Artykuł metodologiczny

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54943

⸱

5 lutego 2017

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Streszczenie

Próbki w pełni zanurzone w cieczy mogą być badane w nanoskali w rozdzielczości przestrzennej za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM) przy użyciu komory mikroprzepływowej umieszczonej w uchwycie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i STEM. System mikroprzepływowy składa się z dwóch mikroprocesorów krzemowych podtrzymujących cienkie okienka membranowe z azotku krzemu (SiN). W tym artykule opisano podstawowe kroki ładowania próbki i pozyskiwania danych. Najważniejsze jest upewnienie się, że komora na ciecz jest prawidłowo zmontowana, zapewniając w ten sposób cienką warstwę cieczy i uszczelnienie próżniowe. Protokół ten zawiera również szereg testów niezbędnych do wykonania podczas ładowania próbki w celu zapewnienia prawidłowego montażu. Po załadowaniu próbki do mikroskopu elektronowego należy zmierzyć grubość cieczy. Nieprawidłowy montaż może spowodować, że ciecz będzie zbyt gęsta, podczas gdy zbyt rzadka ciecz może wskazywać na brak płynu, na przykład gdy tworzy się pęcherzyk. Na koniec protokół wyjaśnia, w jaki sposób wykonywane są obrazy i jak można badać procesy dynamiczne. Próbka zawierająca AuNPs jest obrazowana zarówno w czystej wodzie, jak i w soli fizjologicznej.

Wprowadzenie

Konwencjonalna skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (STEM) jest ograniczona zakresem próbek odpowiednich do analizy, a konkretnie do próbek suchych i stałych, które nadają się do umieszczenia w wysokiej próżni. Jednak wiele pytań naukowych i technologicznych dotyczy materiałów w nanoskali oraz procesów zachodzących w środowisku ciekłym. Próbki całkowicie zanurzone w cieczy można obecnie badać za pomocą STEM, wykorzystując koncepcję polegającą na zastosowaniu komory mikrofluidycznej zamontowanej w uchwycie próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i STEM1. Ta nowo opracowana technika staje się coraz popularniejsza, ponieważ dostarcza nowej wiedzy na temat istotnych procesów w różnych tematach badawczych, w tym procesów wzrostu, rozpuszczania i agregacji nanocząstek2,3,4,5,6. Badania te mogą obejmować nie tylko metale, ale także biominerały7 i układy biologiczne8,9,10,11. Załadunek próbek i akwizycja obrazów w STEM w fazie ciekłej różnią się od procedur stosowanych w STEM dla próbek suchych i wymagają protokołu, który wiąże się z dedykowanym szkoleniem.

System mikroprzepływowy składa się z dwóch krzemowych mikrochipów z oknami membranowymi z azotku krzemu (SiN), które są przezroczyste dla wiązki elektronów o energii 200 keV12 (patrz Rysunek 1A). Szczegółowe informacje dotyczące wymiarów oraz obsługi tych mikrochipów można znaleźć w innym opracowaniu12,13. Próbka zazwyczaj zawiera obiekty w skali nanometrycznej. W niniejszej pracy obserwowano złote nanocząsteczki (AuNPs). Nanocząsteczki AuNPs są unieruchomione na górnym oknie (względem wiązki elektronów biegnącej w dół) lub zawieszone w cieczy. Nanometryczna rozdzielczość przestrzenna w STEM jest uzyskiwana poprzez skanowanie wiązką elektronów nanocząsteczek AuNPs i zbieranie transmitowanych elektronów rozproszonych za pomocą detektora pola ciemnego (ADF)9. Dwa mikrochipy są umieszczone w małym gnieździe w końcówce uchwytu TEM do przepływu cieczy1 (uchwyt ten obsługuje zarówno tryb STEM, jak i TEM, lecz określany jest jako uchwyt TEM). Jeden z mikrochipów zawiera dystans, dzięki czemu między mikrochipami tworzy się komora z cieczą. Uszczelki O-ring po obu stronach dwóch mikrochipów zapewniają szczelność próżniową komory z cieczą13 (patrz Rysunek 1B).

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie podstawowych kroków ładowania próbek i akwizycji danych, aby zainteresowani użytkownicy mogli łatwo uzyskać dostęp do tej nowej, rozwijającej się techniki. Wykorzystano system dostępny od konkretnego producenta, jednak protokół jest również aktualny dla systemów innych firm. Technika ta jest bardziej złożona niż konwencjonalne TEM i STEM, a podczas pracy z systemem uchwytu do cieczy należy wziąć pod uwagę szereg aspektów praktycznych13. Najważniejsze jest zapewnienie prawidłowego montażu komory z cieczą, co pozwoli na uzyskanie cienkiej warstwy cieczy oraz szczelności próżniowej. Dlatego niezwykle istotne jest zachowanie czystości i zapobieganie powstawaniu pyłu podczas przygotowania i montażu uchwytu TEM do przepływu cieczy. W szczególności pierścienie O-ring oraz dwa krzemowe mikroczipy muszą być wolne od wszelkich zanieczyszczeń. Nawet niewielkie cząsteczki pyłu na jednym z mikroczipów mogą znacznie zwiększyć grubość zmontowanej celi, co może uniemożliwić osiągnięcie użytecznej rozdzielczości przestrzennej. Uszczelnienie próżniowe jest istotne, aby po eksperymencie w mikroskopie elektronowym nie pozostały żadne zanieczyszczenia ani uszkodzenia. Niniejszy protokół opisuje procedurę ładowania oraz kilka niezbędnych testów. Obsługa mikroskopu elektronowego jest prosta, ale wymaga kilku dodatkowych kroków w porównaniu z mikroskopią próbek stałych. Wraz ze wzrostem grubości cieczy więcej elektronów jest pochłanianych i rozpraszanych przez ciecz; pomiar grubości cieczy jest zatem niezbędny. Na koniec protokół wyjaśnia sposób wykonywania obrazów oraz sposób badania procesów dynamicznych.

Układ TEM z ogniwem cieczowym: Schemat oddziaływania wiązki elektronów z nanocząsteczkami złota w przepływie cieczy.
Rysunek 1: Ogniwo przepływowe z cieczą do skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (STEM). (A)Schematyczny rysunek zmontowanego ogniwa cieczowego. Dwa krzemowe mikrochipy z oknami z membrany azotku krzemu (SiN) są umieszczone pomiędzy dwoma pierścieniami O-ring. Ciecz znajduje się pomiędzy membranami SiN, dzięki czemu jest oddzielona od próżni w mikroskopie elektronowym. Skupiona wiązka elektronów skanuje próbkę. Kontrast uzyskuje się z elektronów rozproszonych. Nanocząsteczki złota (AuNPs) są unieruchomione w cieczy przy membranie SiN, ale mogą również poruszać się w cieczy. (B)Schematyczny przekrój boczny stosu dwóch mikrochipów z pierścieniami O-ring. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Schemat reakcji chemicznej z zlewkami i pęsetą. Ustawienie eksperymentu, proces rozpuszczania metalu.
Rycina 2: Procedura czyszczenia mikrochipów krzemowych (Si). (A) Dwie zlewki są napełnione odpowiednio 40-60 mL acetonu i etanolu. (B) Mikrochipy Si są umieszczane w zlewce z acetonem. Strona z membraną SiN powinna być skierowana do góry. Odbicie dwóch mikrochipów Si wyraźnie pokazuje rowek na tylnej stronie obu mikrochipów. (C) Po 2 min mikrochipy Si są przenoszone do drugiej zlewki wypełnionej etanolem. Po kolejnych 2 min mikrochipy Si są przenoszone na chusteczkę do czystych pomieszczeń w celu wysuszenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Układ chromatograficzny ze strzykawkami, pęsetami i instrumentami precyzyjnymi do analizy rozdziału DNA.
Rycina 3: Wyposażenie uchwytu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) z przepływem cieczy. (A) Uchwyt TEM z przepływem cieczy z plastikowymi rurkami i strzykawką do doprowadzania cieczy. (B) Końcówka uchwytu TEM z przepływem cieczy odłączona od trzpienia uchwytu, pokrywa komory celi z cieczą, pierścienie O-ring oraz dwa krzemowe mikrochipy. Rurka wystaje z lewej strony końcówki. (C) Komora celi z cieczą z widocznym jednym pierścieniem O-ring oraz szczeliną do umieszczenia mikrochipu. (D) Różne pęsety na powierzchni wolnej od pyłu (folia aluminiowa). (E) Pokrywa komory celi z cieczą z dwoma pierścieniami O-ring. (F) Dwa krzemowe mikrochipy z oknami z membrany SiN. Lewo: mikrochip z próbką bez dystansora; prawo: mikrochip pokrywowy z dystansorem 200 µm. (G) Mikrofluidyczny system pompowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Przygotowanie mikroczipów

1. Czyszczenie mikrochipów  

  1. Przygotuj stanowisko pracy z niskim poziomem zapylenia w komorze z laminarnym przepływem powietrza wyposażonej w filtr cząstek kurzu.
  2. Wyczyść szkiełko do mikroskopu świetlnego za pomocą bezpyłowej chusteczki i czystego etanolu, aby służyło ono do rozmieszczania i transportu mikrochipów. Umieść szkiełko na chusteczce do czystego pomieszczenia w szalce Petriego.
    UWAGA: Należy bezwzględnie unikać stosowania etanolu technicznego.
  3. Wybierz 5 mikrochipów bazowych (bez przekładki) do rozmieszczenia próbek oraz 5 mikrochipów z przekładką o grubości 200 nm.
    UWAGA: Wymiary okien wynoszą 20 x 400 µm2, a grubość SiN wynosi 50 nm. Ze względu na pewną tolerancję wymiarów zaleca się sprawdzenie ich pod mikroskopem świetlnym.
  4. Użyj pęsety z powłoką węglową, aby wyjąć mikrochipy z pudełka do przechowywania i umieścić je na szkiełku. Chwyć mikrochipy pewnie, ale ostrożnie za ich długie boki. Operuj mikrochipem tak, aby strona z membraną SiN była zawsze skierowana ku górze.
    UWAGA: Unikaj dotykania delikatnej membrany SiN na górnej stronie. Należy również zachować ostrożność podczas obchodzenia się z mikrochipami, aby uniknąć odprysków ich ostrych krawędzi, co mogłoby spowodować problemy z cząstkami krzemu na mikrochipie lub późniejsze nieszczelności.
    UWAGA: Trening procedury usuwania mikrochipów z lepkiej powierzchni można przeprowadzić na (tanich) mikrochipach pozornych.
  5. Umieść mikrochipy na chusteczce do czystego pomieszczenia w szalce Petriego. Zamknij szalkę i przenieś ją do dygestorium.
    UWAGA: Kroki obejmujące aceton są wykonywane w dygestorium ze względów bezpieczeństwa chemicznego.
  6. Przygotuj dwa szklane zlewki o pojemności 120 mL. Jedną zlewkę wypłucz acetonem, a drugą etanolem w celu ich oczyszczenia. Napełnij pierwszą zlewkę 40-60 mL acetonu, a drugą 40-60 mL etanolu.
    UWAGA: Na tym etapie protokołu ważne jest stosowanie cieczy klasy HPLC.
  7. Przenieś mikrochipy do zlewki z acetonem w celu usunięcia ochronnej warstwy resistu. Delikatnie poruszaj zlewką ręcznie, aby skutecznie wypłukać mikrochipy, uważając jednak, aby nie odwrócić mikrochipów do góry dnem – patrz Rysunek 2.
  8. Po 2 min usuń mikrochipy i szybko przenieś je do zlewki z etanolem. Delikatnie poruszaj zlewką z etanolem przez 2 min, aby usunąć wszelkie pozostałości warstwy resistu. Przykryj zlewkę folią aluminiową i przenieś ją na stół z laminarnym przepływem powietrza.
    UWAGA: Nie dopuszczaj do wyschnięcia mikrochipów podczas przenoszenia, aby uniknąć osadzania się zanieczyszczeń.
  9. Wyjmij mikrochipy ze zlewki i połóż je na nowej chusteczce do czystego pomieszczenia. Pozostaw je do wyschnięcia na kilka minut, a następnie przenieś mikrochipy na szkiełko do mikroskopu świetlnego w szalce Petriego.
    UWAGA: Mokre mikrochipy mogą łatwo obracać się, odwracać do góry dnem lub przyklejać do pęsety podczas ich puszczania. Można tego uniknąć, delikatnie dociskając mikrochipy do papieru filtracyjnego i odsuwając pęsetę w kierunku poziomym.
  10. Zamknij szalkę Petriego i przenieś mikrochipy do czyścika plazmowego.
  11. Włóż szkiełko z mikrochipami do czyścika plazmowego. Uruchom 5-minutowy program czyszczenia, aby uczynić powierzchnię membrany z azotku krzemu hydrofilową i usunąć węglowodory.
    UWAGA: Odpowiednie ustawienia zastosowane dla naszego czyścika plazmowego to: 70 mTorr, przepływ gazu 11,5 sccm dla O2 i 35,0 sccm dla Ar, docelowa moc RF (Radio Frequency) 50 W, zakres RF 5 W oraz maksymalny odbity sygnał RF. Nadaje się każda plazma zdolna do wywołania ładunku powierzchniowego.
  12. Włóż szkiełko z mikrochipem z powrotem do szalki Petriego, zamknij pokrywkę i przenieś je do mikroskopu świetlnego.
  13. Zbadaj mikrochipy pod mikroskopem świetlnym pod kątem ewentualnych pęknięć membrany lub pozostałych cząstek brudu. Zwróć szczególną uwagę na obszary okien i sprawdź, czy nie ma małych plamek wskazujących na przerwanie membrany. Odrzuć mikrochipy z uszkodzonymi membranami.
  14. Zamknij szalkę Petriego i przechowuj ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

2. Przygotowanie próbki na mikroukładach

  1. Przygotować wodny roztwór AuNP (stabilizowany cytrynianem), mieszając niewielkie ilości roztworów stokowych zawierających AuNP o średnicy 30 nm, stabilizowane cytrynianem, o stężeniu ~3 M.
  2. Umieścić mikroczipy na czystej, lepkiej powierzchni w pudełku transportowym w celu aplikacji kropel/osadzania próbek.
  3. Nanieść kroplę (1-2 µL) roztworu próbki na stronę z membraną SiN świeżo oczyszczonego plazmowo mikroczipu (użyć mikroczipu bez przekładki) i pozostawić roztwór do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    UWAGA: Procedurę tę można powtórzyć w celu zwiększenia stężenia AuNP na membranie SiN.
  4. Nanieść 1 µL wody dejonizowanej na mikroczip w celu usunięcia soli i/lub surfaktantów. Po 30 s ostrożnie usunąć kroplę wody za pomocą papieru filtracyjnego. Pozostawić mikroczipy do wyschnięcia na powietrzu w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    UWAGA: Wystarczająco duża liczba AuNP przylgnie do mikroczipu i nie zostanie już wypłukana wodą.
  5. Przygotowane mikroczipy z próbkami należy wykorzystać w ciągu 4 h, ponieważ membrana SiN z czasem traci nadane jej właściwości hydrofilowe, co może spowodować odmienne zachowanie cieczy podczas eksperymentu. Uwaga: Więcej szczegółów znajduje się w sekcji dyskusji.
  6. Do przechowywania i transportu mikroczipów należy używać zamkniętego pudełka transportowego.

2. Przygotowanie uchwytu TEM do przepływu cieczy

  1. Czyszczenie uchwytu TEM z przepływem cieczy
    1. Wyczyść wszystkie narzędzia (pincetę i śrubokręt), które będą miały kontakt z częściami próżniowymi, używając acetonu i etanolu w kąpieli ultradźwiękowej, a następnie umieść je na wolnej od kurzu powierzchni utworzonej z kawałka nowej folii aluminiowej położonej na stole roboczym. Pracuj w rękawiczkach, aby uniknąć zanieczyszczenia uchwytu TEM z przepływem cieczy.
      UWAGA: Narzędzi nie trzeba czyścić w sposób drobiazgowy, jeśli istnieje pewność, że są one czyste i nadają się do pracy z częściami próżniowymi. Można zrezygnować z rękawiczek, jeśli operator jest w stanie obsługiwać urządzenie bez dotykania części próżniowych.
    2. Umieść uchwyt TEM z przepływem cieczy pod binokularowym mikroskopem świetlnym w taki sposób, aby można było obserwować końcówkę uchwytu zawierającą komorę cieczową. Patrz Rysunek 3.
    3. Zdejmij pokrywkę końcówki uchwytu i połóż ją na powierzchni wolnej od kurzu.
      UWAGA: Tytanowa pokrywka jest podatna na zarysowania spowodowane twardszymi materiałami, takimi jak pinceta. Do materiałów delikatnych zaleca się stosowanie pincet z powłoką polimerową.
    4. Przygotuj co najmniej 1-2 mL czystej wody (klasy HPLC).
      UWAGA: Jeśli nie stosuje się cieczy klasy HPLC, zaleca się sprawdzenie, czy używane ciecze nie zawierają mikrocząstek, które mogłyby doprowadzić do zatorów w układzie przepływowym; w razie potrzeby przefiltruj ciecz za pomocą filtra mikroporowego.
    5. Użyj szklanej strzykawki (1 mL), aby przepłukać cały układ przepływowy 0,5 mL czystej wody. Zaleca się stosowanie mikrofluidycznego systemu pompy strzykawkowej. Użyj pipety i/lub papieru filtrującego, aby usunąć ciecz wypływającą z przedziału komórki cieczowej. Przetestuj szczelność wszystkich rurek pod kątem przepływu cieczy. Następnie osusz końcówkę uchwytu za pomocą papieru filtrującego i/lub pipety.
    6. Użyj mikroskopu świetlnego, aby sprawdzić, czy końcówka uchwytu jest czysta i sucha. W razie potrzeby przemyj końcówkę uchwytu wodą lub etanolem, aby usunąć wszelkie stałe osady, które mogły pozostać po wyschnięciu roztworu. Usuń również drobiny kurzu lub pozostałości włókien. Ostrożnie usuń te elementy pincetą, unikając zarysowania tytanowej powierzchni. Sprawdź również wnętrze rowków pierścieni O-ring i usuń pozostałości cieczy małym kawałkiem chusteczki do czystych pomieszczeń (cleanroom tissue).
      UWAGA: Jeśli uchwyt nie zostanie oczyszczony tą procedurą, zaleca się zdjęcie końcówki z uchwytu i jej czyszczenie w acetonie przez 2 min i w etanolu przez kolejne 2 min w kąpieli ultradźwiękowej.
    7. Obejrzyj pod mikroskopem świetlnym wszystkie pozostałe części końcówki (pierścienie O-ring, pokrywkę i śruby) i usuń kurz, włókna itp...
      UWAGA: Okazyjnie należy usunąć również małe drobinki pochodzące ze śrub lub krzemowych mikrochipów. W razie potrzeby krótko oczyść części próżniowe etanolem klasy HPLC. Pokrywkę i śruby można czyścić ultradźwiękami, zgodnie z opisem dla końcówki. Unikaj częstego moczenia pierścieni O-ring w etanolu, ponieważ z czasem mogą one stać się kruche, co zmniejszy ich szczelność próżniową. System eksploatuje się bez smaru próżniowego, ale w przypadku problemów z uszczelnieniem można go zastosować.
    8. Włóż ponownie pierścienie O-ring do odpowiednich rowków uchwytu i sprawdź, czy pasują i nie wystają z żadnej strony rowka.
    9. Przechowuj uchwyt TEM z przepływem cieczy w stanie wolnym od kurzu aż do momentu załadowania próbki (np. przykrywając go folią aluminiową).
  2. Montaż uchwytu TEM z przepływem cieczy
    UWAGA: Poniższa procedura opisuje sposób ładowania mikrochipów do uchwytu próbek z optymalną orientacją dla STEM. W tej konfiguracji mikrochip bazowy z próbką będzie górnym mikrochipem po przeniesieniu do mikroskopu. Patrz Rysunek 4. W przypadku TEM najwyższa rozdzielczość przestrzenna jest uzyskiwana przy dnie komórki cieczowej w odniesieniu do wiązki elektronów biegnącej w dół. Zatem mikrochipy należałoby zamontować w odwrotnej kolejności.
    1. Użyj zakrzywionej pincety, aby chwycić mikrochip z próbką za dłuższą krawędź i umieść go w szczelinie (gnieździe) w końcówce uchwytu TEM z przepływem cieczy. Strona z SiN powinna być skierowana do góry. Sprawdź prawidłowe umieszczenie mikrochipu w szczelinie za pomocą binokularowego mikroskopu świetlnego.
      UWAGA: Jeśli pierścień O-ring znajdujący się poniżej mikrochipu nie jest prawidłowo osadzony, mikrochip może wystawać ze szczeliny.
    2. Za pomocą mikropipety nanieś na mikrochip z próbką kroplę 0,3 µL przefiltrowanej cieczy do eksperymentu. W razie potrzeby unieruchom mikrochip pincetą, ponieważ siły kapilarne kropli mogą wyciągnąć mikrochip z gniazda.
    3. Użyj zakrzywionej pincety trzymanej odwrotnie, aby pobrać drugi mikrochip (ten z warstwą dystansową). Ostrożnie obróć mikrochip do góry nogami. Umieść mikrochip dystansowy na mikrochipie bazowym w szczelinie.
      UWAGA: Procedurę tę należy wykonać wystarczająco szybko, aby uniknąć wyschnięcia kropli na mikrochipie z próbką.
    4. Sprawdź prawidłowe rozmieszczenie za pomocą binokularowego mikroskopu świetlnego, przesuwając kawałek materiału odbijającego światło pod końcówką uchwytu próbek. Oba mikrochipy muszą być ustawione dokładnie równolegle, aby uzyskać najlepsze pokrycie okien SiN.
      UWAGA: W przypadku braku pokrycia okien, mikrochipy można repozycjonować, naciskając z jednej strony końcówką pincety, jednak należy unikać nadmiernego przesuwania mikrochipów, ponieważ membrana SiN może zostać łatwo uszkodzona. Niektóre mikrochipy mają konfigurację krzyżową (okno jednego mikrochipu jest prostopadłe do okna w drugim mikrochipie); ta konfiguracja ułatwia wyrównanie dwóch mikrochipów, ale jednocześnie zmniejsza pole widzenia w mikroskopie elektronowym.
    5. Chwyć pincetą przednią stronę pokrywy komory próbek i obróć ją do góry nogami. Nie dotykając mikrochipów, umieść tylną stronę pokrywy na końcówce. Powoli otwórz pincetę w taki sposób, aby pokrywa opierała się wyłącznie na dolnym ramieniu pincety. Ostrożnie opuść pokrywę, aż spocznie ona na dwóch mikrochipach. Usuń pincetę.
    6. Ponownie sprawdź wyrównanie okien obu mikrochipów. W razie potrzeby zdejmij pokrywę, skoryguj położenie mikrochipów i ponownie załóż pokrywę.
    7. Włóż śruby i przymocuj je w ich zwykłych miejscach. Sprawdź wyrównanie dwóch okien. W razie potrzeby ponownie wykręć śruby i skoryguj ułożenie mikrochipów.
      UWAGA: Nie dokręcaj śrub zbyt mocno, ponieważ może to spowodować uszkodzenia. Uszczelnienie próżniowe zostaje osiągnięte w momencie, gdy śruby zostaną po prostu dokręcone.
    8. Sprawdź szczelność, inicjując przepływ cieczy przez układ z szybkością 4 µL/min. Jeśli po żadnej ze stron końcówki nie zaobserwowano wycieku, jest to dobry wskaźnik szczelności próżniowej.
    9. Przenieś uchwyt do stacji pompy próżniowej i sprawdź szczelność próżniową. Poziom próżni powinien osiągnąć co najmniej 10-5 mbar w ciągu 5 min pompowania.
      UWAGA: Zaleca się przetestowanie stacji pompowania z uchwytem testowym przed właściwym użyciem.
    10. Przenieś uchwyt do mikroskopu elektronowego w jego obudowie, aby zapobiec osadzaniu się kurzu.
      UWAGA: Każdy komercyjny uchwyt jest dostarczany z obudową.

3. STEM próbki w cieczy

  1. Ustawianie mikroskopu elektronowego do trybu STEM
    UWAGA: Obsługa mikroskopu elektronowego opisana w niniejszym protokole opiera się na standardowych procedurach zawartych w instrukcji obsługi. Protokół opisuje szczegóły wykraczające poza standardowe procedury pozyskiwania danych dla próbek w fazie ciekłej.
    1. Uruchom mikroskop z wyrównanym trybem STEM. W uchwycie do próbek umieść próbkę testową składającą się z cienkiej folii węglowej z AuNP. Dostosuj ustawienia mikroskopu STEM w następujący sposób: ustaw prąd sondy na 0,18 nA oraz półkąt zbieżności wiązki elektronów na 20 mrad, wybierając rozmiar plamki 4C i aperturę obiektywu 30 µm. Wybierz długość kamery 8 cm.
    2. Zanotuj wskazaną gęstość prądu mierzoną na ekranie fluorescencyjnym przy włożonym detektorze ADF. Wyjmij uchwyt z próbką.
      UWAGA: Ta wartość prądu będzie potrzebna później do oszacowania grubości cieczy.
    3. Uruchom przepływ cieczy, używając czystej wody. Nie przekraczaj przepływu 2 µL/min.
    4. Włóż uchwyt TEM z przepływem cieczy do mikroskopu elektronowego i rozpocznij ewakuację. Sprawdź wskazanie próżni w komorze przedpróżniowej oraz czas trwania ewakuacji. Jeśli poziom próżni jest standardowy, a czas trwania procedury pompowania nie przekracza dwukrotnie normalnego czasu ewakuacji (ok. 1 min), włóż uchwyt.
    5. Otwórz zawór wiązki, gdy próżnia w głównej komorze z próbką znajduje się w zakresie umożliwiającym jego otwarcie. Włóż detektor ADF, naciskając przycisk ADF.
      UWAGA: Niniejszy protokół odnosi się do detektora ADF umieszczonego nad ekranem fosforowym mikroskopu elektronowego.
    6. Ustaw mikroskop w trybie ciągłego pozyskiwania obrazu, stosując rozmiar obrazu 512 x 512 pikseli, czas przebywania piksela 2 µs i powiększenie 20 000. Wyszukaj okno SiN, przesuwając stolik w kierunkach x i y.
      UWAGA: Mikroczipy blokują wszystkie elektrony przechodzące przez próbkę w stronę detektora; sygnał jest widoczny tylko w miejscu SiN. Patrz Rysunek 5. Czasami łatwiej jest znaleźć okno SiN, obserwując ekran fluorescencyjny.
    7. Po znalezieniu okna dostosuj ustawienia kontrastu i jasności (używając odpowiednich pokręteł), tak aby krawędź okna stała się widoczna. Przesuń krawędź w stronę środka pola widzenia, naciskając przyciski przesuwu x i y stolika z próbką. Naciśnij przycisk resetu soczewki obiektywu.
      UWAGA: Jasność musi zostać znacznie zredukowana w porównaniu z próbką w próżni ze względu na silne rozpraszanie w cieczy.
    8. Następnie wykonaj wstępne ostrzenie ostrego narożnika na krawędzi okna SiN, regulując pozycję pionową (przesuw z) stolika z próbką. Zweryfikuj, czy pozycja próbki znajduje się na wysokości eukentrycznej, obracając stolik o 5° i wracając do pozycji wyjściowej. Cechy próbki i narożnik okna SiN nie powinny przesuwać się przy małych powiększeniach.
      UWAGA: Zamknij zawór wiązki, jeśli nie korzystasz z mikroskopu, ponieważ skanowanie tej samej pozycji przez dłuższy czas może doprowadzić do uszkodzenia próbki i powstania pęcherzyków gazu.
    9. Ponownie dostosuj pozycję pionową w razie potrzeby, aby krawędź okna ponownie znalazła się na środku obszaru widzenia. Zapisz pozycję stolika za pomocą przycisku zapisu w oprogramowaniu.
    10. Przenieś się w miejsce, w którym znajdują się małe drobiny zanieczyszczeń lub inne obiekty o wysokim kontraście (np. AuNP), przesuwając stolik w kierunkach x i y. Dostosuj ostrość soczewki obiektywu tak, aby wszystkie obiekty były wyraźne.
    11. Zanotuj gęstość prądu mierzoną na ekranie fosforowym widocznym w oprogramowaniu operacyjnym, wskazującą prąd przechodzący przez uchwyt z cieczą i przez otwór detektora ADF. Oblicz grubość celi z cieczą, korzystając z Równania 1. Kontynuuj tylko wtedy, gdy grubość cieczy została określona i nie przekracza 3 µm.
      UWAGA: Grubość celi z cieczą można wyznaczyć na podstawie stosunku zmierzonej gęstości prądu z próbką i bez próbki, korzystając z następującego równania14
      Wzór na zanik wykładniczy w układzie optycznym; opisuje transmisję intensywności światła.       Równanie 1
      gdzie tSiN to grubość amorficznej membrany z azotku krzemu, a twater to grubość warstwy wody. Średnie drogi swobodne wynoszą lSiN = 0,79 µm dla SiN oraz lwater = 3,0 µm dla wody przy półkącie otworu detektora 35 mrad14.
    12. Uważnie obserwuj ciecz przy mniejszych powiększeniach, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków gazu. Można zapobiec powstawaniu pęcherzyków gazu, stosując ciągły przepływ cieczy i prąd sondy niższy niż 0,5 nA.
    13. Przesuwaj stolik w kierunkach x i y, aż zostanie znaleziony obszar zawierający co najmniej 20 AuNP. Ustaw rozmiar obrazu na 1 024 x 1 024 piksele, czas przebywania piksela na 19 µs i powiększenie na 400 000. Pozyskaj obrazy AuNP przytwierdzonych do membrany SiN, naciskając przycisk akwizycji.
      UWAGA: Gdy zostaną uzyskane obrazy, na których AuNP są widoczne z silnym kontrastem i ostrymi krawędziami (patrz Rysunek 6), można mieć pewność, że eksperyment został poprawnie przygotowany. W przypadku wystąpienia nieoczekiwanych problemów nie kontynuuj eksperymentu, lecz upewnij się, że przyczyna została usunięta.
  2. STEM procesu rozpuszczania AuNP
    1. Wyjmij uchwyt TEM z przepływem cieczy z mikroskopu i zatrzymaj przepływ cieczy.
    2. Przygotuj w strzykawce szklanej co najmniej 1 mL 0,1 M roztworu chlorku sodu w wodzie klasy HPLC.
    3. Ustaw system przepływowy na prędkość 20 µL/min i przepłucz cały system 0,3 mL roztworem soli. Użyj papieru filtracyjnego do zebrania cieczy wypływającej z drugiego końca rurki. Następnie ponownie ustaw system przepływowy na 2 µL/min.
    4. Sprawdź szczelność okna SiN za pomocą binokularowego mikroskopu świetlnego. Jeśli nie stwierdzono wycieku, ponownie włóż uchwyt TEM z przepływem cieczy do mikroskopu.
    5. Sprawdź wskazanie próżni w komorze przedpróżniowej i czas trwania ewakuacji. Jeśli poziom próżni jest standardowy, a czas trwania procedury pompowania nie przekracza dwukrotnie normalnego czasu ewakuacji (ok. 1 min), włóż uchwyt.
    6. Przesuń stolik mikroskopu z powrotem do poprzedniej pozycji, korzystając z zapisanej pozycji stolika. Ustaw mikroskop w trybie ciągłego pozyskiwania obrazu, stosując rozmiar obrazu 512 x 512 pikseli, czas przebywania piksela 2 µs i powiększenie 20 000X. Dostosuj kontrast, jasność, ostrość i wysokość eukentryczną zgodnie z opisem w krokach 3.1.7-3.1.9.
    7. Znajdź interesujący obszar, przesuwając stolik w kierunkach x i y. Ustaw rozmiar obrazu na 1 024 x 1 024 piksele, czas przebywania piksela na 2 µs i powiększenie na 500 000. Nagraj serię obrazów STEM, ręcznie naciskając przycisk akwizycji po zarejestrowaniu poprzedniego obrazu.
      UWAGA: AuNP zaczynają się rozpuszczać, gdy tylko wiązka elektronów zostanie przeskanowana nad próbką. Cząsteczki poza obszarem naświetlanym nie są dotknięte i mogą być obserwowane bezpośrednio po tym. Znacznik czasu jest zapisywany w nagłówku obrazu. Można również użyć oprogramowania do automatycznego zbierania serii obrazów w film.
  3. Demontaż i czyszczenie uchwytu TEM po eksperymencie
    1. Po zakończeniu eksperymentów TEM w fazie ciekłej i wycofaniu uchwytu z mikroskopu elektronowego, wyczyść rurki, komorę z cieczą i jej elementy, aby usunąć wszelkie stałe cząsteczki lub pozostałości soli, które mogłyby wpłynąć na przyszłe eksperymenty.
    2. Lekko poluzuj tylną śrubę tak, aby nadal była utwierdzona w gnieździe, ale pokrywę można było łatwo zdjąć. Poluzuj przednią śrubę, wykręć ją i umieść w środowisku wolnym od kurzu.
    3. Zdejmij pokrywę i umieść ją w środowisku wolnym od kurzu do przechowywania.
    4. Wyjmij dwa mikroczipy z kieszeni. Oddziel je, zanurzając ostrożnie w wodzie lub w pozostałym roztworze z eksperymentu. Połóż mikroczipy na ręczniku papierowym stroną z membraną SiN do góry i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w celu dalszej analizy.
    5. Zdejmij pierścienie O-ring i wyczyść odpowiednie rowki wodą klasy HPLC. Przechowuj pierścienie O-ring w środowisku wolnym od kurzu.
    6. Użyj strzykawki szklanej (5 mL), aby przepłukać wszystkie rurki (wlotowe i wylotowe), każdą z nich 5 mL wodą klasy HPLC. Zbierz ciecz do małego zlewka umieszczonego pod końcówką uchwytu TEM. Po przepłukaniu użyj pipety i/lub papieru filtracyjnego, aby usunąć pozostałą ciecz z komory z cieczą.
    7. Obejrzyj końcówkę uchwytu TEM i usuń zanieczyszczenia, takie jak odłamki krawędzi mikroczipów krzemowych, włókna lub kurz. Jeśli sól jest nadal widoczna, powtórz procedurę czyszczenia. Włóż pierścienie O-ring z powrotem do rowków.
    8. Przechowuj uchwyt TEM i jego elementy w środowisku wolnym od kurzu.
  4. Procedura alternatywna do 3.2: STEM ruchomych nanocząsteczek złota
    UWAGA: Do badania ruchu AuNP w cieczy wymagana jest inna procedura montażu.
    1. Pomiń krok 1.2. Załaduj AuNP na mikroczip krzemowy bezpośrednio przed włożeniem ich do uchwytu TEM w kroku 2.2. Próbkę należy przez cały czas utrzymywać pod warstwą cieczy, aby uniknąć silnego przytwierdzenia AuNP do membrany SiN. Pozostałe kroki protokołu są takie same. Seria obrazów STEM jest uzyskiwana w kroku 3.2.6.

Schemat przygotowania preparatu do mikroskopii elektronowej, przedstawiający rozmieszczenie precyzyjnych narzędzi i metodę wyrównywania.
Rysunek 4: Montaż uchwytu TEM do przepływu cieczy. (A) Komora celi cieczowej z mniejszym pierścieniem O-ring umieszczonym w rowku. Na wkładce przedstawiono widok z góry. (B) Bazowy mikrochip jest umieszczany w odpowiednim gnieździe. Na wkładce przedstawiono widok z boku pod kątem, pod którym mikrochip jest widoczny dzięki odbiciu światła. (C-D) Na mikrochip nanosi się kroplę roztworu. (E-G) Umieszczenie mikrochipu przykrywkowego. (H-I) Umieszczenie pokrywy komory celi cieczowej. (J) Mocowanie pokrywy za pomocą dwóch śrub. (K) Zmontowany uchwyt TEM do przepływu cieczy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia krzemowego mikrochipu; ogniskowanie okna SiN; obrazy niedostrojone, optymalne i przeostrzone; skala 3µm.
Rycina 5: Wstępne pozycjonowanie i ogniskowanie z wykorzystaniem mikrografii STEM. (A) Aby zlokalizować okno SiN, stolik jest przesuwany w stronę najsilniejszego sygnału. Krzemowy mikrochip jest na tyle cienki, że część elektronów przenika przez obszar w pobliżu okna. (B) Krawędź ostro ustawionego okna SiN, na której widoczne są jasne AuNPs na ciemnej (wykazującej mniejsze rozproszenie) membranie okna SiN. Krawędź mikrochipu jest jasna ze względu na nadmierne rozproszenie. (C) Ogniskowanie jest wykonywane w narożniku okna SiN. Obrazy przedstawiają sytuację niedostrojenia, poprawnego ustawienia ostrości oraz przeostrzeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Do badania zachowania AuNP w cieczy wykorzystano uchwyt TEM do przepływu cieczy. AuNP zostały stabilnie unieruchomione na membranie SiN w czystej wodzie i obrazowano je z rozdzielczością nanometryczną przy użyciu STEM w fazie ciekłej (Rysunek 6). Uzyskano doskonały kontrast dla silnie rozpraszającego złota. Gęstość prądu na ekranie fosforyzującym zmierzona dla suchej próbki testowej wynosiła 20 pA/cm², natomiast przy włożonym uchwycie TEM do przepływu cieczy wyniosła 8 pA/cm². Korzystając z Równania 1, twater = 2.4 ±0.5 µm, co jest wartością znacznie większą niż oczekiwano na podstawie grubości dystansera wynoszącej 200 nm. Niemniej jednak grubość ta nie jest zbyt duża, aby obrazować AuNP z nanometryczną rozdzielczością przestrzenną. Warstwa cieczy była grubsza niż 200 nm wyznaczone przez dystanser ze względu na wybrzuszenia membran SiN, nierówności mikrochipów oraz zanieczyszczenia znajdujące się na mikrochipach.

W przypadku czystej wody AuNPs zachowują swój kształt podczas obrazowania16, choć reaktywne produkty radiolizy (e-aq, H•, H+, OH•) powstające w wyniku oddziaływania wiązki elektronów z wodą mogą utleniać pojedyncze atomy złota, co prowadzi do zmiany kształtu AuNPs15. Jednakże, gdy w drugim eksperymencie zastosowano system przepływu cieczy do wprowadzenia jonów chlorkowych, zmieniła się stabilność AuNPs. Jony chlorkowe są w stanie stabilizować utlenione atomy złota w formie tetrachloroaureinianu, AuCl4-. Rysunek 7 pokazuje, że AuNPs powoli rozpuszczały się podczas serii obrazowania STEM w czasie, podobnie jak w wynikach raportowanych wcześniej16. Przy zastosowanej gęstości dawki elektronów rozpuszczenie AuNPs o rozmiarze 30 nm trwało ~300 s.

Ruchy AuNP w wodzie zbadano w trzecim eksperymencie (Rycina 8). Przed eksperymentem uchwyt TEM do przepływu cieczy został oczyszczony w celu usunięcia wszelkich śladów soli. W przeciwieństwie do pierwszego eksperymentu, zastosowano alternatywne podejście do przygotowania próbki, aby uzyskać słabsze przytwierdzenie AuNP do membrany SiN14. W tym eksperymencie roztwór AuNP naniesiono na krzemowy mikroczip i zamontowano w uchwycie TEM do przepływu cieczy, nie dopuszczając do wyschnięcia roztworu. W ten sposób AuNP łatwo odrywały się od membrany SiN podczas obrazowania przy zastosowanej dawce promieniowania. Niektóre AuNP oddaliły się z pola widzenia do objętości roztworu, natomiast pozostałe AuNP pozostały w polu widzenia w bezpośrednim sąsiedztwie okna SiN. Obserwowano ruchy tych AuNP, które ostatecznie uległy aglomeracji. Po pewnym czasie aglomeraty te również odłączyły się od membrany SiN i przemieściły się poza pole widzenia do roztworu.

Agregacja nanocząsteczek, obraz z mikroskopu elektronowego, pasek skali 100 nm, badanie z zakresu inżynierii materiałowej.
Rysunek 6: Mikrografia z transmisyjnego mikroskopu elektronowego z detekcją skanującą (STEM) nanocząsteczek AuNPs o średnicy 30 nm na powierzchni warstwy czystej wody. Przedstawiony obraz jest wybranym obszarem obrazu oryginalnego. Rozmiar obrazu wynosił 1 024 x 1 024 piksele, czas ekspozycji piksela wynosił 19 µs, rozmiar piksela wynosił 0,73 nm, a powiększenie wynosiło 400 000X. Dawka elektronów wynosiła zatem 7,1 x 104 e-/nm². Gęstość prądu zmierzona na ekranie fluorescencyjnym wynosiła 8 pA/cm2, zatem obliczono, że grubość cieczy wynosiła 2,4 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia poklatkowa agregacji nanocząsteczek w ciągu 90 sekund; pasek skali 60 nm.
Rycina 7: Seria poklatkowa mikrografii STEM AuNP w soli fizjologicznej. (A-D) Obrazy wyodrębnione z serii obrazów STEM wykonanych w odstępach 30 s. AuNP stopniowo rozpuszczają się w cieczy w wyniku obecności jonów chlorkowych. Czas przebywania wiązki na pikselu wynosił 2 µs, czas klatki w serii poklatkowej wynosił 1,75 s, rozmiar piksela wynosił 0,44 nm, a powiększenie wynosiło 500 000X. Dawka elektronów na obraz wynosiła 1,2 x 104 e-/nm². Grubość cieczy wynosiła 2,4 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dynamiczne śledzenie cząstek w mikroskopii; panel A: ścieżki ruchu cząstek, panel B: kolorowe trajektorie.
Rysunek 8: Mikrografia STEM AuNP przemieszczających się w czystej wodzie. (A) Membrana SiN z AuNP, z których kilka zostało zaznaczone strzałkami. (B) Ścieżki ruchu wybranych AuNP (patrz A). Niektóre AuNP opuściły pole widzenia w czasie obrazowania. Pozostałe AuNP poruszają się bocznie wzdłuż membrany SiN i zaczynają aglomerować. Po osiągnięciu krytycznego rozmiaru klastra odrywają się od membrany i oddalają od pola widzenia. Czas przebywania na pikselu wynosił 1 µs, czas klatki 0,52 s, rozmiar piksela 1,8 nm, a powiększenie 120 000X. Dawka elektronów na obraz wynosiła 3,5 x 102 e-/nm², a grubość cieczy 2,4 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany protokół umożliwia STEM AuNPs w cieczy, w tym obserwację procesów dynamicznych. Montaż uchwytu jest techniką łatwą do nauczenia. Jednak podczas pracy z uchwytem TEM przepływu cieczy należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Na przykład złamane krawędzie mikrochipa Si lub duże cząstki na O-ringach mogą spowodować wyciek płynnej komórki. Z drugiej strony duże cząstki (>200 nm; np. kurz lub zanieczyszczenia Si) na membranie SiN może powodować zwiększenie grubości ciekłej komórki, co prowadzi do niskiego kontrastu obrazowania lub niskiej rozdzielczości przestrzennej, a nawet może spowodować pęknięcie okien SiN. Co ważne, pozostałości soli lub innych substancji chemicznych mogą w niepożądany sposób wpłynąć na wynik eksperymentów. Dlatego tak ważne jest, aby poszczególne etapy przygotowania próbki i montażu uchwytu były wykonywane ostrożnie w czystym i wolnym od kurzu środowisku.

Grubość ciekłej komórki decyduje o osiągalnej rozdzielczości, a także o kontraście uzyskanych obrazów17. Grubość tę można regulować za pomocą przekładek umieszczonych na jednym z dwóch mikrochipów Si. W zależności od wymiarów próbki można uzyskać różne grubości kuwety cieczowej. Do badania AuNP możliwe jest użycie małych przekładek (200-500 nm), podczas gdy całe komórki eukariotyczne potrzebują większych przekładek do 5 μm. Na grubość ciekłej komórki ma ponadto wpływ wybrzuszenie okien membrany SiN wynikające z różnicy ciśnień między cieczą a otaczającą ją próżnią. Efekt ten staje się bardziej wyraźny w przypadku większych okien membranowych SiN. Dlatego, aby zminimalizować grubość ciekłej komórki, zaleca się stosowanie małych okien membrany SiN. W przypadku, gdy trudno jest znaleźć zakładkę między dwoma małymi oknami, można je zmontować w konfiguracji skrzyżowanej za pomocą innego mikroczipa bazowego. Alternatywne konfiguracje w dużej mierze zapobiegają wybrzuszeniom i składają się z monolitycznego mikrochipa18 lub okien membranowych wspartych na słupkach19, ale mają one wady dotyczące ładowania próbki. Jednym z najtrudniejszych aspektów obecnej technologii jest brak precyzyjnej kontroli nad gęstością cieczy. Często ciecz jest znacznie gęstsza niż można się spodziewać po zastosowanych wymiarach przekładki, jak pokazano tutaj. Kilka grup używało zamkniętych komór cieczowych 4,20,21,22; Systemy te mają pewne zalety w zakresie rozdzielczości przestrzennej, ponieważ grubość cieczy można zmniejszyć poprzez wywołanie pęcherzyka w cieczy. Alternatywnie, okna SiN mogą zostać zmuszone do zapadnięcia się, co prowadzi do cieńszej warstwy cieczy. Po trzecie, istnieje obudowa z innych cieńszych okien (np. grafen)23, co również skutkuje znacznie rzadszymi cieczami niż to, co jest możliwe w przypadku systemu opisanego w tym protokole. Jednak w tych układach nie ma możliwości przepływu cieczy.

Podobnie jak w przypadku każdej techniki mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, należy wziąć pod uwagę szereg aspektów eksperymentalnych. Najważniejszym aspektem jest oddziaływanie wiązki elektronów z cieczą lub próbką. Oprócz uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, które ograniczają osiągalną rozdzielczość przestrzenną dla wielu próbek stałych24, na próbki cieczy wpływają również produkty radiolizy generowane wiązką elektronów15,25. Ponieważ produkty te mogą mieć wpływ na eksperyment, niezbędna jest staranna interpretacja danych i projekt eksperymentu26. Ustawienia mikroskopu powinny być dobrane zgodnie z celami konkretnego badania. ADF STEM jest bardziej wydajny do obrazowania nanocząstek o wysokiej liczbie atomowej (Z) w większej grubości ciekłej komórki, podczas gdy TEM zapewnia lepszy kontrast na materiałach o niskiej zawartości Z i jest zwykle szybszy, ale wymaga cieńszych warstw cieczy3. Zamiast detektora ADF, detektor Bright Field (BF) jest czasami używany do obrazowania ogniwa cieczowego, ponieważ BF STEM jest korzystny do obrazowania materiałów o niskiej zawartości Z w grubych warstwach27. Wraz ze wzrostem grubości ogniwa cieczowego potrzebny jest większy prąd. Jednak zwiększa to również stężenie produktów radiolizy i zwiększa uszkodzenia popromienne. Należy również zauważyć, że w detektorze ADF obserwuje się odwrócenie kontrastu dla bardzo gęstych cieczy (>10 μm dla wody).

Warunki cieczy zostały zmienione między naszymi eksperymentami poprzez wyjęcie uchwytu z mikroskopu i wymianę zarówno próbki, jak i cieczy. Oprócz zmiany stężenia soli, łatwo można zmienić inne właściwości cieczy poprzez przepływ w różnych cieczach (np. można użyć roztworów buforowych w celu ustawienia określonego pH16 lub można wprowadzić roztwory organiczne lub inne dodatki). Możliwa jest również zmiana cieczy, gdy uchwyt jest nadal włożony do mikroskopu, poprzez przepływ cieczy przez system mikroprzepływowy. Jednak w tym przypadku nie wiadomo, w którym momencie zmienia się ciecz w próbce. Warto również zauważyć, że dostępne są mikroczipy podtrzymujące elektrody, dzięki czemu można przeprowadzać eksperymenty elektrochemiczne w nanoskali28.

Obiekty badań nie ograniczają się do AuNP w wodzie, ale przy użyciu opisanego powyżej protokołu można badać szeroką gamę próbek, w tym krzemionkę, tlenek tytanu i polimery. Jeśli ruchy obiektów są zbyt szybkie, aby uchwycić je na obrazie w trakcie akwizycji, lepkość można zmniejszyć o rząd wielkości, stosując mieszaninę 50% glicerolu i 50% wody.

Z wyżej wymienionych punktów wyłania się szereg zalet, możliwości, a także wad. Podczas pracy z STEM w fazie ciekłej najważniejsze wady, które należy wziąć pod uwagę, to: 1) na każdy eksperyment ma wpływ dynamiczne oddziaływanie wiązki elektronów z całą próbką (obserwowanym obiektem, cieczą i membranami SiN); 2) obchodzenie się z próbką jest żmudne i często trudno jest uzyskać cienką warstwę cieczy, ponieważ próbka lub mikroczipy zawierają cząstki o wielkości mikrometra; 3) grubość cieczy zwykle różni się znacznie od zamierzonej grubości ustawionej przez przekładkę; oraz 4) rozdzielczość przestrzenna i kontrast silnie zależą od grubości cieczy i różnicy między gęstością zmian obserwowanego obiektu a cieczą.

Obecnie istnieje wiele metod mikroskopii obiektów w cieczy z nanometrową rozdzielczością przestrzenną. Mikroskopia elektronowa w lodzie amorficznym jest potężną techniką29, ale związane z nią procedury eksperymentalne są delikatne, nie wszystkie eksperymenty pozwalają na przygotowanie próbki w lodzie, a eksperymenty z rozdzielczością czasową są niemożliwe. Mikroskopia rentgenowska30,31 może być w zasadzie stosowana, ale ma ograniczoną rozdzielczość przestrzenną i nie jest powszechnie dostępna w laboratoriach. Mikroskopia sił atomowych w cieczy została ustalona, ale jest to technika powierzchniowa tylko 32,33,34,35. Mikroskopia świetlna nie wykazuje wystarczającej rozdzielczości przestrzennej. Obecnie mikroskopia elektronowa w cieczy wydaje się najpotężniejszą techniką bezpośredniej mikroskopii obiektów i procesów w nanoskali.

TEM i STEM w fazie ciekłej nie są jeszcze rutynowymi technikami analitycznymi, ale wciąż się rozwijają. Liczba parametrów, które należy wziąć pod uwagę, jest znaczna i często trudno jest odtworzyć wyniki eksperymentalne. Co więcej, dane ilościowe są trudne do uzyskania, ponieważ badane efekty przeplatają się z procesami zachodzącymi w wyniku działania wiązki elektronów. Opisany tutaj protokół ma na celu standaryzację protokołu eksperymentalnego, uwzględniając w ten sposób wszystkie istotne podstawowe aspekty eksperymentu. Mamy nadzieję, że protokół ten doprowadzi do lepszej odtwarzalności prac eksperymentalnych w tej rozwijającej się dziedzinie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy E. Arztowi za jego wsparcie za pośrednictwem INM. Badania były częściowo wspierane przez Konkurs Leibniza 2014.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lornetkowy mikroskop świetlnyLeicaM60 CMO
Skaningowy miroskop elektronowy transmisyjny z korektorem aberracji sferycznejJEOLARM200F
Uchwyt na próbki TEM z przepływem cieczyDENS SolutionsOcean
Mikroprzepływowa pompa strzykawkowaHarvard ScientificPicoPlus
Środek do czyszczenia plazmyGatanSolarus950
Chemicals
Aceton, Rotisolv  Plus dla HPLCSigma-Aldrich7328.2
Woda, chromasolv Plus dla HPLCSigma-Aldrich34877-2.5L
Etanol, Rotisolv HPLC klasyCarl RothP076.2
Stabilizowany cytrynianem koloidu złota, średnica 30 nmBritish-BiocellEM. GC20
Materials
Base silicon microchipy z membranami z azotku krzemu o grubości 50 nm i wymiarach 20 &mikro; m x 0,40 mmDENS Solutionsfor Ocean System
Dystansowe mikroczipy krzemowe z membranami z azotku krzemu o grubości 50 nm, wymiarach 20 i mikro; m x 0,40 mm i grubość dystansu 200 nmRozwiązania DENSdla systemu
Rurki mikroprzepływoweUpchurch Scientific1570
Plastikowe wymienne końcówki Pęseta
(antymagnetyczny, przeciwkwasowy korpus ze stali nierdzewnej z końcówkami ESD PVDF (SV)) ideal-tek2ASVR.SA
Pęseta ze stali giętej pokrytej teflonem (EMS SA z "PTFE" Powłoka)Mikroskopia elektronowa Sciences78322-7Te
Pęseta ze stali szerokodziobowej pokrytej teflonem (powłoka EMS 2A "PTFE")Mikroskopia elektronowa Sciences78322-2ATe
Strzykawka Hamiltona, 1 ml, gazoszczelna (Model 1001 TLLX SYR)Hamilton81323
Chusteczka do pomieszczeń czystych Sontara Micropure AP (224 x 224 mm)DuPontSontara MicroPure
Ocean

Bibliografia

  1. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  2. Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
  3. de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
  4. Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
  5. Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
  6. Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
  7. Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
  8. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
  9. de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
  10. Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
  11. Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
  12. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
  13. de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
  14. Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
  15. Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
  16. Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
  17. Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
  18. Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
  19. Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
  20. Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
  21. Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).
  22. Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
  23. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  24. Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  25. Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
  26. Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
  27. Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
  28. Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
  29. Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
  30. Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
  31. Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
  32. Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
  33. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
  34. Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
  35. Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

STEM w fazie ciekłejkomora mikroprzepływowamembrana z azotku krzemunanocząstki złotagrubość ogniwa z ciecząuszczelnienie próżnioweobrazowanie wiązką elektronówwprowadzanie próbkianaliza procesów dynamicznych
Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.