Artykuł metodologiczny

Analiza metagenomiczna kiszonki

18.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54936

⸱

13 stycznia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biosciences, University of Exeter

W tym artykule

Podsumowanie

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Streszczenie

Metagenomika jest zdefiniowana jako bezpośrednia analiza kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) oczyszczonego z próbek środowiskowych i umożliwia taksonomiczną identyfikację obecnych w nich społeczności mikroorganizmów. Istnieją dwa główne podejścia metagenomiczne; sekwencjonowanie regionu kodującego gen 16S rRNA, który wykazuje wystarczającą zmienność między taksonami do identyfikacji, oraz sekwencjonowanie typu shotgun, w którym genomy organizmów obecnych w próbce są analizowane i przypisywane do "operacyjnych jednostek taksonomicznych"; gatunków, rodzajów lub rodzin w zależności od zakresu sekwencjonowania.

W tym badaniu, sekwencjonowanie shotgun zostało użyte do analizy społeczności mikrobiologicznej obecnej w kiszonce dla bydła i, w połączeniu z szeregiem narzędzi bioinformatycznych, do kontroli jakości i filtrowania odczytów sekwencji DNA, przeprowadzenia klasyfikacji taksonomicznej populacji drobnoustrojów obecnych w próbce kiszonki i uzyskania funkcjonalnej adnotacji sekwencji. Metody te zostały wykorzystane do identyfikacji potencjalnie szkodliwych bakterii, które istniały w kiszonce, co wskazuje na psucie się kiszonki. Jeśli zepsuta kiszonka nie zostanie usunięta, to po spożyciu może być potencjalnie śmiertelna dla zwierząt gospodarskich.

Wprowadzenie

Metagenomika to bezpośrednia analiza DNA oczyszczonego ze zbiorowisk biologicznych znalezionych w próbkach środowiskowych 1 i pierwotnie była używana do wykrywania nienadających się do hodowli bakterii znalezionych w osadach 2. Metagenomika jest szeroko stosowana w wielu zastosowaniach, takich jak identyfikacja ludzkiego mikrobiomu 3, klasyfikacja populacji drobnoustrojów w oceanie 4 , a nawet do analizy społeczności bakteryjnych, które rozwijają się w ekspresach do kawy 5 . Wprowadzenie technologii sekwencjonowania nowej generacji zaowocowało większą przepustowością i wydajnością sekwencjonowania. W związku z tym sekwencjonowanie DNA stało się bardziej ekonomiczne 6, a głębokość sekwencjonowania, które można wykonać, znacznie wzrosła, dzięki czemu metagenomika stała się potężnym narzędziem analitycznym.

Ulepszenia "Front-end" w praktycznym, molekularnym aspekcie sekwencjonowania metagenomicznego przyczyniły się do rozwoju narzędzi bioinformatycznych in silico dostępnych dla klasyfikacji taksonomicznej 7-9, adnotacji funkcjonalnej 10,11 i wizualnej reprezentacji 12,13 danych sekwencji DNA. Rosnąca liczba dostępnych, zsekwencjonowanych genomów prokariotycznych i eukariotycznych 14 pozwala na dalszą dokładność klasyfikacji społeczności drobnoustrojów, która jest niezmiennie przeprowadzana w odniesieniu do "zaplecza" referencyjnej bazy danych sekwencjonowanych genomów 15. Do analizy metagenomicznej można przyjąć dwa główne podejścia.

Bardziej konwencjonalną metodą jest analiza regionu kodującego gen 16S rRNA genomu bakteryjnego. 16S rRNA jest wysoce konserwatywne między gatunkami prokariotów, ale wykazuje dziewięć hiperzmiennych regionów (V1 - V9), które można wykorzystać do identyfikacji gatunku 16. Wprowadzenie dłuższego sekwencjonowania (≤ sparowanym końcem 300 pz) pozwoliło na analizę sekwencji DNA obejmujących dwa hiperzmienne regiony, w szczególności region V3 - V4 17. Postępy w innych technologiach sekwencjonowania, takich jak Oxford Nanopore 18 i PacBIO 19, pozwalają na sekwencjonowanie całego genu 16S rRNA w sposób ciągły.

Podczas gdy biblioteki oparte na 16S rDNA zapewniają ukierunkowane podejście do identyfikacji gatunków i umożliwiają wykrywanie DNA o niskiej liczbie kopii, które naturalnie występuje w oczyszczonych próbkach, biblioteki sekwencjonowania typu shotgun pozwalają na wykrywanie gatunków, które mogą zawierać regiony DNA, które albo nie są amplifikowalne przez użyte sekwencje starterów markerów 16S rRNA, albo dlatego, że różnice między sekwencją matrycy a sekwencją startera wzmacniającego są zbyt duże 20,21. Ponadto, chociaż polimerazy DNA charakteryzują się wysoką wiernością replikacji DNA, podczas amplifikacji PCR mogą jednak wystąpić błędy zasadowe, które mogą skutkować nieprawidłową klasyfikacją gatunków pochodzących 22. Mogą również wystąpić odchylenia w amplifikacji sekwencji matryc PCR; sekwencje DNA o wysokiej zawartości GC mogą być niedostatecznie reprezentowane w końcowej puli amplikonów 23, a podobnie nienaturalne modyfikacje zasad, takie jak glikol tyminowy, mogą zatrzymać polimerazy DNA, powodując niepowodzenia w amplifikacji sekwencji DNA 24. W przeciwieństwie do tego, biblioteka DNA do sekwencjonowania typu shotgun to biblioteka DNA, która została przygotowana przy użyciu całego oczyszczonego DNA, które zostało wyekstrahowane z próbki, a następnie rozdrobnione na krótsze długości łańcucha DNA przed przygotowaniem do sekwencjonowania. Klasyfikacja taksonomiczna sekwencji DNA generowanych przez sekwencjonowanie typu shotgun jest dokładniejsza w porównaniu z sekwencjonowaniem amplikonów 16S rRNA 25, chociaż koszt finansowy wymagany do osiągnięcia wiarygodnej głębokości sekwencjonowania jest większy niż w przypadku sekwencjonowania amplikonowego 26. Główną zaletą metagenomiki sekwencjonowania typu shotgun jest to, że zsekwencjonowane regiony różnych genomów w próbce są dostępne do poszukiwania genów po ich taksonomicznej klasyfikacji 27.

Dane sekwencji metagenomicznej są analizowane przez coraz szerszy zakres narzędzi bioinformatycznych. Narzędzia te są w stanie wykonywać szeroką gamę zastosowań, na przykład analizę kontroli jakości surowych danych sekwencji 28, nakładanie się sparowanych odczytów końcowych 29, montaż de novo odczytów sekwencji do kontigów i rusztowań 30,31, klasyfikację taksonomiczną i wizualizację odczytów sekwencji i zmontowanych sekwencji 7,12,32,33 oraz funkcjonalną adnotację złożonych sekwencji 34,35.

Kiszonka, produkowana przez rolników na całym świecie z fermentowanych zbóż, takich jak kukurydza (Zea mays), jest głównie używana jako pasza dla bydła. Kiszonka jest traktowana bakterią Lactobacillus sp. w celu wspomagania fermentacji 36, ale do tej pory wiedza na temat innych populacji drobnoustrojów występujących w kiszonce jest ograniczona. Proces fermentacji może prowadzić do rozpowszechnienia się niepożądanych i potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów w kiszonce 37. Oprócz drożdży i pleśni bakterie szczególnie przystosowują się do środowiska beztlenowego podczas fermentacji kiszonki i częściej są związane z chorobami zwierząt gospodarskich niż z degradacją kiszonki 38. Bakterie kwasu masłowego mogą zostać przypadkowo dodane z resztek glebowych podczas napełniania silosów na kiszonkę i są w stanie przekształcić kwas mlekowy, produkt fermentacji beztlenowej, w kwas masłowy, zwiększając w ten sposób pH kiszonki 39. Ten wzrost pH może prowadzić do gwałtownego wzrostu liczby bakterii powodujących psucie się, które normalnie nie byłyby w stanie utrzymać wzrostu w optymalnych warunkach fermentacji kiszonki 38. Clostridium spp., Listeria spp. i Bacillus spp. są szczególnie niepokojące, zwłaszcza w kiszonce na paszę dla bydła mlecznego, ponieważ zarodniki bakterii, które przetrwały w przewodzie pokarmowym 40 , mogą dostać się do łańcucha pokarmowego, prowadzić do psucia się żywności, a w rzadkich przypadkach do śmierci zwierząt i ludzi 37,39,41-44. Ponadto, chociaż trudno jest oszacować dokładny wpływ ekonomiczny leczenia weterynaryjnego i strat zwierząt gospodarskich spowodowanych psuciem się kiszonki, wystąpienie ogniska choroby może być szkodliwe dla gospodarstwa.

Przypuszcza się, że za pomocą podejścia metagenomicznego możemy sklasyfikować populacje mikroorganizmów, które są obecne w próbkach kiszonki, a ponadto zidentyfikować społeczności mikrobiologiczne związane z psuciem się kiszonki, które z kolei potencjalnie miałyby szkodliwy wpływ na zwierzęta gospodarskie, umożliwiając podjęcie działań zaradczych zanim kiszonka zostanie wykorzystana jako źródło pożywienia.

Protokół

1. Lokalizacja strony

  1. Próbkę kiszonki należy pobrać z odpowiedniego miejsca, takiego jak gospodarstwo rolne. Tutaj farma znajdowała się w Ballydulea, Co. Cork, Irlandia (51°51'58.4"N 8°16'48.7"W).

2. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Ekstrakcja DNA została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Kontrola ujemna, która nie zawierała próbki, była stosowana w całej metodzie przygotowania biblioteki.

  1. Dodać 100 - 400 mg próbki do 978 μl buforu fosforanu sodu i 122 μl buforu do lizy gleby w dostarczonych probówkach do lizy
    2. .
  2. Homogenizować próbki, umieszczając probówki do lizy w homogenizatorze na 40 s z prędkością 6,0 m/s.
  3. Odwirować lizaty przy 14 000 x g przez 15 minut i przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej zawierającej 250 μl roztworu osadu białkowego (PPS). Wymieszaj roztwór, odwracając 10 razy i odwiruj przy 14 000 x g przez 5 minut.
  4. Dodać supernatant do 1 ml matrycy wiążącej DNA w czystej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wymieszaj roztwór, ciągle odwracając probówkę przez 3 minuty. Pozostawić mieszaninę do osiadania na 3 minuty, a następnie wyrzucić 500 μl supernatantu. Wymieszać pozostały supernatant.
  5. Przenieść 600 μl zawiesiny do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 x g przez 1 min. Odrzucić filtrat i powtórzyć proces z pozostałą zawiesiną.
  6. Dodać 500 μl buforu do matrycy wiążącej DNA w filtrze wirowym, wymieszać pipetując, a następnie odwirować przy 14 000 x g przez 1 min.
  7. Wyrzuć filtrat i ponownie odwiruj filtr wirowy przy 14 000 x g przez 2 minuty, aby upewnić się, że cały bufor płuczący został usunięty. Suszyć filtr wirowy w temperaturze 23 °C przez 5 minut.
  8. Podgrzej wstępnie (70 °C) wodę wolną od DNaz (DES) i ponownie zawiesić matrycę wiążącą DNA w 100 μl DES w filtrze wirowym. Przenieś filtr wirowy do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wiruj przy 14 000 x g przez 1 minutę w celu wymycia DNA. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia dalszej analizy.

3. Oczyszczanie DNA za pomocą koralików oczyszczających DNA

UWAGA: Przed przygotowaniem biblioteki metagenomicznej, wyekstrahowane DNA zostało oczyszczone za pomocą kulek oczyszczających, aby zapewnić uzyskanie czystej próbki DNA.

  1. Inkubować kulki w temperaturze 23 °C przez 30 minut przed użyciem. Dodać 2 objętości kulek do próbki DNA i inkubować roztwór w temperaturze 23 °C przez 5 minut.
  2. Umieścić próbki na magnesie separacyjnym na 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 200 μl świeżego 80% etanolu (EtOH). Suszyć koraliki na powietrzu przez 10 minut.
  3. Wyjąć próbki z magnesu rozdzielającego i dodać 50 μl buforu elucyjnego (EB), wymieszać pipetując.
  4. Inkubować zawiesinę w temperaturze 23 °C przez 5 minut, po czym umieścić próbki z powrotem na magnesie rozdzielającym na 3 minuty.
  5. Przenieś supernatant, który zawiera DNA, do czystej probówki. Wyrzuć koraliki.
  6. Określić ilościowo oczyszczone DNA zgodnie z sekcją czwartą.

4. Kwantyfikacja oczyszczonego DNA

UWAGA: Oczyszczone DNA zostało oznaczone ilościowo za pomocą fluorometru i dwuniciowego (dsDNA) zestawu do oznaczania wysokiej czułości (HS) zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Przygotować roztwór roboczy, stosując stosunek buforu do odczynnika 199:1.
  2. Dodać 10 μl każdego wzorca DNA do 190 μl roztworu roboczego.
  3. Dodać 10 μl oczyszczonego DNA do 190 μl roztworu roboczego. Ostateczna objętość powinna wynosić 200 μl. Próbki wzorcowe i DNA inkubować w temperaturze 23 °C przez 2 minuty.
  4. Analizuj wzorce przed próbkami DNA na fluorometrze, korzystając z instrukcji wyświetlanych na ekranie.

5. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania strzelby

UWAGA: Biblioteka sekwencjonowania strzelb została przygotowana przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowania biblioteki zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Rozcieńczyć próbki DNA do 0,2 ng/μl za pomocą EB. Każdą próbkę, która jest już poniżej tego stężenia, tj. kontroli ujemnej, pozostawia się w obecnym stężeniu.
  2. Zmieszać 5 μl oczyszczonego DNA z 10 μl buforu i 5 μl mieszanki enzymatycznej. Próbki inkubować w temperaturze 55 °C przez 5 minut.
  3. Dodać 5 μl buforu neutralizującego i inkubować roztwór w temperaturze 23 °C przez 5 minut.
  4. Dodać po 5 μl każdego ze wskaźników sekwencjonowania specyficznych dla próbki i 15 μl głównej mieszanki PCR.
  5. W termocyklerze inkubować próbki w temperaturze 72 °C przez 3 minuty, w temperaturze 95 °C przez 30 s, następnie w 12 cyklach w temperaturze 95 °C przez 10 s, w temperaturze 55 °C przez 30 s i w temperaturze 72 °C przez 30 s. Próbki należy inkubować w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
  6. Oczyścić przygotowane DNA, stosując oczyszczanie kulkowe jak poprzednio, ale z końcową elucją, wyciskając 30 μl EB.

6. Kontrola ilości i jakości biblioteki

UWAGA: Ilość i jakość przygotowanych bibliotek została oceniona za pomocą komercyjnego zestawu i oprzyrządowania.

  1. Inkubować składniki zestawu w temperaturze 23 °C przez 30 minut przed użyciem.
  2. Dodaj 2 μl DNA do 2 μl buforu i wiruj przez 1 minutę przy 2,000 obr./min.
  3. Zakręć próbkę, aby upewnić się, że znajduje się na dnie probówki.
  4. Włóż probówki z próbkami, taśmę analityczną i końcówki do urządzenia i wykonaj analizę zgodnie z zaleceniami oprogramowania.

7. Sekwencjonowanie DNA

  1. Przenieś przygotowane i oznaczone ilościowo próbki bibliotek sekwencjonowania DNA do usługi sekwencjonowania i sekwencjonuj przy użyciu sekwencjonowania sparowanych końców 300 pz 45.

8. Analiza surowych danych sekwencyjnych

UWAGA: Polecenia dla każdego programu korzystającego z systemu operacyjnego Linux są pokazane poniżej kroku protokołu. Potok używany do analizy danych sekwencyjnych pokazano na rysunku 1. Programy muszą zostać zainstalowane przez użytkownika przed analizą. Proces ten powinien być wykonywany indywidualnie dla każdej próbki.

  1. Analizuj i wizualizuj dane sekwencji DNA za pomocą FastQC 46, wpisując w wierszu poleceń /path-to-file/fastqc, a następnie w przód i w tył surowe odczyty raw_read1.fastq raw_read2.fastq.
  2. Określ folder wyjściowy, wpisując -o output_fastqc i format pliku surowych plików odczytanych przez -f fastq.
  3. Wyświetl plik wyjściowy (Rysunek 2).
    ścieżka do-pliku/fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory -f fastq.

9. Kontrola jakości, przycinanie i filtrowanie danych sekwencji

  1. Uruchom program do przycinania, Trimmomatic 28, wpisując w wierszu poleceń java -jar /ścieżka-do-pliku/ trimmomatic-0.35.jar.
  2. Określ, że pliki są sparowanymi plikami końcowymi, wpisując "PE". Określ, że 16 jednostek centralnych (CPU) powinno być używanych przez program, wpisując -threads 16.
  3. Wymień dwa pliki do sprawdzenia w ramach kontroli jakości, wpisując nazwy nieprzetworzonych odczytów do przodu i do tyłu. Prefiks plików wyjściowych jest określany przez wpisanie -baseout silage.
  4. Zdefiniuj opcje programu, wpisując ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:20 CROP:200 HEADCROP:15 MINLEN:36.
  5. Po zakończeniu przeanalizuj przycięte sekwencje za pomocą FastQC, tak jak poprzednio, i porównaj dane wyjściowe z surowymi danymi sekwencji, aby upewnić się, że przycinanie zostało przeprowadzone pomyślnie.
    UWAGA: Narzędzie programowe Trimmomatic przycina odczyty dalej, usuwając wiodące bazy niskiej jakości lub N (poniżej jakości 3), usuwając końcowe bazy niskiej jakości lub N zasad (poniżej jakości 3) i skanując każdy odczyt za pomocą przesuwanego okna o szerokości 4 baz. Parametry zostały ustawione na cięcie, gdy średnia jakość na bazę spadnie poniżej 20, a następnie na spadek wszelkich odczytów poniżej 36 zasad. Na koniec 15 baz zostało przyciętych z nagłówka każdego odczytu, a odczyty zostały przycięte, aby zachować 200 baz od początku odczytu. Ten ostatni krok został wykonany w celu przezwyciężenia niektórych problemów z jakością podczas sekwencjonowania długich (> 200 bp) odczytów. Można je dostosować do konkretnych próbek 28,
    java -jar /ścieżka-do-pliku/trimmomatic-0.35.jar PE -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout kiszonka ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10 PROWADZENIE:3 KOŃCOWE:3 PRZYCINANIEOKNO:4:20 PRZYCINANIE:200 PRZYCINANIE:15 MINLEN:36

10. Montaż metagenomu

  1. Scal niesparowane, przycięte odczyty, wpisując cat, a następnie niesparowane odczyty; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq. Zapisz pliki w nowym pliku, wpisując > silage_merged_unpaired.fastq
    kot silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq > silage_merged_unpaired.fastq
  2. Aby de novo złożyć zsekwencjonowane DNA, użyj SPAdes (St. Petersburg genome assembler) 30, wpisując /path-to-file/spades.py. Określ, że 16 procesorów ma być używanych, wpisując -t 16 i że parametr metagenomiczny powinien być zastosowany, wpisując --meta.
  3. Zidentyfikuj przycięte odczyty do przodu za pomocą -1 silage_read1_paired.fastq, a odwrotne odczyty za pomocą -2 silage_read2_paired.fastq. Scalone, niesparowane odczyty są określone przez -s silage_merged_unpaired.fastq.
  4. Zdefiniuj folder wyjściowy, wpisując -o silage_spades.
    ścieżka-do-pliku/spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades

11. Nakładanie się odczytu na sparowanym końcu

  1. Scal pary odczytów sekwencji DNA za pomocą FLASH (Fast Length Adjustment of Short Reads) 29, wpisując w wierszu poleceń /path-to-file/flash. Określ, że powinno być używanych 16 procesorów, używając -t 16, a prefiks wyjściowy, wpisując -o kiszonka.
  2. Zidentyfikuj przycięte odczyty, wpisując silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq
    ścieżka do-pliku/flash -t 16 -o FLASHed silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq

12. Klasyfikacja taksonomiczna

  1. Wpisz /path-to-file/kraken i określ bazę danych, wpisując --db /path-to-file/standard.
  2. Zdefiniuj, że należy użyć 16 procesorów CPU, wpisując --threads 16 i zidentyfikuj folder wyjściowy przy użyciu polecenia --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt. Wpisz nazwę pliku wejściowego; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq
    ścieżka do-pliku/kraken --db standard --thread 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq
    UWAGA: Klasyfikacja złożonych rusztowań sekwencji DNA przy użyciu Kraken 7 została zakończona na podstawie najnowszej, standardowej bazy danych Kraken, która zawierała wszystkie dostępne sekwencje genomu prokariotów.
  3. Przenieś kolumny 2 i 3 z pliku wyjściowego do nowego pliku, wpisując cut -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt > FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int
  4. Otwórz plik wyjściowy w web browser.
    cut -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt > FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int
  5. Zaimportuj nowy plik do Krona 12, wpisując ktImportTaxonomy. Określ plik wejściowy, wpisując FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int. Zidentyfikuj plik wyjściowy, wpisując -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html.
    ścieżka-do-pliku/ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html

13. Adnotacja funkcjonalna

  1. Wejdź na stronę MG-RAST 47, http://metagenomics.anl.gov/. W razie potrzeby zarejestruj się jako nowy użytkownik. Po zalogowaniu kliknij przycisk "Prześlij". Prześlij zmontowane rusztowania z kroku 10.
  2. Po przesłaniu plików kliknij "Prześlij" i postępuj zgodnie z instrukcjami, czekając na zakończenie analizy.
  3. Po zakończeniu analizy wyświetl link wysłany e-mailem od MG-RAST lub alternatywnie kliknij "Postęp". Dostępna jest lista zrealizowanych zadań. Kliknij odpowiedni identyfikator zadania, a następnie link do "strony pobierania".
  4. Na stronie pobierania, pod nagłówkiem "Grupowanie białek 90%", kliknij przycisk białka, aby pobrać przewidywany plik białka, 550.cluster.aa90.faa.
  5. Aby sklasyfikować białka jako przypuszczalnie należące do określonej klasy enzymów CAZy, porównaj pobrane białka z bazą danych CAZy 48. Pobierz bazę danych Carbohydrate-Active enZYmes (CAZy) z plików to: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip i PL.zip. Pliki te reprezentują odpowiednio następujące klasy enzymów: działania pomocnicze (AA), esterazy węglowodanowe (CE), hydrolazy glikozydowe (GH), transferazy glikozylowe (GT) i liazy polisacharydowe (PL).
  6. Rozpakuj pliki bazy danych i dodaj adnotacje do białek, określając podobieństwo białek do białek z bazy danych CAZy za pomocą algorytmu USEARCH UBLAST 49. Aby użyć pętli bash (dla i w *.txt) do iteracji po 5 plikach bazy danych .txt, wpisz "for i w *.txt; zrób".
  7. Uruchom USEARCH, wpisując /path-to-file/usearch8 z parametrem -ublast, aby użyć algorytmu ublast. Następnie wpisz nazwę pliku sekwencji białka pobranego z MG-RAST, "mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa".
  8. Aby wskazać plik bazy danych, który ma być używany, wpisz "-db $i" i aby określić próg wartości E na poziomie 1e-5, wpisz "-evalue 1e-5".
  9. Aby zakończyć wyszukiwanie po odkryciu sekwencji docelowej i tym samym sklasyfikowaniu tej sekwencji białka jako należącej do docelowej klasy enzymów, np. GH, należy wpisać "-masaccepts 1".
  10. Aby zdefiniować, że należy użyć 16 procesorów, wpisz "-threads 16", a aby określić format pliku wyjściowego jako tekst rozdzielany tabulatorami, wpisz "-blast6out". Aby zidentyfikować plik wyjściowy, wpisz "$i.ublast". Aby zakończyć pętlę bash, wpisz "; Gotowe"
    dla i w *.txt;
    do /ścieżka-do-pliku/usearch8 -ublast .. /mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $i -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 -blast6out $i.ublast;
    gotowy

14. Wizualizacja adnotacji CAZy

  1. Aby zwizualizować dane wyjściowe z adnotacji CAZy jako diagram Venna, wygeneruj listy identyfikatorów białek dla każdej klasy enzymów przy użyciu pętli bash. Wpisz "for i w *.ublast; zrób".
  2. Aby przenieść kolumnę 1 z pliku wyjściowego do nowego pliku, wpisz "cat $i | cut -f 1 >$i.list".
  3. Zakończ pętlę i wpisz "; gotowe".
  4. Otwórz pliki .list w edytorze tekstu. Wejdź na stronę , wybierz liczbę zestawów jako 5 i wklej zawartość każdego pliku z listą w osobnym polu. Pobierz wynikowy diagram jako plik . SVG plik.
    for i w *.ublast;
    czy kot $i | cut -f 1 >$i.list;
    gotowy

Wyniki

Przed analizą bioinformatyczną surowe odczyty sekwencyjne zostały przycięte, a adaptery usunięte przy użyciu oprogramowania Trimmomatic 28. Po etapie przycinania i filtrowania liczba odczytów została zredukowana do 50% odczytów sekwencyjnych (Tabela 1). Średni wynik phred dla zasad po kontroli jakości wynosił >30 (Rysunek 2).

Pary sekwencji DNA posiadające regiony nakładające się zostały połączone przy użyciu oprogramowania FLASH 29 w celu wygenerowania pojedynczych, dłuższych odczytów; odczyty nienakładające się zachowano w osobnym pliku. Pomyślnie połączono 45,47% odczytów (105 343). Po połączeniu nakładających się odczytów za pomocą programu FLASH, uzyskane wydłużone fragmenty poddano klasyfikacji taksonomicznej bakterii przy użyciu oprogramowania Kraken 7, a następnie zwizualizowano za pomocą oprogramowania Krona (Rysunek 3).

Większość gatunków bakterii obecnych w metagenomie kiszonki należy do 4 typów prokariotycznych: Firmicutes (34%), Actinobacteria (28%), Proteobacteria (27%) oraz Bacteroidetes (7%). Rozkład klas występujących w obrębie tych typów przedstawiono na Rysunku 4. Najliczniejszymi gatunkami w metagenomie były Lactobacillus spp. (24%; Firmicutes), Corynebacterium spp. (8%; Actinobacteria), Propionibacterium spp. (3%; Actinobacteria) oraz Prevotella spp. (3%; Bacteroidetes). Zaobserwowano również gatunki istotne dla zdrowia zwierząt i powiązane z chorobami; w próbce kiszonki przewidywano obecność Clostridium spp. (1%), Bacillus spp. (0,6%) oraz Listeria spp. (0,2%).

Adnotacja funkcjonalna została przeprowadzona na zmontowanych odczytach. Metagenom zmontowano za pomocą assemblerem SPAdes 30, wykorzystując przycięte i odfiltrowane odczyty parzyste oraz nieparzyste, co pozwoliło na wygenerowanie 92 284 scaffoldów. W celu zidentyfikowania celulaz, białka zostały przewidziane przy użyciu MG-RAST i adnotowane z wykorzystaniem bazy danych Carbohydrate-Active enZYmes (CAZy). Z 97 562 przewidzianych białek, 6357 adnotowano jako domniemane enzymy aktywne w stosunku do węglowodanów w jednej z pięciu klas enzymów tworzących bazę danych CAZy (Rysunek 5). Wyniki zwizualizowano w formie diagramu Venna przy użyciu oprogramowania InteractiVenn 50, co pokazało rozkład adnotacji białek, w tym tych zawierających adnotacje więcej niż jednej klasy enzymów CAZy. spośród nich 3861 przewidywano jako posiadające aktywność glikozydową, które zostaną dalej scharakteryzowane w laboratorium w celu potwierdzenia ich funkcji.

Schemat przetwarzania danych metagenomicznych; etapy obejmują przycinanie odczytów, składanie (assembly) oraz predykcję proteomu.
Rycina 1: Bioinformatyczny potok analizy metagenomicznej kiszonki. W celu zbadania mikrobiomu kiszonki zastosowano dwa główne podejścia: klasyfikację taksonomiczną oraz adnotację funkcjonalną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wyników jakości dla sekwencjonowania DNA; porównanie odczytów surowych i przyciętych; analiza bioinformatyczna.
Rycina 2: Jakość sekwencji na pojedynczą zasadę przed i po przycinaniu oraz usuwaniu adapterów. Wykres jakości sekwencji na pojedynczą zasadę z programu FASTQC przedstawia średnią wartość phred wzdłuż odczytów sekwencji przed i po kontroli jakości. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat analizy różnorodności mikrobiologicznej; drzewo filogenetyczne z 105 343 przyciętych sekwencji z programu FLASH.
Rycina 3: Klasyfikacja taksonomiczna mikrobiomu bakteryjnego kiszonki stałej. Klasyfikacja przyciętych i nakładających się odczytów sekwencji z programu FLASH została przeprowadzona przy użyciu Kraken 7, a następnie zwizualizowana za pomocą krona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy rozkładu typów bakterii; obejmuje Firmicutes, Actinobacteria; wyniki badania mikrobiomu.
Rycina 4: Rozkład klas taksonomicznych dla 4 najliczniejszych typów w mikrobiomie bakteryjnym kiszonki stałej. Procentowy udział każdej klasy bakterii w ramach czterech najliczniejszych typów. Firmicutes: Clostridia (czerwony) i Bacilli (ciemnoniebieski); Proteobacteria: delta/epsilon (różowy), alpha (jasnoniebieski), gamma (pomarańczowy) i beta (turkusowy); Bacteroidetes: Flavobacteriia (ciemnoniebieski) i Bacteroidia (jasnozielony); Actinobacteria: Coriobacteriia (ciemnofioletowy) i pozostałe Actinobacteria (ciemnozielony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram Venna; analiza nakładania się zbiorów danych; grupowanie porównawcze; część wspólna danych badawczych.
Rycina 5: Adnotacja CAZy przewidywanego proteomu w mikrobiomie kiszonki stałej. Diagram Venna przedstawiający rozkład pięciu klas enzymów adnotacji CAZy w przewidywanym proteomie mikrobiomu kiszonki stałej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Liczba surowych odczytówLiczba odfiltrowanych odczytów (parowanych)Liczba odfiltrowanych odczytówLiczba odczytów po FLASH
(parowanych)(nieparowanych)
2,374,949 x2231,679 x21,892,534105,343

Tabela 1: Tabela podsumowująca odczyty sekwencjonowania.

Dyskusja

Chociaż analiza in silico może dać doskonały wgląd w społeczności drobnoustrojów, które są obecne w próbkach środowiskowych, niezwykle ważne jest, aby wykazane klasyfikacje taksonomiczne były przeprowadzane w połączeniu z odpowiednimi kontrolami i aby osiągnięto odpowiednią głębokość sekwencjonowania, aby uchwycić całą obecną populację 51.

W przypadku każdej analizy obliczeniowej istnieje wiele dróg do osiągnięcia podobnego celu. Metody, które zastosowaliśmy w tym badaniu, są przykładami odpowiednich i prostych metod, które zostały połączone w celu uzyskania szeregu analiz mikrobiomu kiszonki. Do analizy danych metagenomicznych dostępnych jest różnorodnych i stale rosnących narzędzi i technik bioinformatycznych, na przykład Phylosift 8 i MetaPhlAn2 52, które powinny zostać ocenione przed badaniem pod kątem ich znaczenia dla próbki i wymaganej analizy 53. Metody analizy metagenomicznej są ograniczone przez bazy danych dostępne do klasyfikacji, głębokości sekwencjonowania i jakości sekwencjonowania.

Zademonstrowane tutaj przetwarzanie bioinformatyczne zostało przeprowadzone na lokalnej maszynie o dużej mocy; Dostępne są jednak również systemy oparte na chmurze. Te usługi oparte na chmurze pozwalają na wynajem niezbędnej mocy obliczeniowej bez konieczności kosztownej inwestycji w odpowiednią, wydajną lokalną stację roboczą. Potencjalnym zastosowaniem tej metody byłaby ocena kiszonki przed jej zastosowaniem w rolnictwie, aby upewnić się, że nie ma w niej potencjalnie szkodliwych bakterii, zapobiegając w ten sposób ich przedostawaniu się do łańcucha pokarmowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Andrew Birdowi za próbki kiszonki oraz Audrey Farbos z Exeter Sequencing Service za pomoc w przygotowaniu bibliotek sekwencjonowania DNA. Exeter Sequencing Service i podstawowe urządzenia obliczeniowe na Uniwersytecie w Exeter. Nagroda Rady ds. Badań Medycznych ds. Infrastruktury Klinicznej (MR/M008924/1). Wellcome Trust Institutional Strategic Support Fund (WT097835MF), Wellcome Trust Multi User Equipment Award (WT101650MA) oraz BBSRC LOLA award (BB/K003240/1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw FastDNA SPIN do glebyMP Bio 116560200Ekstrakcja DNA
DNA FastPrepMP Bio116004500Ekstrakcja DNA
Koraliki Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Bufor elucyjnyQiagen19806Oczyszczanie DNA
Qubit FluorometrThermo FisherQ33216DNA Kwantyfikacja
Qubit dsDNA HS Zestaw testowyThermo FisherQ32854Kwantyfikacja DNA
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XTPrzygotowanie bibliotekiIlluminaFC-131-1024
Zestaw indeksów Nextera XTPrzygotowanie biblioteki IlluminaFC-131-1001Przygotowanie biblioteki
TapeStation 2200AgilentG2964AAKwantyfikacja DNA
HS D100 ScreenTapeAgilent5067-5584Kwantyfikacja DNA
HS D100 Odczynniki ScreenTapeAgilent5067-5585Końcówki do kwantyfikacji DNA
TapeStationAgilent5067-5153Kwantyfikacja DNA
TapeStationAgilent401428 i 401425Sekwencjonowanie DNA
HiSeq 2500Illumina- dostarczane przez usługa sekwencjonowania
Stacja robocza do analizy dużej mocyRóżnesystemy lokalne lub oparte na chmurze, preferowane przez użytkownika
do oczyszczania DNA

Bibliografia

  1. Riesenfeld, C. S., Schloss, P. D., Handelsman, J. Metagenomics: genomic analysis of microbial communities. Annu. Rev. Genet. 38 (1), 525-552 (2004).
  2. Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59 (1), 143-169 (1995).
  3. Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  4. Venter, J. C., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science. 304 (5667), 66-74 (2004).
  5. Vilanova, C., Iglesias, A., Porcar, M. The coffee-machine bacteriome: biodiversity and colonisation of the wasted coffee tray leach. Sci. Rep. 5, 17163(2015).
  6. Hayden, E. C. Technology: The $1,000 genome. Nature. 507 (7492), 294-295 (2014).
  7. Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Gen. Biol. 15 (3), 46(2014).
  8. Darling, A. E., et al. PhyloSift: phylogenetic analysis of genomes and metagenomes. PeerJ. 2 (12), 243(2014).
  9. Buchfink, B., Xie, C., Huson, D. H. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nat. Meth. 12 (1), 59-60 (2015).
  10. Moreno-Hagelsieb, G., Hudy-Yuffa, B. Estimating overannotation across prokaryotic genomes using BLAST+, UBLAST, LAST and BLAT. BMC Res Notes. 7 (1), 651(2014).
  11. Hauser, M., Steinegger, M., Söding, J. MMseqs software suite for fast and deep clustering and searching of large protein sequence sets. Bioinf. 32 (9), 1323-1330 (2016).
  12. Ondov, B. D., Bergman, N. H., Phillippy, A. M. Interactive metagenomic visualization in a Web browser. BMC Bioinf. 12, (2011).
  13. Kolde, R., Vilo, J. GOsummaries: an R Package for Visual Functional Annotation of Experimental Data. F1000Res. 4, 574(2015).
  14. Reddy, T. B. K., et al. The Genomes OnLine Database (GOLD) v.5: a metadata management system based on a four level (meta)genome project classification. Nuc. Aci. Res. 43 (1), 1099-1106 (2015).
  15. Camacho, C., et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).
  16. Chakravorty, S., Helb, D., Burday, M., Connell, N., Alland, D. A detailed analysis of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria. J. Micro. Met. 69 (2), 330-339 (2007).
  17. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6(2014).
  18. Mikheyev, A. S., Tin, M. M. Y. A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer. Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1097-1102 (2014).
  19. Schadt, E. E., Turner, S., Kasarskis, A. A window into third generation sequencing. Hum. Mol. Genet. 20 (4), 853-853 (2011).
  20. Shapiro, B., Hofreiter, M. A Paleogenomic Perspective on Evolution and Gene Function: New Insights from Ancient DNA. Science. 343 (6169), 1236573(2014).
  21. Der Sarkissian, C., et al. Ancient genomics. Phil. Trans. R. Soc. B. 370 (1660), (2015).
  22. Patin, N. V., Kunin, V., Lidström, U., Ashby, M. N. Effects of OTU Clustering and PCR Artifacts on Microbial Diversity Estimates. Microb Ecol. 65 (3), 709-719 (2013).
  23. McInroy, G. R., Raiber, E. -A., Balasubramanian, S. Chemical biology of genomic DNA: minimizing PCR bias. Chem. Commun. 50 (81), 12047-12049 (2014).
  24. Aller, P., Rould, M. A., Hogg, M., Wallace, S. S., Doublié, S. A structural rationale for stalling of a replicative DNA polymerase at the most common oxidative thymine lesion, thymine glycol. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 814-818 (2007).
  25. Ranjan, R., Rani, A., Metwally, A., McGee, H. S., Perkins, D. L. Analysis of the microbiome: Advantages of whole genome shotgun versus 16S amplicon sequencing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 469 (4), 967-977 (2016).
  26. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  27. Li, X., Rao, S., Wang, Y., Gong, B. Gene mining: a novel and powerful ensemble decision approach to hunting for disease genes using microarray expression profiling. Nuc. Aci. Res. 32 (9), 2685-2694 (2004).
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  29. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinf. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  30. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. J. Comput. Biol. 19 (5), 455-477 (2012).
  31. Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. metaSPAdes: a new versatile de novo metagenomics assembler. , (2016).
  32. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  33. Tanaseichuk, O., Borneman, J., Jiang, T. Phylogeny-based classification of microbial communities. Bioinf. 30 (4), 449-456 (2014).
  34. Bose, T., Haque, M. M., Reddy, C., Mande, S. S. COGNIZER: A Framework for Functional Annotation of Metagenomic Datasets. PLoS ONE. 10 (11), 0142102(2015).
  35. Sharma, A. K., Gupta, A., Kumar, S., Dhakan, D. B., Sharma, V. K. Woods: A fast and accurate functional annotator and classifier of genomic and metagenomic sequences. Genomics. 106 (1), 1-6 (2015).
  36. Eikmeyer, F. G., et al. Metagenome analyses reveal the influence of the inoculant Lactobacillus buchneri CD034 on the microbial community involved in grass ensiling. J. Biotech. 167 (3), 334-343 (2013).
  37. Driehuis, F., Elferink, S. J. W. H. O. The impact of the quality of silage on animal health and food safety: A review. Vet. Quart. 22 (4), 212-216 (2000).
  38. Dunière, L., Sindou, J., Chaucheyras-Durand, F., Chevallier, I., Thévenot-Sergentet, D. Silage processing and strategies to prevent persistence of undesirable microorganisms. Anim Feed Sci Technol. 182 (1-4), 1-15 (2013).
  39. Vissers, M. M. M., et al. Minimizing the Level of Butyric Acid Bacteria Spores in Farm Tank Milk. J. of Dairy Sci. 90 (7), 3278-3285 (2007).
  40. Te Giffel, M. C., Wagendorp, A., Herrewegh, A. Bacterial spores in silage and raw milk. Antonie van. , (2002).
  41. Wiedmann, M. ADSA Foundation Scholar Award-An Integrated Science-Based Approach to Dairy Food Safety: Listeria monocytogenes as a Model System. J. of Dairy Sci. 86 (6), 1865-1875 (2003).
  42. Low, J. C., Donachie, W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. Vet J. 153 (1), 9-29 (1997).
  43. Schoder, D., Melzner, D., Schmalwieser, A. Important vectors for Listeria monocytogenes transmission at farm dairies manufacturing fresh sheep and goat cheese from raw. J.Food. , (2011).
  44. Lindström, M., Myllykoski, J., Sivelä, S., Korkeala, H. Clostridium botulinumin Cattle and Dairy Products. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 50 (4), 281-304 (2010).
  45. Bentley, D. R., et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456 (7218), 53-59 (2008).
  46. Andrews, S. Babraham Bioinformatic- FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. , (2015).
  47. Keegan, K. P., Glass, E. M., Meyer, F. FMG-RAST, a Metagenomics Service for Analysis of Microbial Community Structure and Function. Methods Mol. Biol. 1399, Chapter 13 207-233 (2016).
  48. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nuc. Aci. Res. 37, Database issue 233-238 (2009).
  49. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinf. 26 (19), 2460-2461 (2010).
  50. Heberle, H., et al. InteractiVenn: a web-based tool for the analysis of sets through Venn diagrams. BMC Bioinf. 16 (1), 213(2015).
  51. Ni, J., Yan, Q., Yu, Y. How much metagenomic sequencing is enough to achieve a given goal. Sci. Rep. 3, 1968(2013).
  52. Truong, D. T., et al. MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling. Nat. Meth. 12 (10), 902-903 (2015).
  53. Oulas, A., et al. Metagenomics: tools and insights for analyzing next-generation sequencing data derived from biodiversity studies. Bioinform Biol Insights. 9 (9), 75-88 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie typu shotgunmikrobiom kiszonkispo eczno mikrobiologicznaekstrakcja DNAklasyfikacja taksonomicznaadnotacja funkcjonalnanarz dzia bioinformatycznebiblioteka sekwencjonowania DNAenzymy aktywne w stosunku do w glowodan w
Analiza metagenomiczna kiszonki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.