Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54976

⸱

28 grudnia 2016

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Streszczenie

Postępy w genomice zwiększyły możliwość badania różnorodności biologicznej na niespotykaną dotąd skalę. Jednak sama sekwencja nie będzie pouczająca bez narzędzi do badania funkcji genów. Opracowanie i wymiana szczegółowych protokołów tworzenia nowych systemów modelowych w laboratoriach oraz narzędzi do przeprowadzania badań funkcjonalnych ma zatem kluczowe znaczenie dla wykorzystania potencjału genomiki. Coleoptera (chrząszcze) są największym kladem owadów i zajmują praktycznie wszystkie typy siedlisk na planecie. Oprócz zapewnienia idealnych modeli do badań podstawowych, badania nad chrząszczami mogą mieć wpływ na zwalczanie szkodników, ponieważ często są one szkodnikami w gospodarstwach domowych, rolnictwie i przemyśle spożywczym. Przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli i utrzymania kolonii laboratoryjnych D. maculatus oraz przeprowadzania interferencji za pośrednictwem dsRNA u D. maculatus. Opisano zarówno procedury embrionalne, jak i rodzicielskie RNAi - w tym ustawienie aparatury, przygotowanie, wstrzyknięcie i rekonwalescencję po wstrzyknięciu. Przedstawiono również metody analizy fenotypów embrionalnych, w tym żywotności, wad wzoru u wyklutych larw oraz preparatów kutykulowych dla niewyklutych larw. Testy te, wraz z hybrydyzacją in situ i barwieniem immunologicznym dla markerów molekularnych, sprawiają, że D. maculatus jest dostępnym systemem modelowym do badań podstawowych i stosowanych. Dostarczają one również przydatnych informacji do ustanawiania procedur w innych powstających systemach modelowania owadów.

Wprowadzenie

W 1998 roku Fire i Mello donieśli, że dwuniciowy RNA (dsRNA) może indukować inhibicję funkcji genów u Caenorhabditis elegans1. Odpowiedź ta, wywołana przez dsRNA, została nazwana interferencją RNA (RNAi), a wyciszanie genów zapśredniczone przez RNAi okazało się zachowane u zwierząt, roślin i grzybów2-7. U roślin i niektórych zwierząt RNAi działa systemowo, co oznacza, że efekt może rozprzestrzeniać się na inne komórki/tkanki, do których dsRNA nie został wprowadzony bezpośrednio (przegląd w8-10). Naukowcy wykorzystali tę endogenną komórkową odpowiedź RNAi, projektując cząsteczki dsRNA celujące w interesujące ich geny, co pozwala na wyciszenie (knockdown) funkcji genu bez bezpośredniej manipulacji w genomie (przegląd w11-14).

RNAi jest potężnym narzędziem do badań funkcjonalnych ze względu na następujące zalety. Po pierwsze, dzięki RNAi można celować w gen nawet przy minimalnych informacjach o jego sekwencji. Jest to szczególnie istotne w badaniach organizmów niemodelowych, dla których brakuje danych genomowych lub transkryptomicznych. Po drugie, w organizmach, w których odpowiedź RNAi ma charakter silnie systemowy, wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi można przeprowadzać niemal na każdym etapie rozwoju. Cecha ta jest bardzo użyteczna przy badaniu funkcji genów plejotropowych. Po trzecie, w niektórych przypadkach efekty RNAi rozprzestrzeniają się na gonady i potomstwo, tak że fenotypy obserwuje się u potomstwa15,16. Zjawisko to, znane jako rodzicielskie RNAi (pRNAi), jest szczególnie korzystne w przypadku genów wpływających na rozwój embrionalny, ponieważ liczne potomstwo wyprodukowane przez jednego wstrzykniętego rodzica można badać bez bezpośredniej manipulacji jajami. Z tych względów pRNAi jest metodą z wyboru. Jednakże, jeśli pRNAi jest nieskuteczne, na przykład w przypadku genów niezbędnych do oogenezy, należy zastosować embrionalne RNAi (eRNAi). Po czwarte, RNAi może być wykorzystane do wygenerowania odpowiednika serii allelicznej, ponieważ ilość dostarczonego dsRNA można zmieniać w określonym zakresie, aby wywołać defekty od słabych do silnych. Taka gradacja fenotypów może być pomocna w zrozumieniu funkcji genu, gdy jest on zaangażowany w złożony proces i/lub całkowita utrata funkcji jest letalna. Po piąte, dostarczanie dsRNA jest zazwyczaj łatwe i wykonalne, zwłaszcza u zwierząt wykazujących silne systemowe odpowiedzi RNAi. dsRNA można wprowadzić poprzez mikroiniekcję1,5, karmienie/spożycie17,18, namaczanie19,20 oraz dostarczanie za pośrednictwem wirusów/bakterii21,22. Po szóste, w przeciwieństwie do niektórych metod celowania/edycji genów, przy użyciu RNAi nie ma potrzeby przesiewania organizmów niosących mutację ani przeprowadzania krzyżówek genetycznych w celu wygenerowania homozygot. Dlatego w porównaniu z wieloma innymi technikami badania funkcji genów, RNAi jest szybkie, niedrogie i może być stosowane w badaniach przesiewowych na dużą skalę23-25.

Szerokie zastosowanie RNAi umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w szerokim zakresie organizmów, rozszerzając grupę gatunków dostępnych do badań poza tradycyjne systemy modelowe, dla których opracowano narzędzia genetyczne. Na przykład, badania z wykorzystaniem systemów niemodelowych są niezbędne do uzyskania wglądu w ewolucję genów i sieci genowych poprzez porównanie funkcji ortologów z gatunków reprezentujących różne tryby rozwoju lub wykazujących odmienne cechy morfologiczne26-29. Tego typu badania pozwolą na lepsze zrozumienie różnorodności biologicznej, co wpłynie zarówno na badania stosowane, jak i podstawowe.

Owady, będące największą grupą zwierząt na planecie, dają ogromne możliwości badania mechanizmów leżących u podstaw różnorodności. Ponadto owady są zazwyczaj małe, mają krótkie cykle życiowe, wysoką płodność i są łatwe w hodowli laboratoryjnej. W ciągu ostatnich dwóch dekad metodę RNAi z powodzeniem zastosowano u owadów z różnych rzędów, w tym Diptera (muchówki)5, Lepidoptera (motyle)30, Coleoptera (żukowate)16,31, Hymenoptera (błonkówki: piłkowskrzydłe, osy, mrówki i pszczoły)32, Hemiptera (pluskwiaki), Isoptera (termity)34, Blattodea (karaczany)35, Orthoptera (pasikonikowate: świerszcze, koniki polne, szarańcze i świerszcze)36 oraz Phthiraptera (wszy)37. Skuteczne zastosowanie RNAi dostarczyło danych funkcjonalnych do badań nad wzorcowaniem we wczesnej embriogenezie (oś przednio-tylna32, oś grzbietowo-brzuszna28, segmentacja26,38), determinacją płci39,40, biosyntezą chityny/kutykuli41, sygnalizacją ekdyzonową42, zachowaniami społecznymi43 i wieloma innymi procesami. Metody RNAi opracowane dla różnych gatunków owadów mogą przynieść dodatkowe korzyści, ponieważ prawdopodobnie okażą się przydatne w zwalczaniu szkodników (przegląd w44-46). Efekty RNAi będą specyficzne dla danego genu, jak i gatunku, o ile do celowania zostaną wybrane regiony niezakonserwowane. W przypadku pożytecznych gatunków owadów, takich jak pszczoły miodne i jedwabniki, celowanie w geny niezbędne do przetrwania wirusów lub pasożytów w celu opanowania infekcji może stanowić nową strategię ochrony tych gatunków47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), znany powszechnie jako chrząszcz skórzany, występuje na całym świecie z wyjątkiem Antarktydy. Jako owad holometaboliczny, cykl życiowy D. maculatus obejmuje stadia embrionalne, larwalne, poczwarki oraz stadium imago (Rycina 1). Ze względu na to, że żywi się on tkanką miękką, D. maculatus jest wykorzystywany w muzeach do szkieletowania martwych zwierząt, a entomolodzy sądowi mogą go wykorzystać do szacowania czasu zgonu49,50. D. maculatus żywi się produktami pochodzenia zwierzęcego, w tym padliną, suszonym mięsem, serem oraz poczwarkami/kokonami innych owadów, powodując tym samym szkody w gospodarstwach domowych, zapasach żywności oraz w przemyśle jedwabniczym, serowarskim i mięsnym 51,52. Zastosowanie RNAi u tego chrząszcza mogłoby zapewnić wydajny i przyjazny dla środowiska sposób na zminimalizowanie jego wpływu gospodarczego. Nasze laboratorium wykorzystało D. maculatus jako nowy model owada do badania segmentacji53. Oprócz podatności na hodowlę laboratoryjną, D. maculatus jest interesujący dla badań podstawowych, ponieważ jest gatunkiem o rozwoju średniozarodkowym (intermediate-germ developer), co czyni go użytecznym gatunkiem do badania przejścia między rozwojem krótkozarodkowym a długozarodkowym.

Schemat cyklu życiowego owada: stadia jaja, larwy, poczwarki i osobnika dorosłego wraz z pomiarami skali.
Rycina 1: Cykl życiowy D. maculatus. Fotografie D. maculatus w różnych stadiach rozwojowych, zgodnie z oznaczeniami. Cykl życiowy od jaja do osobnika dorosłego trwa trzy tygodnie w 30 °C, lecz dłużej w niższych temperaturach. (A, F) Świeżo złożone embriony są białe lub jasnożółte i owalne, o długości około 1,5 mm. Embriogeneza trwa ~55 hr w 30 °C. (B, C i G) Larwy posiadają ciemno pigmentowane pasy i są pokryte szczecinkami. Larwy przechodzą przez kilka stadiów rozwojowych (instarów) w zależności od środowiska, a ich długość może przekroczyć 1 cm. (D, H) Młode poczwarki są jasnożółte. Poczwarcowanie trwa ~ 5 - 7 dni w 30 °C. (E, I) Krótko po wykluciu na ciele dorosłego chrząszcza pojawia się ciemna pigmentacja. Osobniki dorosłe mogą żyć do kilku miesięcy, a jedna samica może złożyć setki embrionów w ciągu swojego życia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wcześniej wykazaliśmy, że RNAi jest skuteczną metodą wyciszania funkcji genów u D. maculatus53. W niniejszej pracy dzielimy się naszym doświadczeniem w hodowli kolonii D. maculatus w warunkach laboratoryjnych, przedstawiając szczegółowe protokoły przygotowania RNAi zarówno w stadium embrionalnym, jak i u osobników rodzicielskich, a także procedury wstrzykiwania, opieki poiniekcyjnej oraz analizy fenotypowej. Metody wyciszania genów za pośrednictwem dsRNA i metody analizy zaprezentowane w tym opracowaniu nie tylko dostarczają szczegółowych informacji niezbędnych do badania zagadnień dotyczących D. maculatus, ale mają również potencjalne znaczenie dla zastosowania RNAi u innych nie modelowych gatunków chrząszczy i owadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla D. maculatus

UWAGA: Kolonia hodowlana D. maculatus została założona w laboratorium autorów z wykorzystaniem osobników dorosłych i larw zakupionych komercyjnie. Tożsamość gatunkowa została zweryfikowana za pomocą kodowania DNA53.

  1. Aby przygotować nową klatkę w laboratorium, wysyp cienką warstwę trocin do średniej wielkości klatki dla owadów (30.5 x 19 x 20.3 cm3). Umieść w klatce kawałek styropianu o wymiarach ok. 10 x 6 x 3 cm3, aby larwy mogły się w nim schować podczas przepocznienia. Dodaj 20 - 50 chrząszczy (dorosłych osobników lub larw późnych stadiów). Chrząszcze schowają się w trocinach.
  2. Dodaj mokrą karmę dla kotów w szalce Petriego lub łódzce wagowej. Przykryj klatkę tkaniną z siatki i umieść ją w inkubatorze.
  3. W celu utrzymania kolonii hodowlanej w laboratorium ustaw temperaturę między 25 a 30 °C. D. maculatus rośnie szybciej w wyższych temperaturach, ale sprzyja to również rozwojowi grzybów i roztoczy. Aby utrzymać zdrową kolonię, stosuj temperaturę 25 - 28 °C do regularnego utrzymania populacji oraz 30 °C w celu szybkiego powiększenia kolonii. Cykl życiowy trwa od około trzech tygodni do czterech miesięcy, w zależności od czynników środowiskowych50 (Rysunek 2).

Eksperyment z biodegradacją przez owady; zestawienie ze styropianem, wiórami drewnianymi i karmą dla kotów; badanie ekologiczne.
Rysunek 2: D. maculatus Kolonia laboratoryjna. Przedstawiono zdjęcie typowej klatki dla owadów D. maculatus. Rozsypano wióry drewniane, aby chrząszcze mogły się ukryć. Karmę dla kotów umieszczono w małej szalce Petriego lub łódzce wazowej. Do klatki włożono styropian, który służy jako schronienie dla larw w ostatnim stadium przed przepociwieniem. Klatka pokazana na zdjęciu ma wymiary 30.5 x 19 x 20.3 cm3 i mieści kilkaset larw, pociorek oraz osobników dorosłych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Pozostaw jaja w klatce do czasu ich dojrzewania. Aby powiększyć kolonię, załóż nowe klatki z jajami (zebranymi zgodnie z opisem w sekcji 2), larwami lub osobnikami dorosłymi, analogicznie jak wyżej. D. maculatus składa jaja w całej klatce, szczególnie w pobliżu źródła pożywienia.
  2. Wymieniaj mokrą karmę dla kotów około dwa razy w tygodniu.
    UWAGA: Ze względu na nieprzyjemny zapach mokrej karmy dla kotów, przetestowano również alternatywne źródła pożywienia (patrz sekcja Dyskusja).

2. Pobieranie zarodków

  1. Aby przygotować kolekcję, należy oddzielić z kolonii co najmniej 50 samców i 50 samic. Najlepiej wybrać młode osobniki dorosłe. Umieścić je w klatce mini (17,8 x 10,2 x 12,7 cm3) bez wiórów drzewnych. Dodać karmę dla kotów w łódzce wagowej.
  2. Przed rozpoczęciem zbierania należy dokładnie sprawdzić klatkę pod kątem obecności embrionów i usunąć je. Do klatki włożyć rozciągniętą kulkę waty i pozostawić ją w inkubatorze w temperaturze 30 °C. Po odpowiednim czasie kulka waty będzie gotowa do zbioru embrionów.
  3. Złożyć arkusz czarnego papieru kolorowego (format A4) na pół, aby stworzyć zagięcie, a następnie go rozłożyć.
  4. Wyjąć rozciągniętą kulkę waty z klatki. Usunąć osobniki dorosłe z waty i umieścić je z powrotem w klatce.
  5. Delikatnie ściskając rozciągniętą kulkę waty, powoli rozrywać ją na cienkie włókna bawełniane, aby jaja opadły na czarny papier.
    UWAGA: Embriony D. maculatus są kruche i trudne do dostrzeżenia w watie. Mogą zostać łatwo zmiażdżone, jeśli kulka waty będzie trzymana zbyt mocno.

3. Przygotowanie dsRNA

  1. Przygotowanie matrycy DNA do syntezy dsRNA
    1. Cykl 4 - 6 50 µl Reakcje PCR z wykorzystaniem starterów zawierających sekwencje promotora T7 na obu końcach 5', w celu amplifikacji matrycy DNA zgodnie z protokołem producenta.
    2. Oczyść produkt PCR przy użyciu komercyjnego zestawu do oczyszczania produktów PCR, zgodnie z instrukcjami producenta. Idealne końcowe stężenie matrycy DNA powinno wynosić ≥ 100 ng/µl.
  2. Przygotowanie buforu do iniekcji
    1. Przygotować 100 ml buforu do iniekcji (0,1 mM NaH2PO4, 5 mM KCl). pH należy dostosować do wartości 6,8 za pomocą 5 M NaOH.
    2. Przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C.
  3. Synteza dsRNA
    1. Przygotować reakcję w probówce PCR o pojemności 0,2 ml na lodzie, a następnie przeprowadzić in vitro reakcja transkrypcji z polimerazą T7, zgodnie z instrukcjami producenta, z użyciem ok. 500 ng matrycy na reakcję.
    2. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Przetraw matrycę DNA za pomocą nukleazy DNase, zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Podgrzej probówkę do 94 °C i utrzymać w temperaturze 94 °C przez 3 min.
    5. Aby przeprowadzić hybrydyzację dsRNA, należy powoli schłodzić probówkę poprzez 1 °C/min, aż osiągnie 45 °C po 1 godz.
      UWAGA: Kroki od 3.3.2 do 3.3.5 można przeprowadzić w termocyklerze.
    6. Do osadu dsRNA wytrąconego etanolem dodać 280 µl wody wolnej od RNaz do 20 µl odczynnika, aby uzyskać objętość końcową wynoszącą 300 µlDodaj 30 µl z 3 M NaOAc (pH 5,2) oraz 650 µl etanolu. Umieścić probówkę w -20 °C zamrażarka przez noc.
    7. Po wirowaniu przy 15 682 x g przez 30 min w temperaturze 4 °Cprzemyć osad dsRNA 70% etanolem. Osad wysuszyć i rozpuścić w 20 µl bufor do wstrzykiwania
    8. Zmierz stężenie dsRNA za pomocą spektrofotometru przy A260Idealne stężenie wynosi 3 - 5 µg/µlSprawdzić jakość, przeprowadzając 5 µl roztworu dsRNA w rozcieńczeniu 1:25 na żelu agarozowym 1% przy napięciu 90 V przez 30 min. Wyraźnie widoczny będzie pojedynczy prążek o oczekiwanej wielkości.
    9. Przechowywać dsRNA w temperaturze -20 °C lub w niższej temperaturze.
      UWAGA: W każdym eksperymencie wyciszania RNAi należy uwzględnić kontrolne dsRNA, którego nie oczekuje się, że wpłynie na badany proces. gfp dsRNA stanowi doskonałą kontrolę dla większości eksperymentów. Należy przygotować i wstrzyknąć kontrolne dsRNA równolegle z eksperymentalnym dsRNA.

4. Montaż mikroinjektora i mikromanipulatora

UWAGA: Patrz Rysunek 3.

  1. Podłącz azot lub inne źródło zasilania powietrzem do wlotu ciśnienia pompy pneumatycznej. W przypadku braku pompy pneumatycznej należy przyłożyć ciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml podłączonej do cienkiego przewodu.
  2. Podłącz przełącznik nożny do złącza zdalnego pompy, aby kontrolować przepływ ciśnienia wyrzutu.
  3. Za pomocą rurki przymocuj uchwyt kapilary szklanej do portu ciśnienia wyrzutu pompy.
  4. Zamocuj uchwyt kapilary na mikromanipulatorze w pobliżu mikroskopu stereoskopowego.

5. RNAi w embrionach

UWAGA: Rysunek 4 przedstawia schemat blokowy procesu RNAi w embrionach D. maculatus.

  1. Przygotowanie eRNAi
    1. Przygotować pokrywkę szalki Petriego do zbierania embrionów (średnica 90 mm). Wyłożyć wnętrze pokrywki kawałkiem czarnego papieru filtracyjnego. Na czarnym papierze położyć standardowe szkiełko przedmiotowe.
    2. Rozcieńczyć dsRNA do odpowiedniego stężenia w buforze do iniekcji. W pierwszych eksperymentach stosować stężenie 2 - 3 µg/µl. Przed iniekcją dsRNA należy zawsze przechowywać w lodzie.
    3. Dodać barwnik spożywczy w rozcieńczeniu 1:40 do dsRNA i delikatnie pipetować kilka razy w celu dokładnego wymieszania.
  2. Zbieranie embrionów do iniekcji
    UWAGA: W temperaturze 25 °C jądra w embrionach 6 - 8 h po zniesieniu jaj (AEL) migrują w stronę peryferii jaja53. Blastoderma komórkowa powstaje w ciągu 8 - 10 h AEL53. Aby mieć pewność, że do iniekcji użyto embrionów przed etapem blastodermy komórkowej, zaleca się stosowanie embrionów 0 - 3 h AEL53. Zbieranie, przygotowanie i iniekcja embrionów zajmują zazwyczaj mniej niż 2 h, jeśli kapilary szklane są w dobrym stanie. Zatem cały proces można ukończyć w ciągu 5 h AEL.
    1. Zebrać embriony zgodnie z opisem w krokach 2.2-2.5.
    2. Ostrożnie opukać czarny papier konstrukcyjny, aby przenieść embriony do pokrywki szalki Petriego.
    3. Przykleić taśmę dwustronną wzdłuż krawędzi szkiełka.
    4. Za pomocą pędzla ułożyć embriony na taśmie prostopadle do krawędzi szkiełka, tak aby koniec przedni lub tylny znajdował się przy krawędzi. Należy pamiętać, że końce przednie i tylne wczesnych embrionów nie są łatwo rozróżnialne, zatem średnio połowa zostanie wstrzyknięta na końcu tylnym, co jest rozwiązaniem idealnym.
  3. Napełnianie kapilary szklanej dsRNA
    1. Pobrać 2 - 4 µl dsRNA do końcówki mikrodozownika o pojemności 20 µl.
    2. Włożyć końcówkę do wcześniej wyciągniętej kapilary szklanej (zwanej igłą) i delikatnie wpipetować roztwór dsRNA do kapilary. Igły przygotować z komercyjnych kapilar szklanych za pomocą wyciągarki do mikropipet. Przykład idealnie wyciągniętej igły przedstawiono na Rysunku 5. Długość i zwężenie igieł mogą wymagać optymalizacji po próbach iniekcji.
    3. Zamocować kapilarę szklaną w uchwycie do kapilar szklanych.
    4. Zamontować uchwyt kapilary w mikromanipulatorze.
  4. Iniekcja dsRNA do embrionów
    1. Ostrożnie przenieść szkiełko z embrionami na stolik mikroskopu stereoskopowego.
    2. Przesunąć szkiełko tak, aby jeden embrion znalazł się w centrum pola widzenia, i ustawić ostrość mikroskopu.
    3. Używając mikromanipulatora, ustawić końcówkę kapilary, patrząc przez mikroskop stereoskopowy. Przystawić końcówkę blisko końca pierwszego embrionu w rzędzie.
    4. Włączyć dopływ azotu lub innego powietrza.
    5. Ustawić przełącznik wyboru wejścia elektrozaworu na próżnię (vacuum).
    6. Ustawić regulator ciśnienia wyrzutu na 10 - 15 psi. Dostosować ciśnienie w zależności od aparatury.
    7. W razie potrzeby udrożnić kapilarę. Po otwarciu końcówki, kolorowy roztwór dsRNA wypełni wierzchołek.
    8. Przesunąć końcówkę kapilary do przodu, aby przebić embrion. Jeśli ustawienie ciśnienia jest optymalne, płyn embrionalny nie będzie wpływał do kapilary.
    9. Nacisnąć przełącznik nożny, aby wstrzyknąć roztwór dsRNA do embrionu, aż zostanie podana odpowiednia ilość roztworu. Rysunek 5 przedstawia przykłady morfologii embrionów po wstrzyknięciu odpowiedniej i nieodpowiedniej ilości roztworu.
    10. Pozostawić końcówkę kapilary wewnątrz embrionu przez ok. 2 s, a następnie ją wyciągnąć.
    11. Przesunąć kapilarę do następnego embrionu i powtarzać kroki 5.4.8 - 5.4.10, aż wszystkie embriony zostaną wstrzyknięte. Wymienić kapilarę szklaną, jeśli zostanie zapchana lub pęknie.
  5. Regeneracja i inkubacja po iniekcji
    1. Po iniekcji umieścić szkiełko w szalce Petriego.
    2. Dodać do szalki Petriego zwilżoną kulkę waty. Nie dopuścić, aby wata dotykała szkiełka.
    3. Przykryć szalkę Petriego i owinąć ją folią uszczelniającą. Opisać szalkę, podając nazwę dsRNA, stężenie, datę, godzinę oraz liczbę wstrzykniętych embrionów.
    4. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 30 °C do momentu wyklucia się embrionów.

6. Rodzicielskie RNAi

  1. Izolowanie poczwarek do pRNAi
    1. Zebrać poczwarki z kolonii.
    2. Posortować poczwarki samców i samic pod mikroskopem (patrz Rycina 6). Przechowywać je w dwóch oddzielnych szalkach Petriego w inkubatorze w temperaturze 30 °C, aby zapobiec kopulacji przed iniekcją.
    3. Codziennie sprawdzać, czy pojawiły się imago. Przeobrażenie poczwarek w osobniki dorosłe trwa zazwyczaj 5 - 7 dni w temperaturze 30 °C.
    4. Przenieść wyklute samce i samice (patrz Rycina 6) do dwóch oddzielnych szalek Petriego i karmić je karmą dla kotów co drugi dzień, aż będą gotowe do iniekcji.
    5. Przystąpić do iniekcji, gdy liczba samic i samców w odpowiednim wieku będzie wystarczająca. Najlepsze są samice od 4 do 8 dni po wykluciu. Do typowej analizy wykorzystuje się 8 - 12 samic. Do kopulacji potrzebna jest równa liczba samców54.
  2. Iniekcja dsRNA do odwłoka samicy
    1. Przygotować dsRNA w lodzie (5.1.2 i 5.1.3).
    2. Przymocować igłę o rozmiarze 32G do strzykawki 10 µl.
    3. Znieczulić samice na platformie z CO2.
    4. Nabrać roztwór dsRNA do strzykawki, unikając pęcherzyków powietrza.
    5. Trzymać samicę jedną ręką stroną brzuszną do góry, a w drugiej ręce trzymać strzykawkę.
    6. Delikatnie przebić segmacorię (błonę) między sternitami 2 i 3 końcówką igły. Rycina 7 przedstawia samicę podczas iniekcji. Jeśli igła nie przenika łatwo przez tkankę, skierować ją pod kątem do góry i powoli nacisnąć. Wprowadzić igłę na głębokość około 2 mm do wnętrza ciała.
    7. Kontrolować skalę strzykawki podczas powolnego przesuwania tłoka, wstrzykując ~ 2 µl na samicę.
    8. Po wstrzyknięciu utrzymać igłę w bezruchu przez co najmniej 5 s przed wyjęciem jej z odwłoka samicy.
    9. Przenieść iniekowane samice do szalki Petriego (średnica 90 mm) i karmić karmą dla kotów.
    10. Oznaczyć szalkę Petriego nazwą dsRNA, ilością wstrzykniętej substancji, datą oraz liczbą samic.
  3. Rekonwalescencja po iniekcji i kopulacja
    1. Inkubować szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 30 °C.
    2. Po 24 h przenieść iniekowane samice do miniklatki.
    3. Do klatki dodać równą liczbę nieiniekowanych młodych samców i oznaczyć klatkę.
    4. Do klatki włożyć łódkę ważką z karmą dla kotów.
    5. Pozostawić klatkę w inkubatorze w temperaturze 30 °C, aby umożliwić kopulację. Po 24 h samice powinny zacząć składać jaja; embriony można zbierać codziennie lub w wymaganych odstępach czasu.

7. Analiza fenotypowa po RNAi

UWAGA: W temperaturze 30 °C wylęganie jaj trwa ok. 55 hr50.

  1. Analiza żywotności w eRNAi
    1. Oblicz wskaźnik wykluwania, porównując liczbę wyklutych larw do całkowitej liczby wstrzykniętych embrionów. Należy pamiętać o włączeniu kontroli negatywnej w postaci wstrzyknięcia, ponieważ procedura wstrzykiwania może uszkodzić lub zabić embriony. Typowe wskaźniki wykluwania wahają się od 30% do 60%. Należy uważać, aby wyklute larwy nie zjadały niewyklutych jaj.
  2. Analiza żywotności w pRNAi
    UWAGA: Jeśli żywotność samic jest zaburzona przez gen będący celem RNAi, samice wstrzyknięte specyficznym dsRNA, ale nie kontrolnym dsRNA, zaczną ginąć. Jeśli zaburzona jest produkcja lub składanie jaj, u samic wystąpi częściowa lub całkowita sterylność. Oceń przeżywalność samic w porównaniu z kontrolami negatywnymi lub porównaj całkowitą liczbę jaj złożonych przez samice eksperymentalne i kontrolne (7.2.3).
    1. Przygotuj zbieranie embrionów zgodnie z krokiem 2.2.
    2. Po 24 h zbierz embriony zgodnie z krokami 2.4 – 2.5.
    3. Oblicz całkowitą liczbę embrionów.
    4. Przenieś embriony do szalki Petriego o średnicy 90 mm. Opisz szalkę, podając celowany gen, datę zbioru oraz liczbę embrionów.
    5. Inkubuj embriony w inkubatorze w temperaturze 30 °C aż do wyklucia. Ponieważ wyklute larwy żywią się niewyklutymi embrionami, często sprawdzaj szalkę Petriego i oddzielaj wyklute larwy od niewyklutych embrionów za pomocą pincety (patrz Dyskusja).
    6. Oblicz liczbę wyklutych embrionów i wyznacz wskaźnik wykluwania.
  3. Badanie defektów kutykuli u wyklutych larw
    1. Zbierz wyklute larwy do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    2. W dygestorium dodaj 1 ml roztworu do fiksacji.
    3. Pozostaw probówkę do mikrowirówki w temperaturze 4 °C co najmniej przez noc, aby roztwór spenetrował tkankę larwalną.
    4. W celu wizualizacji usuń z probówki jak najwięcej utrwalacza.
    5. Przepłucz larwy co najmniej trzy razy roztworem PBST.
    6. Przenieś larwy do wieloodworowej płytki szklanej z roztworem PBST, używając końcówki pipety P-1000 z odciętym końcem w celu jej poszerzenia.
    7. Pod mikroskopem stereoskopowym rozciągnij larwy za pomocą pincety, aby zbadać defekty. Krytyczne jest rozciągnięcie larw podczas badania defektów, ponieważ ich ciała kurczą się w utrwalaczu.
  4. Badanie defektów kutykuli u niewyklutych larw
    Uwaga: Ta procedura jest przydatna do badania wczesnych fenotypów embrionalnych, szczególnie w przypadku embrionów, które nie dożywają wyklucia.
    1. W przypadku pRNAi dodaj PBST do szalki Petriego (7.2.4) i przenieś niewyklute embriony do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, używając końcówki pipety P-1000 z odciętym końcem. W przypadku eRNAi dodaj PBST do szalki Petriego (5.5.4), zmieć niewyklute embriony z szkiełka mikroskopowego i przenieś je do probówki do mikrowirówki.
    2. Utrwal embriony roztworem do fiksacji i przepłucz je PBST w celu wizualizacji zgodnie z krokami 7.3.2 – 7.3.6.
    3. Za pomocą pincety wyseparuj embriony z osłonki jajowej pod mikroskopem stereoskopowym w roztworze PBST.
    4. Przenieś embriony z powrotem do probówki do mikrowirówki 1,5 ml (~ 200 µl embrionów w każdej probówce).
    5. Usuń jak najwięcej roztworu.
    6. Dodaj 1 ml 90% kwasu mlekowego/10% EtOH. Pozostaw probówkę do wirowania w inkubatorze w temperaturze 60 °C co najmniej przez noc.
      UWAGA: Embriony mogą pozostawać w 60 °C przez kilka dni.
    7. Aby zamontować embriony, nanieś je pipetą na szkiełko mikroskopowe, używając końcówki pipety P-1000 z odciętym końcem.
    8. Ręcznie ustaw embriony pincetą w optymalnej orientacji.
    9. Przykryj embriony szkiełkiem nakrywką i obserwuj pod mikroskopem z użyciem DIC.
  5. Badanie defektów komórkowych i molekularnych
    UWAGA: Ta procedura jest przydatna do badania przyczyn fenotypów kutykuli lub letalności, której nie towarzyszą defekty kutykuli.
    1. W przypadku pRNAi oddziel embriony od kulek waty na odpowiednim etapie rozwoju i przenieś je do koszyka do zbierania embrionów. Koszyk do zbierania może być taki sam lub podobny do tego, który stosuje się do zbiorów embrionów Drosophila.
      1. Wykonaj koszyk na jaja z plastikowej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 25 ml z usuniętym dnem i wyciętym w pokrywce otworem (o średnicy około 1 cm). Umieść w pokrywce okrąg z bardzo gęstej siatki o średnicy około 2,5 cm, a następnie przykręć fiolkę scyntylacyjną i używaj jej odwróconą do góry dnem.
      2. Ponieważ siatkę można łatwo usunąć po wypłukaniu embrionów, zanurz siatkę w probówce do mikrowirówki z wodą, aby odzyskać wszelkie embriony przylegające do siatki.
    2. W przypadku eRNAi na odpowiednim etapie dodaj PBST do szalki Petriego. Zmieć embriony z szkiełka mikroskopowego i przenieś je do koszyka do zbierania embrionów.
      UWAGA: Protokoły fiksacji, hybrydyzacji in situ, barwienia przeciwciałami i barwienia jąder można znaleźć w pracy Xiang et al. 201553.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Laboratorium autorów wykorzystywało technologię RNAi do badania ewolucji funkcjonalnej genów regulujących segmentację u owadów53,55. Choć wszystkie owady są segmentowane, geny regulujące ten proces uległy prawdopodobnie dywergencji podczas radiacji owadów26,38,56-63. Przesiewy genetyczne u Drosophila pozwoliły zidentyfikować zestaw dziewięciu genów segmentacji typu pair-rule, które odpowiadają za promowanie powstawania segmentów ciała64-70. W nini...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gdy niewielka liczba wyrafinowanych systemów modelowych (myszy, muchy, robaki) została opracowana wXX wieku, w XXIwieku pojawiła się fala nowych systemów zwierzęcych opracowywanych w laboratoriach na całym świecie. Te nowe systemy pozwalają naukowcom na rozwiązywanie porównawczych, ewolucyjnych pytań, których nie można zbadać wyłącznie za pomocą "standardowych" systemów modelowych. To wdrożenie nowych modeli wymaga szybkiego rozwoju metod hodowli laboratoryjnej, identyfikacji genów i podejść...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Alison Heffer i Yong Lu za ustawienie aparatu do mikroiniekcji i podzielenie się swoją bezcenną wiedzą i doświadczeniem z RNAi owadów. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01GM113230 do L.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dermestes maculatus żywe chrząszczeNasze laboratorium lub Carolina Biological Supply#144168Nasz szczep laboratoryjny został zweryfikowany za pomocą kodu kreskowego COI; nie można wykluczyć odmiany szczepu z Karoliny
Mokrą karmę dla kotówFancy FeastKawałki mięsa z sosem. Można kupić w większości sklepów z karmą dla zwierząt i sklepach spożywczych
Sucha karma dla psówPurina Puppy ChowMożna kupić w większości sklepów z karmą dla zwierząt i sklepach spożywczych
Klatka na owady (rozmiar średni, 30,5 x 19 x 20,3 cm)Exo TerraPT2260Do utrzymania kolonii. W razie potrzeby można użyć większej klatki
Klatka na owady (rozmiar mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)Exo TerraPT2250Do pobierania zarodków
szalka PetriegoVWR89038-968
WacikFisher22-456-883
Zestaw do transkrypcji Megascript T7FisherAM1334Na 40 reakcji
Pompa pneumatycznaWPIPV830
Uchwyt kapilarnyWPI
MikromanipulatorNARISHIGEMN-151
Bibuła filtracyjna (90  mm)VWR28342-010
Barwnik spożywczy (zielony)McCormick
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoHilgenberg1406119
Ściągacz igieł (ściągacz do mikropipet)Sutter Instrument Co.P-97
Szkiełko mikroskopoweWorldWide Life Sciences Division41351157
Folia uszczelniająca (Parafilm M)Fisher13-374-12
Model 801 Strzykawka (10  &mikro; l)Igła Hamilton7642-01
(rozmiar 32) Hamilton7762-05
Roztwór utrwalający (Pampel's)BioQuip Products, Inc.1184CToksyczny, należy obchodzić się z nim pod wyciągiem
Kleszcz (DUMONT #5)Fine Science Tools11252-30
Szkiełko nakrywkowe (24 x 50 mm, nr 1.5)Globe Scientific1415-15
Eppendorf Femtotips Końcówka do pipet do mikroładowarekFisherE5242956003
Mikroskopia preparcyjna do wstrzykiwań zarodkówLeicaM420
Mikroskopia preparcyjna do wizualizacji fenotypowej larwZeissSteREO Discover. Mikroskopia V12
DICZeissAXIO Imager. M1

Bibliografia

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208(2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822(2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674(2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440(2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602(2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32(2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490(2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5(2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interferencja RNAembrionalne RNAirodzicielskie RNAihodowla chrząszczywstrzykiwanie dsRNAwstrzykiwanie do embrionówanaliza fenotypowaprzygotowanie kutykuli
Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.