Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

21.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54924

⸱

20 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Durham University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów o rozdzielczości subnanometrowej za pomocą mikroskopii sił atomowych z modulacją amplitudy (tryb stukania) w cieczy. Metodę zademonstrowano na komercyjnych mikroskopach sił atomowych. Wyjaśniamy powody naszego wyboru parametrów i sugerujemy strategie optymalizacji rozdzielczości.

Streszczenie

Mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się dobrze znaną techniką obrazowania próbek w nanoskali w powietrzu i cieczy. Ostatnie badania wykazały, że podczas pracy w trybie modulacji amplitudy (stukania) obrazy o rozdzielczości atomowej lub molekularnej można uzyskać na szerokim zakresie miękkich i twardych próbek w cieczy. W takich sytuacjach małe amplitudy oscylacji (SAM-AFM) zwiększają rozdzielczość poprzez wykorzystanie zasolwatowanej cieczy na powierzchni próbki. Chociaż technika ta jest z powodzeniem stosowana w tak różnych dziedzinach, jak materiałoznawstwo, biologia i biofizyka oraz chemia powierzchni, uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości w cieczy może nadal stanowić wyzwanie dla początkujących użytkowników. Wynika to częściowo z dużej liczby zmiennych, które należy kontrolować i optymalizować, takich jak wybór wspornika, przygotowanie próbki i prawidłowa manipulacja parametrami obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy protokół uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości twardych i miękkich próbek w płynie za pomocą SAM-AFM na komercyjnym instrumencie. Naszym celem jest dostarczenie praktycznego przewodnika krok po kroku, jak uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, w tym czyszczenie i przygotowanie aparatury i próbki, wybór wspornika i optymalizację parametrów obrazowania. Na każdym etapie wyjaśniamy naukowe uzasadnienie naszych wyborów, aby ułatwić dostosowanie metodologii do konkretnego systemu każdego użytkownika.

Wprowadzenie

Od czasu swojego wynalezienia, trzy dekady temu, mikroskopia sił atomowych (AFM)1 stała się preferowaną techniką do badania próbek w nanoskali, zwłaszcza tam, gdzie uśrednianie na makroskopowych powierzchniach nie jest możliwe i wymagane są informacje lokalne. W typowym pomiarze AFM ugięcie elastycznego wspornika jest wykorzystywane do ilościowego określenia siły oddziaływania między niewielką liczbą cząsteczek a ultraostrą końcówką zamontowaną na końcu wspornika. W zależności od rodzaju oddziaływań i rozważanych skal czasowych można uzyskać szeroki zakres informacji, w tym właściwości lepkosprężyste miękkich błon biologicznych2,3, siłę pojedynczego wiązania chemicznego lub molekularnego4,5, atomowe szczegóły powierzchni 6-8, magnetyczne9, pojemnościowe10, przewodzące11, termiczne12,13 i chemiczne14 właściwości próbek15. Częścią sukcesu AFM jest jego zdolność do pracy z szeroką gamą materiałów16 i w wielu środowiskach, takich jak próżnia17, gaz11,18 lub ciecz19,20, ponieważ nie opiera się na określonej sile między sondą a próbką.

W praktyce jednak, obsługa AFM w warunkach innych niż otoczenie może być wyzwaniem, a wiele opublikowanych wyników nadal uzyskuje się w powietrzu. Dodatkową trudnością jest fakt, że zwykle konieczne jest działanie AFM w trybie dynamicznym (końcówka wibracyjna), aby zachować zarówno końcówkę, jak i próbkę, unikając dużych sił tarcia. Chociaż jest to bardziej wymagające, dynamiczne działanie może w zasadzie dostarczyć więcej informacji o analizowanej próbce i bez utraty rozdzielczości przestrzennej. W ciągu ostatniej dekady w dziedzinie dynamicznego AFM w cieczach nastąpił ważny rozwój, od pojawienia się AFM 21-23 z szybkością wideo, po pomiary wieloczęstotliwościowe24,25 i subnanometrowe obrazowanie struktur hydratacyjnych na granicy faz26-31. Działanie AFM zanurzone w cieczy jest obecnie rutynowo stosowane w biologii i biofizyce32-36, badaniach polimerów37, elektrochemii38-40 i charakterystyce granicy faz ciało stałe-ciecz41-44. Obecność cieczy wokół wibrującego wspornika znacząco zmienia jego dynamikę45, jak również interakcję między końcówką a próbką29,42. Przy odpowiednim użyciu ciecz może być wykorzystana do zwiększenia rozdzielczościobrazowania 26,29, z typową poprawą prawie prawie o rząd wielkości w porównaniu z najlepszą rozdzielczością osiągniętą w warunkach otoczenia46.

W AFM najwyższa rozdzielczość przestrzenna osiągalna dla danego pomiaru zależy zarówno od jakości samego AFM, jak i od charakteru badanej interakcji20,47,48. W chwili obecnej większość wysokiej klasy, dostępnych na rynku AFM charakteryzuje się poziomem hałasu zbliżonym do limitu termicznego12, więc czynnikiem decydującym o rozdzielczości jest zwykle interakcja końcówka-próbka. W rzeczywistości to gradient przestrzenny tej interakcji determinuje rozdzielczość: pomiary oparte na oddziaływaniach krótkiego zasięgu, szybko zanikających, dają wyniki o wyższej rozdzielczości niż w przypadku oddziaływań o dłuższym zasięgu. W cieczy siły solwatacji mogą poprawić rozdzielczość obrazowania, ponieważ mają tendencję do zanikania tylko na kilku średnicach molekularnych cieczy (zwykle < 1 nm) podczas oddalania się od powierzchni próbki49. Siły te wynikają z interakcji między cząsteczkami cieczy a powierzchnią próbki. Ciecz o silnym powinowactwie do powierzchni będzie miała tendencję do bycia bardziej uporządkowaną i mniej ruchliwą niż ciecz luzem na granicy faz z próbką29,42,50. W rezultacie, wibrująca końcówka AFM będzie potrzebowała więcej energii, aby przemieścić międzyfazowe cząsteczki cieczy niż masowa ciecz42, co sprawi, że pomiar będzie bardzo czuły na lokalne zmiany właściwości cieczy międzyfazowych w nanoskali - krajobrazie solwatacji.

Aby wykorzystać siły solwatacji, należy wziąć pod uwagę kilka praktycznych aspektów. Po pierwsze, amplituda oscylacji końcówki musi być porównywalna z zakresem sił solwatacji, zwykle < 1 nm. Po drugie, użyta ciecz musi tworzyć dobrze zdefiniowany krajobraz solwatacji na powierzchni próbki. W skali makroskopowej jest to równoznaczne z wymogiem "zwilżania" cieczy dla rozważanej próbki. Na przykład w wodzie łatwiej jest osiągnąć rozdzielczość na poziomie molekularnym na mice hydrofilowej niż na hydrofobowym graficie42,51. Na koniec należy odpowiednio dobrać stałą sprężystości wspornika podpierającego końcówkę52,53. Podczas pracy w tych warunkach AFM nie tylko dostarcza obrazy granicy faz na poziomie molekularnym, ale także uzyskuje informacje o lokalnym powinowactwie próbka-ciecz, które można wykorzystać do uzyskania informacji chemicznych o powierzchni próbki54.

Najczęstszymi dynamicznymi trybami pracy dla AFM w cieczy są modulacja amplitudy (AM, również 'tryb stukania') AFM i modulacja częstotliwości (FM) AFM. W pierwszym przypadku55 raster końcówki skanuje próbkę, podczas gdy jej amplituda drgań jest utrzymywana na stałym poziomie przez pętlę sprzężenia zwrotnego, która w sposób ciągły dostosowuje odległość końcówka-próbka. Obraz topograficzny próbki uzyskuje się z poprawki zastosowanej przez pętlę sprzężenia zwrotnego. W FM-AFM28,41,56 jest to częstotliwość oscylacji wspornika/końcówki, która jest utrzymywana na stałym poziomie, podczas gdy końcówka skanuje próbkę. Obie techniki zapewniają porównywalną rozdzielczość topograficzną w cieczy36,57. Kwantyfikacja interakcji końcówka-próbka wydaje się być prostsza i dokładniejsza w FM-AFM, ale AM-AFM jest łatwiejszy do wdrożenia, bardziej wytrzymały i umożliwia pracę z bardziej miękkimi wspornikami, co jest przydatne do badania łatwo odkształcalnych lub delikatnych próbek. Co istotne, AM-AFM jest bardziej rozpowszechniony wśród użytkowników AFM, częściowo ze względów historycznych, ale także ze względu na fakt, że jest technicznie łatwiejszy do kontrolowania.

Chociaż amplituda jest utrzymywana na stałym poziomie przez pętlę sprzężenia zwrotnego podczas obrazowania AM-AFM, opóźnienie fazowe między oscylacją końcówki a oscylacją napędową może się swobodnie zmieniać. Opóźnienie fazowe może dostarczyć użytecznych informacji na temat interakcji końcówka-próbka, związanych z energią rozpraszaną podczas oscylacji końcówki na styku z próbką58. W związku z tym obrazowanie fazowe może być uzyskiwane jednocześnie z obrazowaniem topograficznym i często jest komplementarne w podkreślaniu niejednorodności powierzchni próbki. Obrazowanie fazowe zostało wykorzystane do różnych mapowań interakcji, w tym do bezpośredniego mapowania energii adhezji42, właściwości lepkosprężystych58 i krajobrazu hydratacji granicy faz44.

Praktycznie, uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości w płynie pozostaje nietrywialne ze względu na dużą liczbę parametrów do kontrolowania oraz brak prostego, systematycznego protokołu, który działa w każdej sytuacji. Jakość obrazu zazwyczaj zależy między innymi od geometrii i elastyczności wspornika, składu chemicznego końcówki, amplitudy oscylacji i sztywności próbki55. Pomiary AFM są również z definicji perturbacyjne dla systemu. W rezultacie, zmiana zmiennych obrazowania i warunków środowiskowych bez odpowiednich rozważań może prowadzić do trudności w odtwarzalności i/lub błędnych obserwacji i fałszywych wyników.

Tutaj prezentujemy nasz protokół do uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości twardych i miękkich próbek w roztworze, przy użyciu komercyjnych instrumentów działających w modulacji amplitudy. Naszym celem jest zaoferowanie praktycznej procedury optymalizacji głównych parametrów, które mogą mieć wpływ na rozdzielczość dla różnych próbek, wyjaśniając w każdym przypadku uzasadnienie naszych wyborów na podstawie zasad fizycznych leżących u podstaw procesu obrazowania. Szczegółowo opisujemy podejście krok po kroku, od czyszczenia i przygotowania podłoża, po wybór wspornika, regulację parametrów obrazowania i rozwiązywanie typowych problemów. Wyjaśnienie naukowych przesłanek stojących za naszymi wyborami i procedurami dotyczącymi wysokiej rozdzielczości powinno pomóc w dokonywaniu racjonalnych wyborów podczas dostosowywania metodologii i służyć jako punkt wyjścia dla nowych systemów obrazowania.

W całym tym tekście używamy AM w odniesieniu do trybu pracy modulacji amplitudy AFM. Jako wartość zadaną odnosimy się do parametru sprzężenia zwrotnego, który jest utrzymywany na stałym poziomie podczas ugięcia wspornika (tryb kontaktowy) lub amplitudy oscylacji (tryb AM). W trybie AM wspornik jest napędzany zewnętrznie albo przez oscylację akustyczną, albo przez impulsowy laser skupiony u podstawy wspornika. Amplituda napędu to natężenie zewnętrznego sygnału oscylacyjnego. Bezwzględna wartość amplitudy napędu wymaganej do osiągnięcia danej amplitudy oscylacji wspornika zależy od wielu parametrów, takich jak sposób jazdy (akustyczny, fototermiczny lub magnetyczny), mocowanie wspornika i parametry (sztywność, geometria) oraz osiowanie lasera. Dokładna wartość amplitudy napędu nie jest zatem istotna, ale jest dostosowywana w każdym doświadczeniu tak, aby zapewnić odpowiednią (i wymierną) amplitudę oscylacji wspornika. Gdy napędzany wspornik znajduje się daleko od próbki i nie występuje tłumienie jego drgań w wyniku interakcji końcówka-próbka, jego amplituda oscylacji nazywana jest amplitudą swobodną. Gdy wibrująca końcówka zbliża się do powierzchni próbki, jej amplituda zaczyna się zmniejszać. Jeśli sprzężenie zwrotne jest włączone, z-piezo będzie stale dostosowywać swoje wydłużenie tak, aby wyciszyć wybraną amplitudę wartości zadanej, stałą. Wartość zadana jest zwykle zawsze mniejsza niż amplituda swobodna. Powszechne jest odniesienie do współczynnika wartości zadanej, stosunku amplitudy wartości zadanej (amplitudy obrazowania) do amplitudy swobodnej. Im mniejszy współczynnik wartości zadanej, tym trudniejsze są warunki obrazowania.

Protokół

1. Czyszczenie narzędzi i innych powierzchni

UWAGA: Przy dążeniu do uzyskania wysokiej rozdzielczości każda forma zanieczyszczenia może mieć szkodliwe skutki. Należy zatem upewnić się, że wszystkie narzędzia używane do manipulowania próbką, podłożem lub końcówkami AFM są dokładnie oczyszczone. Powyższe dotyczy każdej powierzchni lub instrumentu (np. pęsety), który może wejść w kontakt z próbką, belką dwuwporną lub celą AFM, w tym samego stolika do próbek.

  1. Instrumenty poddać myciu w myjce ultradźwiękowej w wodzie ultrapurej (18.2 MΩ, <5 ppm organics), następnie w izopropanolu (czystość 99.7%), a potem ponownie w wodzie ultrapurej, przez 10 min w każdym etapie. W miarę możliwości izopropanol należy stosować pod dygestorium, aby ograniczyć wdychanie oparów.
  2. Osuszyć strumieniem azotu.
  3. Jeśli pełne zanurzenie nie jest możliwe (np. w przypadku uchwytu dźwigara/elektroniki), powierzchnię należy oczyścić mechanicznie, przecierając ją jednowarstwowymi, nie pylącymi chusteczkami (chusteczki do lekkich zabrudzeń) nasączonymi kolejno wodą ultrapurej, izopropanolem i wodą ultrapurej. Pozostawić powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu (zazwyczaj od 15 do 30 min).

2. Przygotowanie podłoża

UWAGA: Podłoże określa powierzchnię stałą bezpośrednio wspierającą próbki, zazwyczaj będącą w fizycznym kontakcie zarówno ze skanerem AFM, jak i z próbką. Większość urządzeń AFM posiada uchwyt magnetyczny i można w nich stosować dyski stalowe, jednak ten sam protokół jest odpowiedni również dla takich podłoży jak szkiełka przedmiotowe. W tym przypadku zakładamy użycie dysku stalowego, do którego przymocowany jest dysk z miki. Celem tej procedury jest maksymalne ograniczenie zewnętrznych źródeł zanieczyszczeń, które mogą wpłynąć na obrazowanie. Przez cały czas należy nosić rękawiczki.

  1. Próbkę w postaci stalowego dysku poddaj sonicacji w kąpieli w wodzie ultrapurej (18,2 MΩ), następnie w izopropanolu, a na koniec ponownie w wodzie ultrapurej, po 10 min w każdym z tych mediów.
  2. Osusz dyski w strumieniu azotu.
  3. Przygotuj niewielką ilość kleju epoksydowego, dokładnie mieszając odczynniki, i nanieś ~10 µl na stalowy dysk.
  4. Przymocuj podłoże (mika muskowitowa, kryształ SiO2, szkło, itp.) do stalowego dysku, wywierając nacisk na podłoże. Pozostaw klej epoksydowy do utwardzenia przez kilka godzin w podwyższonej temperaturze (zgodnie ze specyfikacją producenta).
  5. Upewnij się, że wokół krawędzi podłoża żaden klej epoksydowy nie jest bezpośrednio wystawiony na działanie powietrza. Może to nastąpić w przypadku użycia nadmiernej ilości kleju i może stać się źródłem zanieczyszczeń.
    1. W przypadku podłoża z miki, mocno dociśnij taśmę klejącą o szerokości ~2,5 cm do podłoża tak, aby zakryć całą jego powierzchnię, a następnie gładko ją odklej. Użyj taśmy o słabej sile klejenia i odklejaj mikę, ciągnąc równolegle do powierzchni. Usunięty materiał jest widoczny na taśmie. Powtórz ten proces 2-3 razy, aż mika będzie wyglądać na lustrzanie gładką.
    2. W przypadku szkła/SiO2, jeśli wymagana jest dalsza chemiczna modyfikacja powierzchni, powtórz procedurę sonicacji w kąpieli z kroków 2.1-2.2. Alternatywnie, użyj urządzenia do naświetlania UV (lampy bakteriobójcze UV-C 18 W) przez 30-60 min (zależnie od mocy), aby przeprowadzić pirolizę wszelkich substancji organicznych, które mogą pozostać na powierzchni. Procedura ta sprawia również, że powierzchnia staje się bardziej hydrofilowa bez znaczącego zwiększenia chropowatości.

3. Przygotowanie wspornika i końcówki

  1. Zanurz chip z belką w kąpieli z izopropanolu, a następnie w wodzie ultrapurej, po 60 min w każdym z roztworów.
  2. Jeśli belka/igła wymaga dokładnego czyszczenia (np. po długotrwałym przechowywaniu w pudełku żelowym), przed krokiem 1 należy zastosować 30-minutowe moczenie w acetonie (czystość > 99,5%) (patrz również sekcja dotycząca zanieczyszczeń). Przechowywanie igieł w pudełkach żelowych jest, w naszym doświadczeniu, jednym z głównych źródeł zanieczyszczeń, które mogą pojawić się bardzo szybko59.
  3. Krótko naświetl igłę światłem UV (<5 min), aby wspomóc tworzenie stabilnych miejsc hydratacji60. Unikaj dłuższego naświetlania, ponieważ może ono uszkodzić igłę lub zwiększyć jej promień krzywizny.
  4. Wsuń belkę do uchwytu na belkę w AFM i nanieś pipetą ~50 µl roztworu obrazującego (rodzaj roztworu zależy od badanego obiektu, ale w tym przypadku należy użyć 10 mM roztworu chlorku rubidu w wodzie ultrapurej) na belkę i igłę w celu ich wstępnego zwilżenia; ograniczy to powstawanie pęcherzyków powietrza podczas zbliżania się do próbki.

4. Konfiguracja celi AFM

  1. Zamocuj dysk z próbką i podłoże na stoliku próbkowym, a następnie dodaj kroplę cieczy obrazującej (ciecz powinna mieć zazwyczaj od 2-3 mm grubości w najwyższym punkcie).
  2. Podłącz uchwyt wspornika do AFM.
  3. Zbliż wspornik do próbki tak, aby utworzył się mostek kapilarny między cieczami na wsporniku/igle a próbką.

5. Inicjowanie pomiaru i kalibracja wspornika

  1. Ustaw laser pomiarowy (zazwyczaj czerwony) blisko końcówki wspornika. W zależności od modelu AFM należy to zrobić za pomocą sterowania programowego lub poprzez ręczną regulację pozycji lasera. Pozyskaj widmo termiczne wspornika w cieczy (patrz Rycina 1A). Proces ten rejestruje fluktuacje termiczne wspornika za pomocą lasera, aby wyznaczyć częstotliwość głównego rezonansu wspornika (podstawową modę własną). W większości nowoczesnych urządzeń AFM odbywa się to poprzez zautomatyzowane procedury w sterowaniu programowym, jednak szczegóły mogą się różnić w zależności od modelu AFM.

Wykres częstotliwości względem intensywności oraz wykres odchylenia optycznego przedstawiający dopasowanie widma i widmo termiczne.
Rycina 1: Strojenie i kalibracja wspornika. A: Widmo szumu termicznego pionowego odchylenia wspornika (czarne) z dopasowaniem prostego oscylatora harmonicznego (SHO) dla podstawowego modu własnego (czerwone). W tym przypadku rezonans w wodzie wynosi 18.7 kHz. Pierwsze trzy częstotliwości rezonansowe, odpowiadające pierwszym trzem zginającym moduom własnym, są zaznaczone niebieskimi strzałkami. B: Kalibracja odwrotnej czułości optycznej dźwigni wspornika. Liniowe ugięcie wspornika dociśniętego do sztywnej (niedeformowalnej) powierzchni jest wykorzystywane do pomiaru współczynnika konwersji (InvOLS) między odchyleniem mierzonym w woltach a odpowiadającą mu wartością w nanometrach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Zarejestruj krzywą ugięcia w funkcji odległości, umieszczając wspornik na sztywnym podłożu (np. mika lub szkło) i skalibruj ugięcie, przyjmując, że nachylenie krzywej w liniowym obszarze ugięcia (jak w Rysunku 1B) wynosi jeden61-63.
    UWAGA: Proces ten pozwala wyznaczyć współczynnik konwersji między zmierzonym ugięciem na fotodetektorze (w woltach) a rzeczywistym ugięciem wspornika (w nanometrach) — znanym jako Inverse Optical Lever Sensitivity (InvOLS). Kalibracja może uszkodzić wierzchołek, dlatego lepiej przeprowadzić ją po zakończeniu wszystkich pomiarów. Aby uzyskać przybliżoną wartość (zazwyczaj dokładną w >90%) rzeczywistej amplitudy przed kalibracją, można zastosować wartość InvOLS wyznaczoną dla innego wspornika tego samego typu podczas poprzedniego eksperymentu.
  2. Dopasuj pik rezonansowy w widmie termicznym do modelu prostego oscylatora harmonicznego64-66, aby wyznaczyć stałą sprężystości wspornika. Procedura ta jest zautomatyzowana w większości oprogramowań AFM i zazwyczaj nie wymaga specjalistycznej wiedzy na temat omawianego modelu.
  3. Nastroj wspornik. Wyznacz odpowiedź amplitudową wspornika przy wymuszaniu zewnętrznym (np. akustycznym lub poprzez wzbudzenie fototermiczne) w zakresie częstotliwości zbliżonych do jego nominalnej częstotliwości rezonansowej. Ustaw częstotliwość wymuszania w pobliżu maksimum w tym widmie, nieco po lewej stronie. W przypadku wymuszania akustycznego podczas strojenia może pojawić się wiele pozornych maksimów.
    1. Wybierz pik rezonansowy jak najbliższy (i mieszczący się w obwiedni) rezonansu zidentyfikowanego w widmie termicznym, korzystając z oprogramowania sterującego AFM; szczegóły mogą zależeć od typu i wersji oprogramowania sterującego urządzeniem AFM.

6. Podejście i wstępna kontrola próbki

  1. Ustaw amplitudę wzbudzenia tak, aby amplituda oscylacji swobodnych wynosiła około 5 nm. W przypadku niekalibrowanego InvOLS zazwyczaj odpowiada to wartościom 0,2-0,8 V w większości urządzeń AFM. Ustaw wartość zadaną (setpoint) amplitudy na około 80% amplitudy swobodnej.
  2. Ustaw wzmocnienia pętli sprzężenia zwrotnego na stosunkowo wysokie wartości (wartość bezwzględna zależy od modelu AFM), upewniając się jednocześnie, że nie występuje niestabilność ani drgania (ringing).
  3. Ustaw początkową prędkość skanowania oraz obszar skanowania na małe wartości (np. odpowiednio około 1 Hz i 10 nm). Pomaga to chronić końcówkę przed uszkodzeniem w przypadku niewłaściwego ustawienia parametrów sprzężenia zwrotnego poprzez unikanie skanowania na dużych dystansach. Jeśli warunki skanowania okażą się odpowiednie, obszar skanowania można następnie zwiększyć do większej wartości (np. 100 nm).
  4. Przed przystąpieniem do zbliżania końcówki określ przybliżoną wysokość powierzchni (w niektórych przypadkach należy to zrobić optycznie).
  5. Rozpocznij zbliżanie końcówki do powierzchni za pomocą oprogramowania sterującego AFM. Szczegóły tego procesu zależą od modelu AFM i używanego oprogramowania.
    1. W przypadku problemów ze zbliżaniem przy użyciu miękkiego wspornika, przeprowadź zbliżanie w trybie kontaktowym. W takim przypadku upewnij się, że wzmocnienia są niższe niż w trybie AM i ustaw wartość zadaną na stosunkowo niski poziom (0,1-0,2 V po wycentrowaniu lasera na fotodetektorze), aby chronić końcówkę.
    2. Oceń, czy końcówka dotarła do powierzchni bez rozpoczynania obrazowania, lekko zmieniając wartość zadaną (zwiększając w trybie kontaktowym lub zmniejszając w trybie AM). Jeśli końcówka znajduje się na powierzchni, wpływ na wysunięcie piezoelektryka Z powinien być pomijalny. Ruchy piezoelektryka Z w czasie rzeczywistym są zazwyczaj wyświetlane graficznie w oprogramowaniu sterującym większości urządzeń AFM. Jeśli zmiana wartości zadanej wywołuje widoczny ruch piezoelektryka, oznacza to fałszywe zetknięcie (false engage). W takim przypadku ponownie rozpocznij zbliżanie z aktualnej pozycji końcówki, stosując nieco wyższą (tryb kontaktowy) lub niższą (tryb AM) wartość zadaną.
  6. Gdy końcówka dotrze do powierzchni, wycofaj piezoelektryk Z (zazwyczaj poprzez naciśnięcie przycisku „stop”) i ponownie nastroj wspornik (powtórz krok 5.4.); częstotliwość rezonansowa prawdopodobnie przesunęła się w stronę niższych wartości z powodu oddziaływań końcówka-próbka.
  7. Zmień wartość zadaną na około 80% nowo nastrojonej amplitudy swobodnej (przy tej odległości końcówki od próbki).
  8. Zestaw wspornik z powierzchnią i przeprowadź skanowanie obszaru 10×10 nm2 w trybie AM, aby zweryfikować, czy parametry obrazowania są odpowiednie.
    1. Sprawdź, czy profile przejścia w przód (skanowanie od lewej do prawej) i w tył (skanowanie od prawej do lewej) nakładają się na siebie. Jeśli nie, dodatkowo zmniejsz wartość zadaną i spróbuj zwiększyć wzmocnienie.
    2. Zmniejsz wzmocnienia, jeśli obraz staje się zaszumiony.
  9. Powtórz operację, wykonując skanowanie większego obszaru próbki — od 1×1 µm2 do 5×5 µm2 — o ile jest to możliwe. W przypadku próbek miękkich lub biologicznych może to doprowadzić do zanieczyszczenia końcówki.

7. Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości

  1. Zmniejsz rozmiar skanowania do wartości odpowiedniej dla wizualizacji badanych cech (np. 100×100 nm2 dla kryształów białek lub 20×20 nm2 dla miki lub kalcytu).
  2. Zmniejsz amplitudę wzbudzenia wspornika na tyle, aby pętla sprzężenia zwrotnego automatycznie cofnęła piezoelektryk Z, a tym samym końcówkę od powierzchni. Gdy wspornik znajduje się poza powierzchnią, dostosuj amplitudę wzbudzenia tak, aby amplituda wspornika wynosiła ~1-2 nm (od szczytu do szczytu).
  3. Za pomocą oprogramowania sterującego AFM stopniowo zmniejszaj wartość setpoint o kilkadziesiąt mV za razem, aż piezoelektryk Z ponownie wysunie się w kierunku powierzchni i zostanie odzyskanym pierwotny obraz. Utrzymuj amplitudę setpoint w zakresie od 75% do 95% nowej amplitudy swobodnej.
  4. Ponownie dostosuj wzmocnienia (gains) za pomocą oprogramowania sterującego AFM; przy niższych amplitudach można stosować wyższe wzmocnienia bez wprowadzania znaczących szumów.
    1. Powtórz kroki 7.2-7.4, aby określić najlepszą kombinację amplitudy swobodnej, setpoint i wzmocnienia dla wysokiej rozdzielczości. Optymalne warunki zależą od próbki (krajobrazu solwatacji i właściwości zwilżania cieczy), ale także od wspornika (stałej sprężystości, sztywności).
    2. Przetestuj różne kombinacje amplitud w celu optymalizacji warunków obrazowania. Może być konieczne ponowne zwiększenie amplitudy swobodnej42. W takim przypadku najpierw dostosuj setpoint do wyższej wartości, a następnie zwiększ wzbudzenie (tzn. procedura odwrotna do tej stosowanej przy zmniejszaniu amplitudy).
    3. Utrzymuj amplitudę setpoint w zakresie 0,5 nm - 1,5 nm (od szczytu do szczytu), zachowując stosunki setpoint powyżej 0,7 (typowo 0,75-0,95). Dla interfejsów solvofilnych stosuj wsporniki o stałej sprężystości 0,5 - 2 N/m. Jest to wystarczające, aby końcówka usunęła większość cieczy międzyfazowej bez uderzania w powierzchnię. Praktyczna zasada została zaproponowana w równaniu 4 referencji29.

Wyniki

Protokół opisany w poprzedniej sekcji został z sukcesem zastosowany z wykorzystaniem kilku komercyjnych mikroskopów AFM w celu uzyskania obrazów na poziomie molekularnym lub atomowym. Wszystkie obrazy uzyskano przy amplitudach pracy od 0.5 nm do 1.5 nm, dostosowanych indywidualnie zgodnie z krokami procedury 7.1-7.4. Wyniki uzyskano dla szerokiego zakresu próbek miękkich (Rycina 2) i sztywnych (Rycina 3). W każdym przypadku wyróżniono interesujące cechy strukturalne. Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że małe amplitudy oscylacji i wysokie wartości set-point minimalizują siłę wywieraną przez końcówkę na próbkę, co pozwala na obrazowanie w roztworze kruchych samoorganizacji lipidów (Rycina 2A), białek (Rycina 2B oraz D) i cząsteczek amfifilowych (Rycina 2C) bez ich uszkadzania. Twardsze materiały krystaliczne, takie jak minerały (Rycyny 3A, B, D) i pojedyncze jony metali zaadsorbowane na powierzchni (Rycina 3C), mogą być obrazowane tą metodą, ponieważ w każdym przypadku to ciecz międzyfazowa jest efektywnie obrazowana zgodnie z opisanym protokołem. Siły solwatacji są porównywalne dla próbek przedstawionych na Rycynach 2 i 3: wszystkie próbki są hydrofilowe (bardziej ogólnie „solwofilowe” w przypadku Rycyn 2C, 3B, 3D) w stosunku do roztworu obrazującego. Spójnie z tym, we wszystkich przypadkach zastosowano wsporniki o porównywalnej sztywności (0.2 - 0.8 N/m). Zarówno próbka, jak i końcówka powinny być solwofilowe, aby zapewnić utworzenie przez cząsteczki cieczy dobrze zdefiniowanej struktury solwatacji, którą można obrazować. Nie jest to zawsze warunek wystarczający, ale w większości przypadków i dla stosunkowo małych cząsteczek cieczy, ciecz reorganizuje się w sposób naśladujący symetrię próbki. Głównym czynnikiem determinującym wysoką rozdzielczość jest lokalna zmienność powinowactwa zaadsorbowanych cząsteczek rozpuszczalnika do powierzchni (w skali Ångströma, w przypadku Rycyn 2A, 3A, 3C). Technika ta jest zatem najlepiej dostosowana do materiałów, w których struktura rozpuszczalnika znacznie różni się w obrębie powierzchni.

Mikroskopia sił atomowych dwuwarstwy lipidowej, purpurowej błony, SAM, akwaporyny; topografia i faza.
Rycina 2: Miękkie interfejsy obrazowane za pomocą AM-AFM w roztworach wodnych. A: Dwuwarstwa lipidowa dipalmitoylofosfatydylocholiny (DPPC) w fazie żelowej obrazowana w 150 mM KCl. Sześciokątnie upakowane grupy głowowe lipidów są rozróżnialne zarówno w topografii, jak i fazie, wraz z lokalnym kontrastem wskazującym na specyficzne dla danego miejsca zmienności w hydratacji. B: Purpurowe błony Halobacterium salinarum obrazowane w 150 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7.4. Wyróżniono kilka trimerów białka bakteriorodopsyny. Faza wykazuje kontrast inny niż topografia ze względu na lokalne miejsca hydratacji na białkach. Można dostrzec poszczególne trimery białkowe (linie przerywane). C: Cząsteczki barwnika amfifilowego (Z907) zaadsorbowane na powierzchni nanocząsteczki TiO2 w ogniwie słonecznym uwrażliwionym barwnikiem. Obraz został pozyskany w etylo-izopropylosulfonie. Wygląd przypominający gąbkę jest tworzony przez zaadsorbowane cząsteczki barwnika. D: Kryształ akwaporyny w rodzimych błonach soczewki bydlęcej obrazowany w tym samym buforze co w B. Wyróżniono tetramer akwaporyny. W topografii widoczna jest substruktura odpowiadająca pętlom międzyhelikalnym, podczas gdy faza wykazuje uderzająco inny kontrast ze względu na nietypowe zachowanie wody w pobliżu białka. Obrazy zostały zaadaptowane z ref36 (B), ref38 (C) oraz ref67 (D). Pasek skali wynosi 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm w (C) oraz 15 nm (D). Skala kolorów wskazuje odpowiednio zmienność wysokości i fazy wynoszącą 200 pm i 15° (A), 600 pm i 4° (B), 2.5 nm i 2.5° (C) oraz 1.6 nm i 9.5° (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazy topografii i fazy z mikroskopii sił atomowych kalcytu, SrTiO3, miką+RbCl oraz SiC.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy AM-AFM twardych próbek w roztworach ciekłych. A: Powierzchnia kryształu kalcytu [Notacja naukowa, symbol ułamka okresowego; odpowiedni do wzorów matematycznych lub fizycznych.] obrazowana w zrównoważonym roztworze wody ultrapure. B: Obraz tytanianu strontu uzyskany w dimetylosulfotlenku (DMSO). Wysoka rozdzielczość nie była możliwa do uzyskania w wodzie. C: Muskowit obrazowany w 3 mM RbCl — pojedyncze zaadsorbowane jony Rb+ są widoczne w miejscach sieciowych miki zarówno w skanach fazowych, jak i wysokościowych. D: Węglik krzemu obrazowany w DMSO. Oczekiwane układy krystalograficzne przedstawiono na obrazach B i D. Obrazy zostały zaadaptowane z ref 68 (A), ref 42 (B i D) oraz ref 44 (C). Pasek skali wynosi 3 nm (A, B, D) oraz 5 nm (C). Skala kolorów wskazuje odpowiednio zmienność wysokości i fazy wynoszącą 250 pm i 14° (A), 600 pm i 5,5° (B), 800 pm i 15° (C) oraz 500 pm i 3,5° (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przy założeniu, że ciecz obrazująca oraz sztywność wspornika zostały dobrane odpowiednio, krytycznymi krokami dla uzyskania wysokiej rozdzielczości są regulacja amplitudy obrazowania oraz ogólna czystość badanego układu.

Amplitudy porównywalne z grubością międzyfazowego obszaru cieczy (zazwyczaj mniej niż 2 nm) badają głównie zmienność właściwości rozpuszczalnika międzyfazowego42. Jeśli amplituda oscylacji jest zbyt duża, wibrująca końcówka będzie przechodzić przez dalekosiężne, nieliniowe pola sił52, co uniemożliwia stabilność ruchu wspornika i nieuchronnie prowadzi do uderzenia w próbkę niezależnie od warunków obrazowania29, skutkując pogorszeniem rozdzielczości. Poza utratą rozdzielczości, w ruchu końcówki zaczynają pojawiać się wyższe harmoniczne, a modelowanie systemu staje się bardziej skomplikowane55. Z kolei, jeśli amplituda obrazowania jest zbyt mała, badana jest tylko część międzyfazowego obszaru (zazwyczaj konkretne warstwy cieczy międzyfazowej), a stabilne obrazowanie można osiągnąć jedynie przy użyciu sztywnych wsporników (>10 N/m w wodzie53) w celu uzyskania satysfakcjonującego stosunku sygnału do szumu, co wiąże się z ryzykiem uszkodzenia miękkich próbek przy dużych różnicach wysokości. Konieczność zastosowania sztywnych wsporników wynika z potrzeby pokonania szumu termicznego, który może stać się bardziej znaczący niż mierzony sygnał. Podczas pracy z małymi amplitudami oddziaływania dalekosiężne między końcówką a próbką nadal występują, ale są w dużej mierze stałe i nie wpływają na kontrast wysokiej rozdzielczości w otrzymanych obrazach.

Czystość środowiska obrazowania ma kluczowe znaczenie w przypadku AFM wysokiej rozdzielczości. Niepożądane związki w układzie mogą zakłócać zarówno obrazowanie, jak i spektroskopię sił. Istnieją dwie główne kategorie zanieczyszczeń, które mają tendencję do wpływania na eksperymenty: (i) zanieczyszczenia bezpośrednio widoczne podczas obrazowania (Rycina 4B, 4C) oraz (ii) ogólny, niewyjaśniony brak wysokiej rozdzielczości. Przypadek (i) występuje zazwyczaj tylko w bardzo zidealizowanych układach, takich jak granica woda-mika, gdzie zaadsorbowane agregaty molekularne zakłócające oddziaływania między końcówką a próbką wyraźnie kontrastują z atomowo płaską powierzchnią miki (Rycina 4A). Przed wymianą końcówki i próbki warto zarejestrować krzywe spektroskopowe z dużym ugięciem, co w praktyce oznacza wielokrotne silne dociskanie końcówki do próbki. Normalnie doprowadziłoby to do uszkodzenia nowej końcówki, ale okazjonalnie może oczyścić zabrudzoną końcówkę lub wyindukować stabilne miejsca hydratacji odpowiednie do obrazowania. Taka końcówka nieuchronnie ulegnie jednak stępieniu i w konsekwencji będzie nadawać się wyłącznie do płaskich próbek, nawet jeśli jakość obrazowania ulegnie poprawie. W przypadku podejrzenia zanieczyszczenia sztywnych próbek warto spróbować obrazowania z wykorzystaniem drugiej mody własnej wspornika przed podjęciem wspomnianej wyżej, częściowo destrukcyjnej procedury. Wymaga to jedynie przełączenia częstotliwości wymuszającej na drugą modę własną i ponownego dostrojenia amplitudy/setpointu (patrz sekcja rozwiązywania problemów poniżej). Efektywna sztywność wspornika znacznie wzrasta podczas pracy w drugiej modzie własnej, a wszelkie słabo zaadsorbowane zanieczyszczenia mogą zostać odepchnięte przez końcówkę podczas obrazowania. Strategia ta nie zastępuje konieczności użycia czystej próbki i końcówki, ale oferuje dodatkowe możliwości uzyskania satysfakcjonujących obrazów w sytuacjach, gdy końcówka lub próbka ewidentnie nie są idealne.

Obrazy z mikroskopii sił atomowych (AFM), wykres analizy wysokości, ocena morfologii powierzchni.
Rycina 4: Przykłady zanieczyszczeń zaobserwowanych podczas obrazowania muskowitu, które utrudniają obrazowanie o wysokiej rozdzielczości. A: Muskowit obrazowany w 5 mM RbCl — nie są widoczne żadne cząstki zanieczyszczeń. B: Zanieczyszczenia w formie agregatów o rozmiarach rzędu kilkudziesięciu nm podczas obrazowania w nominalnie ultraczystej wodzie. C: Struktury samoorganizujące się utworzone przez cząstki zanieczyszczeń, prawdopodobnie o charakterze amfifilowym. Obrazowanie przeprowadzono ponownie w nominalnie ultraczystej wodzie. D: Przekroje przesunięte pionowo, odpowiadające liniom przerywanym na obrazach A, B i C, ilustrujące odchylenie od atomowo płaskiej powierzchni muskowitu. Paski skali na obrazach A, B i C odpowiadają 300 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przypadek (ii) jest częstszy i charakteryzuje się głównie frustrującym faktem, że cechy poniżej nanometra są po prostu nierozdzielcze, niezależnie od warunków obrazowania. Sygnatura tego typu sytuacji jest zazwyczaj widoczna w pomiarach spektroskopii sił, które wykazują pewne niespójności. Mogą one obejmować słabo powtarzalne krzywe oraz krzywe amplitudy w funkcji odległości, które znacząco odbiegają od typowego kształtu sigmoidalnego42. Jeśli zanieczyszczenia, jonowe lub inne, są rozproszone jednorodnie w całym płynie, mogą nie być widoczne w obrazowaniu topograficznym, ale mogą zaburzać strukturę hydratacyjną próbki69, co jest kluczowe dla utrzymania regularnej oddziaływania grot-próbka29 i uzyskania wysokiej rozdzielczości70. Mogą również występować bezpośrednie efekty zanieczyszczeń na próbkę, szczególnie w miękkich eksperymentach biologicznych. Na przykład wiadomo, że obecność alkoholi (z procedury czyszczenia) może upłynnić lipidowe dwuwarstwy w fazie żelowej71-73, uniemożliwiając uzyskanie rozdzielczości na poziomie subnanometrowym. Jeśli wysoka rozdzielczość nie jest możliwa, w pierwszej kolejności należy zadbać o proces czyszczenia, skupiając się szczególnie na każdym urządzeniu, które ma kontakt z roztworem do obrazowania. Nawet pozornie stabilne związki, takie jak żywica epoksydowa, mogą w pewnym stopniu rozpuszczać się w płynie, jeśli nie zostały w pełni utwardzone.

Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości za pomocą AM-AFM jest wymagające, wymaga cierpliwości i często wielu prób przed osiągnięciem optymalnych warunków obrazowania. Niewielkie problemy eksperymentalne mogą łatwo stać się na tyle istotne, że uniemożliwią uzyskanie wysokiej rozdzielczości, dlatego umiejętność rozwiązywania problemów jest niezbędna. Poniżej przedstawiamy niektóre z najczęstszych problemów, z którymi spotkaliśmy się podczas stosowania proponowanego rozwiązania.

Strojenie wspornika

Większość komercyjnych AFM wykorzystuje wzbudzenie akustyczne do napędzania dźwigni. W takim przypadku dostrojenie dźwigni, opisane w kroku 5.4, do wartości bliskiej jej częstotliwości rezonansowej często zapewnia wystarczającą wydajność pracy w powietrzu. W środowiskach ciekłych ciecz ma tendencję do wywoływania sprzężenia między różnymi częściami mechanicznymi AFM, takimi jak chip dźwigni i uchwyt. Może to wpływać na pozorną rezonansowość dźwigni, co często objawia się w widmie częstotliwości dźwigni w postaci wielu ostrych pików i dolin, powszechnie opisanych jako „las pików”. W rezultacie znalezienie prawidłowej częstotliwości wzbudzenia jest często trudne. Piki te występują również w środowiskach gazowych, jednak ze względu na wysoką wartość dobroci dźwigni, amplituda w rezonansach jest znacznie większa74,75. W cieczy wybór odpowiedniego piku do napędzania dźwigni może być utrudniony i może wymagać metody prób i błędów. W praktyce pik częstotliwości z najgwałtowniejszą zmianą amplitudy w „lesie pików” wokół częstotliwości rezonansowej jest zazwyczaj najlepszym wyborem, mimo że niekoniecznie pokrywa się on dokładnie z rezonansem, i często zapewnia częstotliwość wzbudzenia odpowiednią do uzyskania obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

Zniekształcenie obrazu

Dryft obrazowania jest często problemem podczas dążeń do uzyskania wysokiej rozdzielczości i sprawia, że obrazy wyglądają na zniekształcone (zazwyczaj rozciągnięte). Jego przyczyna jest zazwyczaj termiczna, wynikająca albo z faktu, że skaner/AFM nie osiągnął równowagi temperatury pracy, albo z szybkiego odparowywania części cieczy z próbki (np. podczas obrazowania w alkoholach). W każdym przypadku dryft staje się pomijalny w stanie równowagi termicznej. Dlategoż użyteczne jest, jeśli to możliwe, ustabilizowanie temperatury próbki. W przeciwnym razie warto pozostawić AFM do skanowania pustej próbki (skanowanie dużego obszaru przy niskiej prędkości skanowania) przez kilka godzin przed przeprowadzeniem eksperymentu. Jeśli odparowywanie nie stanowi problemu, procedurę tę najlepiej przeprowadzić po kroku 6 procedury, pamiętając o uprzednim wycofaniu końcówki na krótką odległość (np. 20 µm) od powierzchni. Sporadycznie dryft utrzymuje się nawet po długotrwałej termalizacji. Zazwyczaj wskazuje to, że wspornik lub jego chip częściowo przeciąga próbkę podczas obrazowania, co może zdarzyć się w przypadku miękkich, spójnych próbek, takich jak cienkie warstwy, lub gdy końcówka/wspornik/chip nie są odpowiednio umieszczone. Na chipach zawierających więcej niż jeden wspornik/końcówkę często pomocne jest odłamanie niewykorzystywanych wsporników, aby nie przeciągały one po powierzchni.

Siła jonowa

Ponieważ w obrazowaniu dominuje ciecz międzyfazowa, w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości naładowanej powierzchni w wodzie czasami pomocne jest dodanie soli. Rola soli jest dwutorowa. Po pierwsze, modyfikuje ona krajobraz hydratacji powierzchni obrazowanej podczas adsorpcji, co często zwiększa kontrast. Po drugie, pomaga ekranować silne oddziaływania elektrostatyczne między sondą a próbką (np. na miki). Zazwyczaj większe jony, takie jak potas, rubid i cez, pozwalają na uzyskanie lepszych obrazów ze względu na ich specyficzne właściwości hydratacyjne76 oraz fakt, że często adsorbują się głównie w jednym, konkretnym stanie hydratacji77.

Uszkodzony wspornik/igła

Jeśli istnieje podejrzenie, że belka jest źródłem zanieczyszczeń (patrz opisane powyżej objawy), należy ją najpierw zbadać pod mikroskopem optycznym. Jeśli belka była przechowywana w pudełku z żelem, mogą na niej osadzić się ślady polimerów żelowych lub oleju silikonowego59, które w skrajnych przypadkach mogą pojawić się jako ciemniejsze plamy na tylnej stronie belki (jak na Rysunku 5A). Oscylacje fototermiczne belki mogą wywoływać podobne plamy, jednak wynikają one z degradacji lub przegrzania powłoki belki przez laser wzbudzający. Zanieczyszczenia mają tendencję do pojawiania się na belce w sposób przypadkowy. Dłuższe (12-godzinne) czyszczenie izopropanolem, a następnie wodą ultrapure może usunąć z belki wszelkie niepożądane cząstki.

Analiza częstotliwości wspornika; schemat intensywności w funkcji częstotliwości porównujący nowe i stare wsporniki.
Rycina 5: Porównanie nowego wspornika z identycznym elementem, który był intensywnie użytkowany na twardych powierzchniach i pozostawiony w pudełku z żelem przez dłuższy czas. A: Góra; obraz optyczny fabrycznie nowego wspornika po oczyszczeniu (patrz procedura). Dół; obraz optyczny wykazujący obecność widocznego zanieczyszczenia (niebieska strzałka) z pudełka z żelem. B: Porównanie odpowiednich widm termicznych wsporników. Wyraźne jest poszerzenie pierwszego piku rezonansowego starego wspornika (zielona strzałka), a niektóre mody wyższego rzędu są wzmocnione (niebieska strzałka). Widma zostały przesunięte pionowo i przedstawione w skali logarytmicznej dla większej przejrzystości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Jeśli wymagana rozdzielczość subnanometryczna nie zostanie osiągnięta, mimo uzyskania akceptowalnych obrazów przy niższej rozdzielczości, możliwe jest, że końcówka AFM uległa modyfikacji chemicznej podczas przechowywania. Można temu zaradzić poprzez naświetlenie chipa z belką na utleniacz ultrafioletowy przez 120 s, co wspomaga tworzenie hydrofilowych grup powierzchniowych na końcówce60. Należy jednak zachować ostrożność, ponieważ dokładny czas naświetlania może się różnić w zależności od geometrii końcówki i mocy UV, a nadmierna ekspozycja może doprowadzić do stępienia końcówki i pogorszenia rozdzielczości.

Szum termiczny

Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości wymaga dużej czułości na zmiany siły i odległości (zazwyczaj siły poniżej pN i odległości poniżej Ångstrema78). W przypadku bardziej elastycznych belek zwierciadłowych problemem może być ruch termomechaniczny belki wynikający z jej wewnętrznego ruchu Browna (wibracji termicznych). W pierwszym przybliżeniu, dla belki o sztywności k, nie jest możliwe pomiar cech mniejszych niż Wzór na prędkość termiczną √(2kBT/k); równanie z kinetycznej teorii gazów; obliczenia fizyczne., co stanowi amplitudę szumu termicznego, gdzie kB to stała Boltzmanna, a T to temperatura. W praktyce zastosowanie belek o wyższych częstotliwościach rezonansowych rozkłada szum w szerszym zakresie częstotliwości i zmniejsza całkowity poziom szumu w pasmie pomiarowym79.

Obrazowanie wyższych modów własnych

Czasami może być przydatne uruchomienie wspornika w jego drugim modzie własnym ze względu na zwiększenie sztywności efektywnej (patrz omówienie zanieczyszczeń). W praktyce odbywa się to po prostu poprzez wzbudzenie wspornika w jego drugim modzie własnym (drugi pik rezonansowy przy wyższej częstotliwości, patrz Rysunek 1A). Podczas strojenia wspornika należy po prostu wybrać drugi mod własny zamiast rezonansu głównego i przejść do kroku 5.4. Należy pamiętać, że wartość InvOLS będzie inna, gdy wspornik jest wzbudzany w drugim modzie własnym; zazwyczaj wynosi ona około 1/3 wartości InvOLS zmierzonej w kroku 5.2 dla wspornika prostokątnego.

Głównym ograniczeniem tej techniki jest wymóg stabilnego krajobrazu solwatacji na powierzchni próbki. Próbka powinna być wystarczająco wytrzymała, aby umożliwić perturbację cieczy międzyfazowej bez wywoływania znacznych odkształceń samej próbki. Może to być problematyczne w przypadku próbek bardzo miękkich i niestabilnych, takich jak duże biomolekuły. Ponadto AFM z małą amplitudą, opisany w niniejszej pracy, nie pozwala na uzyskanie informacji mechanicznych o właściwościach próbki, ponieważ końcówka dźwigni spędza większość czasu w cieczy międzyfazowej. W tym celu korzystne może być zastosowanie innych podejść, takich jak Quantitative Nanomechanical Mapping80 lub wykorzystanie wyższych harmonicznych ruchu dźwigni. Wyższe harmoniczne są zazwyczaj wzmacniane podczas obrazowania w cieczy (przy niskich czynnikach dobroci)29,81-83 i mogą jednocześnie dostarczać informacji o topografii i sztywności próbek25,81-84, lecz zazwyczaj pogarszają one rozdzielczość. W tym przypadku nadal obowiązują inne ograniczenia właściwe dla wszystkich technik mikroskopii sondy skanującej, w szczególności fakt, że wyniki nieuchronnie zawierają informacje o końcówce pomiarowej. Stosowanie małych amplitud nie jest również idealne dla próbek z dużymi zmiennościami wysokości; pętla sprzężenia zwrotnego będzie nieuchronnie reagować wolniej, gdy zmiany wysokości będą większe niż amplituda obrazowania, co stwarza ryzyko uszkodzenia próbki i końcówki. Stosowanie bardziej giętkich dźwigni łagodzi ten problem w pewnym stopniu.

Główną zaletą zaprezentowanej tutaj metody jest fakt, że zapewnia ona najwyższą możliwą rozdzielczość obrazowania za pomocą AFM w cieczy, a jednocześnie może być wdrożona na dowolnym komercyjnym AFM, pod warunkiem, że poziomy szumów urządzenia są wystarczająco niskie. Porównywalną rozdzielczość na instrumentach komercyjnych osiąga się zazwyczaj w trybie kontaktowym, a sporadycznie w FM-AFM z użyciem sztywnych wsporników. Praca w trybie AM i z użyciem stosunkowo miękkich wsporników pozwala na szerszy wybór próbek i jest łatwiejsza do zaimplementowania w większości systemów niż FM-AFM. Podejście to opiera się na wykorzystaniu sił solwatacji występujących na granicy faz między dowolnym ciałem stałym a cieczą w celu zwiększenia rozdzielczości i uzyskania lokalnych informacji chemicznych. W zasadzie może być ono stosowane w warunkach otoczenia, polegając jedynie na warstwach wody (zazwyczaj o grubości kilku nanometrów) osadzających się na większości powierzchni ze względu na wilgotność powietrza. Zasady leżące u podstaw strategii wysokiej rozdzielczości pozostają niezmienione, jednak większość końcówki znajduje się w powietrzu, a między wierzchołkiem końcówki a próbką istnieje jedynie mostek kapilarny85. Wysoka rozdzielczość została wykazana na sztywnych próbkach w tych warunkach86,87. Warunki obrazowania różnią się jednak od tych w cieczy z powodu wyższego współczynnika Q oscylacji wspornika. W praktyce stwierdzono trudności w osiągnięciu stabilnej pracy na próbkach miękkich lub nieregularnych, co prawdopodobnie wynika z czasowych zmian mostka kapilarnego oraz zwiększonych współczynników Q dla danej sztywności wspornika.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu oferuje metodologię uzyskiwania obrazów próbek w cieczy z rozdzielczością na poziomie molekularnym przy użyciu większości nowoczesnych komercyjnych AM-AFM. Przedstawiamy naukowe uzasadnienie wyboru parametrów obrazowania i podkreślamy rolę sił solwatacji. Omówiliśmy również typowe problemy, a w szczególności kwestię zanieczyszczeń. Specyficzne oddziaływania między końcówką a próbką mogą się znacząco różnić w zależności od składu roztworu obrazującego, geometrii i materiału wspornika oraz chemii próbki. Praktyczne zrozumienie natury dominujących sił występujących podczas skanowania jest zatem niezbędne do dostosowania tego protokołu do nowych układów i zapewnienia wiarygodnych wyników. Po optymalizacji, podejście eksperymentalne to stanowi potężne narzędzie do uzyskiwania lokalnych wglądów na poziomie molekularnym in-situ dla próbek w roztworze.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wdzięczne są fundusze od Rady ds. Badań nad Naukami Inżynieryjnymi i Fizycznymi (granty 1452230 i EP/M023915/1), Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (grant BB/M024830/1) oraz Rady Europejskiej (7PR CIG 631186).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Multimode IIIA AFMBruckerNAJedna z używanych maszyn
Cypher ES AFMAsylum ResarchNAJedna z maszyn używanych
/ końcówka AFMNanoworldArrow UHF-AUDnajlepsza do
wysokiej częstotliwości Wspornik / końcówka AFMOlympusRC800-PSAwszechstronna i tania
woda ultraczystaMiliporeNAlaboratoryjne systemy filtrujące mogą indukować zanieczyszczenie
DimetylosulfotlenekSigma-Aaldrich200-664-3 standardowa substancja chemiczna, bez dalszego oczyszczania
Sole monowartościoweSigma-Aaldrichstandardowa substancja chemiczna, bez dalszego oczyszczania
LipidyAvanti Polar Lipidsutworzone przy użyciu standardowych protokołów
KryształyKryształy polerowane MTITaśma
klejąca3MTaśma Scotch Magic TapeNajlepiej sprawdza się taśma półprzezroczysta. Przezroczyste przykleja się zbyt mocno
Wspornik dwuwarstwy lipidowe

Bibliografia

  1. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical mapping of single membrane proteins at submolecular resolution. Nano Lett. 11 (9), 3983-3986 (2011).
  3. Payam, A. F., Ramos, J. R., Garcia, R. Molecular and nanoscale compositional contrast of soft matter in liquid: interplay between elastic and dissipative interactions. ACS Nano. 6 (6), 4663-4670 (2012).
  4. Grandbois, M. How Strong Is a Covalent Bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
  5. Oesterhelt, F. Unfolding Pathways of Individual Bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), 143-146 (2000).
  6. McLean, R. S., Doyle, M., Sauer, B. B. High-Resolution Imaging of Ionic Domains and Crystal Morphology in Ionomers Using AFM Techniques. Macromolecules. 33 (17), 6541-6550 (2000).
  7. Scheuring, S., Reiss-Husson, F., Engel, A., Rigaud, J. L., Ranck, J. L. High-resolution AFM topographs of Rubrivivax gelatinosus light-harvesting complex LH2. EMBO J. 20 (12), 3029-3035 (2001).
  8. Novoselov, K. S., et al. Two-dimensional atomic crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (30), 10451-10453 (2005).
  9. Freeman, M. R., Choi, B. C. Advances in magnetic microscopy. Science. 294 (5546), 1484-1488 (2001).
  10. Bockrath, M., et al. Scanned Conductance Microscopy of Carbon Nanotubes and λ-DNA. Nano Lett. 2 (3), 187-190 (2002).
  11. Oliver, R. A. Advances in AFM for the electrical characterization of semiconductors. Reports Prog. Phys. 71 (7), 076501(2008).
  12. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6 (1), 1-7 (1995).
  13. Majumdar, A., Carrejo, J. P., Lai, J. Thermal imaging using the atomic force microscope. Appl. Phys. Lett. 62 (20), 2501(1993).
  14. Vezenov, D. V., Noy, A., Ashby, P. Chemical force microscopy: probing chemical origin of interfacial forces and adhesion. J. Adhes. Sci. Technol. 19 (3-5), 313-364 (2005).
  15. Gerber, C., Lang, H. P. How the doors to the nanoworld were opened. Nat. Nanotechnol. 1 (1), 3-5 (2006).
  16. Bharat, B. Encyclopedia of Nanotechnology. , Springer Netherlands. Dordrecht. (2012).
  17. Giessibl, F. J. Subatomic Features on the Silicon (111)-(7x7) Surface Observed by Atomic Force Microscopy. Science. 289 (5478), 422-425 (2000).
  18. Haugstad, G. Atomic Force Microscopy. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2012).
  19. Moreno-Herrero, F., Colchero, J., Gòmez-Herrero, J., Barò, A. M. Atomic force microscopy contact, tapping, and jumping modes for imaging biological samples in liquids. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 69 (3), Pt 1 031915(2004).
  20. Gan, Y. Atomic and subnanometer resolution in ambient conditions by atomic force microscopy. Surf. Sci. Rep. 64 (3), 99-121 (2009).
  21. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
  22. Picco, L. M., et al. High-speed AFM of human chromosomes in liquid. Nanotechnology. 19 (38), 384018(2008).
  23. Fantner, G. E., et al. Components for high speed atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 106 (8-9), 881-887 (2006).
  24. Garcia, R., Herruzo, E. T. The emergence of multifrequency force microscopy. Nat. Nanotechnol. 7 (4), 217-226 (2012).
  25. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 809-814 (2011).
  26. Fukuma, T., Higgins, M. J., Jarvis, S. P. Direct imaging of individual intrinsic hydration layers on lipid bilayers at Angstrom resolution. Biophys. J. 92 (10), 3603-3609 (2007).
  27. Higgins, M. J., et al. Structured water layers adjacent to biological membranes. Biophys. J. 91 (7), 2532-2542 (2006).
  28. Kobayashi, K., Oyabu, N., et al. Visualization of hydration layers on muscovite mica in aqueous solution by frequency-modulation atomic force microscopy. J. Chem. Phys. 138 (18), 184704(2013).
  29. Voïtchovsky, K. Anharmonicity, solvation forces, and resolution in atomic force microscopy at the solid-liquid interface. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 88 (2), 022407(2013).
  30. Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat. Nanotechnol. 3 (5), 261-269 (2008).
  31. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Di Cerbo, A., Caramaschi, T., Facci, P. What do we really measure in AFM punch-through experiments on supported lipid bilayers. Soft Matter. 7 (15), 7054(2011).
  32. Schmidt, S., Biegel, E., Müller, V. The ins and outs of Na(+) bioenergetics in Acetobacterium woodii. Biochim. Biophys. Acta. 1787 (6), 691-696 (2009).
  33. Bippes, C. A., Muller, D. J. High-resolution atomic force microscopy and spectroscopy of native membrane proteins. Reports Prog. Phys. 74 (8), 086601(2011).
  34. Chada, N., et al. Glass is a Viable Substrate for Precision Force Microscopy of Membrane Proteins. Sci. Rep. 5, 12550(2015).
  35. Möller, C., Allen, M., Elings, V., Engel, A., Müller, D. J. Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces. Biophys. J. 77 (2), 1150-1158 (1999).
  36. Antoranz Contera, S., Voïtchovsky, K., Ryan, J. F. Controlled ionic condensation at the surface of a native extremophile membrane. Nanoscale. 2 (2), 222-229 (2010).
  37. Kumaki, J. Observation of polymer chain structures in two-dimensional films by atomic force microscopy. Polym. J. 48 (1), 3-14 (2015).
  38. Voïtchovsky, K., et al. In Situ Mapping of the Molecular Arrangement of Amphiphilic Dye Molecules at the TiO Surface of Dye-Sensitized Solar Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 10834-10842 (2015).
  39. Segura, J. J., et al. Adsorbed and near surface structure of ionic liquids at a solid interface. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (9), 3320-3328 (2013).
  40. Hayes, R., Warr, G. G., Atkin, R. Structure and Nanostructure in Ionic Liquids. Chem. Rev. 115 (13), 150601082109009(2015).
  41. Fukuma, T., Kobayashi, K., Matsushige, K., Yamada, H. True atomic resolution in liquid by frequency-modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 87 (3), 034101(2005).
  42. Voïtchovsky, K., Kuna, J. J., Contera, S. A., Tosatti, E., Stellacci, F. Direct mapping of the solid-liquid adhesion energy with subnanometre resolution. Nat. Nanotechnol. 5 (6), 401-405 (2010).
  43. Siretanu, I., et al. Direct observation of ionic structure at solid-liquid interfaces: a deep look into the Stern Layer. Sci. Rep. 4, 4956(2014).
  44. Ricci, M., Spijker, P., Voïtchovsky, K. Water-induced correlation between single ions imaged at the solid-liquid interface. Nat. Commun. 5, 4400(2014).
  45. Kiracofe, D., Raman, A. On eigenmodes, stiffness, and sensitivity of atomic force microscope cantilevers in air versus liquids. J. Appl. Phys. 107 (3), 033506(2010).
  46. San Paulo, A., Garcìa, R. High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes. Biophys. J. 78 (3), 1599-1605 (2000).
  47. Garcìa, R., San Paulo, A. Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy. Phys. Rev. B. 60 (7), 4961-4967 (1999).
  48. Butt, H. J. Electrostatic interaction in atomic force microscopy. Biophys. J. 60 (4), 777-785 (1991).
  49. Israelachvili, J. N. Intermolecular and Surface Forces. Intermol. Surf. Forces. , (2011).
  50. Yu, C. -J., et al. Order in molecular liquids near solid-liquid interfaces. Appl. Surf. Sci. 182 (3-4), 231-235 (2001).
  51. Ortiz-Young, D., Chiu, H. -C., Kim, S., Voïtchovsky, K., Riedo, E. The interplay between apparent viscosity and wettability in nanoconfined water. Nat. Commun. 4, 2482(2013).
  52. Patil, S. V., Hoffmann, P. M. Small-Amplitude Atomic Force Microscopy. Adv. Eng. Mater. 7 (8), 707-712 (2005).
  53. Fukuma, T., Jarvis, S. P. Development of liquid-environment frequency modulation atomic force microscope with low noise deflection sensor for cantilevers of various dimensions. Rev. Sci. Instrum. 77 (4), 043701(2006).
  54. Burkhardt, M., et al. Concept of a molecular charge storage dielectric layer for organic thin-film memory transistors. Adv. Mater. 22 (23), 2525-2528 (2010).
  55. Garcìa, R. Amplitude Modulation Atomic Force Microscopy. , Wiley: Weinheim. (2010).
  56. Uchihashi, T., et al. Quantitative force measurements in liquid using frequency modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 85 (16), 3575(2004).
  57. Yamada, H., et al. Molecular Resolution Imaging of Protein Molecules in Liquid Using Frequency Modulation Atomic Force Microscopy. Appl. Phys. Express. 2 (9), 095007(2009).
  58. Stark, M., et al. From Images to Interactions: High-Resolution Phase Imaging in Tapping-Mode Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 80 (6), 3009-3018 (2001).
  59. Lo, Y. -S., et al. Organic and Inorganic Contamination on Commercial AFM Cantilevers. Langmuir. 15 (19), 6522-6526 (1999).
  60. Akrami, S. M. R., Nakayachi, H., Watanabe-Nakayama, T., Asakawa, H., Fukuma, T. Significant improvements in stability and reproducibility of atomic-scale atomic force microscopy in liquid. Nanotechnology. 25 (45), 455701(2014).
  61. Meyer, G., Amer, N. M. Novel optical approach to atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 53 (12), 1045(1988).
  62. Alexander, S., et al. An atomic-resolution atomic-force microscope implemented using an optical lever. J. Appl. Phys. 65 (1), 164(1989).
  63. Green, C. P., et al. Normal and torsional spring constants of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 75 (6), 1988(2004).
  64. Cleveland, J. P., Manne, S., Bocek, D., Hansma, P. K. A nondestructive method for determining the spring constant of cantilevers for scanning force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 64 (2), 403(1993).
  65. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev. Sci. Instrum. 64 (7), 1868(1993).
  66. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 66 (7), 3789(1995).
  67. Ricci, M., Quinlan, R., Voitchovsky, K. No Title. Soft Matter. , Forthcoming (2016).
  68. Ricci, M., Spijker, P., Stellacci, F., Molinari, J. -F., Voïtchovsky, K. Direct visualization of single ions in the Stern layer of calcite. Langmuir. 29 (7), 2207-2216 (2013).
  69. Kilpatrick, J. I., Loh, S. -H., Jarvis, S. P. Directly probing the effects of ions on hydration forces at interfaces. J. Am. Chem. Soc. 135 (7), 2628-2634 (2013).
  70. Fukuma, T., et al. Mechanism of atomic force microscopy imaging of three-dimensional hydration structures at a solid-liquid interface. Phys. Rev. B. 92 (15), 155412(2015).
  71. Maula, T., Westerlund, B., Slotte, J. P. Differential ability of cholesterol-enriched and gel phase domains to resist benzyl alcohol-induced fluidization in multilamellar lipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (11), 2454-2461 (2009).
  72. Schroeder, F., Morrison, W. J., Gorka, C., Wood, W. G. Transbilayer effects of ethanol on fluidity of brain membrane leaflets. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 946 (1), 85-94 (1988).
  73. Tierney, K. J., Block, D. E., Longo, M. L. Elasticity and phase behavior of DPPC membrane modulated by cholesterol, ergosterol, and ethanol. Biophys. J. 89 (4), 2481-2493 (2005).
  74. Basak, S., Raman, A. Dynamics of tapping mode atomic force microscopy in liquids: Theory and experiments. Appl. Phys. Lett. 91 (6), 064107(2007).
  75. Eslami, B., Solares, S. D. Experimental approach for selecting the excitation frequency for maximum compositional contrast in viscous environments for piezo-driven bimodal atomic force microscopy. J. Appl. Phys. 119 (8), 084901(2016).
  76. Collins, K. D., Neilson, G. W., Enderby, J. E. Ions in water: characterizing the forces that control chemical processes and biological structure. Biophys. Chem. 128 (2-3), 95-104 (2007).
  77. Lee, S. S., Fenter, P., Park, C., Sturchio, N. C., Nagy, K. L. Hydrated cation speciation at the muscovite (001)-water interface. Langmuir. 26 (22), 16647-16651 (2010).
  78. Liang, S., et al. Thermal noise reduction of mechanical oscillators by actively controlled external dissipative forces. Ultramicroscopy. 84 (1-2), 119-125 (2000).
  79. Hodges, A. R., Bussmann, K. M., Hoh, J. H. Improved atomic force microscope cantilever performance by ion beam modification. Rev. Sci. Instrum. 72 (10), 3880(2001).
  80. Adamcik, J., Berquand, A., Mezzenga, R. Single-step direct measurement of amyloid fibrils stiffness by peak force quantitative nanomechanical atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 98 (19), 193701(2011).
  81. Preiner, J., Tang, J., Pastushenko, V., Hinterdorfer, P. Higher harmonic atomic force microscopy: imaging of biological membranes in liquid. Phys. Rev. Lett. 99 (4), 046102(2007).
  82. Dulebo, A., et al. Second harmonic atomic force microscopy imaging of live and fixed mammalian cells. Ultramicroscopy. 109 (8), 1056-1060 (2009).
  83. Xu, X., Melcher, J., Basak, S., Reifenberger, R., Raman, A. Compositional contrast of biological materials in liquids using the momentary excitation of higher eigenmodes in dynamic atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. 102 (6), 060801(2009).
  84. Turner, R. D., Kirkham, J., Devine, D., Thomson, N. H. Second harmonic atomic force microscopy of living Staphylococcus aureus bacteria. Appl. Phys. Lett. 94 (4), 043901(2009).
  85. Barcons, V., Verdaguer, A., Font, J., Chiesa, M., Santos, S. Nanoscale Capillary Interactions in Dynamic Atomic Force Microscopy. J. Phys. Chem. C. 116 (14), 7757-7766 (2012).
  86. Wastl, D. S., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomically resolved graphitic surfaces in air by atomic force microscopy. ACS Nano. 8 (5), 5233-5239 (2014).
  87. Wastl, D. S., Judmann, M., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomic Resolution of Calcium and Oxygen Sublattices of Calcite in Ambient Conditions by Atomic Force Microscopy Using qPlus Sensors with Sapphire Tips. ACS Nano. 9 (4), 3858-3865 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

AFM z modulacj amplitudyobrazowanie w cieczyoptymalizacja wspornikaprzygotowanie pr bkiwysokorozdzielczy AFMparametry obrazowaniaoddzia ywanie ko c wka pr bkauwodniony interfejs ciek y
Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.