ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

Podsumowanie

ACT-PRESTO (technika aktywnej przejrzystości - efektywny i stabilny transfer makrocząsteczek do organów związany z ciśnieniem) umożliwia szybkie, skuteczne, ale niedrogie oczyszczanie tkanek i szybką penetrację przeciwciał do oczyszczonych tkanek poprzez pasywną dyfuzję lub dostarczanie wspomagane ciśnieniem. Za pomocą tej metody można oczyścić szeroki zakres tkanek, znakować immunologicznie wieloma przeciwciałami i obrazować objętość.

Streszczenie

Identyfikacja i eksploracja szczegółowej organizacji organów lub całego ciała na poziomie komórkowym to fundamentalne wyzwania w biologii. Metody przejściowe wymagają znacznej ilości czasu i wysiłku w celu uzyskania obrazu 3D, w tym przekroju nienaruszonej tkanki, znakowania immunologicznego i obrazowania tkanki ciętej seryjnie, co powoduje utratę informacji na każdym etapie procesu. W niedawno opracowanych podejściach do obrazowania w wysokiej rozdzielczości w nienaruszonej tkance, charakterystyka molekularna została ograniczona do znakowania białek. Jednak obecnie dostępne protokoły oczyszczania narządów wymagają znacznie długiego czasu procesu, co utrudnia wdrożenie technik oczyszczania tkanek w laboratorium. Niedawno opracowaliśmy szybki i wysoce powtarzalny protokół o nazwie ACT-PRESTO (active clarity technique-p ressure related efefficient, and stable transphere makromolekuł do wszystkichrodzajów molekuł), który pozwala na usunięcie tkanek w ciągu kilku godzin. Co więcej, ACT-PRESTO umożliwia szybkie znakowanie immunologiczne konwencjonalnymi metodami i przyspiesza przenikanie przeciwciał do głębokiej warstwy gęsto uformowanych, grubych próbek poprzez zastosowanie ciśnienia lub przepływu konwekcyjnego. Opisujemy, jak przygotować tkanki, jak usunąć lipidy za pomocą elektroforezy oraz jak wybarwić immunologicznie za pomocą podawania wspomaganego ciśnieniem. Szybkość i spójność protokołu przyspieszy wykonywanie badań histologicznych 3D i diagnoz opartych na objętości.

Wprowadzenie

Jednym z wyzwań w neuronauce jest wizualizacja okablowania obwodów neuronalnych i pojedynczych komórek w nienaruszonej tkance mózgowej. Do niedawna wykazanie w ten sposób połączeń między neuronami wymagało 1) seryjnego cięcia tkanek; 2) znakowanie molekularne określonych celów, takich jak aksony lub białka; oraz 3) wizualizacja poprzez rekonstrukcję 3D całego mózgu poprzez rejestrację obliczeniową lub wyrównanie obrazów seryjnych 2D¹. Kroki te są pracochłonne, wymagają dużo czasu i mogą spowodować utratę informacji podczas sekcji i etykietowania, co sprawia, że mapowanie sieci neuronowych jest niezwykle trudne. Opracowano jednak wiele metod, które pozwalają na wizualizację nienaruszonej tkanki bez wycinania. Tkanki biologiczne mogą stać się optycznie przezroczyste za pomocą technik oczyszczania tkanek^2-10. Jedną z głównych metod jest zmniejszenie różnic współczynnika załamania światła między nienaruszoną tkanką a roztworem zanurzeniowym w celu zmniejszenia rozpraszania światła w nienaruszonej tkance, a tym samym nadania tkance przezroczystości i umożliwienia obserwacji głębokich struktur. Niektóre rodzaje roztworów zanurzeniowych mają właściwości hydrofobowe, które powodują szybkie wygaszanie fluorescencyjne podczas procedury odwadniania. W związku z tym metody te nie są kompatybilne z obrazowaniem fluorescencyjnym w długim okresie czasu^11,12. Zamiast odczynników hydrofobowych, inne metody wykorzystują odczynniki hydrofilowe do oczyszczania tkanek, takie jak SeeDB⁴ i Scale⁶, które utrzymują informację strukturalną i fluorescencję tkanki biologicznej^4,6,8. Jednak makrocząsteczki, w tym przeciwciała, nie mogą dotrzeć do rdzenia nienaruszonej tkanki przez samą dyfuzję. W związku z tym wstępne znakowanie cząsteczek docelowych w głębokich obszarach gęsto upakowanych tkanek jest technicznie trudne.

W niedawno opracowanej metodzie oczyszczania tkanek, CLARITY³, tkanka biologiczna zatopiona w hydrożelu jest tworzona z akrylamidu, a lipidy są usuwane przez elektroforezę pod roztworem zawierającym dodecylosiarczan sodu (SDS). Próbkę zanurza się następnie w roztworze o dopasowanym wskaźniku odbicia w celu zmniejszenia rozpraszania światła³. System usuwania lipidów został później zmodyfikowany w zaawansowanych CLARITY¹³ i PACT (technika pasywnej klarowności)¹⁰. Po polimeryzacji łańcuchy akrylamidu sieciują się z białkami, tworząc tkankę hydrożelową. Składniki lipidowe nie mogą sieciować się z akrylamidem; w ten sposób lipidy mogą być eliminowane przez elektroforezę w buforze zawierającym SDS. Poprzez aktywną eliminację lipidów tkanka mózgowa znacznie zwiększa swoją przezroczystość⁹. Metody te nie rozwiązują jednak problemu niemożności głębokiego znakowania poprzez swobodną dyfuzję. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, potrzebne są techniki aktywnego transportu odczynników do najgłębszych części grubych tkanek.

Chociaż PRZEJRZYSTOŚĆ umożliwia oczyszczanie tkanek i wizualizację głębokich tkanek, nie jest to łatwa ani szybka procedura. Oczyszczenie całego mózgu myszy może zająć kilka tygodni^7,14. Szybkie oczyszczanie tkanek jest niezbędne do zastosowania takich metod w podstawowych lub klinicznych warunkach laboratoryjnych do badań z zakresu nauk przyrodniczych lub diagnostyki objętościowej. Obecny protokół zapewnia uproszczony proces biologicznego usuwania tkanek i późniejszego wykrywania białek poprzez barwienie immunologiczne wspomagane ciśnieniem. Nadaje się do obrazowania objętościowego o wysokiej rozdzielczości dużych plików i systemów przetwarzania danych 3D w połączeniu z metodami obrazowania.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach muszą być zgodne ze wszystkimi odpowiednimi regulacjami rządowymi i instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie odczynników

1. Dla roztworu monomeru hydrożelowego (A4P0): Dodać 20 g akrylamidu do 450 ml 0,1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i dostosować objętość do 500 ml za pomocą 0,1x PBS.
   UWAGA: Monomery akrylamidu są toksyczne. Wszystkie zabiegi należy wykonywać pod wyciągiem przy użyciu środków ochrony osobistej, w tym osłony twarzy, fartucha laboratoryjnego, rękawic i butów z zakrytymi palcami.
   1. Bezpośrednio przed użyciem dodać 100 mg dichlorowodorku 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu] do 40 ml roztworu monomeru hydrożelowego (A4P0) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml pod wyciągiem.
2. Do elektroforetycznego buforu oczyszczającego tkanki (ETC): Dodać 40 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 12,37 g kwasu borowego do 800 ml dejonizowanego_H2O(_dH2O). Doprowadzić pH do 8,5 za pomocą NaOH i dostosować objętość do 1 L z dodatkowym dH₂O.
   UWAGA: SDS jest szkodliwą substancją chemiczną; Dlatego obchodź się z nim ostrożnie.
3. Dla roztworu CUBIC-mount: Dodać 250 g sacharozy, 125 g mocznika i 125 g N,N,N',N'--tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminy do 150 ml dH₂O i doprowadzić objętość do 500 ml za pomocą_{dH 2}O.

2. Przygotowanie i utrwalenie próbki

1. Eutanazja myszy.
   1. Przygotować alfakson (1 mg/kg mc.) i ksylazynę (0,5 mg/kg mc.) w tej samej strzykawce.
   2. Wstrzyknąć dootrzewnowo mieszaninę alfaksonu i ksylazyny i odczekać 3 minuty, aby mysz straciła przytomność.
   3. Poczekaj, aż znieczulona mysz przestanie reagować na bolesne bodźce, takie jak szczypanie ogona, zanim przejdziesz dalej.
      ostrożność: Postępuj zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami.
2. Perfuzja przezsercowa myszy ze 100 ml 0,9% roztworu NaCl (pH 7,4-7,5) zawierającego heparynę (100 U/ml) w celu wykrwawienia, a następnie 100 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (pH 7,4)¹⁴,
   ostrożność: Roztwór PFA jest toksyczny. Przygotowanie roztworu PFA i wszelkie późniejsze obchodzenie się z nim musi odbywać się pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony indywidualnej.
3. Odetnij głowę myszy, otwórz skórę i rozbij czaszkę między oczami za pomocą małych nożyczek.
4. Usuń kawałki czaszki za pomocą małych, zakrzywionych kleszczy.
5. Wyjmij mózg lub wybrane narządy.
6. Inkubować mózg i narządy w 4% roztworze PFA po utrwaleniu w temperaturze 4 °C przez noc.
   nuta: W celu oczyszczenia tkanki w określonym obszarze, należy wyciąć określony obszar lub przyciąć tkankę po utrwaleniu tkanki.
   ostrożność: Roztwór PFA jest toksyczny. Perfuzja przezsercowa i wszystkie późniejsze czynności związane z myszami muszą być przeprowadzane pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony indywidualnej.

3. Infuzja i polimeryzacja monomeru hydrożelu

1. Inkubować utrwalone narządy w roztworze monomeru hydrożelowego A4P0 w temperaturze 4 °C przez 12-24 godziny, delikatnie wstrząsając.
2. Polimeryzacja tkanek z monomerem hydrożelowym.
   1. Przenieść próbkę do probówki okrągłodennej o pojemności 10 ml z 5 ml roztworu monomeru hydrożelowego. Owiń górną część rurki z okrągłym dnem Parafilmem.
   2. Usuń tlen z probówki okrągłodennej zawierającej nasyconą hydrożelem próbkę całego mózgu myszy, bulgocząc azotem przez ciecz przez 1 minutę. Szybko i szczelnie zamknij probówkę zawierającą próbkę.
3. Przenieść probówkę do łaźni wodnej (37 °C) na 2 godziny.
4. Przemyć krótko spolimeryzowaną próbkę 0,1x PBS, aby usunąć nadmiar hydrożelu.
   ostrożność: Monomery hydrożelowe są toksyczne. Aby uniknąć kontaktu skóry z monomerem hydrożelowym, wszystkie zabiegi należy wykonywać pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony osobistej, w tym osłony twarzy, fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.
   nuta: Spolimeryzowane tkanki mogą być przechowywane w 0,1 PBS zawierającym azydek sodu przez ponad 2 tygodnie w temperaturze 4 °C.
   ostrożność: Azydek sodu jest silnie i ostro toksyczny. Wszystkie zabiegi należy wykonywać pod wyciągiem i przy użyciu środków ochrony osobistej, w tym osłony twarzy, fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.

4. Elektroforetyczne oczyszczanie tkanek (ETC)

1. Przenieś spolimeryzowaną próbkę do pojemnika na tkanki i umieść pojemnik na tkanki w komorze ETC.
2. Napełnij komorę ETC buforem ETC za pomocą pompy perystatycznej.
3. Ustaw warunki ETC i uruchom ETC. Użyj następujących ustawień.
   1. W przypadku ustawień ETC dla całych narządów należy użyć następujących ustawień: (1.5 amp), temperatura (37 °C), czas pracy (6.0 h), prędkość pompy (30 obr./min).
   2. W przypadku ustawień ETC dla wycinków mózgu myszy o grubości od 1 do 2 mm użyj następujących ustawień: prąd (1.5 A), temperatura (37 °C), czas pracy (2.0 h), prędkość pompy (30 obr./min).
4. Przenieś oczyszczoną próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 45 ml 0,1 PBS. Przemyć oczyszczoną próbkę kilkakrotnie 0,1x PBS, aż po krótkim potrząśnięciu probówką nie będą widoczne pęcherzyki (w celu potwierdzenia całkowitego usunięcia SDS).

5. Znakowanie immunologiczne tkanek przetwarzanych metodą ACT

1. Dla całego mózgu myszy: Inkubować próbkę w objętości 3 ml roztworu przeciwciała zawierającego 1x PBS, 6% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% Triton X-100 i 0,01% azydku sodu (roztwór rozcieńczający przeciwciała) ze współczynnikiem rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH) przez 4 dni w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem. Roztwór przeciwciał należy wymienić pod koniec 2. dnia.
   1. Umyj próbkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 45 ml 0,1 PBS przez 3 - 5 godzin i zmieniaj bufor co godzinę.
   2. Inkubować próbkę w objętości 3 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi 488 osła przez 4 dni w temperaturze 37 °C, lekko wstrząsając. Rozcieńczone roztwory przeciwciał należy wymienić w 2 dniu.
2. W przypadku pokrojonej tkanki mózgowej o grubości od 1 do 2 mm: Próbkę inkubować przez noc lub przez okres do 1 dnia w objętości 0,5 do 1 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała kolagenu typu IV w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem.
   1. Próbkę należy przemyć w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o objętości 12 ml 0,1 PBS przez 1-2 godziny. Zmieniaj bufor co godzinę.
   2. Inkubować próbkę w objętości 0,5 do 1 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla drugorzędowego przeciwciała anty-królika sprzężonego z Cy3 przez noc lub przez okres do 1 dnia w temperaturze 37 °C z łagodnym wstrząsaniem.
3. Przemywać próbkę w 0,1x PBS przez 3 - 5 godzin; bufor należy zmieniać co godzinę.
4. Przed przystąpieniem do obrazowania należy inkubować próbkę w odpowiedniej ilości roztworu CUBIC-mount przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Zastąp świeżym roztworem do montażu CUBIC i inkubuj przez dodatkowe 1 h.
   UWAGA: 76 typów przeciwciał działało dobrze w tkance myszy przetwarzanej przez ACT, w tym 31 przeciwciał monoklonalnych¹⁴. Wstępnie znakowaną tkankę można połączyć z immunoznakowaniem dwóch kolejnych fluorochromów w tkance przetworzonej przez ACT.

6. Znakowanie immunologiczne gęstych tkanek (PRESTO)

1. c-PRESTO
   UWAGA: c-PRESTO nadaje się do małych próbek, takich jak całe jądro, cała nerka lub małe odcinki większych narządów.
   1. Przenieść próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml, dodać 500 μl roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała kolagenu typu IV i odwirować probówkę o masie 600 × g przez 2 godziny.
   2. Przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 x PBS przez odwirowanie przy 600 × g przez 30 minut.
   3. Dodać 500 μl roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla sprzężonego z Cy3 drugorzędowego przeciwciała anty-królika i odwirować przy 600 × g przez 2 godziny.
   4. Przepłukać zabarwioną próbkę 0,1 x PBS przez odwirowanie przy 600 × g przez 30 minut.
2. s-PRESTO
   UWAGA: s-PRESTO nadaje się do większych tkanek.
   1. Przygotuj strzykawkę (objętość 30 ml) i podłącz ją do zaworu 3-drogowego (Rysunek 1A). Przyklej zawór za pomocą pistoletu do klejenia w warunkach wysokiego ciśnienia (Rysunek 1B).
   2. Przenieść próbkę do strzykawki z zaworem 3-drogowym w pozycji zamkniętego zaworu.
   3. Dodać 5 - 7 ml roztworu rozcieńczającego przeciwciała o współczynniku rozcieńczenia 1/500 dla przeciwciała kolagenu typu IV. Uwolnić roztwór przeciwciała do próbki, otwierając zawór.
   4. Ustawić tłok strzykawki w pozycji 17 ml, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca na ruch infuzji/odstawienia. Można to zrobić w pozycji otwartego zaworu. Zamknąć zawór 3-drogowy po zakończeniu ustawiania strzykawki.
   5. Umieścić strzykawkę zawierającą próbkę na pompie strzykawkowej. Ustawić warunki pompy strzykawkowej na objętość infuzji/odstawienia 10 ml/min i 4-minutową przerwę w trybie cyklu ciągłego (Rysunek 1C).
      nuta: Pompa zaparza do momentu osiągnięcia docelowej objętości (10 ml), a następnie po krótkiej przerwie (4 min) zmienia się kierunek przepływu.
   6. Uruchom pompę strzykawkową na 3 - 24 godziny w temperaturze pokojowej (Rysunek 1F).
   7. Otwórz zawór 3-drogowy i zastąp roztwór 0,1x PBS.
   8. Przebarwioną próbkę przemyć dwukrotnie 0,1 x PBS przez 1 godzinę za każdym razem za pomocą pompy strzykawkowej.
   9. Zamień roztworem do rozcieńczania przeciwciał zawierającym sprzężone z Cy3 drugorzędowe przeciwciało anty-królicze (współczynnik rozcieńczenia 1/500) i uruchom pompę strzykawkową na 3 - 24 godziny.
   10. Otwórz zawór 3-drogowy i zastąp roztwór 0,1x PBS.
3. Przed przystąpieniem do obrazowania należy inkubować wybarwioną próbkę w odpowiedniej ilości roztworu do montażu sześciennego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Zastąp świeżym roztworem do montażu CUBIC i inkubuj przez dodatkowe 1 godzinę.

7. Obrazowanie

1. Umieść oznakowaną tkankę w naczyniu konfokalnym i dodawaj roztwór CUBIC-mount, aż tkanka zostanie pokryta. Umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować tkankę¹⁴ pod obiektywem 10X.

Wyniki

ACT-tissue Clearing

Jednym z ważnych czynników wpływających na oczyszczanie tkanek jest ich utrwalenie. Wiązanie PFA i infuzja akrylamidu są oddzielnymi etapami w tym protokole. Po etapie polimeryzacji tkankowo-hydrożelowej wolny roztwór A4P0 nie ulega polimeryzacji, chociaż hydrożele nasączone tkankami są sieciowane z endogennymi makrocząsteczkami. Dlatego żaden żel nie powinien tworzyć się poza tkankami (ryc. 2A). Procedura ACT skutkuje mniejszym sieciowaniem między białkami a akrylamidem w porównaniu z protokołem CLARITY. W związku z tym próbka hydrożelu tkankowego jest bardziej porowata. Ta cecha umożliwia szybką ekstrakcję lipidów i dyfuzję makrocząsteczek. Skrawki mózgu myszy o grubości od 1 do 2 mm zostały wystarczająco oczyszczone w ciągu 1-2 godzin (Figura 2B), a 5-6 godzin ETC było wystarczające do usunięcia całych mózgów myszy (Figura 2C). Oczyszczanie tkanek za pośrednictwem hydrożelu indukowało rozszerzanie się tkanki po etapie ETC, ale tkanka powróciła do swojego pierwotnego rozmiaru w roztworze o dopasowanym indeksie odbicia. Próbka tkankowo-hydrożelowa utworzona w procedurze ACT jest wysoce porowata, a zatem małe związki i makrocząsteczki mogą skutecznie przenikać i łatwo dyfundować (ryc. 3). Po 2-godzinnej inkubacji 1-milimetrowych wycinków mózgu z hydroksylazą tyrozynową (TH) i przeciwciałem kolagenowym typu IV, kolejna 2-godzinna inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym była wystarczająca do znakowania neuronów dopaminergicznych na głębokości 500 μm (Figura 3).

Znakowanie immunologiczne PRESTO-tissue

Gęste narządy zazwyczaj mają wysokie stężenie włókien ECM, co wpływa na przenikanie przeciwciał do tkanek. W ten sposób przeciwciała wnikały na głębokość zaledwie 20-30 μm w gęstych tkankach, takich jak tkanka nerkowa, po 12 godzinach inkubacji. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zaprojektowaliśmy metody aktywnej penetracji makrocząsteczek, które umożliwiają dostarczanie odczynników do głębokich tkanek, a mianowicie PRESTO (pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into the organ) (ryc. 4). W porównaniu ze statyczną inkubacją tkanki nerkowej przetworzonej przez ACT z roztworami przeciwciał, zastosowanie sił odśrodkowych (600 x g) za pomocą wirówki stołowej (odśrodkowej PRESTO, c-PRESTO) znacznie poprawiło dostarczanie przeciwciał do głębokich tkanek (ryc. 5). Kiedy zastosowaliśmy procedurę c-PRESTO do gęstych tkanek, 3 godziny inkubacji wystarczyły do oznakowania struktur o głębokości od 250 do 300 μm. Aby poprawić zniekształcenie tkanek bez znacznego uszkodzenia tkanek, zaprojektowaliśmy również maszynę, która zapewnia przepływ konwekcyjny za pomocą pompy strzykawkowej (strzykawka PRESTO, s-PRESTO). Proces ten podobnie poprawił penetrację przeciwciał w porównaniu z dyfuzją bierną (ryc. 5).

Rysunek 1. Przygotowanie aparatu s-Presto. ZA. Strzykawka (30 ml) i trójdrożny kran. Ur. Trójdrogowy kran podłączony i przyklejony do strzykawki. C. Strzykawka zawierająca próbkę i roztwór przeciwciała oraz strzykawka umieszczona na pompie strzykawkowej. D. Pompa strzykawkowa i ustawienie warunków pracy. E. Pompa wprowadza do próbki roztwór zawierający odczynniki do znakowania. Po osiągnięciu wyznaczonej objętości kierunek pompowania zmienia się i wycofuje roztwór po wyznaczonym czasie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. ACT oczyszczanie tkanki mózgu myszy. ZA. Po polimeryzacji wolne roztwory A4P0 nie są polimeryzowane; Hydrożele nasączone tkankami są żelowane przez sieciowanie z endogennymi makrocząsteczkami. B. Plastry mózgu o grubości od 1 do 2 mm oczyszczano przez 1-2 godziny, a także rejestrowano zakres ekspansji i odzyskiwania wielkości w roztworze dopasowującym wskaźnik odbicia (RI). C. Grubość całego mózgu myszy wynosi około 0,8 cm, a 5 - 6 godzin ETC wystarczyło do całkowitego oczyszczenia mózgu. Po 3 godzinach ETC pojawiła się znaczna ilość nieoczyszczonej tkanki. Jednak po 6 godzinach ETC nastąpiło oczyszczenie całego mózgu. Kolor tkanek po ACT w buforze ETC jest biały lub nieprzezroczysty. Poprzez regulację RI tkanki stają się przezroczyste. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Znakowanie immunologiczne za pomocą tkanki mózgowej myszy oczyszczonej przez ACT. Obrazy przetworzonych przez ACT 1-milimetrowych wycinków mózgu myszy pokazujących korę mózgu myszy zabarwioną przeciwciałem przeciwko kolagenowi typu IV i część śródmózgowia zabarwioną przeciwciałem przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH). Podziałka skali, 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Metody znakowania immunologicznego PRESTO. Przeciwciała nie mogą przenikać do gęstych tkanek przez dyfuzję. Metody znakowania immunologicznego opracowane w ramach projektu PRESTO zostały zaprojektowane tak, aby aktywnie wprowadzać makrocząsteczki i dostarczać odczynniki do gęstych tkanek. Zastosowanie sił odśrodkowych za pomocą standardowej wirówki stołowej (odśrodkowej PRESTO, c-PRESTO) znacznie ułatwiło dostarczanie przeciwciał. Zastosowanie przepływu konwekcyjnego za pomocą pompy strzykawkowej (strzykawka PRESTO, s-PRESTO) poprawiło penetrację przeciwciał. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Znakowanie immunologiczne PRESTO gęstej tkanki oczyszczonej przez ACT. W przypadku c-PRESTO tkanki odwirowywano przy 600 x g przez 3 godziny przy użyciu standardowej wirówki stołowej w celu przyspieszenia penetracji przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. W przypadku s-PRESTO do dostarczenia przeciwciał użyto pompy strzykawkowej. Narządy myszy, takie jak nerki i wątroba, zostały oznaczone kolagenem typu IV. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, 3 godziny c- lub s-PRESTO znacznie zwiększają głębokość etykietowania. W nerkach i wątrobie głębokość osi Z osiąga 300 - 350 μm lub głębiej w próbkach PRESTO (po prawej), podczas gdy próbki kontrolne są znakowane na głębokości zaledwie 40 - 50 μm (po lewej). Zrekonstruowany obraz 3D uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Podziałka skali, 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Słabe utrwalenie lub zanurzenie hydrożelu w tkankach może spowodować utratę białek i zniekształcenie tkanki podczas procesu oczyszczania tkanek. Cały mózg dorosłej myszy należy inkubować w 4% paraformaldehydzie przez noc, a następnie zanurzyć w minimalnej objętości 20 ml roztworu monomeru hydrożelowego na 12 - 18 godzin, delikatnie wstrząsając. W przypadku dużych tkanek, w tym tkanek ludzkich, takich jak wycinki mózgu i rdzeń kręgowy, wymagany jest wydłużony czas namaczania w roztworze monomeru hydrożelowego. Protokół ACT można łatwo zastosować do oczyszczania utrwalonych tkanek, ponieważ etapy utrwalania tkanek i infuzji polimeru są oddzielone. Po oczyszczeniu tkanek tkanki ludzkie były dobrze wybarwione kilkoma przeciwciałami. Należy pamiętać, że technika oczyszczania ACT nie jest kompatybilna z utrwalaczami alkoholowymi, takimi jak etanol i metanol.

Etap polimeryzacji tkankowo-hydrożelowej ma również kluczowe znaczenie dla wytworzenia dobrej jakości tkanki po procesie oczyszczania. Ponieważ tlen hamuje polimeryzację akrylamidu, należy go usunąć poprzez odgazowanie roztworu zawierającego tkankę w systemie infuzji azotu gazowego. Alternatywnie odtlenianie można przeprowadzić za pomocą komory próżniowej z blokiem grzewczym przez 23 godziny.

Szybkość usuwania zależy od wielu czynników, w tym wielkości narządu, zawartości lipidów lub białek włóknistych ECM, stanu utrwalenia itp. Większość tkanek dorosłych myszy może zostać usunięta przez ETC w ciągu nocy. Istnieje jednak ryzyko niepotrzebnego nadmiernego oczyszczania i obrzęku tkanek; W związku z tym różnice w czasie rozliczeń mają istotne znaczenie. Warunki oczyszczania tkanek powinny być określone empirycznie. Co ważne, zawartość ECM może wpływać na wygląd oczyszczonej tkanki. Kolor tkanek pozostaje biały lub nieprzezroczysty, nawet po ACT w buforze ETC, ponieważ ACT nie usuwa gęstych włókien białkowych. Jednak, gdy narządy te zostały zanurzone w roztworze pasującym RI, stały się przezroczyste.

Szybkość obrzęku tkanek wydaje się być zależna od zawartości ECM w tkankach, a narządy miękkie, takie jak mózg, wykazują większy współczynnik obrzęku niż gęste narządy. Ponieważ zwiększony obrzęk tkanek pomoże w procedurze oczyszczania tkanek, ACT w większości przypadków rutynowo wykorzystuje destylowany bufor na bazie wody. W niektórych przypadkach, gdy obrzęk tkanek lub przejściowa deformacja nie jest pożądana, na przykład w zarodkach, do obrazowania w wysokiej rozdzielczości można zastosować bufor zawierający 0,1x PBS. Należy również zauważyć, że wyższe stężenia soli w buforze mogą powodować kurczenie się tkanek.

Metoda ACT może wyjaśnić całe narządy, a nawet całe ciało myszy¹⁴. Jednak obrazowanie tkanek głębokich przezroczystych wymaga specjalnych mikroskopów i obiektywów. Tak więc tkanka mózgowa o grubości od 1 do 2 mm jest najbardziej skuteczna w obrazowaniu za pomocą konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego. W naszych rękach usuwanie znakowanych przeciwciał z tkanek przetworzonych przez ACT jest zależne od przeciwciał i nie zaleca się wykonywania różnych rund znakowania przeciwciałami. Kilka przeciwciał, takich jak TH i GFAP, działało szczególnie dobrze w przypadku znakowania immunologicznego całego mózgu¹⁴. Z drugiej strony, niektóre przeciwciała, takie jak Tuj1 lub Map2, często znakowały tylko powierzchnię tkanek. Można to poprawić za pomocą innych metod, takich jak SWITCH¹⁵. Innym potencjalnym ograniczeniem jest to, że może być trudno zachować drobne struktury białkowe w tkance przetwarzanej przez ACT ze względu na pęcznienie i kurczenie się tkanki na etapie oczyszczania tkanki.

Technika PRESTO ma zastosowanie w szerokiej gamie technik znakowania tkanek. Na przykład w metodach przezroczystych tkankowo wykorzystujących wstępnie znakowaną tkankę, takich jak SeeDB⁴ i iDISCO⁷, znakowanie immunologiczne gęstej tkanki wymaga okresów inkubacji dłuższych niż kilka dni do tygodni. Jednak PRESTO może skrócić czas inkubacji do kilku godzin, umożliwiając zakończenie całego procesu w ciągu jednego dnia z gęstą tkanką o grubości 1 mm. PRESTO może zwiększyć skuteczność głębokiego znakowania grubych, gęstych tkanek, a nawet nieoczyszczonych grubych tkanek. Ponieważ PRESTO wykorzystuje wirówkę stołową lub pompę strzykawkową i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu, stosunkowo łatwo jest wdrożyć tę technikę w rutynowych procedurach laboratoryjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4% Paraformaldehyd	Lugen SCI	Mocowanie próbki LGB-1175-4B
Akrylamid	Affymetrix	75820	Roztwór monomeru hydrożelowego
Dichlorowodorek 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propanu]	Wako Pure Chemical Industries	VA-044	Roztwór monomeru hydrożelowego
Kwas borowy	Bufor Affymetrix	76324	ETC
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Bufor	Affymetrix	18220
Granulki wodorotlenku sodu	Bufor chemiczny Junsei	1310-73-2	ETC
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2323A	Znakowanie immunologiczne
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Znakowanie immunologiczne
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002	Znakowanie immunologiczne
Hydroksylaza tyrozyny (TH)	Millipore	AB152	Przeciwciało/znakowanie immunologiczne
Alexa Fluor Cy3 Osioł anty-króliczy IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Przeciwciało wtórne / znakowanie immunologiczne
Alexa Fluor 488 Osioł anty-króliczy IgG (H+L)	Life Technologies - Molekularne Sondy	A21206	Przeciwciało wtórne / immunoznakowanie
Naczynie konfokalne	SPL lifesciences	101350	Obrazowanie
mikroskopu konfokalnego	Leica	SP8	Obrazowanie
sacharozy	Junsei chemiczne	31365-0301	Roztwór do montażu w kostce
Mocznik	Affymetrix	23036	Roztwór do montażu w kostce
N,N,N',N' -tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiamina	Sigma-Aldrich	122262	roztwór do montażu na CUBIC
Izba ECT	Logos Biosystems, Inc.	C10101	System ETC
Sterownik komory ECT	Logos Biosystems, Inc.	System C10201
ETC Sonda temperatury	Logos Biosystems, Inc.	C12101	System ETC
Pompa perystatyczna	Baoding dłuższa pompa precyzyjna Co., Ltd		YZ1515X System ETC
Zbiornik buforowy	Logos Biosystems, Inc.	C10401	System ETC
Pojemnik na tkanki	Logos Biosystems, Inc.	System C12001	ETC
Uchwyt na 1 pojemnik na chusteczki	Logos Biosystems, Inc.	System C12002
ETC Uchwyt na plasterki mózgu myszy	Logos Biosystems, Inc.	System C12004
ETC Uchwyt na cały mózg szczura	Logos Biosystems, Inc.	System C12007
ETC Przewody pompy perystaltycznej	Logos Biosystems, Inc.	C12104	System ETC
Wirówka stołowa	Hanil science industrial Co., Ltd	MICRO 12	c-PRESTO
Pompa strzykawkowa	Baoding dłuższa pompa precyzyjna Co., Ltd	LSP02-1B	s-PRESTO
Strzykawka (30 mL)	Korea vaccine Co., Ltd.	KV-S30	s-PRESTO
3-drogowy kran	Hyupsung medical Co., Ltd.	HS-T-01N	s-PRESTO