Artykuł metodologiczny

Połączona mikroskopia przyżyciowa i ultrasonografia tylna myszy ze wzmocnieniem kontrastowym w celu zbadania rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji mięśni wywołanego insuliną

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54912

⸱

20 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Physiology, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Wywołane insuliną rozszerzenie naczyń krwionośnych reguluje perfuzję mięśni i zwiększa powierzchnię mikrokrążenia (rekrutację mikronaczyniową) dostępną do wymiany substancji rozpuszczonej między krwią a śródmiąższem tkankowym. Przedstawiono połączoną mikroskopię przyżyciową i ultrasonografię ze wzmocnieniem kontrastowym w celu jednoczesnej oceny działania insuliny na większe naczynia i mikrokrążenie in vivo.

Streszczenie

Wykazano, że naczyniowe działanie insuliny przyczynia się do regulacji wrażliwości na insulinę. Wpływ insuliny na perfuzję mięśni reguluje poposiłkowe dostarczanie składników odżywczych i hormonów do tkanek wrażliwych na insulinę. Opisujemy tutaj technikę łączenia mikroskopii przyżyciowej (IVM) i ultrasonografii ze wzmocnieniem kontrastowym (CEUS) przedziału przywodziciela tylnej kończyny myszy w celu jednoczesnej wizualizacji oporu mięśni, tętnic i perfuzji mikrokrążenia in vivo. Jednoczesna ocena działania insuliny na wielu poziomach drzewa naczyniowego jest ważna dla zbadania relacji między wielorakim działaniem wazoaktywnym insuliny a perfuzją mięśni. Eksperymenty w tym badaniu przeprowadzono na myszach. Najpierw wprowadza się kaniulę żyły ogonowej w celu infuzji znieczulenia, związków wazoaktywnych i ultradźwiękowego środka kontrastowego (mikropęcherzyki otoczone lipidami). Po drugie, wykonuje się małe nacięcie w okolicy pachwiny, aby odsłonić drzewo tętnicze przedziału mięśniowego przywodziciela. Sonda ultrasonograficzna jest następnie umieszczana na przeciwległej górnej kończynie tylnej, aby zobaczyć mięśnie w przekroju poprzecznym. Aby ocenić parametry wyjściowe, ocenia się średnicę tętnicy, a następnie wprowadza się mikropęcherzyki ze stałą szybkością w celu oszacowania przepływu krwi w mięśniach i objętości krwi mikrokrążeniowej (MBV). W przypadku stosowania przed i w trakcie klamry hiperinsulinemiczno-euglikemicznej, połączenie IVM i CEUS pozwala na ocenę wywołanych insuliną zmian średnicy tętnic, perfuzji mięśni mikronaczyniowych i wrażliwości całego organizmu na insulinę. Ponadto można określić ilościowo zależność czasową między reakcjami mikrokrążenia a opornością tętnic na insulinę. Możliwa jest również obserwacja myszy podłużnie w czasie, co czyni ją cennym narzędziem do badania zmian we wrażliwości naczyniowej i całego organizmu na insulinę.

Wprowadzenie

W odpowiedzi na wzrost poziomu glukozy we krwi, trzustka wydziela insulinę do krwiobiegu, gdzie jest ona szybko rozprowadzana do tkanek docelowych, takich jak mięśnie szkieletowe, poprzez tętnice oporowe i naczynia włosowate. Mięśnie szkieletowe są odpowiedzialne za ~80% poposiłkowego wychwytu glukozy1. Wykazano, że dostarczanie insuliny do śródmiąższu mięśni szkieletowych jest krokiem ograniczającym szybkość działania metabolicznego insuliny, które sprzyja usuwaniu glukozy2,3,4. W ciągu 10-15 minut insulina zwiększa objętość krwi włośniczkowej (rekrutacja mikronaczyniowa), efekt, który występuje przed wzrostem całkowitego przepływu krwi5,6. Rekrutacja mikronaczyniowa rozszerza powierzchnię śródbłonka dostępną do wymiany składników odżywczych (i insuliny)7,8. Rekrutacja mikronaczyniowa za pośrednictwem insuliny poprzedza i jest niezależnie związana ze zmianami w wychwytze glukozy w mięśniach szkieletowych8,9. Wpływ insuliny na układ naczyniowy określa się mianem "naczyniowej wrażliwości na insulinę".

Wykazano, że rekrutacja mikronaczyniowa za pośrednictwem insuliny i wywołane insuliną rozszerzenie naczyń krwionośnych są upośledzone u otyłych szczurów Zuckera10,11. Co więcej, szczupłe myszy o zmniejszonej gęstości naczyń włosowatych wykazują insulinooporność mięśni12. W swojej wpływowej pracy Kubota i wsp. wykazali, że upośledzona sygnalizacja insuliny w komórkach śródbłonka powodowała zmniejszenie indukowanej insuliną rekrutacji mikronaczyniowej, co zmniejszyło wychwyt glukozy w mięśniach szkieletowych o około 40%13. Te nieprawidłowości w funkcjonowaniu mikronaczyń występują nie tylko w mięśniach, ale także w wielu innych tkankach i narządach, takich jak serce, siatkówka i nerki14,15,16. Te przykłady i inne badania17,18,19,20 sugerują, że naczyniowe działanie insuliny jest ważnym mechanizmem w (pato)fizjologii insulinooporności i jej powikłań.

Chociaż istnieją istotne dowody na to, że insulina zwiększa objętość krwi mikrokrążeniowej (MBV) w mięśniach szkieletowych5,6, mechanizmy, dzięki którym to się dzieje, nie są w pełni zrozumiałe9. Rozszerzenie naczyń krwionośnych zależne od śródbłonka jest niezbędne w wielu aspektach wrażliwości naczyniowej na insulinę21,22,23 na różnych poziomach układu krwionośnego. Wrażliwość naczyniowa na insulinę może objawiać się wywołanym insuliną rozluźnieniem tętnic oporowych oraz rozluźnieniem tętniczek przedkapilarnych w celu zwiększenia powierzchni perfundowanej wymiany mikronaczyniowej 7,24,25.

Mikroskopia przyżyciowa (IVM) została wykorzystana w różnych preparatach tkankowych, w tym w komorach fałdów skórnych myszy dorsum26, krezki myszy i szczura27, modele niedokrwienia kończyn w mouse28 i woreczku policzkowym chomika29. Ultrasonografia z kontrastem (CEUS) to kolejna technika obrazowania, która umożliwia ocenę mikrokrążenia w kardiologu30, a także w mięśniach szkieletowych31. Wykorzystuje mikropęcherzyki wypełnione gazem obojętnym, które zachowują się reologicznie jak czerwone krwinki i pozostają całkowicie w świetle naczyń krwionośnych. Te mikropęcherzyki są podawane dożylnie ze stałą szybkością, aby osiągnąć stan ustalony. Fala ultradźwiękowa o wysokiej energii może być zatem użyta do zniszczenia mikropęcherzyków. Szybkość uzupełniania mikropęcherzyków w obszarze zainteresowania (ROI) reprezentuje prędkość przepływu (MFV). Całkowita intensywność sygnału obrazu o kontraście reprezentuje MBV. CEUS może być wykonywany wielokrotnie (również u ludzi) i przyczynił się do lepszego zrozumienia dysfunkcji naczyniowej, która występuje w stanach insulinooporności (omówionej w Barrett i wsp.32).

W obecnym badaniu opisujemy nową technikę badania regulacji perfuzji mięśni, poprzez jednoczesne stosowanie zarówno IVM, jak i CEUS. Tutaj skupiamy się na działaniach naczyniowych insuliny w przedziale przywodzicieli tylnej kończyny myszy. Przedział ten jest jedną z największych grup mięśni szkieletowych u myszy, co umożliwia badanie lokalnego wychwytu glukozy w reprezentatywnym mięśniu. Ta komora jest idealna do IVM, ponieważ przygotowanie i wizualizacja tętnic są łatwo dostępne dzięki standardowej procedurze chirurgicznej28. Co więcej, nasza własna grupa i inni wykazali, że CEUS może być używany w tym przedziale33,34.

Zaletą połączonej techniki IVM i CEUS jest możliwość oceny działania insuliny na poziomie większych tętniczek (tętnic zasilających lub oporowych) i mikrokrążenia (łożyska kapilarne) w tej samej grupie mięśniowej. Ponadto jednoczesne zastosowanie obu metod zapewnia wgląd w czasowe działanie insuliny na poziomie tętnic opornych i mikrokrążenia. Ta połączona technika IVM i CEUS może być również wdrożona w innych dziedzinach biologii naczyniowej. Na przykład rolę różnych białek i pewnych stanów patofizjologicznych wpływających na śródbłonek można badać za pomocą modeli nokautu. Co więcej, obie techniki mogą być używane w jednej myszy w wielu punktach czasowych, co skraca czas i koszty badań.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i etyki. Cały protokół od indukcji znieczulenia u myszy do zakończenia klamry hiperinsulinemiczno-euglikemicznej trwa około 2 godzin.

1. Przygotowanie mikrochirurgiczne

  1. Wywołaj znieczulenie wraz z analgezją u samca myszy o wadze 20-25 g po 14 godzinach lub całonocnym poście za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia fentanylu (0,31 mg / kg), midazolamu (6,25 mg / kg) i acepromazyny (6,25 mg / kg) (znieczulenie FMA) i umieść je na homeotermicznej poduszce grzewczej o kontrolowanej temperaturze odbytu, która utrzymuje temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
  2. Kilkakrotnie zdezynfekować stół operacyjny i sprzęt za pomocą roztworu na bazie alkoholu.
  3. Przymocuj igłę 27 G do rurki polietylenowej o długości 10 cm (PE-20) i przymocuj rurkę do 4-drożnego łącznika. Wbić igłę w żyłę ogonową i utrwalić ją za pomocą żelu do klejenia tkanek. Ta kaniula będzie używana do infuzji mikropęcherzyków, insuliny, glukozy i znieczulenia.
    Uwaga: Dodanie heparyny (5 U/ml) do sterylnego roztworu soli fizjologicznej podczas procesu kaniulacji w celu przepłukania żyły ogonowej (około 10 μl) zmniejsza możliwość zatkania kaniul.
  4. Przez cały czas trwania zabiegów chirurgicznych i protokołów eksperymentalnych należy utrzymywać znieczulenie poprzez ciągłą infuzję dożylną znieczulenia FMA przez kaniulę żyły ogonowej z szybkością 33,75 μl/kg/min.
  5. Umieść mysz brzuszną stroną do góry i przymocuj stopy za pomocą taśmy termostabilnej, aby odsłonić górną część uda. Użyj lekkiej egzorotacji stawu biodrowego (łapy kończyn tylnych skierowane do góry) i kąta 40-60° w stawie kolanowym, aby ujednolicić rozciągnięcie mięśnia w przedziale przywodzicieli uda.
  6. Usuń włosy w pachwinach i górnej części ud obustronnie za pomocą kremu do depilacji. Zbierz wszystkie luźne włosy wilgotnym wacikiem.
  7. Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym i wykonaj następujące czynności chirurgiczne przy użyciu powiększenia od 10X do 16X.
  8. Wykonaj 2 cm nacięcie za pomocą nożyczek do skóry biegnących równolegle do więzadła pachwinowego, tuż obok krzywizny brzucha (ryc. 1). Zastosuj trakcję po dystalnej stronie nacięcia dystalnie za pomocą zacisku buldoga (ryc. 1D). Pomoże to w dostosowaniu okienka w razie potrzeby i pomoże utrzymać olej parafinowy (opisany w 1.12).
  9. Wypreparuj tkankę tłuszczową z dala od ściany brzucha. Aby uniknąć krwawienia, delikatnie oddziel poduszeczkę tłuszczową od ściany, zamiast preparować bezpośrednio przez podkładkę. Delikatna trakcja na poduszce tłuszczowej w kierunku dystalnym ułatwi ten proces (ryc. 1C).
  10. Zidentyfikuj tętnicę udową i podążaj za nią w dół do pierwszych głównych gałęzi (tętnicy nadbrzusza i tętnicy gracilis) (ryc. 2). Tętnica gracilis jest pierwszą główną gałęzią tętnicy udowej biegnącą po mięśniu przywodziciela wielkiego, a następnie biegnie głęboko do mięśnia gracilis. Tętnica gracilis zostanie wykorzystana do IVM.
  11. Zidentyfikuj przezroczystą głęboką powięź pokrywającą mięśnie i naczynia. Za pomocą ostrych kleszczy pociągnij powięź do góry i przetnij ją za pomocą mikronożyczek.
  12. Przykryj odsłonięty mięsień kroplą (200 μl) parafiny w płynie leczniczym (o temperaturze pokojowej lub podgrzanej do 37 °C), aby zapobiec wysychaniu przygotowanej tkanki. Upewnij się, że kropla oleju nie wycieka. Wyreguluj fałdy skórne nacięcia za pomocą zacisku buldoga, aby utworzyć małą wnękę do przechowywania oleju parafinowego, który kąpie naczynia.
  13. Umieść mysz pod wcześniej skalibrowanym mikroskopem (16-krotne powiększenie optyczne) w taki sposób, aby tętnica gracilis była pionowo na ekranie komputera. Podłącz mikroskop do kamery i komputerowego systemu analizy, który może wyodrębnić średnicę naczyń z zestawu danych obrazu. Średnica to odległość między dwiema świecącymi bokami naczynia. Pożądane jest ciągłe monitorowanie i pomiar średnicy tętnicy.
  14. Umieść źródło światła w wystarczającej odległości (minimum 20 cm) od kończyny tylnej, aby zmniejszyć przewodzenie światła przez głowę.
  15. Nałóż wstępnie podgrzany żel do transdukcji ultradźwięków na górną przeciwległą kończynę tylną. Umieść sondę ultradźwiękową prostopadle do długiej osi kości udowej.
  16. Ostrożnie dostosuj kąt i kierunek sondy ultradźwiękowej, aby uzyskać przekrój poprzeczny grupy mięśni przywodzicieli. Należy zwrócić uwagę, aby utrzymać stabilną pozycję sondy ultradźwiękowej w stosunku do myszy, aby zachować tę samą płaszczyznę obrazowania dla pomiarów wyjściowych i hiperinsulinemicznych.
  17. Pozwól myszy ustabilizować się na 30 minut. Średnica tętnicy gracilis powinna być stabilna przez 10 minut przed udokumentowaniem średnicy linii podstawowej.

2. Pomiary wyjściowe i hiperinsulinemiczne

  1. Upewnij się, że wyjściowa średnica tętnicy gracilis jest zapisana przez program komputerowy używany do IVM.
  2. Przygotuj mikropęcherzyki z wyprzedzeniem zgodnie z opisem35 i policz licznikiem Coultera do stężenia 2,5 x 109 pęcherzyków/ml tuż przed eksperymentem.
  3. Ponieważ mikropęcherzyki mogą być oglądane tylko w trybie kontrastowym aparatu ultrasonograficznego, należy kontrolować parametry wpływające na obraz i zebrane dane dotyczące kontrastu (opisane w ppkt 2.3.1) i konsekwentnie stosować podczas akwizycji.
    1. Użyj następujących ustawień w aparacie ultrasonograficznym: wzmocnienie kontrastu przy 35 decybelach; kompensacja wzmocnienia czasowego na WYŁ.; Gęstość linii na WYSOKĄ; Liczba stref ogniskowych do SZEROKICH; Moc transmisji do 4%; Przenieś szerokość wiązki do STANDARD; Brama SV do 4; Czułość na 1; Trwałość na WYŁ. Wyrównaj położenie stref ogniskowych do środka obszaru zainteresowania.
  4. Zapisz krótki (5 s) klip. Zostanie to wykorzystane do obliczenia sygnału tła.
  5. Wstrząsnąć ręcznie fiolką zawierającą mikropęcherzyki, aby uzyskać jednolitą zawiesinę. Rozpocznij infuzję mikropęcherzyków za pomocą kaniuli żyły ogonowej z szybkością 5 μl/min. Umieścić rurkę infuzyjną na wibrującym wirze (200 razy na minutę), aby utrzymać równomierną zawiesinę mikropęcherzyków.
  6. Odczekać 5 minut ciągłego wlewu mikropęcherzyków, aby osiągnąć poziom w stanie ustalonym. Kontynuuj uzyskiwanie krzywych czasowo-intensywności pęcherzyków za pomocą funkcji destrukcji mikropęcherzyków (MBD) na ultrasonografie po 5 minutach i 10 minutach od rozpoczęcia infuzji mikropęcherzyków (ryc. 3A). Weź średni sygnał z tych dwóch pomiarów, aby uzyskać podstawowe dane dotyczące perfuzji.
  7. Po uzyskaniu danych wyjściowych uruchom zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny zgodnie z opisem34. Użyj kaniuli ogonowej (umieszczonej w 1.3) do podania insuliny i glukozy (oraz znieczulenia).
    1. Krótko mówiąc, wywołaj stan hiperinsulinemii, wprowadzając bolus insuliny 200 mU/kg, a następnie ciągły wlew insuliny (7,5 mU/kg/min) przez 60 minut. Użyj zmiennego wlewu 20% D-glukozy, aby utrzymać euglikemię.
    2. Oceniaj poziom glukozy we krwi z żyły ogonowej co 5 minut za pomocą urządzenia do monitorowania glikemii i utrzymuj poziom 5 mM, dostosowując zmienną szybkość wlewu glukozy. Określ wrażliwość na insulinę, uśredniając średnią szybkość infuzji glukozy w ciągu ostatnich 30 minut.
  8. Upewnij się, że średnica tętnicy Gracilis jest udokumentowana w żądanych odstępach czasu (na przykład po 10, 30 i 60 minutach) od rozpoczęcia zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego za pomocą programu komputerowego.
  9. Po 25 minutach i/lub 55 minutach clampy insulinowej należy rozpocząć drugi (hiperinsulinemiczny) pomiar CEUS, aby udokumentować MBV odpowiednio po 30 i/lub 60 minutach. Wykonaj te same czynności, które opisano w 2.4 i 2.5. Odłącz i użyj portu znieczulającego 4-kierunkowego złącza, aby wprowadzić mikropęcherzyki. Ponownie załóż rurkę anestezjologiczną po zakończeniu infuzji mikropęcherzyków.
  10. Po zakończeniu pomiarów IVM i CEUS 60 minut po rozpoczęciu infuzji insuliny, należy pobrać krew od myszy za pomocą procedury nakłucia serca w celu późniejszej analizy. Spowoduje to również eutanazję myszy. Dokładnie wypreparuj tętnice gracilis i udowe i przechowuj je do dalszych pożądanych eksperymentów (np. Western blots, immunohistochemia, eksperymenty z miografią ciśnieniową ex vivo36,37,38).

3. Analiza offline

UWAGA: Analizy pomiarów IVM i CEUS powinny być wykonywane offline przez zaślepionego badacza. CEUS oferuje możliwość odróżnienia mikrokrążenia od większych naczyń poprzez tymczasowe zniszczenie mikropęcherzyków za pomocą fal ultradźwiękowych o wysokim natężeniu przy użyciu funkcji MBD. Sygnał (mierzony w dowolnych jednostkach (a.u)) w większych naczyniach jest przywracany szybciej niż w mikrokrążeniu ze względu na prędkość mikropęcherzyków w odpowiednich naczyniach.

  1. Do wykonania analiz należy użyć stacji roboczej offline lub oprogramowania zainstalowanego w aparacie ultrasonograficznym.
  2. Narysuj obszar zainteresowań (ROI), aby uwzględnić mikrokrążenie. Narysuj oddzielny zwrot z inwestycji, aby uwzględnić większe naczynia udowe (ryc. 3A).
  3. Zduplikuj ROI mikrokrążenia i większych naczyń dla pomiarów tła, linii podstawowej i hiperinsulinemii, korzystając z funkcji kopiowania ROI wbudowanej w oprogramowanie.
  4. Odejmij sygnał intensywności pomiaru tła od linii podstawowej i pomiarów hiperinsulinemii.
  5. Podziel sygnał intensywności mikrokrążenia przez sygnał intensywności naczyń udowych. Można teraz porównać wyjściowe i hiperinsulinemiczne MBV.

Wyniki

Szybkość wlewu glukozy podczas zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego (wrażliwość na insulinę) wynosiła 180,21 ± 19,81 µmol/kg/min. Miejscowe zastosowanie oleju parafinowego na obszar mięśnia przywodziciela w celu stabilizacji naczynia nie zmieniło średniej średnicy wyjściowej tętnic (73,6 ± 29,0 µm vs 68,8 ± 17,9 µm; p = 0,58), lecz pomogło zmniejszyć zmienność u badanych zwierząt (Rycina 4A). Insulina konsekwentnie zwiększała średnicę tętnicy mięśnia smukłego (o 14,58 ± 6,2% po 60 min; N = 9), co różniło się znacząco (p <0,0001) od zmiany średnicy wywołanej wlewem soli fizjologicznej (-6,3 ± 4,9%; N = 6). Rozszerzenie naczyń indukowane insuliną było zauważalne po 10 min (10,09 ± 5,1%; p = 0,002) i osiągnęło około 95% maksymalnej zdolności rozszerzenia po 30 min.

Przy użyciu CEUS stwierdzono, że insulina konsekwentnie zwiększała MBV mięśni (Rysunek 5A) o 33,5% (± 31,04%, N =7; p = 0,0009) w porównaniu z infuzją soli fizjologicznej (-10,63 ± 27,87%, N = 6) (Rysunek 5B). Przedstawione dane to intensywności sygnału MBV mięśni podzielone przez intensywność w naczyniach udowych. Pozwala to zredukować zmienność doświadczalną pomiędzy różnymi pomiarami oraz różnymi myszami (dane nie zostały przedstawione). Intensywność sygnału w naczyniach udowych wykazuje liniową zależność od stężenia mikropęcherzyków w krwiobiegu (Rysunek 3C). Korekta o sygnał z naczyń udowych teoretycznie koryguje różnice w stężeniach wykorzystanych mikropęcherzyków (Rysunek 3D). Dane w tej sekcji przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe.

Kroki sekcji w chirurgicznej procedurze u myszy ze szczegółowymi widokami anatomicznymi i sprzętem chirurgicznym.
Rysunek 1: Chirurgiczne odsłonięcie przedziału przywodzicieli kończyny tylnej. (A) W pachwinie wykonuje się nacięcie równolegle do kierunku więzadła pachwinowego. (B) Delikatna trakcja poduszki tłuszczowej w kierunku dystalnym (czarne strzałki) odsłoni tkankę łączną (*) między poduszką tłuszczową a ścianą brzucha. (C) Fałdy skóry w miejscu nacięcia można ustabilizować za pomocą kleszczyków typu bulldog, aby stworzyć małą jamkę na olej parafinowy, w którym zanurzone są naczynia. (D) Głowicę ultradźwiękową umieszcza się na przeciwległej górnej części kończyny tylnej po obejrzeniu przygotowanej tętnicy smukłej za pomocą skalibrowanego mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza rozszerzenia tkanek naczyniowych, obraz mikroskopowy, porównanie stanu bazowego z rozszerzeniem.
Rycina 2: Mikroskopia witalna kończyny tylnej myszy. Tętnica udowa (A) daje początek tętnicy nadbrzusznej (B) oraz tętnicy mięśnia smukłego (C), która przebiega nad grupą mięśni przywodzicieli (D). Tętnica mięśnia smukłego jest wykorzystywana w IVM przy użyciu skalibrowanego mikroskopu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat ultrasonografii kontrastowej; wykresy objętości krwi w mięśniach; analiza wpływu szybkości infuzji.
Rycina 3: Intensywność sygnału w ultrasonografii kontrastowej dla objętości krwi w mikro naczyniach mięśniowych oraz w naczyniach udowych. (A) Widok nieliniowego trybu obrazowania kontrastowego platformy cyfrowej podczas stałej infuzji mikropęcherzyków w górnej części kończyny tylnej samca myszy. Panel prawy: wyznaczono dwa obszary ROI reprezentujące MBV mięśni oraz naczynia udowe. W ROI włączono tylko powierzchowną część przedziału mięśnia przywodziciela, ponieważ intensywność sygnału maleje wraz z głębokością. Panel lewy: krzywa czasowo-intensywności z ROI dla MBV mięśni. Linie pionowe reprezentują niszczenie mikropęcherzyków (MBD) za pomocą fal o wysokiej energii. Bezpośrednio po MBD w płaszczyźnie obrazowania nie występuje środek kontrastowy, która następnie stopniowo wypełnia się mikropęcherzykami. Po 10-15 s osiągnięto szczyt wzmocnienia kontrastowego. (B-D) Po osiągnięciu sygnału stanu stacjonarnego szybkość infuzji 2,5 x 109 pęcherzyków/mL została podwojona (5, 10, 20 µL/min). Intensywność sygnału z MBV mięśni (B) oraz naczyń udowych (C) przebiegała równolegle do podwojenia stężenia mikropęcherzyków w krwiobiegu. (D) Korekta MBV mięśni względem sygnału z naczyń udowych eliminuje zmienność intensywności sygnału spowodowaną różnymi stężeniami mikropęcherzyków (N = 9; słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy zmian średnicy, olej parafinowy i infuzja insuliny, analiza danych eksperymentalnych.
Rysunek 4: Pomiary mikroskopii intravitalnej tętnicy gracilis. (A) Olej parafinowy redukuje zmienność średnic tętnic gracilis u różnych zwierząt (która wynosi 29,0 µm bez parafiny w porównaniu do 17,9 µm po zastosowaniu oleju), zachowując jednocześnie stabilną średnią średnicę wyjściową (73,6 µm vs 68,8 µm; p = 0,58). (B) Średnice tętnic w stanie wyjściowym oraz po 60 min infuzji insuliny lub soli fizjologicznej. Insulina po 60 min infuzji konsekwentnie rozszerzała tętnicę gracilis (p <0,0001) w porównaniu z infuzją soli fizjologicznej. (C) Wazodylatacja indukowana insuliną występuje 10 min po rozpoczęciu infuzji (p = 0,002) i osiąga 95% wartości maksymalnej w 30 min. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe; do analizy statystycznej zastosowano nieparzysty test t Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Względne zmiany MBV podczas wlewów soli fizjologicznej i insuliny; wykres porównawczy; wyniki analizy danych.
Rycina 5: Pomiary objętości krwi mikronaczyniowej (MBV) z wykorzystaniem ultrasonografii z kontrastem w obrębie przedziału mięśnia przywodziciela kończyny tylnej myszy. (A) Insulina spowodowała stały wzrost MBV 30 min po rozpoczęciu wlewu insuliny. (B) Różnica między pomiarami w stanie hiperinsulinemii a pomiarami wyjściowymi (zmiana MBV) jest określana jako rekrutacja mikronaczyniowa indukowana insuliną. Insulina wywołała rekrutację mikronaczyniową na poziomie 33,5% (± 31,04%, p = 0,016; N = 7) w porównaniu do wlewu soli fizjologicznej (-10,63 ± 27,87%, N = 6). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe; do analizy statystycznej wykorzystano nieparzysty test t Studenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opracowaliśmy technikę jednoczesnej oceny działania naczyniowego insuliny na większe tętnice (za pomocą IVM) i mikrokrążenie mięśni szkieletowych (za pomocą CEUS). Kluczowymi krokami dla udanych i wiarygodnych pomiarów są: 1) prawidłowe odsłonięcie tętnicy gracilis bez krwawienia; 2) zapobieganie wyciekaniu oleju parafinowego kąpiącego tętnicę; 3) posiadanie opatentowanego dostępu żylnego (kaniula żyły ogonowej) do infuzji związków wazoaktywnych (insuliny) i środka kontrastowego (mikropęcherzyki).

Badania nad dysfunkcją mikrokrążenia w mięśniach zyskują na popularności w kontekście otyłości i insulinooporności 14,25,39,40. Negatywny wpływ otyłości i insulinooporności na funkcjonowanie naczyń ujawnia się na różnych poziomach drzewa naczyniowego. W związku z tym do oceny tych zmian potrzebne są różne podejścia. Połączone zastosowanie technik IVM i CEUS u tej samej myszy zapewnia potężne narzędzie do ilościowego określania działania insuliny na różnych poziomach układu naczyniowego. IVM umożliwia bezpośrednią wizualizację i analizę ilościową tętnicy opornej, a CEUS pozwala na ocenę zmian w perfuzji mięśniowej wywołanych insuliną.

Badanie przedziału mięśniowego przywodzicieli ma kilka zalet. Tętnice są łatwo dostępne, a powierzchowny charakter nacięcia umożliwia zamknięcie nacięcia skóry wchłanialnym sterylnym szwem 5,0 po zakończeniu eksperymentu. Po doświadczeniach zwierzętom wstrzyknięto podskórnie buprenorfinę jako środek przeciwbólowy w dawce 0,1 mg/kg i pozostawiono do odzyskania sił w ciepłym środowisku. Myszy bardzo dobrze tolerowały zabieg i nie doświadczyliśmy utraty zwierząt ani infekcji kończyn tylnych u ponad 35 badanych zwierząt. Umożliwia to obserwację lub badanie zwierząt w sposób podłużny. Zwierzęta wykorzystane w tych eksperymentach zostały jednak znieczulone przy użyciu 1,8% wziewnego izofluranu zrównoważonego tlenem przepływającym z prędkością 0,4 l/min przez maskę anestezjologiczną. W przeciwieństwie do znieczulenia izofluranem 41,42, znieczulenie FMA nie zaburza obwodowej wrażliwości na insulinę. Kolejnym planem jest zbadanie, jak dobrze myszy wracają do zdrowia po znieczuleniu FMA.

Przydatny jest również przedział mięśniowy przywodziciela, ponieważ można ocenić różne związki wazoaktywne pośredniczące w miejscowych i dalszych efektach naczyniowych. Na przykład miejscowe zastosowanie tych związków do tkanki docelowej jest możliwe przy użyciu technik superfuzji28 lub chirurgicznej manipulacji i wszczepienia mankietów uwalniających leki otaczających naczynia43. Ponadto tętnicę gracilis można wyizolować i zbadać w miografie ciśnieniowym. Nasza grupa i inni zebrali istotne dowody eksperymentalne za pomocą miografu ciśnieniowego, aby udokumentować wpływ insuliny i innych związków wazoaktywnych na tę tętnicę ex vivo36,37,38.

Ograniczeniem nieodłącznie związanym ze stosowaniem techniki IVM jest chirurgiczne odsłanianie mięśni i stosowanie oleju parafinowego w celu stabilizacji naczyń. Nie jest jasne, czy działania te mają wpływ na rodzime środowisko tętnicy. Jednak rysunek 3A pokazuje, że podstawowa średnica tętnicy gracilis skąpanej w oleju parafinowym nie zmienia się znacząco. Wykazano również, że olej mineralny skutecznie hamuje dyfuzję tlenu, chroniąc tkankę przed warunkami hiperoksyjnymi44. Ponadto olej pomaga zmniejszyć wahania podstawowej średnicy tętnic. Dlatego zalecamy stosowanie oleju parafinowego i pozostawienie preparatu na co najmniej 30 minut. Warto zauważyć, że użycie buforowanej soli fizjologicznej zamiast oleju – lub jej brak w ogóle – skutkowało bardzo zmiennymi średnicami i zwężeniem naczynia (dane nie pokazane). Co więcej, na zakończenie eksperymentów wyizolowaliśmy tętnice gracilis - skąpane w oleju parafinowym - i przetestowaliśmy ich reaktywność w miografie ciśnieniowym ex vivo. Tętnice skąpane w oleju parafinowym reagowały podobnie do tętnic kontrolnych, gdy były stymulowane insuliną i acetylocholiną (środkiem rozszerzającym naczynia krwionośne) (dane nie pokazane). Konsekwentne rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane insuliną wyraźnie pokazuje, że protokół IVM opisany w tym badaniu daje wiarygodne wyniki.

Zaletą zastosowania obu technik u tej samej myszy jest przezwyciężenie niektórych wewnętrznych ograniczeń jednej techniki przez drugą: CEUS szacuje MBV w niezakłóconym mięśniu in vivo, ale nie można zobaczyć pojedynczych naczyń; IVM umożliwia obserwację pojedynczych statków, choć nie jest w stanie oszacować MBV. Kolejnym planem jest wykorzystanie mikroskopii IVM mięśnia cremaster w połączeniu z CEUS mięśnia przywodziciela po stronie przeciwległej. Modyfikacja ta może zapewnić oszacowanie MBV (przy użyciu CEUS) i bezpośredni dostęp optyczny do naczyń włosowatych (przy użyciu IVM). Protokół może być dalej modyfikowany; Łącznik 4-drożny używany do kaniuli ogonowej można przełączyć na łącznik 5-drożny. Dzięki temu możemy uniknąć odłączenia rurki anestezjologicznej podczas wykonywania drugiego pomiaru CEUS (opisanego w punkcie 2.9). Z naszego doświadczenia wynika, że myszy dobrze tolerowały obecny protokół. Kolejną modyfikacją, którą można wprowadzić do tego protokołu, jest zastosowana szybkość zacisku insuliny. Zastosowaliśmy szybkość zacisku 7,5 mU/kg/min, która jest uważana za suprafizjologiczną. W zależności od badania można zastosować niższą szybkość zacisku insuliny (na przykład 3 mU/kg/min).

Chociaż stwierdziliśmy, że opisany protokół jest niezawodny, istnieją pewne ograniczenia, które wymagają uwagi. Zdarzają się sytuacje, w których pomiar średnicy tętnicy nie jest optymalny. Wykonanie kroków przygotowawczych wymaga pewnego doświadczenia z modelem. Bardzo ważne jest, aby olej parafinowy nie wyciekał z otoczenia naczynia, ponieważ uzupełnienie go nowym olejem zaburzy pracę naczynia i zmieni średnicę, co spowoduje konieczność pozostawienia tętnicy na odpoczynek przez kolejne 30 minut. Ponadto odbicie światła (opisane w kroku 1.14 protokołu) od powierzchni oleju parafinowego było czasami zbyt jasne, co utrudniało dostrzeżenie tętnicy. Można temu przeciwdziałać, kierując źródło światła tak, aby światło padało pod kątem do powierzchni oleju parafinowego i równolegle do tętnicy.

Podsumowując, połączenie technik IVM i CEUS opisanych w tym badaniu umożliwia ilościowe określenie różnych efektów insuliny na różnych poziomach układu krwionośnego. IVM tętnicy gracilis zapewnia wgląd w zmiany naczyniowe w górę rzeki, przyczyniając się do perfuzji mikronaczyniowej mierzonej za pomocą CEUS. Zalecamy połączenie kilku technik eksperymentalnych na tej samej myszy, aby lepiej ocenić funkcję naczyń krwionośnych.

Oświadczenia

Visual Sonics Inc. pokryła opłaty za otwarty dostęp, podczas gdy struktura i treść artykułu pozostała w pełnej gestii autorów.

Podziękowania

Dziękujemy inż. Duncanowi van Groenowi za zaprogramowanie oprogramowania do analizy obrazu (ImageGrabber) użytego w tym badaniu. Finansowanie tych badań zostało zapewnione z grantu VIDI z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (grant 016.136.372).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57BL/6RiverUżyte myszy zostały wyhodowane we własnym
systemie ultrasonograficznym Vevo 2100 o wysokiej rozdzielczościVisualSonics inc.
Przetwornik nieliniowy MS250firmy VisualSonics inc.
Oprogramowanie Vevo 2100VisualSonics inc.
Żel do ultradźwięków (Aquasonic 100, bezbarwny)CSP Medical133-1009Żel ultradźwiękowy służący do przesyłania fal ultradźwiękowych
VortexVWR international58815-234
Poduszka grzewcza Pantlab
Freestyle Precision Xceed Do pomiaru poziomu glukozy we krwi podczas klamry hiperinsulinemiczno-euglikemicznej
Insulina NovorapidNovo Nordisk
Glukoza jednowodna Merck Millipore1083421000
Buforowany roztwór soli fizjologicznejB. Braun152118062
Rurki medyczne PE-20Becton, Dickinson and Company427405
Igła, 27 Gauge Becton-Dickinson & Co305109
Taśma medyczna3M
UchwytZbudowany we własnym zakresie
Waciki bawełnianeDepilator
CremeWiele równoważnych
Żelowy klej tkankowyDerma+flexGA30005-2222
Pompa infuzyjnaHarvard AparaturaHarvard Apparatus PHD 2000
Małe cienkie proste nożyczkiFine Science Tools (FST)14090-09
Uchwyt na igłęFine Science Tools (FST)12500-12
Kleszcze proste z cienką końcówkąFine Science Tools (FST)11251-20
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX12
KameraBaslerscA1390-17gc
Program Image GrabberZbudowany we własnymzakresie System akwizycji obrazu
TimerVWR33501-418
Strzykawki, 1 mlFisher14-817-25
Źródło światła, światłowódSchottKL1500Idealnie ma regulowane ramiona
OlejWiele równoważnych
Nazwa>Firma>Numer katalogowyUwagi
Microbubbles
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholina Avanti Polar Lipids850365C
stearynian polioksyetylenu   Sigmap3440
gaz perfluorobutanowy F2 ChemicalsC4F10(g)
Kąpiel ultradźwiękowa Decon FS200 Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix Obrazowanie medyczne Lantheus515370-0810
Multisizer Coulter Counter BeckmanCoulter Inc
Charles Abbott na sondę ultradźwiękową Multi Equivalent parafinowy

Bibliografia

  1. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Rowe, J. W., Andres, R. Glucose intolerance in uremia. Quantification of pancreatic beta cell sensitivity to glucose and tissue sensitivity to insulin. The J Clin Invest. 62, 425-435 (1978).
  2. Chiu, J. D., et al. Direct administration of insulin into skeletal muscle reveals that the transport of insulin across the capillary endothelium limits the time course of insulin to activate glucose disposal. Diabetes. 57, 828-835 (2008).
  3. Herkner, H., et al. Transcapillary insulin transfer in human skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 33, 141-146 (2003).
  4. Yang, Y. J., Hope, I. D., Ader, M., Bergman, R. N. Insulin transport across capillaries is rate limiting for insulin action in dogs. J Clin Invest. 84, 1620-1628 (1989).
  5. Clerk, L. H., et al. The vasodilatory actions of insulin on resistance and terminal arterioles and their impact on muscle glucose uptake. Diabetes Metab Res Rev. 20, 3-12 (2004).
  6. Vincent, M. A., et al. Microvascular recruitment is an early insulin effect that regulates skeletal muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 53, 1418-1423 (2004).
  7. Barrett, E. J., et al. The vascular actions of insulin control its delivery to muscle and regulate the rate-limiting step in skeletal muscle insulin action. Diabetologia. 52, 752-764 (2009).
  8. Vincent, M. A., Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G., Barrett, E. J. Active role for the vasculature in the delivery of insulin to skeletal muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol. 32, 302-307 (2005).
  9. Clark, M. G., Rattigan, S., Barrett, E. J., Vincent, M. A. Point: There is capillary recruitment in active skeletal muscle during exercise. J Appl Physiol (1985). 104, 889-891 (2008).
  10. Wallis, M. G., et al. Insulin-mediated hemodynamic changes are impaired in muscle of Zucker obese rats. Diabetes. 51, 3492-3498 (2002).
  11. Eringa, E. C., Stehouwer, C. D., Roos, M. H., Westerhof, N., Sipkema, P. Selective resistance to vasoactive effects of insulin in muscle resistance arteries of obese Zucker (fa/fa) rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, 1134-1139 (2007).
  12. Bonner, J. S., et al. Muscle-specific vascular endothelial growth factor deletion induces muscle capillary rarefaction creating muscle insulin resistance. Diabetes. 62, 572-580 (2013).
  13. Kubota, T., et al. Impaired insulin signaling in endothelial cells reduces insulin-induced glucose uptake by skeletal muscle. Cell Metab. 13, 294-307 (2011).
  14. Levy, B. I., et al. Impaired tissue perfusion: a pathology common to hypertension, obesity, and diabetes mellitus. Circulation. 118, 968-976 (2008).
  15. Schelbert, H. R. Coronary circulatory function abnormalities in insulin resistance: insights from positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 53, 3-8 (2009).
  16. Wong, T. Y., et al. Associations between the metabolic syndrome and retinal microvascular signs: the Atherosclerosis Risk In Communities study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 2949-2954 (2004).
  17. Bonadonna, R. C., et al. Role of tissue-specific blood flow and tissue recruitment in insulin-mediated glucose uptake of human skeletal muscle. Circulation. 98, 234-241 (1998).
  18. Ellmerer, M., et al. Reduced access to insulin-sensitive tissues in dogs with obesity secondary to increased fat intake. Diabetes. 55, 1769-1775 (2006).
  19. Ellmerer, M., et al. Physiological hyperinsulinemia in dogs augments access of macromolecules to insulin-sensitive tissues. Diabetes. 53, 2741-2747 (2004).
  20. Vincent, M. A., et al. Mixed meal and light exercise each recruit muscle capillaries in healthy humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, 1191-1197 (2006).
  21. de Jongh, R. T., Serne, E. H., RG, I. J., de Vries, G., Stehouwer, C. D. Impaired microvascular function in obesity: implications for obesity-associated microangiopathy, hypertension, and insulin resistance. Circulation. 190, 2529-2535 (2004).
  22. Ketel, I. J., et al. Obese but not normal-weight women with polycystic ovary syndrome are characterized by metabolic and microvascular insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab. 93, 3365-3372 (2008).
  23. Khan, F., et al. Impaired microvascular function in normal children: effects of adiposity and poor glucose handling. J Physiol. 551, 705-711 (2003).
  24. Clark, M. G. Impaired microvascular perfusion: a consequence of vascular dysfunction and a potential cause of insulin resistance in muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, 732-750 (2008).
  25. Serne, E. H., et al. Impaired skin capillary recruitment in essential hypertension is caused by both functional and structural capillary rarefaction. Hypertension. 38, 238-242 (2001).
  26. Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
  27. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg Endosc. 17, 939-942 (2003).
  28. Cardinal, T. R., et al. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front Physiol. 2, 91(2011).
  29. Duling, B. R. The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation. Microvasc Res. 5, 423-429 (1973).
  30. Wei, K., et al. Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of microbubbles administered as a constant venous infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  31. Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G. Lipid infusion impairs physiologic insulin-mediated capillary recruitment and muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 51, 1138-1145 (2002).
  32. Barrett, E. J., Keske, M. A., Rattigan, S., Eringa, E. C. CrossTalk proposal: De novo capillary recruitment in healthy muscle is necessary. J Physiol. 592, 5129-5131 (2014).
  33. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, 2728-2738 (2012).
  34. Boer, M. P., et al. Globular adiponectin controls insulin-mediated vasoreactivity in muscle through AMPKalpha2. Vascul Pharmacol. 78, 24-35 (2016).
  35. van den Brom, C. E., et al. Myocardial Perfusion and Function Are Distinctly Altered by Sevoflurane Anesthesia in Diet-Induced Prediabetic Rats. J Diabetes Res. 2016, 5205631(2016).
  36. Meijer, R. I., et al. Perivascular adipose tissue control of insulin-induced vasoreactivity in muscle is impaired in db/db mice. Diabetes. 62, 590-598 (2013).
  37. Meijer, R. I., et al. Insulin-induced changes in skeletal muscle microvascular perfusion are dependent upon perivascular adipose tissue in women. Diabetologia. 58, 1907-1915 (2015).
  38. Sun, D., Kaley, G., Koller, A. Characteristics and origin of myogenic response in isolated gracilis muscle arterioles. Am J Physiol. 266, 1177-1183 (1994).
  39. Jonk, A. M., et al. Microvascular dysfunction in obesity: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Physiology (Bethesda). 22, 252-260 (2007).
  40. Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14, 403-438 (2007).
  41. Horber, F. F., et al. Isoflurane and whole body leucine, glucose, and fatty acid metabolism in dogs. Anesthesiology. 73, 82-92 (1990).
  42. Sui, H., et al. Quantifying insulin sensitivity and entero-insular responsiveness to hyper- and hypoglycemia in ferrets. PLoS One. 9, 90519(2014).
  43. Pires, N. M., et al. Local perivascular delivery of anti-restenotic agents from a drug-eluting poly(epsilon-caprolactone) stent cuff. Biomaterials. 26, 5386-5394 (2005).
  44. Young, D. A., Chi, M. M., Lowry, O. H. Energy metabolism of skeletal muscle biopsies stimulated anaerobically without load in vitro. Am J Physiol. 250, 813-820 (1986).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

rednica t tnicymikronaczyniowa obj to krwizacisk hiperinsulinemiczno euglikemicznykaniula do y y ogonowejg owica ultrad wi kowa
Połączona mikroskopia przyżyciowa i ultrasonografia tylna myszy ze wzmocnieniem kontrastowym w celu zbadania rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji mięśni wywołanego insuliną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.