Obrazowanie w rozdzielczości subnanometrowej z mikroskopią sił atomowych z modulacją amplitudy w cieczy

Summary

Prezentujemy metodę uzyskiwania obrazów o rozdzielczości subnanometrowej za pomocą mikroskopii sił atomowych z modulacją amplitudy (tryb stukania) w cieczy. Metodę zademonstrowano na komercyjnych mikroskopach sił atomowych. Wyjaśniamy powody naszego wyboru parametrów i sugerujemy strategie optymalizacji rozdzielczości.

Abstract

Mikroskopia sił atomowych (AFM) stała się dobrze znaną techniką obrazowania próbek w nanoskali w powietrzu i cieczy. Ostatnie badania wykazały, że podczas pracy w trybie modulacji amplitudy (stukania) obrazy o rozdzielczości atomowej lub molekularnej można uzyskać na szerokim zakresie miękkich i twardych próbek w cieczy. W takich sytuacjach małe amplitudy oscylacji (SAM-AFM) zwiększają rozdzielczość poprzez wykorzystanie zasolwatowanej cieczy na powierzchni próbki. Chociaż technika ta jest z powodzeniem stosowana w tak różnych dziedzinach, jak materiałoznawstwo, biologia i biofizyka oraz chemia powierzchni, uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości w cieczy może nadal stanowić wyzwanie dla początkujących użytkowników. Wynika to częściowo z dużej liczby zmiennych, które należy kontrolować i optymalizować, takich jak wybór wspornika, przygotowanie próbki i prawidłowa manipulacja parametrami obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy protokół uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości twardych i miękkich próbek w płynie za pomocą SAM-AFM na komercyjnym instrumencie. Naszym celem jest dostarczenie praktycznego przewodnika krok po kroku, jak uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, w tym czyszczenie i przygotowanie aparatury i próbki, wybór wspornika i optymalizację parametrów obrazowania. Na każdym etapie wyjaśniamy naukowe uzasadnienie naszych wyborów, aby ułatwić dostosowanie metodologii do konkretnego systemu każdego użytkownika.

Introduction

Od czasu swojego wynalezienia, trzy dekady temu, mikroskopia sił atomowych (AFM)¹ stała się preferowaną techniką do badania próbek w nanoskali, zwłaszcza tam, gdzie uśrednianie na makroskopowych powierzchniach nie jest możliwe i wymagane są informacje lokalne. W typowym pomiarze AFM ugięcie elastycznego wspornika jest wykorzystywane do ilościowego określenia siły oddziaływania między niewielką liczbą cząsteczek a ultraostrą końcówką zamontowaną na końcu wspornika. W zależności od rodzaju oddziaływań i rozważanych skal czasowych można uzyskać szeroki zakres informacji, w tym właściwości lepkosprężyste miękkich błon biologicznych^2,3, siłę pojedynczego wiązania chemicznego lub molekularnego^4,5, atomowe szczegóły powierzchni ^6-8, magnetyczne⁹, pojemnościowe¹⁰, przewodzące¹¹, termiczne^12,13 i chemiczne¹⁴ właściwości próbek¹⁵. Częścią sukcesu AFM jest jego zdolność do pracy z szeroką gamą materiałów¹⁶ i w wielu środowiskach, takich jak próżnia¹⁷, gaz^11,18 lub ciecz^19,20, ponieważ nie opiera się na określonej sile między sondą a próbką.

W praktyce jednak, obsługa AFM w warunkach innych niż otoczenie może być wyzwaniem, a wiele opublikowanych wyników nadal uzyskuje się w powietrzu. Dodatkową trudnością jest fakt, że zwykle konieczne jest działanie AFM w trybie dynamicznym (końcówka wibracyjna), aby zachować zarówno końcówkę, jak i próbkę, unikając dużych sił tarcia. Chociaż jest to bardziej wymagające, dynamiczne działanie może w zasadzie dostarczyć więcej informacji o analizowanej próbce i bez utraty rozdzielczości przestrzennej. W ciągu ostatniej dekady w dziedzinie dynamicznego AFM w cieczach nastąpił ważny rozwój, od pojawienia się AFM ^21-23 z szybkością wideo, po pomiary wieloczęstotliwościowe^24,25 i subnanometrowe obrazowanie struktur hydratacyjnych na granicy faz^26-31. Działanie AFM zanurzone w cieczy jest obecnie rutynowo stosowane w biologii i biofizyce^32-36, badaniach polimerów³⁷, elektrochemii^38-40 i charakterystyce granicy faz ciało stałe-ciecz^41-44. Obecność cieczy wokół wibrującego wspornika znacząco zmienia jego dynamikę⁴⁵, jak również interakcję między końcówką a próbką^29,42. Przy odpowiednim użyciu ciecz może być wykorzystana do zwiększenia rozdzielczości^{obrazowania 26,29}, z typową poprawą prawie prawie o rząd wielkości w porównaniu z najlepszą rozdzielczością osiągniętą w warunkach otoczenia⁴⁶.

W AFM najwyższa rozdzielczość przestrzenna osiągalna dla danego pomiaru zależy zarówno od jakości samego AFM, jak i od charakteru badanej interakcji^20,47,48. W chwili obecnej większość wysokiej klasy, dostępnych na rynku AFM charakteryzuje się poziomem hałasu zbliżonym do limitu termicznego¹², więc czynnikiem decydującym o rozdzielczości jest zwykle interakcja końcówka-próbka. W rzeczywistości to gradient przestrzenny tej interakcji determinuje rozdzielczość: pomiary oparte na oddziaływaniach krótkiego zasięgu, szybko zanikających, dają wyniki o wyższej rozdzielczości niż w przypadku oddziaływań o dłuższym zasięgu. W cieczy siły solwatacji mogą poprawić rozdzielczość obrazowania, ponieważ mają tendencję do zanikania tylko na kilku średnicach molekularnych cieczy (zwykle < 1 nm) podczas oddalania się od powierzchni próbki⁴⁹. Siły te wynikają z interakcji między cząsteczkami cieczy a powierzchnią próbki. Ciecz o silnym powinowactwie do powierzchni będzie miała tendencję do bycia bardziej uporządkowaną i mniej ruchliwą niż ciecz luzem na granicy faz z próbką^29,42,50. W rezultacie, wibrująca końcówka AFM będzie potrzebowała więcej energii, aby przemieścić międzyfazowe cząsteczki cieczy niż masowa ciecz⁴², co sprawi, że pomiar będzie bardzo czuły na lokalne zmiany właściwości cieczy międzyfazowych w nanoskali - krajobrazie solwatacji.

Aby wykorzystać siły solwatacji, należy wziąć pod uwagę kilka praktycznych aspektów. Po pierwsze, amplituda oscylacji końcówki musi być porównywalna z zakresem sił solwatacji, zwykle < 1 nm. Po drugie, użyta ciecz musi tworzyć dobrze zdefiniowany krajobraz solwatacji na powierzchni próbki. W skali makroskopowej jest to równoznaczne z wymogiem "zwilżania" cieczy dla rozważanej próbki. Na przykład w wodzie łatwiej jest osiągnąć rozdzielczość na poziomie molekularnym na mice hydrofilowej niż na hydrofobowym graficie^42,51. Na koniec należy odpowiednio dobrać stałą sprężystości wspornika podpierającego końcówkę^52,53. Podczas pracy w tych warunkach AFM nie tylko dostarcza obrazy granicy faz na poziomie molekularnym, ale także uzyskuje informacje o lokalnym powinowactwie próbka-ciecz, które można wykorzystać do uzyskania informacji chemicznych o powierzchni próbki⁵⁴.

Najczęstszymi dynamicznymi trybami pracy dla AFM w cieczy są modulacja amplitudy (AM, również 'tryb stukania') AFM i modulacja częstotliwości (FM) AFM. W pierwszym przypadku⁵⁵ raster końcówki skanuje próbkę, podczas gdy jej amplituda drgań jest utrzymywana na stałym poziomie przez pętlę sprzężenia zwrotnego, która w sposób ciągły dostosowuje odległość końcówka-próbka. Obraz topograficzny próbki uzyskuje się z poprawki zastosowanej przez pętlę sprzężenia zwrotnego. W FM-AFM^28,41,56 jest to częstotliwość oscylacji wspornika/końcówki, która jest utrzymywana na stałym poziomie, podczas gdy końcówka skanuje próbkę. Obie techniki zapewniają porównywalną rozdzielczość topograficzną w cieczy^36,57. Kwantyfikacja interakcji końcówka-próbka wydaje się być prostsza i dokładniejsza w FM-AFM, ale AM-AFM jest łatwiejszy do wdrożenia, bardziej wytrzymały i umożliwia pracę z bardziej miękkimi wspornikami, co jest przydatne do badania łatwo odkształcalnych lub delikatnych próbek. Co istotne, AM-AFM jest bardziej rozpowszechniony wśród użytkowników AFM, częściowo ze względów historycznych, ale także ze względu na fakt, że jest technicznie łatwiejszy do kontrolowania.

Chociaż amplituda jest utrzymywana na stałym poziomie przez pętlę sprzężenia zwrotnego podczas obrazowania AM-AFM, opóźnienie fazowe między oscylacją końcówki a oscylacją napędową może się swobodnie zmieniać. Opóźnienie fazowe może dostarczyć użytecznych informacji na temat interakcji końcówka-próbka, związanych z energią rozpraszaną podczas oscylacji końcówki na styku z próbką⁵⁸. W związku z tym obrazowanie fazowe może być uzyskiwane jednocześnie z obrazowaniem topograficznym i często jest komplementarne w podkreślaniu niejednorodności powierzchni próbki. Obrazowanie fazowe zostało wykorzystane do różnych mapowań interakcji, w tym do bezpośredniego mapowania energii adhezji⁴², właściwości lepkosprężystych⁵⁸ i krajobrazu hydratacji granicy faz⁴⁴.

Praktycznie, uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości w płynie pozostaje nietrywialne ze względu na dużą liczbę parametrów do kontrolowania oraz brak prostego, systematycznego protokołu, który działa w każdej sytuacji. Jakość obrazu zazwyczaj zależy między innymi od geometrii i elastyczności wspornika, składu chemicznego końcówki, amplitudy oscylacji i sztywności próbki⁵⁵. Pomiary AFM są również z definicji perturbacyjne dla systemu. W rezultacie, zmiana zmiennych obrazowania i warunków środowiskowych bez odpowiednich rozważań może prowadzić do trudności w odtwarzalności i/lub błędnych obserwacji i fałszywych wyników.

Tutaj prezentujemy nasz protokół do uzyskiwania obrazów o wysokiej rozdzielczości twardych i miękkich próbek w roztworze, przy użyciu komercyjnych instrumentów działających w modulacji amplitudy. Naszym celem jest zaoferowanie praktycznej procedury optymalizacji głównych parametrów, które mogą mieć wpływ na rozdzielczość dla różnych próbek, wyjaśniając w każdym przypadku uzasadnienie naszych wyborów na podstawie zasad fizycznych leżących u podstaw procesu obrazowania. Szczegółowo opisujemy podejście krok po kroku, od czyszczenia i przygotowania podłoża, po wybór wspornika, regulację parametrów obrazowania i rozwiązywanie typowych problemów. Wyjaśnienie naukowych przesłanek stojących za naszymi wyborami i procedurami dotyczącymi wysokiej rozdzielczości powinno pomóc w dokonywaniu racjonalnych wyborów podczas dostosowywania metodologii i służyć jako punkt wyjścia dla nowych systemów obrazowania.

W całym tym tekście używamy AM w odniesieniu do trybu pracy modulacji amplitudy AFM. Jako wartość zadaną odnosimy się do parametru sprzężenia zwrotnego, który jest utrzymywany na stałym poziomie podczas ugięcia wspornika (tryb kontaktowy) lub amplitudy oscylacji (tryb AM). W trybie AM wspornik jest napędzany zewnętrznie albo przez oscylację akustyczną, albo przez impulsowy laser skupiony u podstawy wspornika. Amplituda napędu to natężenie zewnętrznego sygnału oscylacyjnego. Bezwzględna wartość amplitudy napędu wymaganej do osiągnięcia danej amplitudy oscylacji wspornika zależy od wielu parametrów, takich jak sposób jazdy (akustyczny, fototermiczny lub magnetyczny), mocowanie wspornika i parametry (sztywność, geometria) oraz osiowanie lasera. Dokładna wartość amplitudy napędu nie jest zatem istotna, ale jest dostosowywana w każdym doświadczeniu tak, aby zapewnić odpowiednią (i wymierną) amplitudę oscylacji wspornika. Gdy napędzany wspornik znajduje się daleko od próbki i nie występuje tłumienie jego drgań w wyniku interakcji końcówka-próbka, jego amplituda oscylacji nazywana jest amplitudą swobodną. Gdy wibrująca końcówka zbliża się do powierzchni próbki, jej amplituda zaczyna się zmniejszać. Jeśli sprzężenie zwrotne jest włączone, z-piezo będzie stale dostosowywać swoje wydłużenie tak, aby wyciszyć wybraną amplitudę wartości zadanej, stałą. Wartość zadana jest zwykle zawsze mniejsza niż amplituda swobodna. Powszechne jest odniesienie do współczynnika wartości zadanej, stosunku amplitudy wartości zadanej (amplitudy obrazowania) do amplitudy swobodnej. Im mniejszy współczynnik wartości zadanej, tym trudniejsze są warunki obrazowania.

Protocol

1. Czyszczenie narzędzi i innych powierzchni

UWAGA: Dążąc do wysokiej rozdzielczości, każda forma zanieczyszczenia może mieć szkodliwe konsekwencje. Dlatego konieczne jest upewnienie się, że wszystkie narzędzia używane do manipulowania próbką, podłożem lub końcówkami AFM są dokładnie oczyszczone. Poniższe informacje dotyczą każdej powierzchni lub przyrządu (np. pęsety), które mogą mieć kontakt z próbką, wspornikiem lub komórką AFM, w tym samego stolika na próbkę.

1. Instrumenty należy poddać sonikacji w kąpieli w ultraczystej wodzie (18,2 MΩ, <5 ppm substancji organicznych), następnie izopropanolu (czystość 99,7%), a następnie ponownie ultraczystej wodzie, każdy przez 10 minut. Jeśli to możliwe, używaj izopropanolu pod wyciągiem, aby zmniejszyć wdychanie oparów.
2. Suszyć pod strumieniem azotu.
3. Jeśli pełne zanurzenie nie jest możliwe (np. w przypadku uchwytu wspornikowego/elektroniki), należy fizycznie oczyścić powierzchnię, przecierając kolejno jednowarstwowymi chusteczkami o niskiej zawartości kłaczków (lekkie wycieraczki do chusteczek) nasączonymi wodą ultraczystą, izopropanolem i wodą ultraczystą. Pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu (zwykle w ciągu 15 do 30 minut).

2. Przygotowanie podłoża

UWAGA: Podłoże oznacza powierzchnię ciała stałego, na której bezpośrednio opierają się próbki, zwykle w fizycznym kontakcie zarówno ze skanerem AFM, jak i z próbką. Większość AFM ma mocowanie magnetyczne i można używać stalowych dysków, ale ten sam protokół jest również odpowiedni dla podłoży takich jak szkiełka. Tutaj zakładamy, że jest to stalowy dysk, na którym przymocowany jest krążek miki. Celem tej procedury jest ograniczenie w jak największym stopniu zewnętrznych źródeł zanieczyszczeń, które mogą wpływać na obrazowanie. Rękawiczki muszą być noszone przez cały czas.

1. Szklany krążek próbki należy poddać sonikacji w kąpieli w wodzie ultraczystej (18,2 MΩ), następnie izopropanolu, a na koniec ponownie wodzie ultraczystej, każda przez 10 minut.
2. Wysuszyć krążki pod strumieniem azotu.
3. Przygotuj niewielką ilość kleju epoksydowego z dokładnie wymieszanymi odczynnikami i umieść ~10 μl na stalowym krążku.
4. Przymocuj podłoże (mikę muskowitową, kryształ SiO₂, szkło itp.) do stalowego dysku, wywierając nacisk na podłoże. Pozostaw żywicę epoksydową do utwardzenia przez kilka godzin w podwyższonej temperaturze (patrz specyfikacje producenta).
5. Upewnij się, że żadna żywica epoksydowa nie jest bezpośrednio wystawiona na działanie powietrza, wokół krawędzi podłoża. Stanie się tak, jeśli zostanie użyta nadmierna ilość żywicy epoksydowej i może stać się źródłem zanieczyszczenia.
   1. W przypadku podłoża z miki mocno dociśnij taśmę klejącą o szerokości ~2,5 cm do podłoża, tak aby cała twarz była pokryta, a następnie delikatnie ją odklej. Użyj delikatnie klejącej taśmy i obierz mikę, ciągnąc równolegle do powierzchni. Usunięty materiał jest widoczny na taśmie. Powtórz ten proces 2-3 razy, aż mika będzie gładka jak lustro w stosunku do oka.
   2. W przypadku szkła/SiO₂, jeśli wymagana jest dalsza chemiczna modyfikacja powierzchni, należy powtórzyć procedurę sonikacji kąpieli z kroków 2.1-2.2. Alternatywnie użyj urządzenia do ekspozycji UV (lampy bakteriobójcze UV-C o mocy 18 W) na 30-60 minut, w zależności od mocy), aby poddać pirolizie wszelkie substancje organiczne, które mogą pozostać na powierzchni. Ta procedura sprawia również, że powierzchnia jest bardziej hydrofilowa bez znacznego zwiększania chropowatości.

3. Przygotowanie wspornika i końcówki

1. Zanurz wiór wspornikowy w kąpieli z izopropanolem, a następnie w ultraczystej wodzie, każdy na 60 minut.
2. Jeśli wspornik/końcówka wymaga intensywnego czyszczenia (np. po długotrwałym przechowywaniu w pudełku żelowym), dodaj 30-minutowe moczenie w acetonie (> czystości 99,5%) przed krokiem 1 (patrz również rozdział dotyczący zanieczyszczenia). Z naszego doświadczenia wynika, że przechowywanie końcówek w pudełkach żelowych jest jednym z głównych źródeł zanieczyszczeń, które mogą wystąpić bardzo szybko⁵⁹.
3. Wystaw końcówkę na krótko na działanie światła UV (<5 min), aby sprzyjać tworzeniu stabilnych miejsc nawodnienia⁶⁰. Unikaj dłuższych czasów prześwietlenia, ponieważ może to uszkodzić końcówkę lub zwiększyć jej promień krzywizny.
4. Włóż wspornik do uchwytu wspornika AFM i odpipetuj ~50 μl roztworu do obrazowania (charakter roztworu będzie zależał od badanej próbki, ale w tym przypadku użyj 10 mM roztworu chlorku rubidu w ultraczystej wodzie) na wspornik i przechylić, aby go wstępnie zwilżyć; ograniczy to pojawianie się pęcherzyków powietrza podczas zbliżania się do próbki.

4. Konfiguracja komórki AFM

1. Zamontuj krążek z próbką i podłoże na stoliku próbki i dodaj kroplę płynu do obrazowania (ciecz zwykle o grubości 2-3 mm w najwyższym punkcie).
2. Podłącz uchwyt wspornika do AFM.
3. Zbliżyć wspornik i próbkę do siebie, tak aby utworzyć mostek kapilarny między płynami na wsporniku/końcówce a próbką.

5. Inicjalizacja pomiaru i kalibracji wspornika

1. Ustaw laser pomiarowy (zwykle czerwony) blisko końcówki wspornika. W zależności od modelu AFM można to zrobić za pomocą oprogramowania lub ręcznej regulacji położenia lasera. Uzyskaj widmo termiczne wspornika w cieczy (patrz rysunek 1A). Proces ten rejestruje fluktuacje termiczne wspornika za pomocą lasera, w celu znalezienia częstotliwości głównego rezonansu wspornika (podstawowy tryb własny). W większości nowoczesnych AFM odbywa się to za pomocą zautomatyzowanych procedur w oprogramowaniu sterującym, ale szczegóły mogą się różnić w zależności od AFM.

Rysunek 1: Strojenie i kalibracja wspornika. A: Widmo szumu termicznego pionowego ugięcia wspornika (czarne) z prostym dopasowaniem oscylatora harmonicznego (SHO) do podstawowej postaci własnej (czerwonej). Tutaj rezonans wynosi 18,7 kHz w wodzie. Pierwsze trzy częstotliwości rezonansowe, które odpowiadają pierwszym trzem modom własnym przy zginaniu, są podświetlone niebieskimi strzałkami. B: Kalibracja odwrotnej czułości dźwigni optycznej wspornika. Odchylenie liniowe wspornika dociśniętego do sztywnej (nieodkształcalnej) powierzchni służy do pomiaru współczynnika konwersji (InvOLS) między ugięciem mierzonym w woltach a odpowiednią wartością w nanometrach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Zapisać krzywą ugięcia w funkcji odległości z wysięgnikiem na sztywnym podłożu (np. mice lub szkle) i skalibrować ugięcie, nakładając, że nachylenie krzywej w obszarze ugięcia liniowego (jak na rysunku 1B) wynosi jedność^61-63,
   UWAGA: W tym procesie znajduje się współczynnik konwersji między zmierzonym ugięciem na fotodetektorze (w woltach) a rzeczywistym ugięciem wspornika (w nanometrach) — znanym jako odwrotna czułość dźwigni optycznej (InvOLS). Kalibracja może uszkodzić końcówkę, dlatego lepiej przeprowadzić ją po zakończeniu wszystkich pomiarów. Użyj wartości InvOLS wyznaczonej dla innego wspornika tego samego typu podczas poprzedniego eksperymentu, aby uzyskać oszacowanie (zwykle z dokładnością >90%) rzeczywistej amplitudy przed kalibracją.
3. Dopasuj pik rezonansowy w widmie termicznym za pomocą prostego oscylatora harmonicznego model ^64-66, aby uzyskać stałą sprężystości wspornika. Procedura ta jest zautomatyzowana w większości programów AFM i zwykle nie wymaga specjalistycznej wiedzy na temat danego modelu.
4. Dostrój wspornik. Znajdź odpowiedź amplitudową wspornika, gdy jest napędzany zewnętrznie (np. akustycznie lub przez wzbudzenie fototermiczne) w zakresie częstotliwości zbliżonych do jego nominalnej częstotliwości rezonansowej. Ustaw częstotliwość jazdy na bliską maksimum w tym spektrum, nieco w lewo. Jeśli wspornik jest napędzany akustycznie, podczas strojenia może pojawić się wiele fałszywych maksimów.
   1. Wybierz pik rezonansowy jak najbliżej (i w obwiedni) rezonansu zidentyfikowanego w widmie termicznym (i w jego obwiedni) za pomocą oprogramowania sterującego AFM, ale szczegóły mogą zależeć od typu i wersji oprogramowania, które steruje AFM.

6. Podejście i wstępna kontrola próbki

1. Ustaw amplitudę sterowania tak, aby amplituda drgań swobodnych wynosiła około 5 nm. Zazwyczaj odpowiada to 0,2-0,8 V w większości AFM (w przypadku, gdy InvOLS nie jest skalibrowany). Ustaw nastawę amplitudy na ~80% wolnej amplitudy.
2. Ustaw zyski sprzężenia zwrotnego stosunkowo wysoko (wartość bezwzględna zależy od AFM), ale upewnij się, że nie występuje niestabilność ani dzwonienie.
3. Ustaw początkową częstotliwość skanowania i rozmiar skanowania na małe wartości (np. odpowiednio na ~1 Hz i 10 nm). Pomaga to zachować końcówkę w przypadku, gdy niektóre parametry sprzężenia zwrotnego są źle dostosowane, unikając skanowania na duże odległości. Rozmiar skanowania można następnie zwiększyć do większej wartości (np. 100 nm), jeśli warunki skanowania wydają się odpowiednie.
4. Określ przybliżoną wysokość powierzchni (w niektórych przypadkach należy to zrobić optycznie) przed podejściem.
5. Zainicjuj zbliżanie się końcówki do powierzchni za pomocą oprogramowania sterującego AFM. Drobne szczegóły tego procesu będą zależeć od modelu AFM i używanego oprogramowania.
   1. Jeśli występują problemy z podejściem podczas korzystania z miękkiego wspornika, przeprowadź podejście w trybie kontaktowym. W takim przypadku należy upewnić się, że wzmocnienia są niższe niż w trybie AM i ustawić wartość zadaną na stosunkowo niską wartość (0,1-0,2 V po wyśrodkowaniu lasera na fotodetektorze), aby zachować końcówkę.
   2. Oceń, czy końcówka dotarła do powierzchni bez rozpoczynania obrazowania, nieznacznie zmieniając wartość zadaną (wzrost w trybie kontaktu lub spadek w trybie AM). Jeśli końcówka znajduje się na powierzchni, wpływ na przedłużenie Z-piezo powinien być znikomy. Ruchy na żywo Z-piezo są zwykle wyświetlane graficznie w oprogramowaniu sterującym większości AFM. Jeśli zmiana wartości zadanej wyzwala widoczny ruch piezo, oznacza to fałszywe włączenie. W tym drugim przypadku należy ponownie rozpocząć podejście od bieżącej pozycji końcówki, używając nieco wyższej (kontakt) lub niższej (AM) wartości zadanej.
6. Gdy końcówka dotrze do powierzchni, wycofaj Z-piezo (zwykle po prostu naciskając "stop") i ponownie dostrój wspornik (powtórz krok 5.4.); częstotliwość rezonansowa prawdopodobnie przesunie się do niższej wartości z powodu interakcji końcówka-próbka.
7. Zmień nastawę na ~80% nowo dostrojonej amplitudy swobodnej (w tej odległości końcówka-próbka).
8. Włącz wspornik i przeprowadź skanowanie powierzchni 10×10^nm2 w trybie AM, aby sprawdzić, czy parametry obrazowania są odpowiednie.
   1. Sprawdź, czy profile śledzenia (skanowanie od lewej do prawej) i ponownego śledzenia (skanowanie od prawej do lewej) nakładają się na siebie. Jeśli nie, zmniejsz wartość zadaną i spróbuj zwiększyć wzmocnienie.
   2. Zmniejsz wzmocnienia, jeśli obraz staje się zaszumiony.
9. Powtórzyć operację z dużym skanem próbki — 1×1 μm² do 5×5 μm² — o ile jest to możliwe. W przypadku próbek miękkich lub biologicznych może to spowodować zanieczyszczenie końcówki.

7. Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości

1. Zmniejsz rozmiar skanu do wartości odpowiedniej do wizualizacji cech (np. 100×100 nm² dla kryształów białka lub 20×20 nm² dla miki lub kalcytu).
2. Zmniejsz amplitudę napędu wspornika na tyle, aby pętla sprzężenia zwrotnego automatycznie cofnęła Z-piezoelektryczny, a tym samym końcówkę od powierzchni. Gdy wspornik znajduje się z dala od powierzchni, wyreguluj amplitudę napędu tak, aby amplituda wspornika wynosiła ~1-2 nm (peak-to-peak).
3. Korzystając z oprogramowania sterującego AFM, stopniowo zmniejszaj wartość zadaną o kilkadziesiąt mV na raz, aż Z-piezo ponownie rozciągnie się w kierunku powierzchni i zostanie odzyskany oryginalny obraz. Utrzymuj amplitudę wartości zadanej między 75% a 95% nowej amplitudy swobodnej.
4. Ponownie wyreguluj wzmocnienia za pomocą oprogramowania sterującego AFM; wyższe wzmocnienia mogą być używane przy niższych amplitudach bez wprowadzania znacznego szumu.
   1. Powtórz kroki 7.2-7.4, aby określić najlepszą kombinację swobodnej amplitudy, wartości zadanej i wzmocnienia dla uzyskania wysokiej rozdzielczości. Optymalne warunki zależą od próbki (krajobraz solwatacji i właściwości zwilżające cieczy), ale także od wspornika (stała sprężystości, sztywność).
   2. Eksploruj różne kombinacje amplitud, aby zoptymalizować warunki obrazowania. Może być konieczne ponowne zwiększenie amplitudy swobodnej⁴². W takim przypadku należy najpierw ustawić wartość zadaną na wyższą wartość, a następnie zwiększyć napęd (tj. procedura odwrotna niż stosowana do zmniejszania amplitudy).
   3. Utrzymuj amplitudę wartości zadanej w zakresie 0,5 nm - 1,5 nm (szczyt do szczytu) przy współczynnikach wartości zadanych utrzymywanych powyżej 0,7 (zwykle 0,75-0,95). W przypadku granic faz solvofilnych należy stosować wsporniki o stałej sprężystości 0,5 - 2 N/m. Jest to wystarczające, aby końcówka usunęła większość płynu międzyfazowego bez uderzania w powierzchnię. Praktyczna zasada jest zaproponowana w równaniu 4 odnośnika²⁹.

Results

Protokół opisany w poprzedniej sekcji został z powodzeniem zastosowany w kilku komercyjnych AFM w celu uzyskania obrazów na poziomie molekularnym lub atomowym. Wszystkie obrazy uzyskano z amplitudami roboczymi w zakresie od 0,5 nm do 1,5 nm regulowanymi indywidualnie zgodnie z krokami procedury 7.1-7.4. Wyniki można uzyskać dla szerokiego zakresu próbek miękkich (rysunek 2) i sztywnych (rysunek 3). W każdym przypadku wyróżnione są interesujące cechy. Jedną z największych zalet tej techniki jest to, że małe amplitudy oscylacji i wysokie wartości zadane minimalizują siłę wywieraną przez końcówkę na próbkę, umożliwiając obrazowanie delikatnych samoorganizacji lipidów (ryc. 2A), białek (ryc. 2B i D) i cząsteczek amfifilowych (ryc. 2C) bez uszkodzenia roztworu. Twardsze materiały krystaliczne, takie jak minerały (ryc. 3A, B, D) i pojedyncze jony metali zaadsorbowane na powierzchni (ryc. 3C), można obrazować przy użyciu tego podejścia, ponieważ w każdym przypadku to ciecz międzyfazowa jest skutecznie obrazowana za pomocą opisanego protokołu. Siły solwatacji są porównywalne w próbkach pokazanych na rysunkach 2 i 3: wszystkie próbki są hydrofilowe (bardziej ogólnie, "solwofilowe" w przypadku rysunków 2C, 3B, 3D) w odniesieniu do roztworu do obrazowania. Konsekwentnie we wszystkich przypadkach stosowano wsporniki o porównywalnej sztywności (0,2 - 0,8 N/m). Zarówno próbka, jak i końcówka powinny być solwofilowe, aby zapewnić, że cząsteczki cieczy tworzą dobrze zdefiniowaną strukturę solwatacji, którą można obrazować. Nie zawsze jest to wystarczający warunek, ale w większości przypadków i w przypadku stosunkowo małych cząsteczek cieczy ciecz przekształca się w sposób naśladujący symetrię próbki. Głównym czynnikiem wpływającym na wysoką rozdzielczość jest lokalna zmienność powinowactwa zaadsorbowanych cząsteczek rozpuszczalnika do powierzchni (skala Ångströma, w przypadku rysunków 2A, 3A, 3C). Technika ta najlepiej sprawdza się zatem w przypadku materiałów, w których struktura rozpuszczalnika różni się w dużym stopniu na całej powierzchni.

Rysunek 2: Miękkie interfejsy zobrazowane za pomocą AM-AFM w roztworach wodnych. A: Dwuwarstwa lipidowa dipalmitoilo-fosfatydylocholiny (DPPC) w fazie żelowej obrazowana w 150 mM KCl. Sześciokątnie upakowane grupy lipidowe są rozróżnialne zarówno pod względem topografii, jak i fazy, wraz z lokalnym kontrastem wskazującym na specyficzne dla miejsca różnice w nawodnieniu. B: Fioletowe błony Halobacterium salinarum zobrazowane w 150 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7,4. Wyróżniono kilka trymerów białkowych bakteriorodopsyny. Faza wykazuje kontrast inny niż topografia ze względu na lokalne miejsca hydratacji na białkach. Można wykonać indywidualne trimery białek (linie przerywane). C: Cząsteczki barwnika amfifilowego (Z907) zaadsorbowane na powierzchni nanocząstki TiO₂ w barwnikowym ogniwie słonecznym. Obraz został uzyskany w etylo-izopropylosiulfonie. Wygląd przypominający gąbkę jest tworzony przez zaadsorbowane cząsteczki barwnika. D: Kryształ akwaporyny w natywnych błonach soczewek bydlęcych zobrazowany w tym samym buforze co B. Podświetlony jest tetramer akwaporyny. Podstruktura odpowiadająca pętlom międzyspiralnym jest widoczna w topografii, podczas gdy faza wykazuje uderzająco inny kontrast ze względu na niezwykłe zachowanie wody w pobliżu białka. Obrazy są zaadaptowane z ref³⁶ (B), ref³⁸ (C) i ref⁶⁷ (D). Podziałka wynosi 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm w (C) i 15 nm (D) Skala kolorów wskazuje odpowiednio wysokość i zmianę fazy 200 pm i 15° (A), 600 pm i 4° (B), 2,5 nm i 2,5° (C) oraz 1,6 nm i 9,5° (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy AM-AFM twardych próbek w roztworach płynów. A: Kryształ kalcytu [] powierzchnia zobrazowana w zrównoważonym roztworze ultraczystej wody. B: Tytanian strontu zobrazowany otrzymany w dimetylosulfotlenku (DMSO). Wysoka rozdzielczość nie była możliwa w wodzie. C: Mika moskiewska zobrazowana w 3 mM RbCl — pojedyncze zaadsorbowane jony Rb⁺ są widoczne w miejscach sieci miki zarówno w skanach fazowych, jak i wysokościowych. D: Węglik krzemu na obrazie w DMSO. Oczekiwane układy krystalograficzne przedstawiono na rysunkach B i D. Obrazy są zaadaptowane z ref ⁶⁸ (A), ref ⁴² (B i D) oraz ref ⁴⁴ (C). Podziałka wynosi 3 nm (A, B, D) i 5 nm (C). Skala kolorów wskazuje odpowiednio wysokość i zmianę fazy 250 pm i 14° (A), 600 pm i 5,5° (B), 800 pm i 15° (C) oraz 500 pm i 3,5° (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Zakładając, że ciecz obrazowa i sztywność wspornika zostały odpowiednio dobrane, najbardziej krytycznymi krokami dla osiągnięcia pomyślnej wysokiej rozdzielczości są dostosowanie amplitudy obrazowania i ogólnej czystości badanego systemu.

Amplitudy porównywalne z grubością obszaru cieczy międzyfazowej (zwykle mniejszej niż 2 nm) badają głównie zmiany właściwości rozpuszczalnika międzyfazowego⁴². Jeśli amplituda oscylacji jest zbyt duża, wibrująca końcówka będzie przechodzić przez nieliniowe pola sił^{dalekiego zasięgu 52} , które wykluczają stabilność ruchu wspornikowego, i nieuchronnie uderzy w próbkę niezależnie od warunków obrazowania²⁹, powodując pogorszenie rozdzielczości. Oprócz utraty rozdzielczości, w ruchu końcówki zaczynają pojawiać się wyższe harmoniczne, a system staje się bardziej skomplikowany do modelowania⁵⁵. Alternatywnie, jeśli amplituda obrazowania jest zbyt mała, badana jest tylko część granicy faz (zazwyczaj określone warstwy cieczy międzyfazowej), a stabilne obrazowanie można osiągnąć tylko za pomocą sztywnych wsporników (>10 N/m w wodzie⁵³) w celu uzyskania zadowalającego stosunku sygnału do szumu, z ryzykiem uszkodzenia miękkich próbek przy dużych wahaniach wysokości. Potrzeba sztywnych wsporników ma na celu przezwyciężenie szumu termicznego, który może stać się bardziej znaczący niż mierzony sygnał Podczas pracy z małymi amplitudami interakcje dalekiego zasięgu między końcówką a próbką są nadal obecne, ale są w dużej mierze stałe i nie wpływają na kontrast o wysokiej rozdzielczości w uzyskanych obrazach.

Czystość środowiska obrazowania ma ogromne znaczenie, jeśli chodzi o AFM o wysokiej rozdzielczości. Niepożądane związki w systemie mogą zakłócać zarówno obrazowanie, jak i spektroskopię sił. Istnieją dwie główne kategorie zanieczyszczeń, które mają tendencję do wpływania na eksperymenty: (i) zanieczyszczenia bezpośrednio widoczne podczas obrazowania (Rysunek 4B, 4C) oraz (ii) ogólny niewyjaśniony brak wysokiej rozdzielczości. Przypadek (i) ma tendencję do występowania tylko w wysoce wyidealizowanych układach, takich jak na granicy faz woda-mika, gdzie zaadsorbowane agregaty molekularne, które zakłócają interakcje końcówka-próbka, są wyraźnie skontrastowane z atomowo płaską powierzchnią miki (Rysunek 4A). Przed wymianą końcówki i próbki warto nabyć krzywe spektroskopowe z dużym ugięciem, skutecznie wielokrotnie mocno dociskając końcówkę do próbki. Normalnie uszkodziłoby to nową końcówkę, ale czasami może wyczyścić brudną końcówkę lub wywołać stabilne miejsca nawodnienia odpowiednie do obrazowania. Ta końcówka będzie jednak nieuchronnie stępiona i dlatego będzie odpowiednia tylko dla płaskiej próbki, nawet jeśli obrazowanie ulegnie poprawie. W przypadku podejrzenia zanieczyszczenia na sztywnych próbkach, warto spróbować zobrazować za pomocą drugiej postaci własnej wspornika przed przystąpieniem do nieco destrukcyjnej procedury opisanej powyżej. Wymaga to po prostu przełączenia częstotliwości sterującej na drugi tryb własny i ponownego dostosowania amplitudy/wartości zadanej (patrz dyskusja na temat rozwiązywania problemów poniżej). Efektywna sztywność wspornika znacznie wzrasta podczas pracy w drugim trybie własnym, a wszelkie słabo zaadsorbowane zanieczyszczenia mogą zostać odepchnięte przez końcówkę podczas obrazowania. Strategia ta nie zastępuje potrzeby czystej próbki i końcówki, ale oferuje kilka dalszych możliwości uzyskania zadowalających obrazów, gdy końcówka/próbka wyraźnie nie jest idealna.

Ryc. 4: Przykłady zanieczyszczeń zaobserwowanych podczas obrazowania miki muskowitowej, które hamują obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. A: Mika zobrazowana w 5 mM RbCl — nie widać żadnych cząstek zanieczyszczeń. B: Zanieczyszczenie przybierające postać agregatów rzędu dziesiątek nm podczas obrazowania w nominalnie ultraczystej wodzie. C: Samoorganizujące się struktury utworzone przez cząstki zanieczyszczeń, przypuszczalnie o charakterze amfifilowym. Obrazowanie ponownie przeprowadzono w nominalnie ultraczystej wodzie. D: Przesunięte w pionie odcinki odpowiadające przerywanym liniom w A, B i C ilustrujące odchylenie od atomowo płaskiej powierzchni miki. Podziałki liniowe w A, B i C odpowiadają długości fali 300 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przypadek (ii) jest bardziej powszechny i charakteryzuje się głównie frustrującym faktem, że cechy subnanometrowe po prostu nie mogą być rozwiązane, niezależnie od warunków obrazowania. Sygnatura tego typu sytuacji jest zwykle widoczna w pomiarach spektroskopii sił, które wykazują pewne niespójności. Mogą to być krzywe o niskiej odtwarzalności oraz krzywe amplitudy i odległości, które znacznie odbiegają od typowego kształtu esigmoidalnego⁴². Jeśli zanieczyszczenia, jonowe lub inne, są jednorodnie rozproszone w płynie, mogą nie pojawić się w obrazowaniu topograficznym, ale mogą zakłócić strukturę hydratacji próbki⁶⁹, co ma kluczowe znaczenie dla utrzymania regularnej interakcji końcówka-próbka²⁹ i uzyskania wysokiej rozdzielczości⁷⁰. Może również wystąpić bezpośredni wpływ zanieczyszczeń na próbkę, zwłaszcza w miękkich, biologicznych eksperymentach. Na przykład dobrze wiadomo, że obecność alkoholi (z procedury czyszczenia) może upłynniać dwuwarstwy lipidowe w fazie żelowej^71-73, uniemożliwiając uzyskanie rozdzielczości na poziomie poniżej nanometrów. Jeśli uzyskanie wysokiej rozdzielczości nie jest możliwe, należy najpierw zachować ostrożność w procesie czyszczenia, skupiając się zwłaszcza na sprzęcie, który ma kontakt z roztworem do obrazowania. Nawet pozornie stabilne związki, takie jak żywica epoksydowa, mogą do pewnego stopnia solwatować w płynie, jeśli nie są w pełni utwardzone.

Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości za pomocą AM-AFM jest wymagające, wymaga cierpliwości i często kilku prób przed osiągnięciem najlepszych możliwych warunków obrazowania. Małe problemy eksperymentalne mogą łatwo stać się na tyle poważne, że uniemożliwią wysoką rozdzielczość, a umiejętności rozwiązywania problemów są niezbędne. Poniżej wymieniamy niektóre z najczęstszych problemów, które napotkaliśmy w związku z proponowanym przez nas rozwiązaniem.

Strojenie wspornikowe

Większość komercyjnych AFM wykorzystuje wzbudzenie akustyczne do napędzania wspornika. W takim przypadku dostrojenie wspornika, jak opisano w kroku 5.4, w pobliżu jego częstotliwości rezonansowej, często zapewnia wystarczającą wydajność do pracy w powietrzu. W środowisku ciekłym ciecz ma tendencję do wywoływania pewnego sprzężenia między różnymi częściami mechanicznymi AFM, takimi jak wiór wspornikowy i uchwyt. Może to wpływać na pozorny rezonans wspornika, często ilustrowany przez widmo częstotliwości wspornikowej, które wykazuje wiele ostrych szczytów i dolin powszechnie opisywanych jako "las szczytów". W związku z tym często trudno jest znaleźć odpowiednią częstotliwość wysterowania. Piki te występują również w środowiskach gazowych, ale ze względu na wysoką wartość współczynnika jakości wspornika, amplituda przy rezonansach jest znacznie większa^74,75. W cieczy wybór odpowiedniego piku do napędzania wspornika może nie być łatwy i może wymagać prób i błędów. W praktyce szczyt częstotliwości z największą zmiennością amplitudy w "lesie szczytów" wokół częstotliwości rezonansowej jest zwykle najlepszym wyborem, mimo że niekoniecznie znajduje się dokładnie na rezonansie i często zapewnia częstotliwość sterującą odpowiednią do uzyskania obrazowania o wysokiej rozdzielczości.

Zniekształcenie obrazu

Dryf obrazowania jest często problemem w przypadku poszukiwania wysokiej rozdzielczości i sprawia, że obrazy wyglądają na zniekształcone (zwykle rozciągnięte). Jego pochodzenie jest na ogół termiczne, albo dlatego, że skaner/AFM nie osiągnął swojej równowagi roboczej, albo dlatego, że część cieczy próbki szybko paruje (np. obrazowanie w alkoholach). We wszystkich przypadkach dryft staje się nieistotny w równowadze termicznej. Dlatego warto ustalić temperaturę próbki, jeśli to możliwe. W przeciwnym razie warto pozostawić AFM na zeskanowanie ślepej próbki (skan o dużym rozmiarze przy niskiej szybkości skanowania) na kilka godzin przed przeprowadzeniem eksperymentu. Jeśli parowanie nie stanowi problemu, procedurę tę najlepiej wykonać po kroku 6 procedury, uważając, aby najpierw wyciągnąć końcówkę na niewielką odległość (np. 20 μm) od powierzchni. Zdarza się, że dryf utrzymuje się nawet po rozległej termalizacji. Zwykle oznacza to, że wspornik lub jego chip częściowo ciągnie próbkę podczas obrazowania, co może się zdarzyć w przypadku miękkich spoistych próbek, takich jak cienkie folie lub jeśli końcówka/wspornik/wiór nie jest odpowiednio umieszczona. W przypadku wiórów, które zawierają więcej niż jeden wspornik/końcówkę, często pomocne jest złamanie wspornika, który nie jest używany, zamiast pozwalać mu ciągnąć się po powierzchni.

Siła jonowa

Ponieważ obrazowanie jest zdominowane przez ciecz międzyfazową, czasami pomocne jest dodanie odrobiny soli w celu obrazowania naładowanej powierzchni w wodzie w wysokiej rozdzielczości. Rola soli jest dwojaka. Po pierwsze, modyfikuje krajobraz nawodnienia powierzchni obrazowanej po adsorpcji, co często zwiększa kontrast. Po drugie, pomaga w badaniach przesiewowych silnych oddziaływań elektrostatycznych między końcówką a próbką (np . na mice). Ogólnie rzecz biorąc, większe jony, takie jak potas, rubid i cez, pozwalają na lepsze obrazy ze względu na ich specyficzne właściwości hydratacyjne⁷⁶ oraz fakt, że często adsorbują się głównie w unikalnym stanie uwodnienia⁷⁷.

Zły wspornik/końcówka

W przypadku podejrzenia, że wspornik jest źródłem zanieczyszczenia (patrz objawy opisane powyżej), należy go najpierw sprawdzić pod mikroskopem optycznym. W przypadku przechowywania w pudełku żelowym, wspornik może zbierać ślady polimerów żelowych lub oleju silikonowego⁵⁹ , które w skrajnych przypadkach mogą pojawić się jako ciemniejsze plamy z tyłu wspornika (jak na rysunku 5A). Oscylacje fototermiczne wspornika mogą wywoływać podobne plamy, ale są one spowodowane degradacją/przegrzaniem powłoki wspornika przez laser sterujący. Zanieczyszczenie ma tendencję do pojawiania się losowo na wsporniku. Dłuższe (12 godzin) czyszczenie izopropanolem, a następnie ultraczystą wodą może usunąć wszelkie niepożądane cząstki z wspornika.

Rysunek 5: Porównanie nowego wspornika z identycznym wspornikiem, który był intensywnie stosowany na twardych powierzchniach i pozostawiony w pudełku żelowym przez dłuższy czas. A: Góra; Obraz optyczny zupełnie nowego wspornika, który został oczyszczony (patrz procedura). Dno; Obraz optyczny pokazujący wygląd widocznego zanieczyszczenia (niebieska strzałka) z pudełka żelowego. B: Porównanie odpowiednich widm termicznych wsporników. Poszerzenie pierwszego piku rezonansowego starego wspornika jest wyraźne (zielona strzałka), a niektóre tryby wyższego rzędu są ulepszone (niebieska strzałka). Widma zostały przesunięte w pionie i przedstawione w skali logarytmicznej dla przejrzystości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jeśli wymagana rozdzielczość subnanometrowa nie zostanie osiągnięta, pomimo akceptowalnych obrazów w niższej rozdzielczości, możliwe jest, że końcówka AFM została chemicznie zmodyfikowana podczas jej przechowywania. Można to leczyć poprzez wystawienie chipa wspornikowego na działanie utleniacza ultrafioletowego przez 120 sekund, co pomaga w tworzeniu hydrofilowych grup powierzchniowych na końcówce⁶⁰. Należy jednak zachować ostrożność, ponieważ dokładny czas potrzebny może się różnić w zależności od geometrii końcówki i mocy promieniowania UV, a nadmierna ekspozycja może spowodować stępienie końcówki i zmniejszenie rozdzielczości.

Hałas termiczny

Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości wymaga dużej czułości na zmiany siły i odległości (zazwyczaj siły poniżej pN i odległości poniżej Ångströma⁷⁸). W przypadku bardziej miękkich wsporników problemem może być termomechaniczny ruch wspornika spowodowany jego wewnętrznym ruchem Browna (drgania termiczne). W pierwszym przybliżeniu, przy wsporniku o sztywności k, nie jest możliwe zmierzenie cech mniejszych niż amplituda szumu termicznego, gdzie k_B jest stałą Boltzmanna, a T jest temperaturą. W praktyce zastosowanie wspornika o wyższych częstotliwościach rezonansowych rozprasza szum w szerszym zakresie częstotliwości i zmniejsza ogólny poziom szumów w paśmie pomiarowym⁷⁹.

Obrazowanie w wyższym trybie własnym

Czasami może być użyteczne działanie wspornika w drugim trybie własnym ze względu na zwiększoną efektywną sztywność (patrz omówienie zanieczyszczeń). W praktyce odbywa się to po prostu poprzez napędzanie wspornika w jego drugiej postaci własnej (drugi pik rezonansowy przy wyższej częstotliwości, patrz rysunek 1A). Podczas strojenia wspornika po prostu wybierz drugi tryb własny zamiast rezonansu głównego i przejdź do kroku 5.4. Należy zauważyć, że InvOLS będzie inny, gdy wspornik jest napędzany w drugiej postaci własnej; zazwyczaj ~1/3 InvOLS mierzonej w kroku 5.2 dla prostokątnego wspornika.

Głównym ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona stabilnego krajobrazu solwatacji na powierzchni próbki. Próbka powinna być wystarczająco wytrzymała, aby umożliwić zakłócenie cieczy międzyfazowej bez powodowania znacznego odkształcenia samej próbki. Może to stanowić wyzwanie w przypadku bardzo miękkich i niestabilnych próbek, takich jak duże biomolekuły. Dodatkowo, AFM o małej amplitudzie, jak opisano tutaj, nie może uzyskać informacji mechanicznych o właściwościach próbki, ponieważ końcówka wspornika spędza większość czasu w płynie międzyfazowym. W tym celu korzystne może być zastosowanie innych podejść, takich jak ilościowe mapowanie nanomechaniczne⁸⁰ lub wykorzystanie wyższych harmonicznych ruchu wspornikowego. Wyższe harmonijki są na ogół wzmacniane podczas obrazowania w płynie (o niskich współczynnikach jakości)^29,81-83 i mogą zapewnić jednocześnie topografię i sztywność próbek^25,81-84, ale są one na ogół szkodliwe dla wysokiej rozdzielczości. Inne ograniczenia związane ze wszystkimi technikami mikroskopii z sondą skaningową są tutaj nadal aktualne, w szczególności fakt, że wyniki nieuchronnie zawierają informacje o końcówce pomiarowej. Stosowanie małych amplitud również nie jest idealne dla próbek o dużych wahaniach wysokości; Pętla sprzężenia zwrotnego nieuchronnie będzie reagować wolniej, gdy zmiany wysokości są większe niż amplituda obrazowania, co grozi uszkodzeniem próbki i końcówki. Zastosowanie bardziej miękkiego wspornika w pewnym stopniu łagodzi ten problem.

Główną zaletą przedstawionej tutaj metody jest fakt, że zapewnia ona najwyższą możliwą rozdzielczość obrazu przy użyciu AFM w cieczy, ale może być zaimplementowana na każdym komercyjnym AFM, pod warunkiem, że poziom hałasu maszyny jest wystarczająco niski. Porównywalna rozdzielczość na instrumentach komercyjnych jest zwykle osiągana w trybie kontaktowym lub czasami w FM-AFM ze sztywnymi wspornikami. Praca w trybie AM i ze stosunkowo miękkimi wspornikami pozwala na szerszy wybór próbek i jest łatwiejsza do wdrożenia niż FM-AFM w większości systemów. Podejście to opiera się na wykorzystaniu sił solwatacji występujących na granicy faz między dowolnym ciałem stałym i cieczą w celu zwiększenia rozdzielczości i uzyskania lokalnych informacji chemicznych. Zasadniczo może być stosowany w warunkach otoczenia, opierając się tylko na warstwach wody (zwykle o grubości kilku nanometrów) gromadzących się na większości powierzchni z powodu wilgotności powietrza. Zasady leżące u podstaw strategii wysokiej rozdzielczości pozostają niezmienione, ale większość końcówki znajduje się w powietrzu, a między wierzchołkiem końcówki a próbką⁸⁵ znajduje się jedynie mostek kapilarny. Wysoką rozdzielczość wykazano na próbkach sztywnych w tych warunkach^86,87. Warunki obrazowania są jednak inne niż w przypadku zanurzonej cieczy ze względu na wyższy współczynnik Q oscylacji wspornika. W praktyce trudno było nam osiągnąć stabilną pracę na miękkich lub nieregularnych próbkach, prawdopodobnie ze względu na czasowe zmiany mostka kapilarnego i zwiększone współczynniki Q dla danej sztywności wspornika.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół oferuje metodologię uzyskiwania obrazów o rozdzielczości molekularnej próbek w cieczy za pomocą najnowocześniejszych komercyjnych AM-AFM. Przedstawiamy naukowe uzasadnienie naszego wyboru parametrów obrazowania i podkreślamy rolę sił solwatacji. Omawiamy również typowe problemy, a w szczególności zanieczyszczenia. Specyficzne interakcje końcówka-próbka mogą się znacznie różnić w zależności od zawartości roztworu do obrazowania, geometrii i materiału wspornika oraz składu chemicznego próbki. Praktyczne zrozumienie natury dominujących sił obecnych podczas skanowania jest zatem niezbędne do dostosowania tego protokołu do nowych systemów i zapewnienia wiarygodnych wyników. Po zoptymalizowaniu podejście eksperymentalne jest skuteczne w uzyskiwaniu wglądu in situ w próbki w roztworze na lokalnym poziomie molekularnym.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multimode IIIA AFM	Brucker	NA	Jedna z używanych maszyn
Cypher ES AFM	Asylum Resarch	NA	Jedna z maszyn używanych
/ końcówka AFM	Nanoworld	Arrow UHF-AUD	najlepsza do
wysokiej częstotliwości Wspornik / końcówka AFM	Olympus	RC800-PSA	wszechstronna i tania
woda ultraczysta	Milipore	NA	laboratoryjne systemy filtrujące mogą indukować zanieczyszczenie
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aaldrich	200-664-3	standardowa substancja chemiczna, bez dalszego oczyszczania
Sole monowartościowe	Sigma-Aaldrich		standardowa substancja chemiczna, bez dalszego oczyszczania
Lipidy	Avanti Polar Lipids		utworzone przy użyciu standardowych protokołów
Kryształy	Kryształy polerowane MTI		Taśma
klejąca	3M	Taśma Scotch Magic Tape	Najlepiej sprawdza się taśma półprzezroczysta. Przezroczyste przykleja się zbyt mocno