Akwizycja elektroencefalograficzna o dużej gęstości w modelu gryzoni przy użyciu tanich zasobów typu open source

Summary

Instrukcje dotyczące taniego konstruowania i chirurgicznego wszczepiania myszom przewlekłego przezczaszkowego montażu elektroencefalograficznego o dużej gęstości są dostarczone. Opisano również techniki nagrywania, ekstrakcji i przetwarzania sygnału.

Abstract

Zaawansowane techniki analizy elektroencefalograficznej wymagające wysokiej rozdzielczości przestrzennej, w tym obrazowanie źródeł elektrycznych i pomiary łączności sieciowej, mają zastosowanie do coraz szerszego zakresu zagadnień w neurobiologii. Wykonywanie tego rodzaju analiz w modelu gryzoni wymaga większej gęstości elektrod niż mogą to osiągnąć tradycyjne elektrody śrubowe. Chociaż istnieją montaże elektroencefalograficzne o większej gęstości dla gryzoni, są one ograniczone do większości badaczy, nie są wystarczająco wytrzymałe, aby można je było powtarzać przez dłuższy czas lub są ograniczone do stosowania u znieczulonych gryzoni. ^1-3 Proponowana tania metoda konstruowania trwałego, licznego, przezczaszkowego układu elektrod, składającego się z obustronnie wszczepialnych nakryć głowy, jest badana jako sposób na przeprowadzenie zaawansowanych analiz elektroencefalogramu u myszy lub szczurów.

Przedstawiono procedury wytwarzania nakryć głowy i chirurgicznego wszczepienia implantów niezbędnych do wytworzenia sygnału o wysokim współczynniku szumu, elektroencefalograficznych i elektromiograficznych o niskiej impedancji. Chociaż metodologia jest przydatna zarówno u szczurów, jak i myszy, ten manuskrypt koncentruje się na trudniejszej implementacji dla mniejszej czaszki myszy. Swobodnie poruszające się myszy są podłączone do tylko za pomocą wspólnego adaptera podczas nagrywania. Jedna wersja tego systemu elektrod, która zawiera 26 kanałów elektroencefalograficznych i 4 kanały elektromiograficzne, jest opisana poniżej.

Introduction

Aktywność neuronalna może być rejestrowana pozakomórkowo z różnymi poziomami szczegółowości, od mikroskopijnej (indywidualne potencjały czynnościowe) przez mezoskopową (lokalne potencjały pola) do makroskopowej (elektroencefalogram). Te ślady fal mózgowych są klasycznie analizowane w dziedzinie częstotliwości w celu scharakteryzowania stanów behawioralnych, neurofizjologicznych lub elektrofizjologicznych. Można to zrobić za pomocą pojedynczego biopotencjału,4 ale zapisy EEG o rzadkiej gęstości nie są w stanie określić przestrzennego składnika aktywności neuronalnej. Nowoczesna analiza elektroencefalogramu opiera się na wielu elektrodach w celu stworzenia szczegółowych map czasoprzestrzennego rozkładu aktywności kory mózgowej w celu skorelowania tej aktywności z określonymi warunkami psychologicznymi i procesami fizjologicznymi. ^5-7 Dwie z najczęściej stosowanych kategorii analiz wymagających montażu EEG o dużej gęstości to obrazowanie źródeł elektrycznych i pomiary łączności sieci neuronowych. ^8-11

Obrazowanie źródła elektrycznego polega na lokalizacji funkcjonalnie aktywnych obszarów mózgu. Mapowanie topograficzne układu elektrod może wizualizować gęstość źródła prądu aktywności elektrycznej w mózgu podczas potencjałów związanych ze zdarzeniami (ERP) i potencjałów wywołanych (EP). Lokalizacja źródła elektrycznego jest powszechnie stosowana zarówno w badaniach napadów, jak i w analizach dystrybucji mocy. ^12-15 Ponieważ EEG ma wysoką rozdzielczość czasową, badania EEG umożliwiają ocenę ERP i EP w czasie rzeczywistym, a także czasowo precyzyjną analizę post hoc. ^3,11,12

Powiązanie stanów i funkcji poznawczych z wzajemnym oddziaływaniem oscylacji obserwowanych na elektroencefalogramie jest ostatecznym celem różnych pomiarów połączeń sieci neuronowych. Liczne badania wykazały, że synchronizacja i blokowanie fazowe oscylacji między różnymi regionami mózgu są związane z określonymi stanami pobudzenia, uwagi i ^{działania.6,13,14,16-19} Wykazanie takich powiązań sygnałów między regionami mózgu wymaga tablic o dużej gęstości, które umożliwiają ocenę łączności sieciowej.

Lokalizacja źródeł i analizy sieciowe sygnałów EEG pochodzą z badań na ludziach, ale badania nad neuronalnymi podstawami tych sygnałów z konieczności obejmują modele zwierzęce, ponieważ wymagają one technik inwazyjnych, które są niemożliwe do wykonania u ludzi. Aby powtórzyć te analizy w modelach gryzoni, potrzebna jest metoda przechwytywania sygnałów EEG o dużej gęstości w mózgu gryzoni. Podczas gdy inne grupy skonstruowały układy mikroelektrod o dużej gęstości do stosowania u myszy, takie podejścia są ograniczone do dostępności dla badaczy bez dostępu do urządzeń do nanowytwarzania, nie są wystarczająco solidne, aby można je było powtarzać przez dłuższy czas lub są ograniczone do stosowania u znieczulonych myszy. ^1-3,7 Poniżej przedstawiono tani alternatywny protokół do budowy przewlekłego układu elektrod przezczaszkowych o dużej gęstości.

Opisane tutaj podejście do pozyskiwania sygnałów nie ogranicza się do EEG, ale obejmuje sygnały elektromiograficzne (EMG). Akwizycja sygnałów EMG może być uzupełniającym podejściem do definiowania stanu zachowania i jest szczególnie przydatna w badaniach snu. Takie podejście zapewnia rozwiązanie pośrednie między drogimi siatkami wewnątrzczaszkowymi o bardzo dużej gęstości a ograniczoną liczbą odprowadzeń możliwą do osiągnięcia w przypadku tradycyjnych elektrod śrubowych, które są niewystarczające dla zaawansowanych metod analizy. Konstrukcja głowicy jest łatwa w budowie i przystępna cenowo do badań o wysokiej przepustowości. Zastosowanie tego systemu akwizycji w połączeniu z różnymi genetycznymi lub farmakologicznymi technikami manipulacyjnymi w modelach gryzoni może pomóc w odkryciu mechanizmów generowania drgań korowych, rozbieżności behawioralnych od prawdziwych różnic genotypowych, lokalizacji źródeł ERP i EP oraz komunikacji sieciowej na dużą skalę.

Protocol

Badania przeprowadzone podczas tego badania były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Pensylwanii.

1. Projektowanie i budowa nakryć głowy

1. Usuń co ósmy rząd kołków z kostki 2 x 50 pinów 100-pozycyjnego złącza gniazdowego za pomocą pęsety, wciskając część gniazdową kołka przez plastikową cegłę.
   Uwaga: Piny skierowane w dół będą orientacją, do której będzie się odwoływać w pozostałej części protokołu. (Zwróć na to uwagę w szczególności w punkcie 2.6).
2. Przykryj szpilki bardzo cienką warstwą lakieru do paznokci, aby zaizolować i pozwól lakierowi całkowicie wyschnąć.
3. Usuń lakier do paznokci z końcówek szpilek za pomocą acetonu i małej szmatki.
4. Przytnij nadmiar plastiku z 2 x 7 za pomocą żyletki lub szczypiec do cięcia drutu. Spowoduje to powstanie cegieł 2 x 7, które są izolowane na całej długości kołków i odsłonięte na końcówce kołka. Ostatecznie staną się one przezczaszkowymi elektrodami EEG. Dwie cegły 2 x 7 są niezbędne do stworzenia kompletnego przewlekłego układu elektrod (rysunek 1A).
5. Wytnij dwie klocki 1 x 2 pin do nagrywania sygnału EMG. Użyj tego samego procesu, usuwając niechciane szpilki za pomocą pęsety i odcinając nadmiar plastiku, aby stworzyć cegły 1 x 2. Upewnij się, że te 1 x 2 mają gładką stronę do nich od oryginalnego 100-pozycyjnego gniazda, ponieważ odległość ta stanie się standardową odległością pinów dla każdej głowicy, więc pojedynczy adapter będzie działał dla wszystkich głowic (Rysunek 1A).
6. Użyj 2-częściowej żywicy epoksydowej, aby przymocować element pinowy 1 x 2 do elementu pinowego 2 x 7 (Rysunek 1D).
   1. Ponieważ oba zestawy kołków muszą być w tej samej orientacji, pokryj żywicą epoksydową 1 x 2 po bocznej stronie obu połówek głowicy, tak aby gładkie boki 1 x 2 i 2 x 7 stykały się ze sobą. Wyrównaj otwory i szpilki 1 x 2 z najbardziej wysuniętymi do tyłu 2 rzędami kołków na 2 x 7,
      Uwaga: Dwie połówki nakrycia głowy nie są epoksydowane razem. Pozwala to na elastyczność w obrębie dwóch połówek adaptera głowicy w celu łatwiejszego podłączenia podczas habituacji i podczas dni eksperymentalnych (ryc. 1E).
   2. Pozwól połówkom nakrycia głowy utwardzić się przez noc. Po zakończeniu nakrycie głowy jest obustronnie symetryczne. Każda połówka składa się z cegły 2 x 7 z bocznie przymocowaną cegłą 2 x 1 pin, która jest w jednej linii z najbardziej tylnymi 2 rzędami klocka 2 x 7 pin.
7. Przygotuj przewody do rejestracji sygnału EMG. Jednożyłowy drut srebrny o gramaturze perfluoroalkoksylowej o gramaturze 31 G służy do rejestracji sygnału EMG (rysunek 1D). Jednak w razie potrzeby można zastąpić okablowanie wielożyłowe lub inne metalowe.
   1. Aby utworzyć przewody EMG klatki piersiowej, weź kawałek srebrnego drutu izolowanego perfluoroalkoksylowo o długości 3,0 cm i usuń 1 cm plastikowej izolacji z jednego końca za pomocą żyletki. Owiń nieizolowany drut wokół pęsety dwukrotnie. Usuń drut z pęsety i usuń 25 mm izolacji z niezapętlonego końca za pomocą żyletki.
   2. Aby skonstruować druty EMG szyjki macicy, powtórz proces z 1,5 cm odcinkiem drutu. Do kompletnego nakrycia głowy potrzebne są dwa druty EMG szyjki macicy i dwa druty EMG klatki piersiowej.
8. Usuń boczną szpilkę w najdalszym przednim rzędzie obu nakryć głowy, co odpowiada współrzędnym stereotaktycznym 3,3 mm przed Bregma i 2,3 mm z boku Bregmy, ponieważ poniżej tego miejsca nie ma mózgu, jak określono w atlasie^{mózgu myszy 20} (ryc. 2A).
9. Na obu połówkach główki przytnij kołki cegły 1 x 2 do plastikowej podstawy głowicy za pomocą nożyc do drutu (3,0 mm od końcówki szpilki) i drut EMG szyjki macicy do przedniej szpilki, a EMG piersiowy do tylnej szpilki.
   1. Sprawdź, czy każdy styk jest izolowany elektrycznie. Wykonaj test ciągłości za pomocą multimetru cyfrowego, podłączając dwa przewody woltomierza do różnych pinów w trybie ciągłości. Elektrycznie izolowane styki nie wydadzą sygnału dźwiękowego podczas tego testu multimetru; Jednak kołki sprzężone elektrycznie będą. Przykryj lutowane połączenia lakierem do paznokci, a po wyschnięciu zegnij druty EMG tak, aby były równoległe do osi przedniej/tylnej z minimalnym przemieszczeniem bocznym.
10. Przytnij szpilki do względnej długości tak, aby pasowały do profilu powierzchni mózgu.
    1. Za pomocą atlasu mózgu myszy zapisz odległość brzuszną do powierzchni mózgu od Bregmy dla każdej współrzędnej pin. ²⁰ Szpilka, której brzuszna odległość od Bregmy jest największa, będzie służyć jako wskaźnik do przycinania szpilki. Ten kołek nie zostanie przycięty, podczas gdy wszystkie inne kołki zostaną przycięte w stosunku do tego kołka o maksymalnej odległości brzusznej (Tabela 1).
       Uwaga: Kołki można szlifować na wymiar, ale należy to robić ostrożnie, ponieważ tarcie między kołkiem a ściernicą może spowodować wygięcie kołków głowicy. Jeśli szpilka jest wygięta, użyj pęsety, aby ją wyprostować. Alternatywą dla szlifowania kołków na długość jest przycięcie ich szczypcami do cięcia drutu.
11. Przykryj wszystkie końcówki szpilek srebrnym roztworem za pomocą srebrnego pisaka i pozostaw do wyschnięcia. Ten krok obniża impedancję elektrody do ≤30 kΩ, co zwiększa stosunek sygnału do szumu i jednocześnie eliminuje szorstkie krawędzie spowodowane przycinaniem szpilek, zmniejszając w ten sposób ryzyko uszkodzenia tkanek i przyspieszając powrót do zdrowia po operacji. Gotowa połówka nakrycia głowy waży około 0,5 g.

2. Budowa adaptera i mapowanie kanałów

1. Przytnij przewody połączeniowe 36-pozycyjnego dwurzędowego męskiego złącza nanominiaturowego na jednolitą długość 2 lub 3 cm za pomocą żyletki. Dla każdego przewodu zdejmij 2.5 mm izolacji z końca i ocynuj odsłonięty metal dla każdego drutu. Upewnij się, że podczas cynowania masz pojedyncze, cienkie pasmo ocynowanego drutu dla każdego drutu adaptera nano, ponieważ ma to kluczowe znaczenie dla odizolowania pinów. Odetnij zdjętą izolację za pomocą szczypiec do cięcia drutu (Rysunek 1C).
2. Utwórz pasujące złącze męskie/męskie do głowicy za pomocą nagłówka listwy połączeniowej 2 x 50. Wytnij dwa 2 x 7 i dwa 2 x 1 z cegły 2 x 50. Usuń niechciane styki z klocka 2 x 50, odłamując jeden z męskich kołków, a następnie zepchnij nieprzerwaną drugą połowę tego samego elementu ze złącza za pomocą pęsety (Rysunek 1B).
   Uwaga: Jedna strona tych pinów będzie służyć jako styki adaptera do podłączenia do każdej głowicy, podczas gdy druga połowa zostanie przylutowana do ocynowanych przewodów złącza nano. Upewnij się, że płaskie plastikowe krawędzie 2 x 1 i 2 x 7 stykają się, aby zagwarantować prawidłowe połączenie złącza męskiego/męskiego z głowicą utworzoną w kroku 1.
3. jeden z przewodów uziemiających/odniesienia od złącza nano do żądanego pinu uziemienia/odniesienia. Przewody uziemiające i odniesienia są połączone ze sobą na RHD2132 układzie wzmacniacza. Użyj pojedynczego kołka, który znajduje się 0,60 mm z przodu Bregma i 1,00 mm z boku Bregmy, zarówno jako odniesienie, jak i uziemienie. (Lewe nakrycie głowy, szpilka przyśrodkowa trzeciego najbardziej wysuniętego do przodu rzędu; jednak każda inna szpilka może być przypisana, jeśli jest to preferowane, Ryc. 2.) Należy pamiętać, że możliwe jest oddzielenie uziemienia i odniesienia na chipie wzmacniacza poprzez usunięcie rezystora 0Ω, który łączy ze sobą masę i odniesienie, jeśli pożądane jest odizolowanie tych dwóch.
4. ocynowane przewody złącza nano po tej samej stronie złączy męskich/męskich, co połączenie pinu uziemiającego/odniesienia. Każdy przewód jest mapowany na określony kanał, więc konfigurację kanału można zakończyć w tym momencie. Schematy map kanałów dla stopni czołowych wzmacniacza można znaleźć na stronie Open Ephys Wiki (https://open-ephys.atlassian.net/wiki/display/OEW/Home). odpowiedni przewód, którego kanał jest znany odpowiedniemu pinowi, aby uzyskać pożądane mapowanie.
5. Odetnij nieużywane przewody u podstawy złącza nano za pomocą szczypiec do cięcia drutu.
6. Użyj woltomierza, aby upewnić się, że każdy styk jest elektrycznie odizolowany od wszystkich innych pinów. Po potwierdzeniu izolacji nałóż cienką warstwę lakieru do paznokci wokół każdego złącza lutowniczego, aby dodatkowo zaizolować każdy kołek.
7. Używając 2-częściowej żywicy epoksydowej, wzmocnij pasujący adapter nano do dwustronnych kołków 2 x 7 i 2 x 1 na klockach męsko-męskich.
   Uwaga: W tym pojedynczym adapterze będą dwie połówki, które pasują do układu pinów utworzonych wcześniej połówek głowicy. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że środkowa część każdej połowy adaptera nie ma nadmiaru żywicy epoksydowej wylewającej się z plastikowej krawędzi złącza męskiego/męskiego, ponieważ zapobiegnie to jednoczesnemu podłączeniu obu połówek głowicy. Nie pozwól, aby żywica epoksydowa przepłynęła na spód części adaptera pinowego adaptera, ponieważ uniemożliwiłoby to również prawidłowe połączenia. Użyj 2 połówek głowicy jako formy do prawidłowego wyrównania styków łącznika.
8. Żywica epoksydowa obejmuje obie połówki adaptera i żywicę epoksydową podstawę złącza nano, aby zwiększyć jego trwałość. Pamiętaj, aby pokryć wszystkie połączenia lutownicze żywicą epoksydową. Pozwól adapterowi utwardzić się przez noc.
9. Potwierdzenie poprawnego mapowania kanałów można przeprowadzić za pomocą pomiarów impedancji w graficznym interfejsie użytkownika (GUI) Open-Ephys. Kompletny adapter waży około 1,3 g (rysunek 1F).

3. Chirurgia

1. Przygotuj sterylne pole operacyjne.
   1. W razie potrzeby nosić sterylne rękawice i inne środki ochrony osobistej. Sterylizuj narzędzia w autoklawie. Wysterylizuj ramkę stereotaktyczną roztworem dwutlenku chloru o stężeniu 1,0 mM. Rozpyl roztwór na ramę i odczekaj 5 minut przed spłukaniem sterylną wodą.
   2. Aby wysterylizować wszczepialne części głowicy, spryskaj je roztworem dwutlenku chloru o stężeniu 1,0 mM i odczekaj 5 minut przed spłukaniem sterylną wodą. Umieść teraz sterylny sprzęt do implantacji na sterylnej szalce Petriego.
2. Uzyskaj przedchirurgiczną wagę dla myszy, a następnie znieczulij mysz w komorze indukcyjnej o pojemności 200 ml przy użyciu 1,5-2,0% izofluranu w 100% tlenie. Użyć natężenia przepływu do komory około 500 ml/min.
3. Potwierdź utratę odruchu prostowania, obracając komorę indukcyjną. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść ją w stożku nosowym na ramie stereotaktycznej, nie zabezpieczając całkowicie głowy myszy za pomocą nauszników. Kontynuuj monitorowanie odpowiedniej głębokości znieczulenia poprzez ocenę uszczypnięcia palców u stóp, jednocześnie oceniając parametry życiowe.
4. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą regulatora temperatury w pętli zamkniętej, takiego jak sonda doodbytnicza i system poduszek grzewczych. Przykryj oczy myszy maścią okulistyczną do oczu przed odcięciem futra na czubku czaszki za pomocą zakrzywionych nożyczek lub maszynki do strzyżenia. Zdezynfekuj głowę betadyną i poczekaj, aż betadyna całkowicie wyschnie przed kontynuowaniem.
5. Podawaj leki przeciwbólowe i antybiotyki wraz z płynami dootrzewnowo. Na 25 g myszy, 0,5 mg cefazoliny, 0,125 mg meloksykamu, 0,5 ml soli fizjologicznej i 2,5 μg buprenorfiny q 4-6 hr prn.
6. Wstrzyknąć 250 μl 0,25% bupiwakainy podskórnie wzdłuż linii środkowej głowy i 100 μl 0,25% bupiwakainy podskórnie w oba łuki jarzmowe myszy.
7. Zabezpiecz mysz w ramce stereotaktycznej i odsłoń czaszkę.
   1. Przymocuj głowę myszy za pomocą stereotaktycznych pasków dousznych do ramki stereotaktycznej. Upewnij się, że mysz znajduje się na chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia, potwierdzając brak odruchu szczypania palca u nogi. Wykonaj nacięcie o długości 1,5-2,0 cm wraz z jednorazowym skalpelem nr 11 wzdłuż linii środkowej czaszki. Nacięcie rozpocznie się między oczami i będzie kontynuowane z tyłu do potylicy.
   2. Odsłoń czaszkę, rozsuwając skórę na boki za pomocą mikroklamerów. Zmniejsz stężenie izofluranu z 2,0% do stężenia, które utrzymuje chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, ale nie redukuj do mniej niż 1,0% izofluranu w 100% tlenu. Analgezja przedoperacyjna zmniejsza ilość wziewnego środka znieczulającego potrzebnego do utrzymania chirurgicznej głębokości znieczulenia i może prowadzić do szybszego powrotu do zdrowia i poprawy wyników przeżycia.
8. Wypoziomuj czaszkę i wywierć otwory na żarna.
   1. Zidentyfikuj Bregmę i wyzeruj współrzędne stereotaktyczne w Bregmie, która staje się początkiem układu współrzędnych. Aby wypoziomować czaszkę w osi przyśrodkowej/bocznej, przesuń sondę poziomującą przymocowaną do ramienia manipulatora stereotaktycznego 1,50 mm w bok w obu kierunkach od Bregmy i upewnij się, że głębokość grzbietowa/brzuszna jest mniejsza niż 0,05 mm, gdy sonda styka się z lewą i prawą stroną czaszki.
      Uwaga: Rozdzielczość 10 μm grzbietowego/brzusznego ramienia manipulatora w połączeniu z cyfrowym wyświetlaczem współrzędnych upraszcza poziomowanie. Wyrównanie osi przednio-tylnej wokół Bregmy odbywa się zgodnie z tą samą techniką. Różnica w odległości brzusznej w przypadku kontaktu Bregma i Lamda powinna być również mniejsza niż 0,05 mm.
      1. Wyreguluj czaszkę, aż do zakończenia poziomowania w obu kierunkach, tak aby płaszczyzna poprzeczna była równoległa do podłoża. Pozwala to na uzyskanie prawdziwych współrzędnych stereotaktycznych, jak widać w atlasie mózgu myszy. ²⁰
   2. Za pomocą mikrowiertła o średnicy 0,5 mm w wiertle stereotaktycznym wywierć otwory na zadziory od 3,30 mm z przodu do 4,50 mm z tyłu do Bregmy w odstępach co 1,30 mm z boku 1,00 mm do linii środkowej na obu połówkach czaszki. W przypadku bocznych kolumn elektrod o średnicy 2,30 mm należy wywiercić otwory na zadziory od 2,00 mm przed Bregmą do 4,50 mm za Bregmą w odstępach co 1,30 mm po obu stronach linii środkowej (rysunek 2). Wysoka dokładność i precyzja, która jest wymagana przy tej operacji wiercenia, jest uproszczona dzięki rozdzielczości 10 μm cyfrowego ramienia manipulatora stereotaktycznego.
      Uwaga: Aby kołki nakrycia głowy zostały prawidłowo wszczepione, czaszka myszy musi być bezpiecznie osadzona w ramie stereotaktycznej. Jeśli czaszka poruszy się podczas wiercenia, może dojść do niewspółosiowości głowicy i otworów na zadziory.
9. Wszczep nakrycia głowy.
   1. Za pomocą prostych kleszczy przygotuj tunele druciane EMG dla przewodów EMG klatki piersiowej. Zakop się 2,5 cm między skórą a mięśniem z tyłu dla lewego i prawego przewodu EMG. Najpierw włóż EMG klatki piersiowej i szyjki macicy do jamy utworzonej za pomocą prostych kleszczy, a następnie manewruj cegłą EEG za pomocą zakrzywionych kleszczy tak, aby kołki wyrównały się z wcześniej wywierconymi otworami na żarna.
   2. Lekko dociśnij nakrycie głowy i wbij szpilki w czaszkę. Średnica sworznia wynosi 0,46 mm. Dzięki izolacyjnemu lakierowi do paznokci kołki będą ściśle pasować do wywierconych otworów na zadziory. Nakrycie głowy będzie stabilne po odpowiednim włożeniu. Dostosuj przewody EMG do pozycji końcowych. Powtórz ten sam proces dla nakrycia głowy po drugiej stronie.
10. Zabezpiecz nakrycie głowy na miejscu za pomocą cementu dentystycznego.
    1. Po umieszczeniu obu głowic wymieszaj metakrylan metylu w stosunku 1:1 z jego związkiem sieciującym. Nałóż mieszaninę tak, aby zakrywała odsłoniętą czaszkę, wypolerowane paznokciami części elektrod szpilkowych i proksymalną część przewodów EMG, ale nie zakrywała żeńskich pojemników nakrycia głowy.
    2. Pamiętaj, aby nie dostać cementu na futro. Nie pozwól, aby utworzyły się grzbiety cementu, których mysz będzie mogła się chwycić. Upewnij się, że cement ma wystarczająco dużo czasu, aby wyschł, a następnie wyjmij mysz z ramy stereotaktycznej. Całkowita waga, jaką będzie musiała unieść mysz, pochodzi z 2 połówek nakrycia głowy, a cement zabezpieczający wynosi około 1,2 g.
11. Umieść zwierzę w czystym obszarze rekonwalescencji.
    1. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej. Monitoruj mysz, aż odzyska wszystkie odruchy postawowe, co oznacza wybudzenie z narkozy. Indywidualne zakwaterowanie jest zalecane w celu długotrwałej rekonwalescencji.
    2. Zaleca się codzienne monitorowanie przez co najmniej 3 dni po zabiegu z analgezją interwencyjną. Odczekaj 10-14 dni rekonwalescencji po operacji przed rozpoczęciem okresu przyzwyczajenia na uwięzi.

4. Przyzwyczaj zwierzęta do uwięzi

1. Podłącz adapter do myszy za pomocą zagłówka myszy (Rysunek 1G-H). Przytrzymaj przeciwległe rogi nakryć głowy, które są zacementowane na miejscu za pomocą zakrzywionych hemostatów, gdy mysz jest unieruchomiona, i powoli włóż kołki adaptera do wszczepionej głowicy po obu stronach.
2. Podłącz 32-kanałowy amplifier do adaptera (Rysunek 1H). Upewnij się, że logo na adapterze i wzmacniaczu są wyrównane w spójnej orientacji zarówno dla adaptera, jak i amplifier, aby zapobiec błędom mapowania kanałów. Podłącz amplifier do RHD2000 standardowego szeregowego interfejsu peryferyjnego (SPI). Ten połączy się z systemem akwizycji w celu nagrywania sygnału.
3. Umieść mysz w komorze, która ma ramię wspornikowe zainstalowane na ścianie komory. Podłącz interfejsu SPI do ramienia wspornika i wyreguluj napięcie w ramieniu wspornikowym, aby przeciwdziałać ciężarowi na uwięzi. Mysz jest w stanie poruszać się swobodnie i jest przyzwyczajona do godziny dziennie na tydzień przed nagrywaniem.
4. Aby odłączyć mysz, po prostu odłącz i adapter od myszy, używając płaskiej mikroszpatułki ze stali nierdzewnej, aby pomóc w odłączeniu adaptera od myszy.

5. Konfiguracja systemu ekstrakcji sygnału/Nagrywanie sygnału

1. Podłącz skonstruowany adapter do główki wszczepionej myszy. Podłącz wzmacniacz headstage do adaptera i podłącz standardowy interfejsu SPI do amplifier i do płytki akwizycyjnej. Podłącz SPI do odpowiednio napiętego wspornika, aby zminimalizować dodatkowy ciężar na głowie myszy.
2. Umieść lokalną klatkę Faradaya, utworzoną przy użyciu siatki przewodzącej lub folii aluminiowej, wokół sceny głównej i uziemij lokalną klatkę Faradaya.
3. Uzyskaj impedancje elektrod przed rozpoczęciem każdego nagrania, wybierając częstotliwość próbkowania 30 kS/s i zmierz impedancje za pomocą modułu w graficznym interfejsie użytkownika. Wartość impedancji mniejsza lub równa 10 kΩ dla pojedynczego pinu jest wymagana do potwierdzenia prawidłowego styku elektrody. Wyższe wartości impedancji powodują odrzucenie danych z tej elektrody.
4. Do nagrywania utwórz łańcuch sygnałowy Rhythm FPGA, Bandpass Filter i przeglądarkę LFP w graficznym interfejsie użytkownika. Zaleca się wybranie częstotliwości próbkowania 1,00 kS/s, szerokości pasma 0,1-7,500 Hz i odznaczenie DSP. Ustaw filtr pasmowoprzepustowy na 0.1-250 Hz i wyświetl kanały, otwierając przeglądarkę LFP. Amplitudy kanałów 250 i 400 μV z wybraną metodą rysowania najlepiej wizualizują dane.
5. Rozpocznij nagrywanie za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Utwórz nowy folder dla każdego nagrania i ustaw ścieżkę do zapisywania plików w tym folderze. Aby rozpocząć nagrywanie, po prostu naciśnij przycisk nagrywania. Wszystkie 32 kanały ze złącza są nagrywane domyślnie, ale niechciane kanały można odznaczyć, klikając po prawej stronie modułu Rhythm FPGA przed rozpoczęciem nagrywania.
6. Importuj dane do Matlaba w celu analizy. Istnieje wiele zestawów narzędzi typu open source, które można wykorzystać, aby pomóc w analizie.

Results

Przykładowe dane zarejestrowane w swobodnie poruszającej się myszy z wszczepioną głowicą EEG o dużej gęstości są pokazane na rysunku 3. Poszczególne przebiegi EEG odpowiadają schematowi mapowania kanałów pokazanemu na rysunku 2. Przykłady EMG szyjki macicy i klatki piersiowej są również pokazane na rycinie 3. Należy zauważyć, że zapis EMG klatki piersiowej zawiera również wbudowaną aktywność elektryczną pochodzącą z serca myszy, która staje się łatwo widoczna po obliczeniu sygnału różnicowego między dwoma przewodami EMG klatki piersiowej (T). Dzięki temu nagraniu możliwe jest również obliczenie tętna myszy poprzez pomiar czasu między elektrokardiograficznymi skokami QRS. ^23-24 Podobnie, możliwe jest zmierzenie częstości oddechów myszy, obliczając zmienność fazową skoku QRS, gdy jama klatki piersiowej rozszerza się i kurczy z każdym oddechem. ²⁵ W związku z tym taka konfiguracja pozwala na nabycie mysiej polisomnografii. Co więcej, układ umożliwia korowe mapowanie wzrokowych potencjałów wywołanych (ryc. 4). Gdy impuls światła o długości 10 ms jest dostarczany tylko do lewego oka myszy, klasyczne reakcje są rejestrowane w przeciwległej (ale nie ipsilateralnej) pierwszorzędowej korze wzrokowej, po której następuje opóźniona odpowiedź w przeciwległej wtórnej korze wzrokowej. Film umieszczony na rysunku 4 pokazuje zmieniające się w czasie potencjały elektryczne na całej powierzchni kory mózgowej wraz z wykresami aktywności w przeciwległych V1 i V2.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. szt.

Ap
3.3			0	0
cyfra arabska		0,4	0,6	0,6	0,4
0,7		0,6	0,9	0,9	0,6
-0,6		0,9	1	1	0,9
-1,9		1	1.1	1.1	1
-3,2	3	1	1	1	1	3
-4,5	3	0,7	0,7	0,7	0,7	3
Ml		-2,3	-1	1	2.3

Tabela 1: Długości przycinania szpilek. Ten rysunek pokazuje wymagane długości przycinania, w mm, na sworzeń dla głowicy. Długości do przycinania szpilek uzyskano z atlasu mózgu myszy. Po przycięciu szpilek nakrycie głowy dopasowuje się do profilu powierzchni mózgu. ²⁰ pinów EMG jest całkowicie odciętych, ponieważ przewody używane do nagrywania sygnału EMG są przylutowane do króćca pinów.

Rysunek 1: Elementy głowicy, pośrednie etapy budowy i prawidłowe połączenie do nagrywania. Ten rysunek przedstawia surowiec używany do tworzenia nakryć głowy. Począwszy od 100-pinowego złącza gniazdowego, tworzone są mniejsze komponenty 2 x 7 i 2 x 1. Należy pamiętać, że w komponencie 2 x 1 oryginalna krawędź 2 x 50 jest nienaruszona, co pozwala na spójną konstrukcję głowicy i pozwala na podłączenie jednego adaptera do wielu wszczepionych myszy. Rysunki 1B i 1C przedstawiają surowce niezbędne do stworzenia adaptera od głowicy do wzmacniacza. 1B przedstawia końcówkę głowicy adaptera, która podobnie jest przycięta w celu połączenia z głowicą. Zwróć uwagę, że 2 x 1 ponownie ma oryginalną krawędź od surowego elementu, zapewniając prawidłowe połączenie między adapterem a głowicą. Rysunek 1C przedstawia koniec adaptera, który łączy się ze wzmacniaczem. Rysunek 1D przedstawia epoksydowe komponenty 2 x 7 i 2 x 1 wraz z przygotowanymi przewodami EMG do rejestracji sygnału. Rysunek 1E przedstawia ukończone nakrycie głowy. Rysunek 1F przedstawia ukończoną kartę. Rysunek 1G przedstawia prawidłowe połączenie między głowicami a adapterem. Wreszcie, rysunek 1H przedstawia wszczepioną mysz z podłączonym adapterem i wzmacniaczem. Układ wzmacniacza jest podłączony do interfejsu, który biegnie do płytki akwizycyjnej (nie pokazano). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Montaż elektrody i w pełni skonstruowane nakrycie głowy. Ten rysunek pokazuje rozmieszczenie elektrod w stosunku do mózgu myszy. Lokalizacje elektrod są oparte na współrzędnych stereotaktycznych z Bregma. Współrzędne każdej elektrody można znaleźć w kroku 4.8 protokołu. Kolor elektrody odpowiada podstawowym obszarom mózgu dla każdej elektrody. Biały = czołowa kora asocjacyjna (FrA), Pomarańczowy = pierwszorzędowa kora ruchowa (M1), Różowy = wtórna kora ruchowa (M2), Ciemnozielony = pierwszorzędowa kora somatosensoryczna, okolica kończyny przedniej (S1FL), Zielony = pierwszorzędowa kora somatosensoryczna, strefa dysgranularna (S1DZ), Jasnozielony = pierwszorzędowa kora somatosensoryczna, pole beczkowe (S1BF), Żółty = przyśrodkowa kora asocjacji ciemieniowej (MPtA), Ciemnoniebieski = pierwszorzędowa kora wzrokowa (V1), Jasnoniebieski = wtórna kora wzrokowa, obszar przyśrodkowy (V2MM), = zasplenialna kora dysgranularna (RSD). ²⁰ Pokazane jest również wspólne odniesienie/podstawa. Ten schemat odniesienia minimalizuje artefakt oddechowy w surowym sygnale. Numery powiązane z każdą pojedynczą elektrodą zapewniają mapę kanałów dla całej matrycy. Obraz zmodyfikowany z atlasu mózgu myszy Allena. ^21,22 Rysunek 2B przedstawia w pełni skonstruowane nakrycie głowy w skali w odniesieniu do dziesięciocentówki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Próbka śladów EEG i EMG z montażu elektrody. Przebiegi elektrod odpowiadają odwzorowaniu kanałów pokazanemu na rysunku 1A. EMG szyjki macicy (C) zapewnia możliwość określenia napięcia mięśni karkowych (+). Sygnały EMG zawierają również impulsy elektryczne zespołu QRS serca (*). Pokazane są paski skali 200 μV dla amplitudy ścieżki i 1 sekundy dla czasu trwania ścieżki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przestrzenny rozkład wizualnego potencjału wywołanego. Rozkład przestrzenny potencjału wywołanego po zastosowaniu jednostronnego błysku świetlnego podawanego tylko do lewego oka. Górny diagram przedstawia montaż EEG o dużej gęstości, przy czym każdy okrąg reprezentuje elektrodę. Zmiana koloru w czasie odpowiada zmianom napięcia w czasie dla każdej odpowiedniej elektrody. W czasie = 0 ms dostarczany jest impuls świetlny o długości 10 ms, który jest przedstawiany na środkowym rysunku. Dolna grafika przedstawia średnie ślady potencjału wywołanego dla przeciwległych elektrod EEG V1 i V2 (n = 108 prób EP). Impuls świetlny pojawia się po 0 ms. Należy zauważyć, że odpowiednią odpowiedź potencjału wywołanego obserwuje się w kontralateralnym V1 (ślad), po którym następuje dłuższe opóźnienie wywołanej odpowiedzi potencjalnej w kontralateralnej V2 (czerwony ślad). (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).
 

Discussion

Opisano niskokosztową konstrukcję i kroki chirurgiczne niezbędne do prawidłowego uzyskania 26-kanałowego montażu EEG o dużej gęstości u myszy. Prawidłowy kontakt z elektrodą zewnątrzoponową ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości sygnałów EEG w tym systemie. Dwa kroki w protokole rozwiązują ten problem: przycinanie szpilek w celu dopasowania do konturu mózgu oraz implantacja nakrycia głowy przed wzmocnieniem akrylowym. Ważne jest, aby na etapie budowy nie przyciąć szpilki zbyt krótko. Podczas wszczepiania nakryć głowy konieczne jest sprawdzenie rozmieszczenia kołków przed ostatecznym wzmocnieniem akrylowym. Jednym ze sposobów potwierdzenia prawidłowego kontaktu z elektrodą jest test impedancji. Pozornie impedancje 5-10 kΩ sugerują prawidłowe umiejscowienie znieczulenia zewnątrzoponowego.²⁶ Pomiary impedancji wskazują na trwałość głowic, ponieważ wartości impedancji elektrod są stabilne w tym zakresie 5-10 kΩ przez co najmniej 4 miesiące po implantacji. Innym istotnym krokiem jest wyrównanie pinów EMG z dwoma najbardziej tylnymi rzędami cegły EEG 2 x 7. Ma to kluczowe znaczenie dla podłączenia adaptera, ponieważ nieprawidłowo ustawione piny EMG i EEG spowodują niemożność podłączenia adaptera lub wygiętych pinów adaptera.

Główną zaletą tego systemu akwizycji jest łatwość modyfikacji kształtu układu elektrod w celu optymalizacji różnorodnych potrzeb eksperymentalnych. Można łatwo stworzyć niestandardowe układy elektrod, które są optymalnie dostosowane do konkretnych eksperymentów. Dostosowanie do konkretnych eksperymentów może potencjalnie połączyć EEG z kaniulą w celu ukierunkowanego dostarczania leków w połączonych badaniach farmakologicznych, elektroencefalograficznych i behawioralnych. ²⁷ Nakrycia głowy, adaptery i zabiegi chirurgiczne można łatwo dostosować do wielu badań, jeśli stosuje się metody opisane w powyższym protokole. Drugą ważną zaletą tego systemu akwizycji jest jego niski koszt. Obecnie ten system akwizycji może nagrywać 128 kanałów wejściowych na maksymalnie 4 oddzielnych kablach, co pozwala na jednoczesne nagrywanie z 4 myszy lub, w razie potrzeby, szczurów z siatkami o większej gęstości. Taka rozbudowa wymagałaby jedynie dodatkowych kabli i adapterów.

Takie podejście do akwizycji EEG o dużej gęstości rozwiązuje wady innych metod akwizycji EEG o dużej gęstości u myszy. System opisany w tej pracy jest zgrabnie skonstruowany z prostych materiałów i wykorzystuje sprzęt i oprogramowanie typu open source, które jest niedrogie i stabilne, pozwala na wielokrotne pomiary u tego samego zwierzęcia przez miesiące, umożliwia swobodny ruch podczas eksperymentu i nie wymaga znieczulenia myszy do nagrywania. Ograniczenia tego systemu polegają na tym, że do tej pory został on zwalidowany tylko u myszy o wadze 20 g lub więcej i starszych niż 12 tygodni. Mniejsze lub młodsze myszy mogą mieć trudności z implantacją nakrycia głowy. Wtórnym ograniczeniem tej metodologii jest brak możliwości precyzyjnej kontroli głębokości elektrody po wyprodukowaniu głowicy. Jednak to samo ograniczenie dotyczy tradycyjnych śrubowych elektrod EEG, ponieważ nie ma sposobu, aby dokładnie określić głębokość przedśmiertnej w stosunku do powierzchni kory mózgowej. Rozwiązywanie problemów w przypadku tej metody zwykle polega na prawidłowym ekranowaniu sygnału zakłócającego z myszy podczas korzystania z uwięzi w celu uzyskania sygnału wolnego od zakłóceń.

Matryce EEG o dużej gęstości są niezbędne do złożonych analiz czasoprzestrzennych danych EEG, które są nową normą we współczesnej interpretacji EEG. Podczas gdy zilustrowano rozkład przestrzenny wizualnego potencjału wywołanego, dane uzyskane za pomocą tego systemu mogą być analizowane przy użyciu technik obrazowania źródeł elektrycznych i pomiarów łączności neuronalnej. Zmniejszenie powierzchni styku między tymi stykami elektrody o 60% do 70% w porównaniu z tradycyjnymi stykami śrubowymi pozwala na bardziej precyzyjną lokalizację sygnału, jak pokazano na rysunku 4. Zastosowanie technik analitycznych o dużej gęstości u genetycznie zmodyfikowanych myszy, po interwencji farmakologicznej lub u zwierząt z wewnętrzną patologią, taką jak zaburzenia napadowe, może pomóc w rozpoznaniu mechanizmów generujących określone oscylacje kory mózgowej, zlokalizowaniu źródeł ERP i EP oraz ujawnieniu właściwości sieci na dużą skalę. Dzięki lepszemu równoległemu dopasowaniu systemów ludzkich podejście to pozwoli na udoskonalenie modeli neurofizjologii i neuropatologii człowieka na małych zwierzętach, ułatwiając przełożenie odkryć dokonanych na modelach gryzoni na znaczenie naukowe i kliniczne u ludzi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
32-kanałowy wzmacniacz RHD2132 Intan	Technologies	C3314
Płyta zakupowa	Open Ephys	v2.2
100-pozycyjne złącze odbieralne	Digi-Key	ED85100-ND	Głowica
aceton (1 l)	Sigma Aldrich	179973-1L
Żyletka (100 szt.)	McMaster Carr	3962A4
Szczypce do cięcia drutu	MSC Industrial	321786
2-częściowy żywica epoksydowa	McMaster Carr	7605A18
Drut srebrny powlekany PFA (25 stóp)	Systemy AM	787000	EMG Wire
CircuitWriter Pen	MCM Electronics	200-175	Srebrny aplikator do końcówek elektrod
36-pozycyjne dwurzędowe męskie złącze nano-miniaturowe	Złącze Omnetics Corporation	A79028-001	Głowica do adaptera wzmacniacza
Nagłówek listwy połączeniowej 2 x 50	Digi-Key	ED83100-ND	Głowica do wzmacniacza
Adapter Clidox Base i Acitvator	Pharmacal	95120F i 96120F	Sterylant
Isoflurane	Priamal Enterprises Ltd	66794-019-10
Gaz tlenowy		OX USP300
Regulator temperatury z zamkniętą pętlą	CWE Inc.	08-130000
Nożyczki zakrzywione	FST	14085-09
0,25% chlorowodorek bupiwakainy	Hospira	0409-1159-02	Znieczulenie miejscowe
Meloksykam 5 mg / ml	Henry Schein	6451602845	Ulga w bólu / stanie zapalnym
0,9% Chlorek sodu	Hospira	0409-4888-20	Płyny
Cefazolin	Hospira	0409-0806-01	Antybakteryjny
No.11 Jednorazowy Scapel (20 szt.)	Pióro	2975#11
Serrefines	FST	18052-3
Waciki bawełniane (1,000 szt.)	MSC Industrial	8749574
Mikrowiertło 0,5 mm	FST	19007-05
Wiertło stereotaktyczne	Kopf	Model 1471
zakrzywione Kleszcze	Roboz	RS-5136
Metakrylan metylu	AM Systems	525000	Cement do głowicy
Związek sieciujący metakrylan metylu	Systemy	526000
Zakrzywione hemostatyki	FST	13003-10	Aide in Adapter Connection
RHD2000 standardowy interfejsu SPI (3ft)	Intan Technologies	C3203
Ramię wspornikowe	Instech	MCLA
Micro Spatula (12 szt.)	Fischer Scientific	S50822
	MCM Electronics	21-10115
Lut z rdzeniem kalafonii 60/40 Cyna / ołów	MCM Electronics	21-1045
Lakier do paznokci Color Craze z utwardzaczami (na bazie nitrocelulozy)	L.A. Kolory	CNP508
Przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt z cyfrowym wyświetlaczem Konsola	Kopf	Model 940