Przygotowanie bliższej części kości udowej do badania wytrzymałości na pękanie i ilościowej analizy elementów skończonych opartej na tomografii komputerowej

Podsumowanie

Przedstawiamy solidny protokół, jak starannie zabezpieczyć i przygotować kość udową zwłok do testów złamań i ilościowego obrazowania tomografii komputerowej. Metoda zapewnia precyzyjną kontrolę nad warunkami wejściowymi w celu określenia zależności między gęstością mineralną kości, wytrzymałością na złamania oraz zdefiniowaniem geometrii i właściwości modelu elementów skończonych.

Streszczenie

Badanie złamań zwłok jest rutynowo używane do zrozumienia czynników wpływających na siłę bliższej części kości udowej. Ponieważ tkanki biologiczne ex vivo są podatne na utratę swoich właściwości mechanicznych z upływem czasu, przygotowanie próbki do badań eksperymentalnych musi być przeprowadzone ostrożnie, aby uzyskać wiarygodne wyniki, które reprezentują warunki in vivo. Z tego powodu zaprojektowaliśmy protokół i zestaw uchwytów do przygotowania próbek kości udowej w taki sposób, aby ich właściwości mechaniczne uległy minimalnym zmianom. Kość udowa była utrzymywana w stanie zamrożonym, z wyjątkiem etapów przygotowawczych i testów mechanicznych. Odpowiednie pomiary kliniczne całkowitej gęstości mineralnej kości biodrowej i szyjki kości udowej (BMD) uzyskano za pomocą klinicznego densytometru kości z podwójną absorpcją promieniowania rentgenowskiego (DXA), a geometrię 3D i rozkład minerałów kostnych uzyskano za pomocą tomografii komputerowej z fantomem kalibracyjnym do oszacowań ilościowych na podstawie wartości w skali szarości. Wszelkie możliwe choroby kości, złamania lub obecność implantów lub artefaktów wpływających na strukturę kości zostały wykluczone za pomocą skanów rentgenowskich. W celu przygotowania, wszystkie kości zostały starannie oczyszczone z nadmiaru tkanek miękkich, a następnie pocięte i zalane pod kątem rotacji wewnętrznej, który był przedmiotem zainteresowania. Uchwyt tnący pozwolił na odcięcie dystalnego końca kości, pozostawiając bliższą część kości udowej na pożądanej długości. Aby umożliwić ustawienie szyjki kości udowej pod określonymi kątami podczas późniejszej tomografii komputerowej i testów mechanicznych, bliższe trzony kości udowej zostały zalane polimetakrylanem metylu (PMMA) przy użyciu uchwytu zaprojektowanego specjalnie dla pożądanych orientacji. Dane zebrane z naszych eksperymentów zostały następnie wykorzystane do walidacji ilościowej analizy elementów skończonych (MES) opartej na tomografii komputerowej (QCT), zgodnie z opisem w innym protokole. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono protokół precyzyjnego przygotowania kości do badań mechanicznych i późniejszego modelowania QCT/MES. Obecny protokół został z powodzeniem zastosowany do przygotowania około 200 kości udowych ze zwłok w okresie 6 lat.

Wprowadzenie

Określanie rzeczywistej wytrzymałości na złamanie bliższej kości udowej zwłok za pomocą testów mechanicznych jest metodą niszczącą, która wymaga rygorystycznego podejścia do testowania dokładnych pomiarów. W szczególności konieczne są odpowiednie metody przygotowania kości, aby utrzymać integralność kości w stanie zbliżonym do in vivo przed testem złamań mechanicznych¹. Osiąga się to poprzez odpowiednie przechowywanie kości i zminimalizowanie obchodzenia się z nimi w temperaturze pokojowej. Dane te są szeroko wykorzystywane do walidacji modeli QCT/MES złamań kości udowej, które mogą być wykorzystane klinicznie w celu zrozumienia ryzyka złamania, szczególnie u pacjentów z osteoporozą. Niestety, obecnie nie ma standardowej procedury przygotowania próbek bliższej części kości udowej do badań mechanicznych. Dobra procedura badawcza powinna zapewnić powtarzalność i odtwarzalność procesu przygotowania. Dlatego osprzęt wymagany do przygotowania próbki musi być starannie zaprojektowany i wykonany, aby zminimalizować prawdopodobieństwo wystąpienia różnych błędów testowych. Musimy również zminimalizować czas przygotowania, przez który tkanka kostna znajduje się w temperaturze pokojowej, a tym samym jest zagrożona degradacją z nieodwracalnymi zmianami właściwości mechanicznych.

W tym celu opracowaliśmy procedurę, która zachowuje tkankę kostną na wielu etapach przygotowania. Jest to ważne, aby zapewnić minimalny czas ekspozycji w temperaturze pokojowej, jednocześnie minimalizując liczbę cykli zamrażania/rozmrażania, które mogą wpływać na właściwości fizyczne tkanek². Cała procedura jest długa i nietrywialna, ponieważ etapy te trwały wiele tygodni i wymagały zaplanowania procedur skanowania oraz dostępności personelu. Etapy obejmowały rozmrażanie próbek kości, badanie przesiewowe próbek za pomocą skanowania DXA w celu uzyskania wartości gęstości mineralnej kości (BMD), prześwietlenie w celu wykluczenia wszelkich chorych próbek, a na koniec tomografię komputerową w celu oszacowania rozkładu minerałów kostnych i geometrii kości udowej. Wszystkie próbki zostały przygotowane do testów poprzez usunięcie obcych tkanek miękkich z powierzchni kości, przycięcie kości udowej do długości wymaganej do testów i umieszczenie kości udowej w pożądanej orientacji w celu symulacji bocznego upadku na biodro podczas kolejnych testów. Istotne jest, aby okres wszystkich tych operacji był jak najkrótszy. Solidny protokół jest zatem niezbędny do konsekwentnego przygotowania próbki, zachowania tkanek między etapami i skrócenia całkowitego czasu przygotowania.

Celem tego artykułu jest szczegółowe przedstawienie procedur związanych z przygotowaniem próbek kości udowej do późniejszych testów mechanicznych w różnych warunkach. Zachowanie tkanki kostnej ma kluczowe znaczenie w tym procesie i osiągnęliśmy to, utrzymując próbki zamrożone między etapami i trzymając je starannie owinięte w ręczniki nasączone solą fizjologiczną przez cały czas, z wyjątkiem skanowania i mechanicznego testowania kości. Kość udowa była również trzymana owinięta w mokre ręczniki z solą fizjologiczną podczas etapów związanych z utwardzaniem PMMA, aby zapobiec wysuszeniu tkanki kostnej.

Protokół

UWAGA: Wszystkie badania przedstawione w tym protokole zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) w Mayo Clinic. Kości zostały pozyskane w ciągu 6 lat od różnych organizacji. Wszystkie próbki pobrano w ciągu 72 godzin od śmierci, zawinięto w ręczniki nasączone solą fizjologiczną i przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania.

1. Pomiar gęstości mineralnej kości za pomocą DXA

1. Wyjąć próbki przechowywane w temperaturze -20 °C w celu rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez około 24 godziny; próbki nie muszą być wyjmowane z oryginalnego opakowania, jeśli usunięto większość tkanek miękkich.
2. Użyj dwóch worków ryżu o wadze 5 funtów, aby uwzględnić tkankę miękką. Przykryj dwie torebki ryżu na stole DXA plastikowymi torbami, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Worki z ryżem będą symulować otaczającą tkankę miękką (in vivo) podczas skanowania, jak pokazano na rysunku 1.
3. Zabezpiecz powierzchnię skanera DXA papierem wyłożonym plastikiem i umieść 2 owinięte folią torebki na ryż na stole skanera (Rysunek 1A).
4. Połóż 2 kości udowe (prawą i lewą) na workach z ryżem tak, aby bliższy koniec (w tym głowa kości udowej) był wyśrodkowany na workach, a tylna strona była skierowana w dół (ryc. 1B). Naśladuje to pacjenta leżącego na plecach.
5. Przykryj przedni/odsłonięty proksymalny koniec kości udowej dodatkowymi dwoma workami ryżu o wadze 5 funtów (ryc. 1C).
6. Umieść głowę maszyny nad bliższą częścią kości udowej i zeskanuj kość udową zgodnie ze standardową procedurą instytucjonalną pomiaru BMD pacjenta (ryc. 1C). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta DXA.
   1. Z poziomu interfejsu oprogramowania maszyny DXA wykonaj normalne skanowanie kości udowej. Wybierz badanie kości udowej, umieść ramię DXA na górze kości udowej zwłok, naciskając odpowiednio strzałkę w lewo lub w prawo na ramieniu DXA i rozpocznij badanie, klikając przycisk "start". Przeprowadź analizę BMD, klikając "Analizuj".
      UWAGA: Wynikowa automatyczna punktacja T ze skanu klasyfikuje kość jako normalną, osteopeniczną lub osteoporotyczną (ryc. 1D). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta DXA.

2. Czyszczenie, cięcie i wiercenie dystalnego końca kości

1. Oczyść najbardziej proksymalną 300 mm kości udowej, ostrożnie usuwając pozostałą tkankę miękką z kości. Ten krok jest potrzebny, aby umożliwić PMMA kontakt z kością podczas procesu zalewania w ramach przygotowań do testów mechanicznych. W tym procesie kości nie muszą być rozmrażane do temperatury pokojowej.
2. Zdezynfekuj miejsce pracy 70% alkoholem izopropylowym i przykryj stół chłonnymi podkładkami papierowymi z folią z tworzywa sztucznego z jednej strony (Rysunek 2A). Ustaw całą kość udową na stole (Rysunek 2B) na cały proces, począwszy od czyszczenia, a skończywszy na cięciu (Rysunek 2A do 2H). Nosić środki ochrony osobistej (PPE), w tym rękawice i okulary ochronne
.
3. Zeskrob nadmiar okostnej i odetnij nadmiar tkanki za pomocą skrobaka i skalpela (ryc. 2C, 2H).
4. Umieść kość w specjalnie wykonanym uchwycie tnącym, jak pokazano na rysunku 2D, z głową kości udowej przy akrylowej płytce uchwytu.
5. Dopasuj i przytrzymaj trzon względem dwóch kołków na uchwycie tnącym (Rysunek 2D).
6. Przymocuj kość do uchwytu, dokręcając płytkę szczelinową na trzonie; jeśli kość nie leży płasko na uchwycie, zawieś dystalny koniec na blacie stołu, a także opcjonalnie zawiąż szyjkę kości udowej w razie potrzeby, aby utrzymać próbkę na miejscu (ryc. 2D).
7. Przeciąć dystalną część kości udowej za pomocą odlewanego noża (Rysunek 2E) przez szczelinową płytkę jako prowadnicę; przytrzymaj kość suchą szmatką/ręcznikiem, aby uzyskać lepszy chwyt.
8. Usuń kość z uchwytu; normalna długość kości po przecięciu wynosi 255 mm (Rysunek 2F).
9. Oczyścić jamę szpikową szpiku za pomocą kirety o głębokości około 25 mm. Następnie włóż gąbkę z gazy, aby pomóc wysuszyć wewnętrzną powierzchnię. Usuń gazę tuż przed umieszczeniem dystalnego końca kości udowej w formie. Chwyć kość suchym ręcznikiem/szmatką i wywierć otwór o średnicy 10 mm przez dystalny koniec w odległości około 25 mm od bliższego odciętego końca próbki. Uwaga: Ma to na celu umożliwienie PMMA penetracji kanału i mocnego zabezpieczenia kości.

3. Sadzenie kości w jednym worku

1. Zaprojektuj i wyprodukuj pojemnik doniczkowy. Pojemniki doniczkowe wykonane są z arkuszy akrylowych o grubości 5 mm i mają następujące wymiary zewnętrzne: 50 mm na 50 mm o przekroju kwadratowym i 100 mm wysokości (rysunek 3A).
2. Oznaczyć pojemnik doniczkowy odpowiednią identyfikacją kości (ryc. 3A i 3B – patrz etykieta na pudełku akrylowym).
3. Ustaw uchwyt do osadzania we właściwej orientacji (lewa noga lub prawa noga; np. obrót wewnętrzny o 15° lub 30°).
4. Umieść pojemnik do sadzenia w podstawie uchwytu do sadzenia, umieść kość w pojemniku do sadzenia (Rysunek 3B) i wyrównaj szyjkę ze wskazówką w uchwycie (Rysunek 3C), aby dostosować wewnętrzny kąt obrotu kości do żądanej wartości.
5. Odmierz 60 g proszku PMMA i wymieszaj z 30 g płynnej żywicy pod wyciągiem, aż proszek się rozpuści. Mieszanina powinna być nalewa. Do tego procesu użyj jednorazowego kubka papierowego.
6. Wlać mieszaninę do pojemnika doniczkowego z kością pod wyciągiem (rysunek 3D), pozostawić do utwardzenia na około 10 - 15 minut, aż PMMA stanie się klarowny i twardy. Powinno to wypełnić tylko ~ 1/2 pojemnika doniczkowego PMMA. Ostrożnie zawiń kość w ręczniki nasączone solą fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu tkanek z powodu wytwarzania ciepła podczas polimeryzacji PMMA (ryc. 3E).
7. Okresowo sprawdzaj kość udową, aby upewnić się, że pozostaje wyrównana w pojemniku podczas utwardzania.
8. Wyjmij kość udową z uchwytu doniczkowego i owiń ręcznikiem papierowym nasączonym solą fizjologiczną (Rysunek 3E).
9. Przygotuj 90 g PMMA pod wyciągiem, jak wyjaśniono w kroku 3.5 i całkowicie napełnij pojemnik doniczkowy. Utwardzaj PMMA przez około 10 - 15 minut, aż stanie się twardy.
10. Po utwardzeniu żywicy szczelnie zawiń/ponownie zawiń kość w ręczniki papierowe nasączone solą fizjologiczną, przykryj plastikową torbą i przechowuj próbki w temperaturze -20 °C w zamrażarce.

4. Obrazowanie kości za pomocą promieniowania rentgenowskiego

(UWAGA! Podczas korzystania z urządzenia należy zachować odpowiednią ostrożność w przypadku promieniowania rentgenowskiego)

1. Jeśli używasz klisz do zdjęć rentgenowskich, włącz wywoływacz rentgenowski co najmniej 20 minut (zgodnie z instrukcjami producenta) przed skanowaniem, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara (w pomieszczeniu wywoływacza).
2. Przed prześwietleniem rentgenowskim upewnij się, że w kasecie znajduje się nienaświetlona klisza; kasetę należy otwierać tylko w ciemnym pomieszczeniu.
3. Włącz maszynę, aby odblokować i wysunąć głowicę maszyny.
4. Umieść wózek pod ścieżką belki i umieść kasetę na wózku pod belką (Rysunek 4A).
5. Umieść i ustaw kość udową na kasecie (ryc. 4B); zostaną uchwycone dwie orientacje: widok przyśrodkowo-boczny i widok przednio-tylny. Odpowiednio oznacz obrazy próbek.
6. Po pierwszej ekspozycji zamień miejsca ołowiu i kości.
7. Przykryj już odsłoniętą połowę ołowiem i odsłoń kość w drugiej orientacji po nieodsłoniętej stronie. Dzięki temu użytkownik może użyć jednego filmu rentgenowskiego dla pojedynczej kości w dwóch orientacjach (ryc. 4C-D).
8. Zmień kasetę i obróć każdą kość udową do drugiej orientacji.
9. W przypadku pojedynczej kości udowej należy przykryć połowę kasety ołowianą osłoną, aby uniknąć początkowej ekspozycji całej folii na promieniowanie rentgenowskie.
10. Przesuń się za przenośną ścianę wyłożoną ołowiem w celu ochrony osobistej i użyj spustu, aby odsłonić kości.
11. Po zakończeniu przywróć głowicę rentgenowską do pozycji zablokowania i przechowywania, przekręć kluczyk do pozycji OFF na urządzeniu rentgenowskim i usuń odsłoniętą kliszę rentgenowską.
12. Wywołaj film, aby uzyskać obrazy rentgenowskie (ryc. 4E) za pomocą zwykłego wywoływacza do filmów. Włącz białe światło w pomieszczeniu i znajdź wywoływacza filmu. Włącz czerwone światło i wyłącz białe światło przed otwarciem kasety i kontynuuj proces wywoływania filmu. Otwórz kasetę i przepuść film przez wywoływacz. Włącz białe światło i wyłącz czerwone światło po wywołaniu filmu.

5. Tomografia komputerowa kości

1. Wyjmij kości z zamrażarki na około 24 godziny przed skanowaniem. Kości muszą być całkowicie rozmrożone przed skanowaniem.
2. Upewnij się, że kości są zawinięte w plastikowe torby do skanowania, aby zminimalizować sprzątanie na końcu.
3. Umieść i zabezpiecz kość udową i fantom kalibracyjny w uchwycie do tomografii komputerowej (Rysunek 5A-B). Uchwyt utrzymuje fantom kalibracyjny (rysunek 5C), a także utrzymuje kość udową w orientacji (rysunek 5D-E) identycznej z orientacją pożądaną do późniejszych badań mechanicznych. Ta krzyżowa rejestracja jest wymagana do wykorzystania danych ze skanowania CT (rysunek 5F) w procesie modelowania QCT/MES (opisanym w innym protokole).
   UWAGA: Oprawa została zaprojektowana w taki sposób, że odsłania kość udową do tomografii komputerowej bez zasłaniania bliższej części kości udowej (głowa kości udowej, szyja, krętarz większy i trzon bliższy).
4. Upewnij się, że uchwyt wraz z kością udową w tomografie komputerowym jest prawidłowo wyrównany, używając laserów systemowych jako prowadnic (Rysunek 5D-E). Ponownie sprawdź wyrównanie oprawy z laserem CT o długiej osi (naciskając przycisk włączania/wyłączania lasera). Fantom NIE musi być wyrównany z laserem, ponieważ jest zamocowany w uchwycie. Wyzeruj pozycję stołu na panelu sterowania maszyny, naciskając przycisk zerowania (→ 0 ←) na panelu sterowania.
5. Postępując zgodnie ze standardową procedurą operacyjną CT, uruchom CT przy 120 kVp, 216 mAs, czasie obrotu 1 s i skoku 1 w trybie ultra wysokiej rozdzielczości (zUHR). Daje to grubość warstwy 0,4 mm i rozmiar piksela 0,30 - 0,45 mm w zależności od wielkości pola widzenia (FOV).
6. Sprawdź dane tomografii komputerowej przed testami mechanicznymi, aby upewnić się, że interesujące obrazy zostały przechwycone i zapisane. Ponownie zamrozić kość w temperaturze -20 °C do dnia doświadczenia.

Wyniki

Kadawerowe kości udowe zostały dostarczone w stanie zamrożonym i przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu rozpoczęcia przygotowań. Skanowanie BMD wykonano za pomocą skanera DXA w celu pomiaru BMD całkowitej biodra i szyjki kości udowej, a także wyznaczenia T-score dla każdego preparatu (Rysunek 1). T-score to liczba odchyleń standardowych zmierzonego BMD w porównaniu do średnich wartości dla młodych, zdrowych osób. Wartość ta może wynosić -2,5 lub mniej dla kości z os...

Dyskusja

Przedstawiliśmy solidny protokół przygotowania kości w celu zapewnienia badań mechanicznych i modelowania QCT/MES siły kości udowej w konfiguracji bocznego upadku na biodro. Ta metoda stała się naszym standardowym wewnętrznym protokołem. W ciągu 6 lat, przy różnym personelu, udało się przygotować około 200 kości udowych zgodnie z tym protokołem. Wyniki protokołu obejmują klasyfikację stanów kostnych za pomocą DXA, wykluczenie chorób przerzutowych, wcześniejszych złamań lub implantów za pomocą promieniowania rentgenowskie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pojemnik do zalewania CT i przyrząd do skanowania	Produkowane wewnętrznie	Nie dotyczy	Specjalnie zaprojektowany i wyprodukowany
tomograf komputerowy	Skaner Siemens	Somatom Definition (Siemens, Malvern, PA)	Sprzęt do skanowania CT
Ilościowy CT Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Kalibracja CT Model 3 Phantom	Służy do uzyskiwania wartości BMD z jednostek Hounsfield w obrazie CT
Skaner absorpcjometrii rentgenowskiej o podwójnej energii		Electric N/A	GE Lunar iDXA skaner do zdrowia kości lub dowolny podobny skaner BMD Higieniczna
żywica orhodontyczna (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Substancja kontrolowana i można ją kupić za odpowiednią aprobatą
Zamrażarka	Kenmore	N/A	To jest -20 ° C schowek na skaner rentgenowski kości
	General Electric	46-270615P1	Sprzęt do obrazowania rentgenowskiego.
Filmy rentgenowskie	Kodak	N/A	Służy do wyświetlania obrazów rentgenowskich
Wywoływacz rentgenowski	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Służy do wywoływania obrazów rentgenowskich
Kaseta rentgenowska	Kodak X-Omatic	N/A	Służy do przechowywania filmów rentgenowskich
5-funtowe worki na ryż	Świetna wartość	N/A	Służy do naśladowania tkanek miękkich podczas procesu skanowania DXA
Sól fizjologiczna (0,9% chlorek sodu)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Służy do utrzymywania nawodnionych próbek
Skalpele i skrobaki	Bard-Parker	N/A	Służy do oczyszczania kości z tkanek miękkich
Frez do odlewu	Stryker	810-BD001	Służy do cięcia trzonu kości udowej
Wiertarka	Bosch	N/A	Służy do wiercenia trzonu kości udowej
Okap wyciągowy	Hamilton	70532	Służy do wentylacji podczas stosowania produkcji PMMA

General