Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Streszczenie

Obecnie dostępnych jest wiele narzędzi chemicznych do wprowadzania sond chemicznych do białek w celu zbadania ich struktury i funkcji. Przydatną metodą jest koniugacja białek poprzez genetyczne wprowadzenie nienaturalnego aminokwasu zawierającego bioortogonalną grupę funkcyjną. W niniejszym raporcie opisano szczegółowy protokół koniugacji przeciwciał specyficznych dla danego miejsca. Protokół zawiera szczegóły eksperymentalne dotyczące genetycznego włączenia aminokwasu zawierającego azydek oraz reakcji koniugacji przez cyklodykcję azydkowo-alkinową promowaną szczepem (SPAAC). Ta reakcja wspomagana przez szczep przebiega poprzez proste mieszanie reagujących cząsteczek o fizjologicznym pH i temperaturze i nie wymaga dodatkowych odczynników, takich jak jony miedzi(I) i ligandy chelatujące miedź. Dlatego metoda ta byłaby przydatna do ogólnej koniugacji białek i opracowywania koniugatów przeciwciał z lekami (ADC).

Wprowadzenie

Od czasu zgłoszenia genetycznego włączenia p-metoksyfenyloalaniny do Escherichia coli,1 ponad 100 nienaturalnych aminokwasów (UAA) zostało z powodzeniem włączonych do różnych białek. ^1-3 Wśród tych użytków rolnych aminokwasy zawierające bioortogonalne grupy funkcyjne zostały szeroko przebadane i stanowią największy odsetek. Bioortogonalne grupy funkcyjne stosowane w UAA obejmują keton, ⁴ azydek, ⁵ alkin, ⁶ cyklooktyn, ⁷ tetrazynę^{, α}, β-nienasycony amid^{, 9} norbonen, ¹⁰ transcyklookten11 i bicyklo[6.1.0]-nonyn. ¹¹ Chociaż każda grupa funkcyjna ma swoje zalety i wady, aminokwasy zawierające azydek są najszerzej stosowane do koniugacji białek. p-Azidophenylalanina (AF), jeden z aminokwasów zawierających azydo, jest łatwo dostępna, a jej skuteczność inkorporacji jest doskonała. Zmutowane białka zawierające ten aminokwas mogą reagować z alkinami przez cykloaddycję katalizowaną miedzią lub z cyklooktynami przez SPAAC. ^12-20

Dni

Ostatnio biofarmaceutyki cieszą się dużym zainteresowaniem w przemyśle farmaceutycznym. Koniugat przeciwciało-lek (ADC) to klasa przeciwciał terapeutycznych, które są korzystne ze względu na ich zdolność do terapii celowanej w leczeniu nowotworów u ludzi²¹ i innych chorób. Ponad 50 ADC jest obecnie w fazie badań klinicznych, a liczba ta szybko rośnie. Przy opracowywaniu ADC należy wziąć pod uwagę wiele czynników, aby zmaksymalizować skuteczność i zminimalizować skutki uboczne. Wśród tych czynników kluczowe znaczenie ma skuteczna i specyficzna dla miejsca reakcja koniugacji w celu utworzenia wiązania kowalencyjnego między przeciwciałem a lekiem. Pożądaną skuteczność i swoistość w reakcji koniugacji można osiągnąć poprzez koniugację z bioortogonalną grupą funkcyjną w nienaturalnym aminokwasie, który jest specyficznie włączony do przeciwciała. ^22-26 Tutaj przedstawiamy protokół specyficznego dla miejsca włączenia AF do fragmentu przeciwciała i koniugacji zmutowanego fragmentu przeciwciała za pomocą sondy biochemicznej.

Protokół

1. Budowa plazmidu

1. Skonstruuj plazmid ekspresyjny (pBAD-HerFab-L177TAG), który wyrażałby docelowy gen przeciwciała (pBAD-HerFab-WT) za pomocą znacznika His₆ i zastąp kodon dla Leucyny-177 kodonem bursztynowym (TAG) ²⁷, używając konwencjonalnej techniki mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.
   Zobacz tabelę materiałów.
2. Skonstruuj inny plazmid ekspresyjny (pEVOL-AFRS) zawierający geny dla wyewoluowanej pary tRNA^Tyr i syntetazy aminoacylo-tRNA (aaRS). Użyj specjalnie zaprojektowanego wektora plazmidowego, pEVOL, do efektywnej inkorporacji UAA. Szczegółowe informacje o plazmidach i protokoły klonowania są opisane w poprzednim raporcie. ²⁸
3. Uzyskaj wysokiej jakości plazmidowe DNA przy użyciu dostępnych na rynku zestawów do przygotowania plazmidu. Stosunek 260/280 wynoszący ~1,8 jest optymalny dla oczyszczonego DNA. W razie potrzeby wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym 1%, aby sprawdzić czystość DNA.

2. Przygotowanie kultury

1. Elektroporacja
   1. Dodaj każdy 1 μl DNA pEVOL-AFRS²⁸ i pBAD-HerFab-L177TAG do 20 μl szczepu Escherichia coli DH10β. Delikatnie wymieszać za pomocą pipety. Plazmidy mogą być przekształcane razem lub w niezależnych reakcjach.
   2. W przypadku kuwet 0.1 cm ustaw ustawienia elektroporacji na 25 μF i 2.5 kV.
   3. Włóż kuwetę do suwaka komory wstrząsowej. Wsuń suwak do komory, aż kuweta mocno zetknie się z elektrodami komory.
   4. Wykonaj impuls raz, naciskając przycisk impulsu, aż maszyna do elektroporacji wyda sygnał dźwiękowy.
   5. Dodaj 1 ml super optymalnego bulionu z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC) zawierającą 2% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂ i 20 mM glukozy do kuwety szybko i przenieś mieszaninę do probówki. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
   6. Rozprzestrzenić transformowane komórki E. coli na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB) zawierających odpowiednie antybiotyki (35 μg/ml chloramfenikolu i 100 μg/ml ampicyliny do wyboru odpowiednio pEVOL-AFRS i pBAD-HerFab-L177TAG). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
2. Przygotowanie kultury
   1. Zaszczepić pojedynczą przekształconą kolonię w pożywce o pojemności 5 ml LB zawierającej antybiotyki. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.

3. Ekspresja i oczyszczanie HerFab-L177AF

1. Ekspresja HerFab-L177AF
   1. Przenieść kulturę pierwotną (5 ml) do pożywki o pojemności 200 ml zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i AF (1 mM), a następnie inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
      UWAGA: 100 mM roztwór podstawowy AF (10 ml) przygotowano przez rozpuszczenie 206 mg AF w 100 mM kwasu solnego (10 ml, objętość końcowa).
   2. Dodać 2 ml 1,6 M arabinozy (16 mM stężenie końcowe), gdy kultura osiągnie fazę logarytmiczną (OD₅₅₀ = 0,8, OD = gęstość optyczna). Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.
   3. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 11 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zamrozić osad w temperaturze -20 °C.
2. Liza komórek
   1. Zawiesić osady komórkowe w 20 ml buforze do lizy peryplazmatycznej zawierającym 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% sacharozy i 0,2 mg/ml lizozymu i inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Odwirować lizat komórkowy przy sile 18 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad.
3. Chromatografia powinowactwa Ni-NTA
   1. Dodać zawiesinę żywicy Ni-NTA do każdej probówki wirówkowej (400 μl żywicy na 200 ml kultury) i delikatnie mieszać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
   2. Wlać zawiesinę do kolumny polipropylenowej i przemyć żywicę trzykrotnie 5 ml buforu płuczącego zawierającego 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8,0), 20 mM imidazolu i 300 mM NaCl.
   3. Eluować przeciwciało docelowe za pomocą 300 μl buforu elucyjnego zawierającego 50 mM NaH₂PO₄ (pH 8,0), 250 mM imidazolu i 300 mM NaCl.
   4. Oznaczyć stężenie zmutowanego białka za pomocą testu białkowego Bradforda²⁹ lub mierząc absorbancję przy 280 nm. Oblicz współczynnik ekstynkcji (75,866 ^{M-1 cm-1}) dla HerFab-L177AF przy 280 nm za pomocą kalkulatora współczynnika ekstynkcji białka, używając współczynnika ekstynkcji (2,471 ^{M-1 cm-1}) dla AF.
      UWAGA: Sekwencję aminokwasową HerFab można znaleźć na stronie NCBI (GI:783282791 i GI:783282792).

4. Koniugacja oczyszczonego HerFab-L177AF z sondami alkinowymi przy użyciu cykloaddycji azydowo-alkinowej promowanej szczepem (SPAAC)

1. Dodać 20 μl Cy5,5-Azadibenzocyklooktynyny(Cy5,5-ADIBO) w H₂O (200 μM stężenie końcowe) do roztworu 10 μL HerFab-L177AF (10 μM stężenie końcowe) w buforze fosforanowym zawierającym 10 mM Na₂HPO₄ (pH 7,0) i 100 mM NaCl.
   UWAGA: Jako alternatywy dostępne są również pochodne difluorowanej cyklooktyny (DIFO) i bicyklo[6.1.0]nonyny (BCN) do tego samego zastosowania.
2. Pozostawić reakcję cykloaddycji wspomaganą przez szczep na 6 godzin w temperaturze 37 °C. W przypadku użycia sondy światłoczułej (np. Cy5,5) należy przykryć naczynie reakcyjne folią aluminiową.
3. Oczyść oznakowany HerFab zgodnie z krokiem 5.

5. Oczyszczanie oznakowanego HerFab

1. Dodać 500 μl próbki do kolumny wirowej z filtrem odśrodkowym.
2. Odwirować kolumnę wirową o sile 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
3. Odrzucić przepływową i przenieść oczyszczoną próbkę z kolumny wirowej do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
4. Alternatywą dla kroku 5.1-5.3 jest przeprowadzenie oczyszczania przez dializę w stosunku do tego samego buforu.
5. Oczyszczony, oznakowany HerFab należy przechowywać w temperaturze 4 °C.

6. Analiza SDS-PAGE oznaczonego HerFab

1. Dodać 5 μl buforu próbki białka LDS zawierającego 106 mM Tris·HCl, 141 mM zasady Tris (pH 8,5), 2% LDS, 10% glicerolu, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G250 i 0,175 mM czerwieni fenolowej do 13 μl oczyszczonego znakowanego HerFab (7,8 μM lub 0,38 mg/ml) w obecności (+) lub braku (−) 2 μl ditiotreitolu (DTT, 100 mM stężenie końcowe). Inkubować mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
2. Podłącz kasetę z żelem 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE do ogniwa elektroforezy i dodaj bufor do pracy. Załaduj sprzężone próbki białek i wstępnie wybarwiony marker masy cząsteczkowej. Wykonać elektroforezę żelową przez 35 minut przy napięciu 200 V.
   Uwaga: Utrzymuj komórkę elektroforezy w ciemności przez cały okres, aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforu.
3. Po elektroforezie przenieś żel do skanera fluorescencyjnego żelu i skanuj w poszukiwaniu emisji fluorescencji na odpowiedniej długości fali. W przypadku Cy5.5 użyj trybu Cy5 w oprogramowaniu skanera.
4. Zabarwić żel dostępną w handlu plamą białkową.

Wyniki

W tym badaniu, fragment przeciwciała został specyficznie sprzężony z fluoroforem poprzez włączenie aminokwasu zawierającego azydek do fragmentu i reakcję zmutowanego fragmentu przeciwciała z napiętą cyklooktyną (Rysunek 1). HerFab został wybrany jako docelowy fragment przeciwciała, do którego włączono AF jako aminokwas zawierający azydek. Aby wybrać pozostałość w HerFab do zastąpienia przez AF, przeanalizowano rentgenowską strukturę krystaliczną HerFab. ^{Rozdział 30 ...}

Dyskusja

Genetyczne włączenie nienaturalnych aminokwasów do białek ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami stosowanymi do modyfikacji białek. ^1-3 Jedną z ważnych zalet jest jego ogólne zastosowanie do każdego rodzaju białka. W zasadzie nie ma ograniczeń w wyborze białka docelowego i miejsca docelowego białka. Jednak zastąpienie reszty o znaczeniu strukturalnym lub funkcjonalnym przez powierzchnię użytka jamonowego może spowodować zmianę struktury i funkcji białka docelowego. Ogólnie rzecz biorąc, pozostałości, k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. Budowa plazmidu
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG			Opcjonalnie zawierają bursztynowy kodon stop (TAG) w żądanej pozycji. Ko, W. et al. Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez promowaną szczepem cykloaddycję azydowo-alkinową. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plazmid pEvol-AFRS			Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. i Schultz, P. G. Ulepszony system do nienaturalnej mutagenezy aminokwasów w E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B	Invitrogen	C6400-03	Expression Host
Plasmid Mini-prep kit	Nucleogen	5112	200/pack
Agaroza	Intron biotechnology	32034	500  g
Bromek etydyny	Alfa Aesar	L07482	1 g
LB Bulion	BD Difco	244620	500  g
2. Przygotowanie hodowli
2.1 Elektroporacja
Micro pulser	BIO-RAD	165-2100
Kuweta mikropulsatorowa	BIO-RAD	165-2089	0.1  cm odstęp między elektrodami, opakowanie 50
Ampicylina Sód	Wako	018-10372	25 g
Chloramfenikol	Alfa Aesar	B20841	25 g
Agar	SAMCHUN	214230	500 g
SOC medium	Sigma	S1797	100 mL
3. Ekspresja i oczyszczanie HerFab-L177AF
3.1 Ekspresja Herfab-L177AF<
>p-azido-L-fenyloalanina (AF)	Bachem	F-3075.0001	1 g
L(+)-Arabinoza, 99%	Acros	104981000	100 g
Kwas solny, 35~37%	SAMCHUN	H0256	500 mL
3.2 Liza komórek
Tris(hydroksymetylo)aminometan, 99%	SAMCHUN	T1351	500 g
dwuwodna sól disodowa EDTA, 99,5%	SAMCHUN	E0064	1 kg
sacharoza	Sigma	S9378	500 g
Lysozyme	Siyaku	126-0671	1 g
3.3 Chromatografia powinowactwa Ni-NTA
Żywica Ni-NTA	QIAGEN	30210	25 ml
Kolumna polipropylenowa	QIAGEN	34924	50/opakowanie, pojemność 1 ml
Imidazol, 99%	SAMCHUN	I0578	1 kg
Fosforan sodu jednozasadowy, 98%	SAMCHUN	S0919	1 kg
Chlorek sodu, 99%	SAMCHUN	S2907	1 kg
4. Koniugacja oczyszczonego HerFab-L177AF z sondami alkinowymi przy użyciu cykloaddycji azydowo-alkinowej (SPAAC) promowanej szczepem
Cy5.5-ADIBO	FutureChem	FC-6119	1 mg
5. Oczyszczanie znakowanych filtrów odśrodkowych HerFab
Amicon Ultra 0,5 mL	MILLIPORE	UFC500396	96/opakowanie, 500 μ L pojemność
6. SDS-PAGE Analiza znakowanego HerFab i fluorescencyjnego skanowania żelowego
1,4-Dithio-DL-treitol, naziemna telewizja cyfrowa, 99,5%	Sigma	10708984001	10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x	Thermofisher	NP0007	10 mL
MES bufor do biegania	Thermofisher	NP0002	500 ml
Nupage Novex 4-12% żele SDS PAGE	Thermofisher	NO0321	12-dołkowy
Coomassie Brilliant Blue R-250	Wako	031-17922	25 g
Typhoon 9210 kamera o zmiennym trybie pracy	Amersham Biosciences