soli fizjologicznej, aby chronić i nawodnić jelito grube i cienkie podczas chirurgia
Sztuczne łzyRugby370114Olej mineralny 15%, wazelina biała 83%; stosować do ochrony oczu podczas operacji
Buprenorfina HCl, 0,3 mg/mlMfg. przez Reckitt BenckiserNDC-12496-0757-1Stosować w dawce 0,05 - 0,1 mg/kg masy ciała, 1 - 2x dziennie przez 72 godziny, wstrzykiwany podskórnie
Chlorowodorek bupiwakainy, 0,5% (5 mg / ml)Mfg. firmy Humira IncNDC-04091163-01Stosować w dawce 0,5%, 1x bezpośrednio po zabiegu, 10 μ l wstrzykiwany podskórnie w miejscu nacięcia 
anty-CD45BD Pharmingen550539Zastosowanie w immunofluorescencji multipleksowej w celu wykluczenia leukocytów w identyfikacji ognisk przerzutowych
Celox™ Szybka gaza hemostatycznaMedtrade Products Ltd.FG08839011Pokrój na 5 mm i sup2; kawałki, użyj do zatrzymania przepływu krwi z żyły wrotnej za pomocą ciśnienia po wstrzyknięciu
DepilacjaSłuży do usuwania włosów z obszaru chirurgicznego; wielu dostawców
Chlorheksydyna, 2% roztwórVet One1CHL008Zachowaj ostrożność, nie dostajesz chlorheksydyny do błon śluzowych lub uszu myszy
Przeciwciało anty-CK18Abcamab53118Stosować w immunofluorescencji multipleksowej do identyfikacji ognisk przerzutowych
Aplikatory z bawełnianą końcówką, sterylneFisher Scientific23-400-1146-calowy drewniany trzonek 2 szt./koperta
DMEM, hyklon o wysokiej zawartości glukozySH30243.01Baza do hodowli komórkowych do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1
Sterylizatorsuchych szklanych kulekUżywaj między operacjami do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej, zachowaj ostrożność, bardzo gorące; wielu dostawców
Etanol, roztwórZachowaj ostrożność łatwopalny; służy do czyszczenia obszaru operacyjnego w razie potrzeby; wielu dostawców
Hyklonsurowicy bydlęcej płoduSH30071.03Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1, stosować w stężeniu 10% w DMEM gaza o wysokiej zawartości glukozy
, sterylnyKendall21462 "x 2", użyć zanurzonego w 2% roztworze chlorheksydyny do czyszczenia brzucha przed nacięciem chirurgicznym
przeciwciało anty-Green Fluorescencyjne białkoVector LaboratoriesBA0702Służy do barwienia dla oznaczonych GFP D2A1 lub innych linii komórkowych guza sutka
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081Dodatek do pożywek do hodowli komórkowych do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1, stosować przy 2 mM (1x) w DMEM Podkładka grzewcza o wysokim poziomie glukozy
, x 2 - 3Służy do utrzymania ciepła ciała podczas operacji i rekonwalescencji; wielu dostawców
HemocytometrHausser Scientific1483Do stosowania w hodowli komórkowej do liczenia komórek
KleszczeStal nierdzewna; wielu dostawców
przeciwciało anty-Heppar-1DakoM7158Stosować w immunofluorescencji multipleksowej w celu wykluczenia hepatocytów w identyfikacji ognisk przerzutowych
Strzykawka insulinowa, 0,3 ml, BD o rozmiarze 29  324702Do wstrzykiwań bupiwakainy w miejscu szwu; należy zachować ostrożność, ostry
IsofluranePiramalNDC-66794-017-25podawany w dawce 2,5%
parownika izofluranuVetEquip911103Zachowaj ostrożność, odparowuje gazy znieczulające
ŹródłoSłuży do wizualizacji pola operacyjnego; wielu dostawców
Neutralna buforowana formalina, 10%Anatech Ltd.135Stosować ostrożnie, toksycznie; stosować jako utrwalacz tkankowy do punktów końcowych przerzutów i oceny obciążenia przerzutami za pomocą histologii
Opal™ 4-kolorowy zestaw fIHCPerkinElmer, Inc.NEL794001KTStosować do multipleksowej immunofluorescencji Heppar-1 / CD45 / CK18 w celu wykrycia przerzutów w mysiej
wątrobie NożyczkiStal nierdzewna; Używaj ostrożności, ostry; wielu dostawców
Penicylina / Streptomycyna, 100xCorning30-002-ClDodatek do pożywki do hodowli komórek do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1, stosować w dawce 1x w DMEM Sól
fizjologiczna buforowana fosforanami o wysokiej zawartości glukozyStosować w 1x do ponownego zawieszania komórek nowotworowych przed wstrzyknięciem, wielu dostawców
Wyjmowana strzykawka igłowa, 25 i mu; l, Model 1702Hamilton7654-01Do wstrzykiwania żyły wrotnej; zachowaj ostrożność, szczególnie podczas pracy z igłami załadowanymi komórkami nowotworowymi, ostrymi, gdy igła jest przymocowana
RękojeśćStal nierdzewna; wielu dostawców
Ostrze skalpela, #15Stal węglowa, sterylne, rozmiar 15; wielu dostawców
Małe wyjmowane igły do piasty, rozmiar 32 Hamilton7803-04Do iniekcji żyły wrotnej, długość 1", styl punktowy 4, 12° można również używać igieł wielokrotnego użytku o rozmiarze od 33 do 34; Zachowaj ostrożność, szczególnie podczas pracy z igłami załadowanymi komórkami nowotworowymi, ostrymi
PodchlorynUżywaj ostrożności,; stosować w dawce 10% do dezynfekcji miejsca pracy i powierzchni, wielu dostawców
Sterylny roztwór soli fizjologicznejFisher ScientificBP358-2120,9% roztwór NaCl; alternatywnie może być domowej roboty i sterylnie filtrowany
Rękawice chirurgiczne, sterylneWielu dostawców
Szwy sterylne EthiconJ310H4-0 27" powlekany vicryl z igłą 22 mm 1/2c stożkową ze stopu etystopu; Zachowaj ostrożność, sharp
Przenośna maszyna anestezjologicznaVetEquip901801Używaj z parownikiem izofluranowym do znieczulenia myszy
KleszczeStal nierdzewna, ząbkowana, stępiona; wielu dostawców
Zasłony na ręczniki, sterylne Dynarex441018" x 26", do pokrycia poduszki grzewczej i zapewnienia sterylnego miejsca pracy podczas operacji
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Do stosowania w hodowli komórkowej w celu oceny żywotności należy stosować 1:1 z komórkami w 1x PBS
Trypsin / EDTA, 0,05% (1x)Gibco25300-054Stosować w hodowli komórkowej do odłączania komórek nowotworowych od płytek do hodowli tkankowych
przeciwciało chemiczna 70% hemostatyczne światła operacyjne skalpela sodu opatrunkowe do kciuków

Bibliografia

  1. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  2. Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
  3. Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
  4. Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
  5. Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
  6. Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
  7. Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
  8. Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
  9. Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
  10. Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
  11. Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
  12. Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
  13. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  14. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
  15. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  16. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
  18. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
  19. Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
  20. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
  21. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  22. Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
  23. Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
  24. Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
  25. Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
  26. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
  27. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
  28. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  29. Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489(2014).
  30. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
  31. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
  32. Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
  33. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
  34. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  35. Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
  36. Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
  37. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
  38. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212(2006).
  39. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
  40. Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
  41. Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
  42. Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
  43. Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
  44. Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
  45. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260(2012).
  46. Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
  47. Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
  48. Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
  49. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
  50. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677(2014).
  51. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
  52. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  53. Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469(2015).
  54. Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
  55. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29(2009).
  56. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
  57. Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
  58. Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
  59. Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
  60. Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
  61. Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  62. Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
  63. Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
  64. Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960(2015).
  65. Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35(2016).
  66. Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
  67. Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
  68. O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
  69. Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
  70. Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
  71. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
  72. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
  73. Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
  74. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
  75. Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
  76. Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
  77. Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
  78. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
  79. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model raka piersiwstrzyknięcie komórek nowotworowychwątroba mysianacięcie chirurgicznegaza hemostatycznaobrazowanie intravitalneanaliza H&Eanaliza immunofluorescencyjna
Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.