Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Summary

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Abstract

Próbki w pełni zanurzone w cieczy mogą być badane w nanoskali w rozdzielczości przestrzennej za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) przy użyciu komory mikroprzepływowej umieszczonej w uchwycie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i STEM. System mikroprzepływowy składa się z dwóch mikroprocesorów krzemowych podtrzymujących cienkie okienka membranowe z azotku krzemu (SiN). W tym artykule opisano podstawowe kroki ładowania próbki i pozyskiwania danych. Najważniejsze jest upewnienie się, że komora na ciecz jest prawidłowo zmontowana, zapewniając w ten sposób cienką warstwę cieczy i uszczelnienie próżniowe. Protokół ten zawiera również szereg testów niezbędnych do wykonania podczas ładowania próbki w celu zapewnienia prawidłowego montażu. Po załadowaniu próbki do mikroskopu elektronowego należy zmierzyć grubość cieczy. Nieprawidłowy montaż może spowodować, że ciecz będzie zbyt gęsta, podczas gdy zbyt rzadka ciecz może wskazywać na brak płynu, na przykład gdy tworzy się pęcherzyk. Na koniec protokół wyjaśnia, w jaki sposób wykonywane są obrazy i jak można badać procesy dynamiczne. Próbka zawierająca AuNPs jest obrazowana zarówno w czystej wodzie, jak i w soli fizjologicznej.

Introduction

Konwencjonalna skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (STEM) jest ograniczona zakresem próbek odpowiednich do analizy, w szczególności suchych i stałych próbek nadających się do umieszczenia w wysokiej próżni. Jednak wiele pytań naukowych i technologicznych dotyczy materiałów i procesów w nanoskali w środowisku ciekłym. Próbki całkowicie zanurzone w cieczy mogą być teraz badane za pomocą STEM przy użyciu koncepcji, która obejmuje komorę mikroprzepływową umieszczoną w uchwycie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i STEM¹. Ta nowo opracowana technika staje się coraz bardziej popularna, ponieważ zapewnia nowy wgląd w ważne procesy związane z różnymi tematami badawczymi, w tym procesy wzrostu, rozpuszczania i agregacji nanocząstek^2,3,4,5,6. Można badać nie tylko metale, ale także biominerały⁷ i systemy biologiczne^8,9,10,11. Ładowanie próbek i akwizycja obrazu w przypadku STEM w fazie ciekłej różnią się od STEM suchych próbek i obejmują protokół, który wymaga specjalnego szkolenia.

System mikroprzepływowy składa się z dwóch mikroprocesorów krzemowych obsługujących okna membranowe z azotku krzemu (SiN) przezroczyste dla wiązki elektronów o energii 200 keV¹² (patrz Rysunek 1A). Szczegółowe informacje na temat wymiarów i obsługi tych mikroczipów można znaleźć gdzie indziej^12,13. Próbka zwykle zawiera obiekty w skali nano. W niniejszej pracy zaobserwowaliśmy nanocząstki złota (AuNPs). AuNPs są unieruchomione w górnym oknie (w stosunku do wiązki elektronów poruszającej się w dół) lub unoszą się w cieczy. Rozdzielczość przestrzenną w skali nano w STEM uzyskuje się poprzez skanowanie wiązki elektronów nad AuNP i zbieranie przesyłanych rozproszonych elektronów za pomocą detektora pierścieniowego ciemnego pola (ADF)⁹. Dwa mikroczipy są umieszczone w małym otworze w końcówce uchwytu TEM przepływu cieczy¹ (uchwyt działa zarówno dla STEM, jak i TEM, ale jest określany jako uchwyt TEM). Jeden z mikroczipów zawiera przekładkę, dzięki czemu między mikroczipami tworzy się komora na płyn. O-ringi po obu stronach dwóch mikroczipów zapewniają próżniowe uszczelnienie komory cieczy¹³ (patrz rysunek 1B).

Celem tego artykułu jest pokazanie podstawowych kroków ładowania próbek i pozyskiwania danych, tak aby zainteresowani użytkownicy mogli łatwo zapoznać się z tą nową techniką. Używany jest system dostępny w konkretnej firmie, ale protokół obowiązuje również dla systemów innych firm. Technika ta jest bardziej złożona niż konwencjonalne TEM i STEM, a podczas pracy z systemem uchwytów na ciecze należy wziąć pod uwagę szereg praktycznych aspektów¹³. Najważniejsze jest upewnienie się, że komora na ciecz jest prawidłowo zmontowana, zapewniając w ten sposób cienką warstwę cieczy i uszczelnienie próżniowe. Dlatego bardzo ważne jest, aby pracować czysto i zapobiegać tworzeniu się pyłu podczas przygotowania i montażu uchwytu TEM do przepływu cieczy. W szczególności O-ringi i dwa mikroczipy krzemowe muszą być wolne od wszelkich zanieczyszczeń. Nawet drobne cząsteczki kurzu na jednym z mikroczipów mogą znacznie zwiększyć grubość zmontowanego ogniwa, co może uniemożliwić osiągnięcie użytecznej rozdzielczości przestrzennej. Uszczelnienie próżniowe jest ważne, aby po eksperymencie w mikroskopie elektronowym nie pozostały żadne zanieczyszczenia ani uszkodzenia. Protokół ten opisuje procedurę załadunku i kilka niezbędnych testów. Obsługa mikroskopu elektronowego jest prosta, ale wymaga kilku dodatkowych kroków w porównaniu z mikroskopią próbek stałych. Wraz ze wzrostem grubości cieczy więcej elektronów jest absorbowanych i rozpraszanych przez ciecz; Niezbędny jest pomiar grubości cieczy. Na koniec protokół wyjaśnia, w jaki sposób wykonywane są obrazy i jak można badać procesy dynamiczne.

Rysunek 1: Komórka przepływu cieczy do skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). orazSchematyczna ilustracja zmontowanej komórki cieczowej. Dwa mikroczipy krzemowe z okienkami membranowymi z azotku krzemu (SiN) są umieszczone między dwoma pierścieniami uszczelniającymi o przekroju okrągłym. Ciecz jest zamknięta między membraną SiN i w ten sposób jest oddzielana od próżni w mikroskopie elektronowym. Skupiona wiązka elektronów skanuje próbkę. Kontrast uzyskuje się z rozproszonych elektronów. Nanocząstki złota (AuNPs) są unieruchomione w cieczy na membranie SiN, ale mogą również przemieszczać się w cieczy. orazSchematyczny przekrój poprzeczny stosu dwóch mikroczipów z O-ringami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

Rysunek 2: Procedura czyszczenia mikroczipów Si. (A) Dwie zlewki napełnia się 40–60 ml acetonu i etanolu każda. (B) Mikroczipy krzemu umieszcza się w zlewce wypełnionej acetonem. Strona z membraną SiN powinna być skierowana do góry. Odbicie dwóch mikroczipów Si wyraźnie pokazuje rowek na odwrocie dwóch mikroczipów. (C) Po 2 minutach mikroczipy krzemu przenosi się do drugiej zlewki wypełnionej etanolem. Po kolejnych 2 minutach mikroczipy krzemu są przenoszone do chusteczki w pomieszczeniu czystym w celu wysuszenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Uchwyt do mikroskopii elektronowej z transmisją przepływu cieczy (TEM). (A) Uchwyt TEM przepływu cieczy z plastikową rurką i strzykawką do przepływu cieczy. (B) Końcówka uchwytu TEM przepływu cieczy zdjęta z wału uchwytu, pokrywa komory ogniwa cieczy, O-ringi i dwa mikroczipy krzemowe. Rurka wystaje z lewej strony końcówki. (C) Komora na ogniwo ciekłe z jednym pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym, szczeliną do umieszczenia mikroczipa. (D) Różne pęsety na powierzchni wolnej od kurzu (folia aluminiowa). (E) Pokrywa komory kuwety cieczowej z dwoma pierścieniami uszczelniającymi o przekroju okrągłym. (F) Dwa mikroczipy krzemowe z okienkami membrany SiN. Po lewej: mikroczip z próbką bez przekładki; Po prawej: Mikroczip na pokrywie z przekładką 200 μm. (G) Układ pomp mikroprzepływowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie mikroczipów

1. Czyszczenie mikroczipów

1. Przygotuj miejsce pracy o niskim poziomie zapylenia w okapie z laminarnym przepływem powietrza z filtrem cząstek stałych.
2. Wyczyść szklane szkiełko mikroskopowe z lekkim szkiełkiem mikroskopowym za pomocą bezwłóknistej chusteczki i czystego etanolu w celu umieszczenia i transportu mikroczipów. Umieścić szkiełko podstawowe na chusteczce higienicznej w pomieszczeniu czystym na szalce Petriego.
   UWAGA: Zawsze unikaj używania etanolu technicznego.
3. Wybrać 5 mikroczipów bazowych (bez przekładki) do umieszczenia próbki i 5 mikroczipów z przekładką o grubości 200 nm.
   UWAGA: Wymiary okna to 20 x 400^μm2, a grubość SiN to 50 nm. Ponieważ istnieje pewna tolerancja wymiarów, zaleca się sprawdzenie wymiarów za pomocą mikroskopu świetlnego.
4. Użyj pęsety pokrytej węglem, aby wyjąć mikroczipy z pudełka do przechowywania i umieścić je na szklanym szkiełku. Chwyć mikroczipy mocno, ale ostrożnie za ich długie boki. Z mikroczipem należy obchodzić się w taki sposób, aby strona membrany SiN była zawsze skierowana do góry.
   UWAGA: Unikaj dotykania delikatnej membrany SiN na górnej stronie. Należy również zachować ostrożność podczas obchodzenia się z mikroczipami, aby uniknąć pękania ich ostrych krawędzi, co może powodować problemy z powodu cząstek krzemu znajdujących się na mikrochipie lub późniejszych wycieków.
   UWAGA: Szkolenie przygotowujące do procedury usuwania mikroczipów z lepkiej powierzchni można przeprowadzić na (tanich) atrapach mikroczipów.
5. Umieść mikroczipy na chusteczce w pomieszczeniu czystym na szalce Petriego. Zamknij naczynie i przenieś je do dygestoria.
   UWAGA: Czynności związane z acetonem są wykonywane w dygestorium w celu zapewnienia bezpieczeństwa chemicznego.
6. Weź dwie szklane zlewki o pojemności 120 ml. Opłucz jedną zlewkę acetonem, a drugą etanolem, aby je oczyścić. Napełnij pierwszy z nich 40-60 ml acetonu, a drugi 40-60 ml etanolu.
   UWAGA: Ważne jest, aby używać płynów klasy HPLC również na tym etapie protokołu.
7. Przenieść mikroczipy do zlewki z acetonem w celu usunięcia ochronnej warstwy rezystancyjnej. Delikatnie przesuń zlewkę ręcznie, aby skutecznie wypłukać mikroczipy, ale uważaj, aby nie obrócić mikroczipów do góry nogami – patrz rysunek 2.
8. Po 2 minutach wyjmij mikroczipy i szybko przenieś je do zlewki z etanolem. Delikatnie przesuwaj zlewkę ręcznie z etanolem przez 2 minuty, aby usunąć wszelkie pozostałości warstwy rezystancyjnej. Przykryj zlewkę folią aluminiową i przenieś ją na stół warsztatowy z laminarnym przepływem powietrza.
   UWAGA: Nie pozwól, aby mikroczipy wyschły podczas przenoszenia, aby uniknąć osadzania się zanieczyszczeń.
9. Wyjmij mikroczipy ze zlewki i umieść je na nowej chusteczce do pomieszczenia czystego. Pozostaw do wyschnięcia na kilka minut i przenieś mikroczipy na szkiełko mikroskopu świetlnego na szalce Petriego.
   UWAGA: Mokre mikroczipy mogą się łatwo obrócić, przewrócić do góry nogami lub przykleić do pęsety po zwolnieniu. Można tego uniknąć, delikatnie dociskając mikroczipy do bibuły filtracyjnej i odciągając pęsetę w kierunku poziomym.
10. Zamknij szalkę Petriego i przenieś mikroczipy do myjki plazmowej.
11. Umieść szkiełko szkiełkowe z mikroczipami w myjce plazmowej. Uruchom 5-minutowy program czyszczenia, aby powierzchnia membrany z azotku krzemu stała się hydrofilowa i usunięta z węglowodorów.
    UWAGA: Odpowiednie ustawienia stosowane w naszej myjce plazmowej to: 70 mTorr, przepływ gazu 11.5 sccm dla O₂ i 35.0 sccm dla Ar, 50 W cel o częstotliwości radiowej (RF), zakres RF 50 W i maksymalny odbity RF. Każda plazma zdolna do indukowania ładunku powierzchniowego jest odpowiednia.
12. Włóż szklane szkiełko z mikroczipem z powrotem do szalki Petriego, zamknij pokrywkę i przenieś ją do mikroskopu świetlnego.
13. Zbadaj mikroczipy pod mikroskopem świetlnym pod kątem ewentualnych pęknięć membrany lub pozostałych cząstek brudu. Zachowaj szczególną ostrożność w obszarach okien i sprawdź, czy nie ma małych plam wskazujących na pęknięcie membrany. Odrzuć mikroczipy z uszkodzonymi membranami.
14. Zamknij szalkę Petriego i przechowuj ją w stole warsztatowym z laminarnym przepływem powietrza.

2. Przygotowanie próbki na mikroczipach

1. Przygotować wodny roztwór AuNP (stabilizowany cytrynianem) przez zmieszanie niewielkich ilości roztworów podstawowych zawierających stabilizowane cytrynianem AuNP o średnicy 30 nm w stężeniu ~3 M.
2. Umieść mikroczipy na czystej, lepkiej powierzchni w pudełku transportowym w celu aplikacji kropelkowej/osadzania próbki.
3. Umieścić kropelkę (1-2 μl) roztworu próbki po stronie membrany SiN świeżo oczyszczonego plazmowo mikroczipa (użyć mikroczipa bez przekładki) i pozostawić roztwór do wyschnięcia w stole warsztatowym z laminarnym przepływem powietrza.
   UWAGA: Procedurę tę można powtórzyć w celu zwiększenia stężenia AuNPs na membranie SiN.
4. Nanieść 1 μl wody dejonizowanej na mikroczip w celu usunięcia soli i/lub środków powierzchniowo czynnych. Po 30 s ostrożnie usuń kroplę wody bibułą filtracyjną. Pozwól mikroczipom wyschnąć w powietrzu w stole warsztatowym z laminarnym przepływem powietrza.
   UWAGA: Wystarczająco duża liczba AuNP przylgnie do mikroczipa i nie będzie już zmywana w wodzie.
5. Przygotowane mikroczipy należy zużyć w ciągu 4 godzin, ponieważ SiN z czasem traci swoje hydrofilowe właściwości powierzchni renderowanej, co może spowodować, że ciecz będzie zachowywać się inaczej podczas eksperymentu. Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z sekcją dyskusji.
6. Do przechowywania i przenoszenia mikroczipów należy używać zamkniętego pudełka transportowego.

2. Przygotowanie uchwytu TEM do przepływu cieczy

1. Czyszczenie uchwytu TEM przepływu cieczy
   1. Wyczyść wszystkie narzędzia (pęsetę i śrubokręt), które będą miały kontakt z częściami próżniowymi za pomocą acetonu i etanolu w kąpieli ultradźwiękowej i umieść je na wolnej od kurzu powierzchni zapewnionej przez kawałek nowej folii aluminiowej umieszczony na stole roboczym. Pracować w rękawicach, aby uniknąć zanieczyszczenia uchwytu TEM przepływu cieczy.
      UWAGA: Narzędzia nie muszą być dokładnie czyszczone, jeśli masz pewność, że są czyste do pracy z częściami odkurzającymi. Rękawiczek można unikać, jeśli jest się w stanie obchodzić się ze sprzętem bez dotykania części próżniowych.
   2. Umieścić uchwyt TEM przepływu cieczy pod lornetkowym mikroskopem świetlnym w taki sposób, aby można było zaobserwować końcówkę uchwytu zawierającego komorę cieczy. Zobacz rysunek 3.
   3. Zdejmij pokrywę końcówki uchwytu i umieść ją na powierzchni wolnej od kurzu.
      UWAGA: Tytanowa pokrywka jest wrażliwa na zarysowania spowodowane twardszymi materiałami, takimi jak pęseta. Zaleca się stosowanie pęsety pokrytej polimerem do wrażliwych materiałów.
   4. Przygotuj co najmniej 1-2 ml czystej wody (klasa HPLC).
      UWAGA: Jeśli nie używa się cieczy klasy HPLC, zaleca się sprawdzenie, czy używane płyny nie zawierają mikrocząstek, które mogłyby prowadzić do zatkania układu przepływowego; W razie potrzeby przefiltruj ciecz za pomocą filtra z mikroporami.
   5. Za pomocą szklanej strzykawki (1 ml) przepłukać cały system przepływu 0,5 ml czystej wody. Zaleca się stosowanie mikroprzepływowego systemu pompy strzykawkowej. Użyj pipety i/lub bibuły filtracyjnej, aby usunąć ciecz wyrzucaną do komory kuwety cieczowej. Przetestuj wszystkie rurki pod kątem przepływu cieczy. Następnie osusz końcówkę uchwytu za pomocą bibuły filtracyjnej i/lub pipety.
   6. Użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić, czy końcówka uchwytu jest czysta i sucha. W razie potrzeby umyj końcówkę uchwytu wodą lub etanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości stałe, które mogły pozostać po wysuszonym roztworze. Usuń również kawałki kurzu lub resztki włókien. Ostrożnie usuń te kawałki pęsetą, unikając w ten sposób zarysowania tytanowej powierzchni. Sprawdź również wnętrze rowków O-ringów i usuń resztki płynu za pomocą małego kawałka chusteczki do pomieszczeń czystych.
      UWAGA: Jeśli uchwyt nie oczyści się w tej procedurze, zaleca się wyjęcie końcówki z uchwytu i czyszczenie jej w acetonie przez 2 minuty i w etanolu przez kolejne 2 minuty za pomocą kąpieli ultradźwiękowej.
   7. Sprawdź wszystkie dalsze części końcówki (O-ringi, pokrywę i) pod mikroskopem świetlnym i usuń kurz, włókna itp...
      UWAGA: Czasami należy również usunąć małe kawałki pochodzące ze lub mikroczipów Si. W razie potrzeby krótko wyczyść części odkurzacza etanolem klasy HPLC. Pokrywkę i można czyścić za pomocą ultradźwięków, jak wyjaśniono dla końcówki. Unikaj częstego umieszczania O-ringów w etanolu, ponieważ może to z czasem spowodować kruchość O-ringów, zmniejszając ich szczelność próżniową. System jest eksploatowany bez smaru próżniowego, ale jeśli wystąpią problemy z uszczelnieniem, można użyć smaru próżniowego.
   8. Włóż ponownie O-ringi do odpowiednich rowków uchwytu i sprawdź, czy pasują i nie wystają z żadnej strony rowka.
   9. Utrzymuj uchwyt TEM przepływu cieczy wolny od kurzu do momentu załadowania próbki (np. przykrywając go folią aluminiową).
2. Montaż uchwytu TEM przepływu cieczy
   UWAGA: Poniższa procedura opisuje procedurę ładowania mikroczipów do uchwytu na próbki o optymalnej orientacji dla STEM. W tej konfiguracji podstawowy mikroczip z próbką będzie górnym mikroczipem po przeniesieniu do mikroskopu. Zobacz rysunek 4. W przypadku TEM najwyższą rozdzielczość przestrzenną uzyskuje się na dnie ogniwa cieczowego w odniesieniu do wiązki elektronów poruszającej się w dół. W ten sposób mikroczipy byłyby zamontowane na odwrót.
   1. Użyj zakrzywionej pęsety, aby chwycić mikroczip próbki na dłuższym boku i umieść go w szczelinie (kieszeni) w końcówce uchwytu TEM do przepływu cieczy. Trzymaj stronę SiN skierowaną do góry. Sprawdź prawidłowe umieszczenie mikroczipa w gnieździe za pomocą lornetkowego mikroskopu świetlnego.
      UWAGA: Jeśli O-ring pod mikrochipem nie zostanie prawidłowo umieszczony, mikrochip może wystawać z gniazda.
   2. Umieścić kroplę 0,3 μl przefiltrowanej cieczy do eksperymentu na mikrochipie próbki za pomocą mikropipety. W razie potrzeby przymocuj mikroczip pęsetą, ponieważ siły kapilarne kropli mogą wyciągnąć mikroczip z kieszeni.
   3. Użyj odwróconej zakrzywionej pęsety, aby pobrać drugi mikroczip (ten z warstwą dystansową). Ostrożnie odwróć mikroczip do góry nogami. Umieść mikroczip dystansowy na mikrochipie bazowym w gnieździe.
      UWAGA: Procedurę tę należy wykonać wystarczająco szybko, aby uniknąć wysuszenia kropli na mikroczipie próbki.
   4. Sprawdź prawidłowe umiejscowienie za pomocą lornetkowego mikroskopu świetlnego, przesuwając kawałek materiału odbijającego światło poniżej końcówki uchwytu próbki. Oba mikroczipy muszą być ustawione dokładnie równolegle, aby uzyskać najlepsze zachodzenie na siebie okien SiN.
      UWAGA: W przypadku, gdy okienka nie zachodzą na siebie, mikroczipy można przestawić, popychając z jednej strony końcówką pęsety, ale unikaj zbyt dużego przesuwania mikroczipów, ponieważ membrana SiN może zostać łatwo uszkodzona. Niektóre mikroczipy mają konfigurację skrzyżowaną (okienko jednego mikroczipa jest prostopadłe do okienka w drugim mikrochipie); Taka konfiguracja ułatwia wyrównanie dwóch mikroprocesorów, ale także zmniejsza pole widzenia w mikroskopie elektronowym.
   5. Weź pęsetą przednią stronę pokrywy komory na próbki i odwróć ją do góry nogami. Nie dotykając mikroczipów, umieść tylną stronę pokrywy na końcówce. Powoli otwórz pęsetę w taki sposób, aby pokrywka spoczywała wyłącznie na dolnej gałęzi pęsety. Ostrożnie opuść pokrywę, aż spocznie na dwóch mikroczipach. Wyjmij pęsetę.
   6. Ponownie sprawdź wyrównanie okienek obu mikroczipów. W razie potrzeby zdejmij pokrywkę, dostosuj położenie mikroczipów i ponownie załóż pokrywę.
   7. Umieść i zamocuj je w swoich zwykłych miejscach. Sprawdź wyrównanie dwóch okien. W razie potrzeby ponownie wykręć i wyreguluj mikroczipy.
      UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno, ponieważ może to spowodować uszkodzenie. Uszczelnienie próżniowe uzyskuje się, gdy po prostu się dokręcają.
   8. Sprawdzić uszczelnienie, inicjując przepływ cieczy przez system przy natężeniu przepływu 4 μl/min. Jeśli nie obserwuje się wycieków po żadnej stronie końcówki, jest to dobry wskaźnik szczelności próżniowej.
   9. Przenieś uchwyt do stacji pompy próżniowej i sprawdź szczelność próżni. Poziom podciśnienia powinien osiągnąć co najmniej ^10-5 mbar w ciągu 5 minut od pompowania.
      UWAGA: Zaleca się przetestowanie stacji pomp z atrapą uchwytu przed użyciem.
   10. Przenieś uchwyt do mikroskopu elektronowego w jego obudowie, aby zapobiec zbieraniu się kurzu.
       UWAGA: Do każdego uchwytu komercyjnego dołączona jest obudowa.

3. Trzon próbki w cieczy

1. Regulacja mikroskopu elektronowego dla STEM
   UWAGA: Działanie mikroskopu elektronowego opisanego w niniejszym protokole opiera się na standardowych procedurach, które można znaleźć w instrukcji obsługi. Protokół opisuje wymagane szczegóły wykraczające poza standardowe procedury pozyskiwania danych na próbkach płynnych.
   1. Uruchom mikroskop z wyrównanym trybem STEM. Do uchwytu na próbkę umieścić próbkę badawczą składającą się z cienkiej warstwy węgla z AuNPs. Dostosuj ustawienia mikroskopu STEM w następujący sposób: ustaw prąd sondy na 0,18 nA, a półkąt zbieżności wiązki elektronów na 20 mrad, wybierając rozmiar plamki 4C i aperturę obiektywu 30 μm. Wybierz kamerę o długości 8 cm.
   2. Zanotuj wskazaną gęstość prądu mierzoną na ekranie fluorescencyjnym, gdy włożony jest detektor ADF. Wyjmij uchwyt na próbkę.
      UWAGA: Ta aktualna wartość jest później potrzebna do oszacowania grubości cieczy.
   3. Rozpocznij przepływ cieczy od czystej wody. Nie przekraczaj przepływu 2 μl/min.
   4. Włóż uchwyt TEM przepływu cieczy do mikroskopu elektronowego i rozpocznij ewakuację. Sprawdź zarówno wskazanie podciśnienia w komorze próżni wstępnej, jak i czas trwania opróżniania. Jeśli poziom podciśnienia jest standardowy, a czas trwania procedury pompowania nie przekracza dwukrotnie normalnego czasu opróżniania (około 1 minuty), włóż uchwyt.
   5. Otwórz zawór belki, gdy podciśnienie w głównej komorze próbki znajduje się w zakresie umożliwiającym jej otwarcie. Włóż detektor ADF, naciskając przycisk ADF.
      UWAGA: Ten protokół odnosi się do detektora ADF umieszczonego nad ekranem luminoforowym mikroskopu elektronowego.
   6. Ustaw mikroskop w trybie ciągłej akwizycji obrazu, używając rozmiaru obrazu 512 x 512 pikseli, czasu zatrzymania pikseli 2 μs i powiększenia 20 000. Wyszukaj okno SiN, tłumacząc stół montażowy w kierunkach x i y.
      UWAGA: Mikroczipy blokują wszelkie elektrony przechodzące przez próbkę w kierunku detektora; sygnał jest widoczny tylko w miejscu, w którym znajduje się SiN. Zobacz rysunek 5. Czasami łatwiej jest znaleźć okno SiN, patrząc na ekran fluorescencyjny.
   7. Po znalezieniu okna dostosuj ustawienia kontrastu i jasności (za pomocą odpowiednich pokręteł) tak, aby krawędź okna stała się widoczna. Przesuń krawędź w kierunku środka pola view, naciskając przyciski przesunięcia x i y na stoliku z próbką. Naciśnij przycisk resetowania soczewki obiektywu.
      UWAGA: Jasność musi być znacznie zmniejszona w porównaniu z próbką próżniową ze względu na silne rozproszenie w cieczy.
   8. Kontynuuj zgrubne ogniskowanie ostrego narożnika na krawędzi okienka SiN, regulując pozycję pionową (translacja z) stolika na próbkę. Sprawdź, czy sample znajduje się na wysokości eucentrycznej, obracając stolik o 5° i obracając go z powrotem. Cechy próbki i narożnika okna SiN nie powinny przesuwać się przy małych powiększeniach.
      UWAGA: Zamknij zawór wiązki, jeśli nie używasz mikroskopu, ponieważ skanowanie w tej samej pozycji przez dłuższy czas może spowodować uszkodzenie próbki i tworzenie się pęcherzyków
   9. W razie potrzeby ponownie dostosuj położenie pionowe, aby ponownie umieścić krawędź okna na środku obszaru wyświetlania. Zapisz pozycję stolika za pomocą przycisku przechowywania w oprogramowaniu.
   10. Przejdź do pozycji, w której obecne są małe kawałki gruzu lub inne obiekty o wysokim kontraście (np. AuNPs), przesuwając stolik w kierunkach x i y. Dostosuj ostrość soczewki obiektywu tak, aby wszystkie obiekty były ostre w ostrości.
   11. Zwróć uwagę na gęstość prądu zmierzoną na ekranie luminoforowym widocznym przez oprogramowanie operacyjne, wskazującym przesyłany prąd przez uchwyt cieczy i przez otwór detektora ADF. Oblicz grubość komórki cieczy, korzystając z równania 1. Postępować tylko wtedy, gdy grubość cieczy została określona i nie przekracza 3 μm.
       UWAGA: Grubość ciekłej celi można określić na podstawie stosunku zmierzonej gęstości prądu z próbką i bez niej, korzystając z następującego równania¹⁴
       Równanie 1
       przy t_SiN grubość membrany z amorficznego azotku krzemu, a t_woda grubość warstwy wody. Średnie długości drogi swobodnej wynoszą l_SiN = 0,79 μm SiN,= i l_woda = 3,0 μm wody dla półkąta otwarcia detektora 35 mrad¹⁴.
   12. Uważnie obserwuj ciecz przy mniejszych powiększeniach, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków gazu. Pęcherzykom gazu można zapobiec, stosując ciągły przepływ cieczy i prąd sondy mniejszy niż 0. 5 nA.
   13. Przesuwaj stolik w kierunkach x i y, aż zostanie znaleziony obszar zawierający co najmniej 20 AuNPs. Ustaw rozmiar obrazu na 1 024 x 1 024 pikseli, czas zatrzymania piksela na 19 μs, a powiększenie na 400 000. Uzyskaj obrazy AuNP przylegających do membrany SiN, naciskając przycisk akwizycji.
       UWAGA: Po uzyskaniu obrazów, na których AuNP są widoczne z silnym kontrastem i ostrymi krawędziami (patrz Rysunek 6), można być pewnym, że eksperyment jest prawidłowo przeprowadzony. W przypadku wystąpienia nieoczekiwanych problemów nie kontynuuj eksperymentu, ale upewnij się, że przyczyna została usunięta.
2. STEM rozwiązania AuNP
   1. Wyjmij uchwyt TEM przepływu cieczy z mikroskopu i zatrzymaj przepływ cieczy.
   2. Przygotować co najmniej 1 ml roztworu 0,1 M chlorku sodu w wodzie o czystości HPLC w szklanej strzykawce.
   3. Ustawić układ przepływu na prędkość 20 μl/min i przepłukać cały układ przepływu 0,3 ml roztworu soli fizjologicznej. Użyj bibuły filtracyjnej, aby zebrać ciecz wyrzucaną na drugi koniec rurki. Następnie ponownie wyreguluj system przepływu na 2 μl/min.
   4. Sprawdź integralność okna SiN za pomocą lornetkowego mikroskopu świetlnego. Jeśli nie zaobserwuje się wycieku, włóż ponownie uchwyt TEM przepływu cieczy do mikroskopu.
   5. Sprawdź wskazanie podciśnienia w komorze próżni wstępnej i czas trwania opróżniania. Jeśli poziom podciśnienia jest standardowy, a czas trwania procedury pompowania nie przekracza dwukrotnie normalnego czasu opróżniania (około 1 minuty), należy włożyć uchwyt
   6. Przesuń stolik z powrotem mikroskopu z powrotem do jego poprzedniej pozycji, korzystając z zapisanej pozycji stage. Ustaw mikroskop w trybie ciągłej akwizycji obrazu, używając rozmiaru obrazu 512 x 512 pikseli, czasu przebywania pikseli 2 μs i powiększenia 20 000x. Dostosuj kontrast, jasność, ostrość i wysokość eucentryczności zgodnie z opisem w krokach 3.1.7-3.1.9.
   7. Znajdź interesujące Cię miejsce, tłumacząc stół montażowy w kierunkach x i y. Ustaw rozmiar obrazu na 1 024 x 1 024 pikseli, czas zatrzymania piksela na 2 μs, a powiększenie na 500 000. Nagraj serię obrazów STEM, ręcznie naciskając przycisk akwizycji po zarejestrowaniu poprzedniego obrazu.
      UWAGA: AuNP zaczynają się rozpuszczać, gdy tylko wiązka elektronów zostanie zeskanowana nad próbką. Cząstki znajdujące się poza napromieniowanym obszarem nie są naruszone i można je zaobserwować natychmiast po ich naświcie. Sygnatura czasowa jest przechowywana w nagłówku obrazu. Możliwe jest również użycie oprogramowania do automatycznego zbierania serii obrazów w film.
3. Demontaż i czyszczenie uchwytu TEM po doświadczeniu
   1. Po zakończeniu eksperymentów TEM w fazie ciekłej i wyjęciu uchwytu z mikroskopu elektronowego, wyczyść rurkę, komorę cieczy i jej elementy, aby usunąć wszelkie cząstki stałe lub pozostałą sól, które mogą mieć wpływ na przyszłe eksperymenty.
   2. Lekko poluzuj tylną, aby nadal była zamocowana w swoim gnieździe, ale pokrywę można było łatwo zdjąć. Poluzuj przednią, wyjmij ją i umieść w miejscu wolnym od kurzu.
   3. Zdejmij pokrywę i umieść ją w środowisku wolnym od kurzu do przechowywania.
   4. Wyjmij dwa mikroczipy z kieszeni. Oddziel je, ostrożnie zanurzając je w wodzie lub w pozostałym roztworze eksperymentu. Umieść mikroczipy na bibułce stroną z membraną SiN do góry i pozwól im wyschnąć na powietrzu w celu dalszej analizy.
   5. Zdejmij O-ringi i wyczyść odpowiednie rowki wodą klasy HPLC. Przechowuj O-ringi w środowisku wolnym od kurzu.
   6. Użyj szklanej strzykawki (5 ml), aby przepłukać wszystkie rurki (wejściowe i wyjściowe), z których każdy zawiera 5 ml wody klasy HPLC. Zebrać płyn za pomocą małej zlewki umieszczonej poniżej końcówki uchwytu TEM. Po przepłukaniu użyj pipety i/lub bibuły filtracyjnej, aby usunąć pozostały płyn z komory na płyn.
   7. Sprawdź końcówkę uchwytu TEM i usuń pozostałości, takie jak złamane krawędzie mikroczipów krzemowych, włókna lub kurz. Jeśli sól jest nadal widoczna, powtórz procedurę czyszczenia. Przywróć O-ringi do ich rowków.
   8. Przechowuj uchwyt TEM i jego elementy w środowisku wolnym od kurzu.
4. Procedura alternatywna do 3.2: STEM ruchomych nanocząstek złota
   UWAGA: Do badania ruchu AuNP w cieczy wymagana jest inna procedura montażu.
   1. Pomiń krok 1.2. Załaduj AuNP na mikrochip krzemowy bezpośrednio przed włożeniem ich do uchwytu TEM w kroku 2.2. Próbkę należy przez cały czas przykryć warstwą cieczy, aby uniknąć silnego przyłączenia AuNP do membrany SiN. Pozostałe kroki protokołu są takie same. Seria obrazów STEM jest uzyskiwana w kroku 3.2.6.

Rysunek 4: Montaż uchwytu TEM przepływu cieczy. (A) Komora ogniwa ciekłego z mniejszym pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym umieszczonym w rowku. Wstawka pokazuje widok z góry. (B) Mikroczip bazowy umieszcza się w odpowiednim gnieździe. Wstawka pokazuje widok z boku pod takim kątem, że mikroczip jest widoczny od odbicia światła. (C-D) Kroplę roztworu dodaje się do mikroczipa. (E-G) Umieszczenie mikroczipa na pokrywie. (H-I) Umieszczenie pokrywy komory na komórkę cieczy. (J) Mocowanie pokrywy za pomocą dwóch. (K) Zmontowany uchwyt TEM przepływu cieczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wstępne pozycjonowanie i ustawianie ostrości za pomocą mikrofotografii STEM. (A) Aby zlokalizować okno SiN, stage jest przesuwany w kierunku najjaśniejszego sygnału. Krzemowy mikrochip jest na tyle cienki, że niektóre elektrony mogą przejść w pobliżu okna. (B) Krawędź zogniskowanego okna SiN pokazująca niektóre AuNP wyglądające jasno na ciemnym (mniej rozpraszającym) oknie membrany SiN. Krawędź mikrochipa jest jasna z powodu nadmiernego rozpraszania. (C) Ustawianie ostrości odbywa się w rogu okna SiN. Obrazy pokazują sytuacje nieostre, ostre i nadmiernie ostre. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

Uchwyt TEM przepływu cieczy został użyty do badania zachowania AuNPs w cieczy. AuNP stabilnie unieruchomiono na membranie SiN w czystej wodzie i zobrazowano z rozdzielczością nanoskalową przy użyciu STEM w fazie ciekłej (ryc. 6). Doskonały kontrast uzyskano na silnie rozpraszającym się złocie. Gęstość prądu na sicie luminoforowym zmierzona dla suchej próbki testowej wynosiła 20 pA/cm², podczas gdy przy włożonym uchwycie TEM przepływu cieczy wynosiła 8 pA/cm². Stosując równanie 1, t_wody = 2,4 ±0,5 μm, znacznie więcej niż oczekiwano na podstawie grubości przekładki wynoszącej 200 nm. Niemniej jednak grubość nie jest zbyt duża, aby można było obrazować AuNP z nanometrową rozdzielczością przestrzenną. Grubość cieczy była grubsza niż 200 nm ustawiona przez przekładkę ze względu na wybrzuszenie membran SiN, niepłaskość mikroczipów i zanieczyszczenia znajdujące się na mikrochipach.

Dla czystej wody, AuNPs zachowują swój kształt podczas obrazowania¹⁶, chociaż produkty radiolizy reaktywnej (^e-aq, H^•, H⁺, OH^•) pochodzące z oddziaływania wiązki elektronów z wodą mogą utleniać pojedyncze atomy złota, prowadząc do zmiany kształtu AuNPs¹⁵. Jednak, gdy w drugim eksperymencie użyto systemu przepływu cieczy do wprowadzenia jonów chlorkowych, stabilność AuNP uległa zmianie. Jony chlorkowe są zdolne do stabilizacji utlenionych atomów złota w postaci tetrachloroaureatu, AuCl₄^-. Rysunek 7 pokazuje, że AuNP powoli rozpuszczały się podczas serii obrazowania poklatkowego STEM, podobnie jak wyniki zgłoszone wcześniej¹⁶. Przy zastosowanej dawce elektronów rozpuszczenie AuNP o wielkości 30 nm zajęło ~300 s.

Ruchy AuNPs w wodzie były badane w trzecim eksperymencie (Rysunek 8). Przed eksperymentem zbiornik TEM przepływu cieczy został oczyszczony w celu usunięcia wszelkich śladów soli. W odróżnieniu od pierwszego eksperymentu, zastosowano alternatywne podejście do przygotowania próbki, aby uzyskać słabsze przyłączenie AuNP do membrany SiN¹⁴. W tym eksperymencie roztwór AuNP umieszczono na mikrochipie krzemowym i zmontowano w uchwycie TEM przepływu cieczy, nie dopuszczając do wyschnięcia roztworu. W ten sposób AuNP łatwo odłączają się od błony SiN podczas obrazowania przy zastosowanej dawce. Część AuNP przesunęła się z pola widzenia do roztworów masowych, podczas gdy pozostałe AuNP pozostały w polu widzenia w bliskiej odległości od okna SiN. Zaobserwowano ruchy tych AuNP, które w końcu uległy aglomeracji. Po pewnym czasie aglomeraty te również odczepiły się od membrany SiN i przemieściły się z pola widzenia do roztworu.

Rysunek 6: Mikrografia skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) AuNP o średnicy 30 nm w górnej części warstwy czystej wody. Pokazany obraz to zaznaczony obszar oryginalnego obrazu. Rozmiar obrazu wynosił 1 024 x 1 024 pikseli, czas przebywania pikseli wynosił 19 μs, rozmiar piksela wynosił 0,73 nm, a powiększenie 400 000X. Dawka elektronów wynosiła więc 7,1 x 10⁴ e^-/nm². Gęstość prądu zmierzona na ekranie luminoforowym wynosiła 8 pA/^cm2, więc grubość cieczy obliczono na 2,4 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Seria poklatkowych mikrofotografii STEM AuNP w soli fizjologicznej. (A-D) Obrazy wyodrębnione z serii poklatkowych zdjęć STEM w odstępach 30 s. AuNP stopniowo rozpuszczają się w cieczy w wyniku obecności jonów chlorkowych. Czas przebywania pikseli wynosił 2 μs, czas klatek serii poklatkowej wynosił 1,75 s, rozmiar piksela wynosił 0,44 nm, a powiększenie 500 000X. Dawka elektronów na obraz wynosiła 1,2 x 10⁴ e^-/nm². Grubość cieczy wynosiła 2,4 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Mikrofotografia STEM AuNP poruszających się w czystej wodzie. (A) Membrana SiN z AuNPs, z których kilka jest zaznaczonych strzałkami. (B) Ślady ruchu wybranych AuNP (patrz A). Niektóre AuNP oddalają się od pola widzenia w czasie obrazowania. Pozostałe AuNP przemieszczają się poprzecznie wzdłuż membrany SiN i zaczynają się aglomeratować. Po osiągnięciu krytycznego rozmiaru klastra wysyłają się z membrany i oddalają się od pola widzenia. Czas przebywania pikseli wynosił 1 μs, czas klatek 0,52 s, rozmiar piksela 1,8 nm, a powiększenie 120 000X. Dawka elektronów na obraz wynosiła 3,5 x 10² e^-/nm², a grubość cieczy wynosiła 2,4 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisany protokół umożliwia STEM AuNPs w cieczy, w tym obserwację procesów dynamicznych. Montaż uchwytu jest techniką łatwą do nauczenia. Jednak podczas pracy z uchwytem TEM przepływu cieczy należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Na przykład złamane krawędzie mikrochipa Si lub duże cząstki na O-ringach mogą spowodować wyciek płynnej komórki. Z drugiej strony duże cząstki (>200 nm; np. kurz lub zanieczyszczenia Si) na membranie SiN może powodować zwiększenie grubości ciekłej komórki, co prowadzi do niskiego kontrastu obrazowania lub niskiej rozdzielczości przestrzennej, a nawet może spowodować pęknięcie okien SiN. Co ważne, pozostałości soli lub innych substancji chemicznych mogą w niepożądany sposób wpłynąć na wynik eksperymentów. Dlatego tak ważne jest, aby poszczególne etapy przygotowania próbki i montażu uchwytu były wykonywane ostrożnie w czystym i wolnym od kurzu środowisku.

Grubość ciekłej komórki decyduje o osiągalnej rozdzielczości, a także o kontraście uzyskanych obrazów¹⁷. Grubość tę można regulować za pomocą przekładek umieszczonych na jednym z dwóch mikrochipów Si. W zależności od wymiarów próbki można uzyskać różne grubości kuwety cieczowej. Do badania AuNP możliwe jest użycie małych przekładek (200-500 nm), podczas gdy całe komórki eukariotyczne potrzebują większych przekładek do 5 μm. Na grubość ciekłej komórki ma ponadto wpływ wybrzuszenie okien membrany SiN wynikające z różnicy ciśnień między cieczą a otaczającą ją próżnią. Efekt ten staje się bardziej wyraźny w przypadku większych okien membranowych SiN. Dlatego, aby zminimalizować grubość ciekłej komórki, zaleca się stosowanie małych okien membrany SiN. W przypadku, gdy trudno jest znaleźć zakładkę między dwoma małymi oknami, można je zmontować w konfiguracji skrzyżowanej za pomocą innego mikroczipa bazowego. Alternatywne konfiguracje w dużej mierze zapobiegają wybrzuszeniom i składają się z monolitycznego mikrochipa¹⁸ lub okien membranowych wspartych na słupkach¹⁹, ale mają one wady dotyczące ładowania próbki. Jednym z najtrudniejszych aspektów obecnej technologii jest brak precyzyjnej kontroli nad gęstością cieczy. Często ciecz jest znacznie gęstsza niż można się spodziewać po zastosowanych wymiarach przekładki, jak pokazano tutaj. Kilka grup używało zamkniętych komór cieczowych 4,20,21,22^; Systemy te mają pewne zalety w zakresie rozdzielczości przestrzennej, ponieważ grubość cieczy można zmniejszyć poprzez wywołanie pęcherzyka w cieczy. Alternatywnie, okna SiN mogą zostać zmuszone do zapadnięcia się, co prowadzi do cieńszej warstwy cieczy. Po trzecie, istnieje obudowa z innych cieńszych okien (np. grafen)²³, co również skutkuje znacznie rzadszymi cieczami niż to, co jest możliwe w przypadku systemu opisanego w tym protokole. Jednak w tych układach nie ma możliwości przepływu cieczy.

Podobnie jak w przypadku każdej techniki mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, należy wziąć pod uwagę szereg aspektów eksperymentalnych. Najważniejszym aspektem jest oddziaływanie wiązki elektronów z cieczą lub próbką. Oprócz uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, które ograniczają osiągalną rozdzielczość przestrzenną dla wielu próbek stałych²⁴, na próbki cieczy wpływają również produkty radiolizy generowane wiązką elektronów^15,25. Ponieważ produkty te mogą mieć wpływ na eksperyment, niezbędna jest staranna interpretacja danych i projekt eksperymentu²⁶. Ustawienia mikroskopu powinny być dobrane zgodnie z celami konkretnego badania. ADF STEM jest bardziej wydajny do obrazowania nanocząstek o wysokiej liczbie atomowej (Z) w większej grubości ciekłej komórki, podczas gdy TEM zapewnia lepszy kontrast na materiałach o niskiej zawartości Z i jest zwykle szybszy, ale wymaga cieńszych warstw cieczy³. Zamiast detektora ADF, detektor Bright Field (BF) jest czasami używany do obrazowania ogniwa cieczowego, ponieważ BF STEM jest korzystny do obrazowania materiałów o niskiej zawartości Z w grubych warstwach²⁷. Wraz ze wzrostem grubości ogniwa cieczowego potrzebny jest większy prąd. Jednak zwiększa to również stężenie produktów radiolizy i zwiększa uszkodzenia popromienne. Należy również zauważyć, że w detektorze ADF obserwuje się odwrócenie kontrastu dla bardzo gęstych cieczy (>10 μm dla wody).

Warunki cieczy zostały zmienione między naszymi eksperymentami poprzez wyjęcie uchwytu z mikroskopu i wymianę zarówno próbki, jak i cieczy. Oprócz zmiany stężenia soli, łatwo można zmienić inne właściwości cieczy poprzez przepływ w różnych cieczach (np. można użyć roztworów buforowych w celu ustawienia określonego pH¹⁶ lub można wprowadzić roztwory organiczne lub inne dodatki). Możliwa jest również zmiana cieczy, gdy uchwyt jest nadal włożony do mikroskopu, poprzez przepływ cieczy przez system mikroprzepływowy. Jednak w tym przypadku nie wiadomo, w którym momencie zmienia się ciecz w próbce. Warto również zauważyć, że dostępne są mikroczipy podtrzymujące elektrody, dzięki czemu można przeprowadzać eksperymenty elektrochemiczne w nanoskali²⁸.

Obiekty badań nie ograniczają się do AuNP w wodzie, ale przy użyciu opisanego powyżej protokołu można badać szeroką gamę próbek, w tym krzemionkę, tlenek tytanu i polimery. Jeśli ruchy obiektów są zbyt szybkie, aby uchwycić je na obrazie w trakcie akwizycji, lepkość można zmniejszyć o rząd wielkości, stosując mieszaninę 50% glicerolu i 50% wody.

Z wyżej wymienionych punktów wyłania się szereg zalet, możliwości, a także wad. Podczas pracy z STEM w fazie ciekłej najważniejsze wady, które należy wziąć pod uwagę, to: 1) na każdy eksperyment ma wpływ dynamiczne oddziaływanie wiązki elektronów z całą próbką (obserwowanym obiektem, cieczą i membranami SiN); 2) obchodzenie się z próbką jest żmudne i często trudno jest uzyskać cienką warstwę cieczy, ponieważ próbka lub mikroczipy zawierają cząstki o wielkości mikrometra; 3) grubość cieczy zwykle różni się znacznie od zamierzonej grubości ustawionej przez przekładkę; oraz 4) rozdzielczość przestrzenna i kontrast silnie zależą od grubości cieczy i różnicy między gęstością zmian obserwowanego obiektu a cieczą.

Obecnie istnieje wiele metod mikroskopii obiektów w cieczy z nanometrową rozdzielczością przestrzenną. Mikroskopia elektronowa w lodzie amorficznym jest potężną techniką²⁹, ale związane z nią procedury eksperymentalne są delikatne, nie wszystkie eksperymenty pozwalają na przygotowanie próbki w lodzie, a eksperymenty z rozdzielczością czasową są niemożliwe. Mikroskopia rentgenowska^30,31 może być w zasadzie stosowana, ale ma ograniczoną rozdzielczość przestrzenną i nie jest powszechnie dostępna w laboratoriach. Mikroskopia sił atomowych w cieczy została ustalona, ale jest to technika powierzchniowa tylko 32,33,34,35. Mikroskopia świetlna nie wykazuje wystarczającej rozdzielczości przestrzennej. Obecnie mikroskopia elektronowa w cieczy wydaje się najpotężniejszą techniką bezpośredniej mikroskopii obiektów i procesów w nanoskali.

TEM i STEM w fazie ciekłej nie są jeszcze rutynowymi technikami analitycznymi, ale wciąż się rozwijają. Liczba parametrów, które należy wziąć pod uwagę, jest znaczna i często trudno jest odtworzyć wyniki eksperymentalne. Co więcej, dane ilościowe są trudne do uzyskania, ponieważ badane efekty przeplatają się z procesami zachodzącymi w wyniku działania wiązki elektronów. Opisany tutaj protokół ma na celu standaryzację protokołu eksperymentalnego, uwzględniając w ten sposób wszystkie istotne podstawowe aspekty eksperymentu. Mamy nadzieję, że protokół ten doprowadzi do lepszej odtwarzalności prac eksperymentalnych w tej rozwijającej się dziedzinie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lornetkowy mikroskop świetlny	Leica	M60 CMO
Skaningowy miroskop elektronowy transmisyjny z korektorem aberracji sferycznej	JEOL	ARM200F
Uchwyt na próbki TEM z przepływem cieczy	DENS Solutions	Ocean
Mikroprzepływowa pompa strzykawkowa	Harvard Scientific	PicoPlus
Środek do czyszczenia plazmy	Gatan	Solarus950
Chemicals
Aceton, Rotisolv  Plus dla HPLC	Sigma-Aldrich	7328.2
Woda, chromasolv Plus dla HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
Etanol, Rotisolv HPLC klasy	Carl Roth	P076.2
Stabilizowany cytrynianem koloidu złota, średnica 30 nm	British-Biocell	EM. GC20
Materials
Base silicon microchipy z membranami z azotku krzemu o grubości 50 nm i wymiarach 20 &mikro; m x 0,40 mm	DENS Solutions	for Ocean System
Dystansowe mikroczipy krzemowe z membranami z azotku krzemu o grubości 50 nm, wymiarach 20 i mikro; m x 0,40 mm i grubość dystansu 200 nm	Rozwiązania DENS	dla systemu
Rurki mikroprzepływowe	Upchurch Scientific	1570
Plastikowe wymienne końcówki Pęseta
(antymagnetyczny, przeciwkwasowy korpus ze stali nierdzewnej z końcówkami ESD PVDF (SV	)) ideal-tek	2ASVR.SA
Pęseta ze stali giętej pokrytej teflonem (EMS SA z "PTFE" Powłoka)	Mikroskopia elektronowa Sciences	78322-7Te
Pęseta ze stali szerokodziobowej pokrytej teflonem (powłoka EMS 2A "PTFE")	Mikroskopia elektronowa Sciences	78322-2ATe
Strzykawka Hamiltona, 1 ml, gazoszczelna (Model 1001 TLLX SYR)	Hamilton	81323
Chusteczka do pomieszczeń czystych Sontara Micropure AP (224 x 224 mm)	DuPont	Sontara MicroPure