Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Opisujemy protokół wywoływania nagradzających i nienagradzających doświadczeń u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) przy użyciu dobrowolnego spożycia etanolu jako miary zmian w stanach nagrody.

Streszczenie

Opisujemy protokół pomiaru samodzielnego podawania etanolu u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) jako wskaźnik zmian w stanach nagrody. Pokazujemy prosty sposób na wykorzystanie systemu nagrody w locie, modyfikację doświadczeń związanych z naturalną nagrodą i wykorzystanie dobrowolnej konsumpcji etanolu jako miary zmian w stanach nagrody. Podejście to służy jako odpowiednie narzędzie do badania neuronów i genów, które odgrywają rolę w zmianach stanu wewnętrznego za pośrednictwem doświadczeń. Protokół składa się z dwóch odrębnych części: wystawiania muszek na nagradzające i nienagradzające doświadczenia oraz oznaczania dobrowolnego spożycia etanolu jako miary motywacji do uzyskania nagrody za narkotyk. Te dwie części mogą być używane niezależnie do indukowania modulacji doświadczenia jako pierwszy krok do dalszych testów lub odpowiednio jako niezależny test żywieniowy dwuwyboru. Protokół nie wymaga skomplikowanej konfiguracji i dlatego może być stosowany w każdym laboratorium z podstawowymi narzędziami do hodowli much.

Wprowadzenie

Modyfikacja zachowania w odpowiedzi na doświadczenie pozwala zwierzętom dostosować swoje zachowanie do zmian w ich otoczeniu¹. Podczas tego procesu zwierzęta integrują swój wewnętrzny stan fizjologiczny ze zmieniającymi się warunkami środowiska zewnętrznego, a następnie wybierają jedno działanie zamiast drugiego, aby zwiększyć swoje szanse na przeżycie i reprodukcję. Systemy nagrody wyewoluowały, aby motywować zachowania, które są wymagane do przetrwania osobników i gatunków, wzmacniając zachowania, które zwiększają natychmiastowe przetrwanie, takie jak jedzenie lub picie, lub te, które zapewniają długoterminowe przetrwanie, takie jak zachowania seksualne lub opieka nad potomstwem². Sztuczne związki, takie jak narkotyki, również wpływają na układ nagrody, dokooptując ścieżki neuronowe, które pośredniczą w naturalnych nagrodach².

W ciągu ostatnich dwóch dekad muszka owocowa Drosophila melanogaster stała się obiecującym modelem do badania molekularnych i neuronalnych mechanizmów, które kształtują wpływ etanolu na zachowanie^3,4.

Poprzednio zidentyfikowaliśmy podzbiór neuronów peptydergicznych u muszek (neurony receptora NPF/NPF (R)), które łączą naturalne nagrody, takie jak doświadczenie seksualne, z motywacją uzyskania nagród za narkotyki⁵. Ekspresja NPF jest wrażliwa zarówno na doświadczenia seksualne, jak i na nagrody za narkotyki, takie jak zatrucie etanolem. Zmiany w poziomach ekspresji NPF są przekształcane w zmiany w samodzielnym podawaniu etanolu⁵, gdzie wysoki NPF zmniejsza, a niski NPF zwiększa preferencję spożywania etanolu. Aktywacja neuronów NPF jest satysfakcjonująca dla much, ponieważ wykazują one silną preferencję dla zapachu w połączeniu z aktywacją, co znajduje również odzwierciedlenie w zmniejszonym zużyciu etanolu. Co ważniejsze, aktywacja neuronów NPF zakłóca zdolność much do tworzenia pozytywnego związku między zatruciem etanolem a sygnałem zapachowym. Związek przyczynowo-skutkowy między układem NPF/R, pamięcią nagrody i spożyciem etanolu sugeruje, że można użyć samodzielnego podawania etanolu jako miary zmian w stanach nagrody5.

W tej publikacji demonstrujemy zintegrowane podejście do wykorzystania naturalnego systemu nagrody muchy i oznaczania zmian w stanach nagrody. Podejście składa się z dwóch oddzielnych części, protokołu treningowego do manipulowania naturalnymi doświadczeniami związanymi z nagrodą, a następnie testu kapilarnego wyboru (CAFE) w celu oceny samodzielnego podawania etanolu jako oszacowania zmian w stanach nagrody. Test CAFE jest analogiczny do testów wyboru dwóch butelek stosowanych w badaniach na gryzoniach do samodzielnego podawania leków i wykazano, że odzwierciedla pewne właściwości zachowań podobnych do uzależnienia u muszek⁶.

Protokół

Uwaga: Ogólny zarys projektu eksperymentalnego: Projekt eksperymentalny obejmuje dostosowany protokół tłumienia zalotów^7-9, w którym samce much są narażone na satysfakcjonujące i nienagradzające doświadczenia w 3 kolejnych sesjach treningowych w ciągu 4 dni. Pod koniec fazy doświadczania muchy są testowane w teście dobrowolnego spożycia etanolu metodą dwóch wyborów przez 3 - 4 dni. Protokół w niniejszym dokumencie obejmuje kilka etapów przygotowawczych, z których niektóre można wykonać z wyprzedzeniem, aby można je było wykorzystać w więcej niż jednym eksperymencie, podczas gdy inne powinny mieć miejsce w odpowiednim czasie przed rozpoczęciem eksperymentu (Tabela 1).

1. Kroki przygotowawcze

1. Przygotowanie systemu podajnika kapilarnego
   1. Podgrzać igłę o sile 27 g i użyć jej do nakłucia małych otworów wzdłuż fiolki (Rysunek 1).
   2. Przeciąć korek fiolki na pół (w poprzek) za pomocą żyletki. Zaznacz cztery punkty na powierzchni korka, tworząc kwadratowy kształt, w którym umieszczą się uchwyty kapilarne. Użyj igły 18 G, aby zrobić 4 otwory przez zatyczkę (Rysunek 1b).
   3. Za pomocą żyletki przeciąć mikropipety, tak aby mogły mocno utrzymać szklane kapilary o pojemności 5 μl, które służą jako adaptery.
   4. Włóż 4 adaptery kapilarne do przygotowanych zatyczek.
   5. Zaznacz położenie 2 kapilar zawierających etanol i dwóch kapilar zawierających nonetanol na wtyczce.
      Uwaga: Zaleca się, aby pozycje 2 rodzajów naczyń włosowatych były spójne we wszystkich fiolkach. Zwróć uwagę na wielkość otworów, ponieważ duże otwory umożliwiają ucieczkę much z fiolek. Ponadto zaleca się używanie gładszej strony zatyczki (zwykle przeciwnej do strony odciętej) jako strony, która jest skierowana w dół po włożeniu do fiolki, ponieważ przecięcie korka tworzy małe, luźne włókna, w które muchy mogą się zaplątać.
   6. Przygotować dużą liczbę fiolek i łączników do użycia w eksperymentach z systemem podajnika kapilarnego (CAFE) opisanych w kroku 2.3.
2. Przygotowanie małych szklanych fiolek z żywnością
   1. Dzień przed zebraniem much (krok 1.4) ułóż 200 szklanych fiolek na stojakach na probówki do mikrowirówek. Rozpuść pokarm na muchy (zgodnie z przepisem na melasę z mąki kukurydzianej, patrz Tabela materiałów) za pomocą kuchenki mikrofalowej. Wlej 2 ml pokarmu na muchy do szklanych fiolek (staraj się nie rozmazywać pokarmu na ściankach fiolki). Poczekaj, aż pokarm stwardnieje i przykryj fiolki folią.
      UWAGA: Szklane fiolki zawierające karmę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
   2. W dniu zbierania much wyjmij fiolki z lodówki i pozwól im dotrzeć do RT przed użyciem ich do trzymania much.
      UWAGA: Jeśli fiolki z jedzeniem mają kilka tygodni, upewnij się, że żywność jest nadal nienaruszona i nie odczepiona od fiolki, ponieważ muchy mogą zostać uwięzione w pęknięciach między jedzeniem a szkłem.
3. Przygotowanie podstawowego roztworu pokarmowego do testu kapilarnego
   1. Aby przygotować podstawowy roztwór spożywczy (5% sacharozy i 5% ekstraktu drożdżowego), rozpuść 5,88 g ekstraktu drożdżowego i 5,88 g sacharozy w 100 ml wody destylowanej.
      UWAGA: Roztwór podstawowy jest bardzo podatny na zanieczyszczenie. Dlatego zaleca się autoklawowanie go w autoklawie (121 °C, 30 minut, bez cyklu suszenia) i podwielokrotnienie na 850 μl roboczych podwielokrotności, które należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia. Stężenie składników w roztworze podstawowym wynosi 5,88% i osiągnie końcowe stężenie 5% po dodaniu 15% etanolu lub wody (150 μl do 850 μl gotowego roztworu spożywczego) tuż przed jego użyciem w kroku 2.3.
4. Zbieranie eksperymentalnych much
   1. Zbierz 200 naiwnych samców much za pomocą podkładki CO₂.
      Uwaga: Użyj dowolnego szczepu laboratoryjnego istotnego dla pytania eksperymentalnego. 250 much można łatwo zebrać z pięciu butelek much w fazie ich eklozji. Zbierając muchy, zwróć szczególną uwagę, aby zebrać muchy, które niedawno się zamknęły (muchy wyglądające dziewiczo: jasne muchy z plamką smółkową na brzuchu). Muchy doświadczalne powinny być trzymane pojedynczo w małych szklanych fiolkach zawierających pokarm i starzone do 3-4 dni przed użyciem w eksperymencie.
   2. Użyj miękkich zatyczek, aby zamknąć fiolki.
      UWAGA: Te same miękkie zatyczki będą bardzo przydatne w fazie treningu, gdy używasz aspiracji ust do wkładania i wyjmowania samic z fiolek podczas fazy doświadczenia.
5. Zbieranie much trenerskich
   UWAGA: Wszystkie zebrane muchy należy przechowywać w 12 godzinach/12 godzin jasnych/ciemnych inkubatorach w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 70% (RH). Cykl 12 h/12 h światło/ciemność można zmienić na dogodny czas rozpoczęcia.
   1. Dziewicza kobieta trenerka leci
      1. Zbierz 500 dziewiczych samic trenerów ze stada WT lub dziewictwa i użyj ich jako dziewiczych receptywnych samic. Trzymaj samice much w grupach po 25 sztuk na zwykłą fiolkę z pokarmem i pozwól im zestarzeć się do 3-4 dni przed użyciem ich w eksperymencie.
   2. Kryte muchy trenerskie
      1. Zbierz 300 dziewiczych samic much ze stada WT lub dziewiczego, aby poddać je kryciu przed fazą treningu (krok 1.6.1).
         UWAGA: Samice much są trzymane w grupach po 10 samic na zwykłą fiolkę z pokarmem i dojrzewają do 3-4 dni przed użyciem w eksperymencie.
   3. Samce much używane do generowania krytych samic much trenerów
      1. Zbierz 150 samców much (niekoniecznie dziewiczych).
         UWAGA: Muchy są trzymane w grupach po 15 samców na zwykłą fiolkę z jedzeniem i dojrzewają do 3-4 dni przed sparowaniem z dziewiczymi samicami much w celu stworzenia krytych samic trenerów.
6. Generowanie pokrytych samic much trenerskich
   1. Aby wygenerować kryte samice much, które mają być wykorzystane jako trenerzy, połącz grupy 10 dziewiczych samic much z 15 samcami much, przerzucając jedną fiolkę zawierającą samce do fiolki zawierającej samice 16 - 18 godzin przed fazą treningu (krok 2.1)¹⁰.
      UWAGA: Zwykle powinno to mieć miejsce wieczorem przed sesją treningową. Stosunek 1,5:1 między samcami much a samicami much zapewnia, że wszystkie samice zostaną sparowane.
   2. W dniu eksperymentu należy oddzielić kryte samice od samców, odsysając samce z fiolki za pomocą aspiratora doustnego. Zrób to tuż przed rozpoczęciem każdego dnia treningowego.

2. Kroki eksperymentalne

1. Przygotowanie do fazy doświadczenia
   1. Rozpocznij eksperyment jak najbliżej początku fazy świetlnej w inkubatorze. Umieść samice trenerki (zarówno dziewicze, jak i kryte) w komorze behawioralnej.
      UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu w komorze behawioralnej lub w innym zacisznym środowisku, które jest ciche i ustawione na 25 °C i 60 - 65% wilgotności względnej. Utrzymanie wilgotności powyżej 50% jest bardzo ważne, ponieważ zaloty i zachowania godowe zależą od wyczuwania feromonów, o których wiadomo, że są wrażliwe na wilgoć.
2. Wystawianie samców much na satysfakcjonujące i nienagradzające doświadczenia
   1. Szklane fiolki zawierające pojedyncze samce much należy ułożyć na stojakach do mikrowirówek, umieszczając fiolki wzdłuż brzegów stojaka.
      UWAGA: Taki układ pozwala eksperymentatorowi łatwo obserwować pary much, które przechodzą kopulację, bez wyjmowania fiolek ze stojaka.
   2. Przygotuj (jak opisano w kroku 2.2.1) 2 grupy po 100 szklanych fiolek zawierających pojedyncze samce much na oddzielnych stojakach dla samców poddawanych i nienagradzanych doświadczeń godowych (tj. odrzuconych i pokrytych).
   3. Odessać samice trenerów i dodać je do każdej fiolki zawierającej samce much. Ustaw timer na 1 godzinę. Zaczynając od odrzuconej grupy, dodaj pokrytą samicę do każdej fiolki. Następnie przejdź do samców do krycia i dodaj dziewiczą samicę do każdej fiolki.
   4. Uważnie obserwuj spotkania godowe, aby upewnić się, że samce wchodzące w interakcję z dziewiczymi samicami pomyślnie łączą się w pary w ciągu pierwszej godziny i że samce wchodzące w interakcje z wcześniej pokrytymi samicami nie łączą się w pary. Aby monitorować odrzuconą kohortę w ciągu 1 godziny, ustaw drugi timer na 15 minut i obserwuj samce co 15 minut.
   5. Wypisać samce z odrzuconej kohorty, której udało się połączyć w pary, oraz samce z kohorty, które nie zakończyły się kopulacją do końca pierwszej sesji treningowej.
   6. Zakończ pierwszą sesję treningową, odsysając wcześniej sparowane trenerki do zwykłej fiolki z pokarmem dla much i zachowaj je na następną sesję kondycjonowania. Wykonaj ten krok, delikatnie zasysając samice z pokrytej grupy samców.
   7. Pozwól muchom odpocząć przez 1 godzinę.
   8. Powtórz kroki 2.2.3 - 2.2.7 dwukrotnie.
   9. Powtarzaj sesję treningową w krokach 2.2.3 - 2.2.8 każdego dnia przez kolejne 3 dni.
3. Nagrywanie zużycia (CAFE)
   1. Pod koniec ostatniej sesji kondycjonowania (czwartego dnia) odessać pojedyncze samce i zgrupować je w fiolkach z karmnikiem kapilarnym. Użyj miękkiej zatyczki, aby przykryć fiolkę podajnika kapilarnego podczas wkładania much i szybko zastąp ją gotową zatyczką podajnika kapilarnego po włożeniu wszystkich much. Grupa 6 - 8 przelotów z każdej z grup eksperymentalnych do fiolki, tworząc nie mniej niż 8 fiolek na warunek.
   2. Zwilż korki, delikatnie dodając 5 ml wody do górnej części korka. Zachowaj ostrożność podczas dodawania wody, aby uniknąć rozlania do fiolek. Dodać równą ilość wody do każdej fiolki.
      UWAGA: Ten krok ma na celu zmniejszenie parowania z naczyń włosowatych. Dlatego powtarza się to codziennie przez resztę eksperymentu. W zależności od wilgotności względnej, w kolejnych dniach może być konieczne dodanie mniejszej ilości wody do korków.
   3. Przygotuj dwa oddzielne roztwory spożywcze, dodając etanol lub wodę do podstawowych porcji żywności, aby uzyskać końcowe stężenie 15%.
   4. Aby wypełnić naczynia włosowate dwoma roztworami spożywczymi, należy utworzyć krople płynnego pokarmu o objętości 5 μl na pasku folii laboratoryjnej i pozwolić, aby roztwór wypełnił kapilarę, aż osiągnie znak 5 μl. Upewnij się, że używasz przezroczystego końca kapilary, który znajduje się blisko czarnej linii 5 μl.
      UWAGA: Aby wypełnić kilka naczyń włosowatych jednocześnie, można połączyć ze sobą 6 - 8 adapterów kapilarnych i użyć ich jako wkładki do przytrzymania naczyń włosowatych.
   5. Delikatnie postukaj w kapilary na pasku parafiny, aby umieścić roztwór spożywczy dokładnie w miejscu czarnego znaku. Uszczelnij naczynia włosowate, zanurzając koniec każdej kapilary w małych kroplach oleju mineralnego. Ten krok minimalizuje potencjalne parowanie roztworu spożywczego.
   6. Wprowadzić dwie kapilary zawierające etanol i dwie kapilary zawierające nonetanol przez 4 adaptery/uchwyty w korku, aż odsłonięte boki kapilar ledwo wystają z wnętrza fiolki (1 mm lub mniej od powierzchni korka).
      UWAGA: Trzymanie otworu kapilar blisko mokrego korka zmniejsza parowanie i umożliwia łatwy dostęp do pokarmu, ponieważ muchy zwykle siedzą na korkach i schodzą na odsłoniętą kapilę, aby się pożywić.
   7. Oprócz fiolek zawierających eksperymentalne muchy, należy przygotować próbną fiolkę bez much. Ta kontrola służy do oceny naturalnego parowania.
      UWAGA: Staraj się utrzymywać względnie równe położenie otworu kapilarnego w porównaniu z zatyczkami, ponieważ różnice mogą prowadzić do zmiennego parowania i mylących danych dotyczących zużycia. Utrzymuj odpowiednią wilgotność podczas eksperymentu i umieść otwory kapilarne jak najbliżej mokrego korka, ponieważ niska wilgotność i duża odległość od mokrego korka mogą spowodować niekontrolowane parowanie.
   8. Za pomocą linijki zapisać względne położenie cieczy w każdej z kapilar w stosunku do czarnej linii w mm i zapisać te wartości.
      UWAGA: Jeśli roztwór znajduje się dokładnie na czarnej linii, wartość powinna być równa zero, a jeśli jest powyżej lub poniżej, powinny to być odpowiednio wartości dodatnie lub ujemne. Początkowe poziomy cieczy wyznaczają punkty odniesienia dla końcowych wartości zużycia O/N.
   9. Umieść fiolki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny. Wymieniaj naczynia włosowate o stałej porze przez cały czas trwania eksperymentu.
   10. Delikatnie usunąć naczynia włosowate z fiolek i zmierzyć poziom płynu w stosunku do czarnej linii znakującej.
   11. Dokładnie sprawdzić poziom płynu w próbie fiolki.
       UWAGA: Jeśli poziom spadł o więcej niż 2 mm, oznacza to, że parowanie jest wysokie, a poziomy zużycia nie są wiarygodne.
   12. Delikatnie zwilż korki 2 ml wody i włóż nowy zestaw naczyń włosowatych, jak pokazano w krokach 2.3.3 - 2.3.10. Umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny.
4. Określanie preferencji
   1. Oblicz całkowite zużycie każdej kapilary, odejmując poziom końcowy od poziomu początkowego w punkcie początkowym.
   2. Połącz wartości obu naczyń włosowatych z tym samym pokarmem (tj. kapilar z nonetanolem oddzielnie od kapilar zawierających etanol
   ).
   3. Obliczyć preferencję dotyczącą etanolu, odejmując ilość zużytą z kapilar innych niż etanol od ilości zużytej z kapilar zawierających etanol i dzieląc wartość przez całkowite wartości zużycia ze wszystkich kapilar tej samej fiolki.
   4. Uśrednić wskaźniki preferencji wszystkich fiolek z tej samej grupy eksperymentalnej.
      
      UWAGA: Etanol 1 (NE1), Nieetanol 2 (NE2), Etanol 1 (E1), Etanol 2 (E2), Nonetanol całkowity (NE) = NE1 + NE2, Etanol całkowity (E1 + E2), Całkowite zużycie (Suma całkowita) = Całkowita NE + Całkowita E oraz Wskaźnik preferencji etanolu (PI)

Wyniki

FPeveni, Devineni i in. wykazali, że gdy muszki owocowe mają możliwość wyboru spożywania pokarmu zawierającego etanol, wykazują silną preferencję dla pokarmu zawierającego etanol niż pokarmu niezawierającego etanolu⁶. Poniżej przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników, które uzyskaliśmy podczas badania wrodzonych preferencji dotyczących etanolu u naiwnych samców much, które nie przeszły protokołu treningowego.

Dyskusja

W tym miejscu ilustrujemy szczegóły zintegrowanego podejścia do pomiaru zmian w zachowaniach związanych z poszukiwaniem nagrody, w oparciu o wcześniejsze prace opisane przez Devineni i wsp.⁶ oraz Shohat-Ophir i wsp. ⁵. Pierwsza sekcja protokołu wykorzystuje różne rodzaje interakcji seksualnych jako dane wejściowe do doświadczenia, a druga sekcja wykorzystuje test żywieniowy dwóch wyborów w celu oceny wpływu doświadczenia na preferencję spożywania etanolu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolki polistyrenowe 25 x 95 mm	FlyStuff	32-109
wąskie fiolki plastikowe flugs	FlyStuff	42-102
Jednorazowa sterylna igła 18 g i 27 g	może być nabyty przez dowolną firmę		1,20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0,40 X 13 mm (27 G x 1/2")
10 x 75 mm Jednorazowe probówki hodowlane ze szkła borokrzemianowego	Kimble Chase	73500-1075
kalibrowane pipety 5 μ L	VWR	53432-706	oznaczony kolorem białym, aby zawierał 5 i #956; L
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5904
Sacharoza, klasa biologii molekularnej	CALBIOCHEM	573113
Ekstrakt drożdżowy w proszku do mikrobiologii	można nabyć przez dowolną firmę
Etanol	Sigma-Aldrich	32221
Końcówki do pipet standardowych (mikropipety)	ThermScientific	T114R-Q	objętość: 0,1 - 20 μ L (ultramicro)
IDENTI-PLUGS (Zaślepki do rurek piankowych)	Jaece	L800-A	pasuje do otworu 6 - 13 mm
IDENTI-PLUGS (Zaślepki do rurek piankowych)	Jaece	L800-D	pasuje do otworu 35 - 45 mm
Virginator Fly Stock	Bloomington Drosophila Stock Center	#24638
Wąskie fiolki, tacka (PS)	Genesee Scientific Corporation	# 32-109BR
Przepisy i metody Drysophila Preparaty Centrum	Magazynowe Bloomington Drosophila	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
kwas propionowy	Sigma-Aldrich	P5561
kwas fosforowy	Sigma-Aldrich
4-hydroksybenzoesan metu	Sigma-Aldrich	H3647
Agar Agar może	być nabyty przez dowolną firmę
Mączka kukurydziana	może być nabyta przez dowolną firmę
Melasa babci	B& G Foods, Inc	nie wskazano
że suche drożdże instant	mogą być przejęte przez dowolną firmę