Artykuł metodologiczny

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

DOI:

10.3791/54976

⸱

28 grudnia 2016

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w genomice zwiększyły możliwość badania różnorodności biologicznej na niespotykaną dotąd skalę. Jednak sama sekwencja nie będzie pouczająca bez narzędzi do badania funkcji genów. Opracowanie i wymiana szczegółowych protokołów tworzenia nowych systemów modelowych w laboratoriach oraz narzędzi do przeprowadzania badań funkcjonalnych ma zatem kluczowe znaczenie dla wykorzystania potencjału genomiki. Coleoptera (chrząszcze) są największym kladem owadów i zajmują praktycznie wszystkie typy siedlisk na planecie. Oprócz zapewnienia idealnych modeli do badań podstawowych, badania nad chrząszczami mogą mieć wpływ na zwalczanie szkodników, ponieważ często są one szkodnikami w gospodarstwach domowych, rolnictwie i przemyśle spożywczym. Przedstawiono szczegółowe protokoły hodowli i utrzymania kolonii laboratoryjnych D. maculatus oraz przeprowadzania interferencji za pośrednictwem dsRNA u D. maculatus. Opisano zarówno procedury embrionalne, jak i rodzicielskie RNAi - w tym ustawienie aparatury, przygotowanie, wstrzyknięcie i rekonwalescencję po wstrzyknięciu. Przedstawiono również metody analizy fenotypów embrionalnych, w tym żywotności, wad wzoru u wyklutych larw oraz preparatów kutykulowych dla niewyklutych larw. Testy te, wraz z hybrydyzacją in situ i barwieniem immunologicznym dla markerów molekularnych, sprawiają, że D. maculatus jest dostępnym systemem modelowym do badań podstawowych i stosowanych. Dostarczają one również przydatnych informacji do ustanawiania procedur w innych powstających systemach modelowania owadów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W 1998 roku Fire i Mello poinformowali, że dwuniciowe RNA (dsRNA) może indukować zahamowanie funkcji genów u Caenorhabditis elegans1. Ta reakcja wywołana przez dsRNA została nazwana interferencją RNA (RNAi), a takie wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi stwierdzono, że jest zachowane u zwierząt, roślin i grzybów2-7. U roślin i niektórych zwierząt RNAi działa ogólnoustrojowo, co oznacza, że efekt może rozprzestrzeniać się na inne komórki/tkanki, w których dsRNA nie jest bezpośrednio wprowadzany (przegląd w8-10). Naukowcy wykorzystali tę endogenną komórkową odpowiedź RNAi, projektując dsRNA tak, aby celowały w interesujące geny, zmniejszając w ten sposób funkcję genów bez bezpośredniego manipulowania genomem (przegląd w11-14).

RNAi jest potężnym narzędziem do badań funkcjonalnych ze względu na następujące zalety. Po pierwsze, nawet przy minimalnej ilości informacji o sekwencji genu, gen może być celowany za pomocą RNAi. Jest to szczególnie ważne w przypadku badań organizmów niemodelowych, którym brakuje danych genomicznych lub transkryptomicznych. Po drugie, w organizmach, w których odpowiedź RNAi jest silnie ogólnoustrojowa, knockdown genu za pośrednictwem RNAi może być przeprowadzony na prawie każdym etapie rozwoju. Ta funkcja jest bardzo przydatna do badania funkcji genów plejotropowych. Po trzecie, w niektórych przypadkach efekty RNAi rozprzestrzeniają się na gonady i potomstwo, tak że fenotypy obserwuje się u potomstwa15,16. Zjawisko to, znane jako rodzicielskie RNAi (pRNAi), jest szczególnie korzystne dla genów wpływających na rozwój embrionalny, ponieważ liczne potomstwo wyprodukowane przez jednego rodzica, któremu wstrzyknięto implant, może być badane bez bezpośredniej manipulacji komórkami jajowymi. Z tych powodów pRNAi jest metodą z wyboru. Jeśli jednak pRNAi jest nieskuteczne, na przykład dla genów niezbędnych do oogenezy, należy użyć embrionalnego RNAi (eRNAi). Po czwarte, RNAi można wykorzystać do wygenerowania odpowiednika szeregu allelicznego, w którym ilość dostarczanego dsRNA może być zmieniana w pewnym zakresie, aby wytworzyć słabe lub silne defekty. Taka gradacja fenotypów może być pomocna w zrozumieniu funkcji genu, gdy gen jest zaangażowany w złożony proces i/lub całkowita utrata funkcji jest śmiertelna. Po piąte, dostarczanie dsRNA jest ogólnie łatwe i wykonalne, szczególnie u zwierząt wykazujących silne odpowiedzi ogólnoustrojowe RNAi. dsRNA można wprowadzić przez mikroiniekcję1,5, karmienie/spożycie17,18, moczenie,19,20 i dostarczanie za pośrednictwem wirusów/bakterii21,22. Po szóste, w przeciwieństwie do niektórych metod celowania/edycji genów, nie ma potrzeby przeprowadzania badań przesiewowych w poszukiwaniu organizmów będących nosicielami mutacji ani przeprowadzania krzyżówek genetycznych w celu wygenerowania homozygot przy użyciu RNAi. Dlatego też, w porównaniu z wieloma innymi technikami badania funkcji genów, RNAi jest szybkie, niedrogie i może być stosowane do badań przesiewowych na dużą skalę23-25.

Szeroka użyteczność RNAi zapewnia środki do przeprowadzania badań funkcjonalnych w szerokim zakresie organizmów, rozszerzając zakres gatunków dostępnych do badań poza tradycyjne systemy modelowe, dla których opracowano narzędzia genetyczne. Na przykład badania z wykorzystaniem systemów niemodelowych są konieczne, aby uzyskać wgląd w ewolucję genów i sieci genów poprzez porównanie funkcji ortologów gatunków reprezentujących różne tryby rozwoju lub wykazujących odrębne cechy morfologiczne26-29. Tego typu badania pozwolą lepiej zrozumieć różnorodność biologiczną, co będzie miało wpływ zarówno na badania stosowane, jak i podstawowe.

Będąc największą grupą zwierząt na świecie, owady stanowią doskonałą okazję do zbadania mechanizmów leżących u podstaw różnorodności. Ponadto owady są na ogół małe, mają krótkie cykle życia, wysoką płodność i są łatwe do hodowli w laboratorium. W ciągu ostatnich dwóch dekad RNAi został z powodzeniem zastosowany u owadów z różnych rzędów, w tym Diptera (muchówki)5, Lepidoptera (motyle i)30, Coleoptera (chrząszcze)16,31, Hymenoptera (błonkoskrzydłe, osy, mrówki i pszczoły)32, Hemiptera (prawdziwe robaki), Isoptera (termity)34, Blattodea (karaluchy)35, Orthoptera (świerszcze, koniki polne, szarańcza i katydidy)36i Phthiraptera ()37. Udane zastosowanie RNAi dostarczyło danych funkcjonalnych do badań nad wzorcami we wczesnej embriogenezie (oś przednio-tylna32, oś grzbietowo-brzuszna28, segmentacja26,38), determinacja płci39,40, biosynteza chityny/kutykuli41, sygnalizacja ekdyzonu42, zachowania społeczne43i nie tylko. Metody RNAi opracowane dla różnych gatunków owadów mogą przynieść dodatkowe korzyści, ponieważ mogą być przydatne do zwalczania szkodników (przegląd w44-46). Efekty RNAi będą specyficzne dla genów, jak również dla gatunków, o ile do celów docelowych zostaną wybrane regiony niekonserwatywne. W przypadku pożytecznych gatunków owadów, takich jak pszczoły miodne i jedwabniki, celowanie w geny niezbędne do przetrwania wirusów lub pasożytów w celu kontrolowania infekcji może zapewnić nową strategię ochrony tych gatunków47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), potoczna nazwa chrząszcza skórnego, występuje na całym świecie z wyjątkiem Antarktydy. Jako owad holometaboliczny, cykl życiowy D. maculatus obejmuje stadia embrionalne, larwalne, poczwarkowe i dorosłe (ryc. 1). Ponieważ żywi się mięsem, D. maculatus jest używany w muzeach do szkieletowania martwych zwierząt, a entomolodzy sądowi mogą go używać do oszacowania czasu śmierci49,50. D. maculatus żywi się produktami pochodzenia zwierzęcego, w tym tuszami, suszonym mięsem, serem i poczwarkami/kokonami innych owadów, powodując w ten sposób szkody w gospodarstwach domowych, przechowywanej żywności oraz przemyśle jedwabniczym, serniczym i mięsnym 51,52. Zastosowanie RNAi w tym chrząszczu może zapewnić skuteczny i przyjazny dla środowiska sposób na zminimalizowanie jego wpływu na gospodarkę. Nasze laboratorium wykorzystało D. maculatus jako nowego owada modelowego do badania segmentacji53. Oprócz tego, że nadaje się do hodowli laboratoryjnej, D. maculatus jest interesujący dla badań podstawowych, ponieważ jest pośrednim twórcą zarazków, co czyni go gatunkiem przydatnym do badania przejścia między rozwojem krótkich i długich zarazków.

figure-introduction-1
Rycina 1: Cykl życiowy D. maculatus. Fotografie D. maculatus na różnych etapach życia, jak wskazano. Cykl życiowy od jaja do dorosłego osobnika trwa trzy tygodnie w temperaturze 30 °C, ale dłużej w niższych temperaturach. (A, F) Świeżo złożone zarodki są białe do jasnożółtych i owalne, o długości około 1,5 mm. Embriogeneza trwa ~55 godzin w temperaturze 30 °C. (B, C i G) Larwy mają ciemne pigmentowane paski i są pokryte szczeciną. Larwy przechodzą przez kilka stadiów w zależności od środowiska, a ich długość może sięgać nawet ponad 1 cm. (D, H) Młode poczwarki są jasnożółte. Przepoczwarzenie trwa ~ 5 - 7 dni w temperaturze 30 °C. (E, I) Wkrótce po zamknięciu na ciele dorosłego chrząszcza pojawia się ciemna pigmentacja. Dorosłe osobniki mogą żyć nawet kilka miesięcy, a jedna samica może złożyć setki zarodków w ciągu swojego życia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Poprzednio wykazaliśmy, że RNAi jest skuteczne w obniżaniu funkcji genu u D. maculatus53. Tutaj dzielimy się naszym doświadczeniem w hodowli kolonii D. maculatus w laboratorium wraz z protokołami krok po kroku dotyczącymi konfiguracji zarówno embrionalnego, jak i rodzicielskiego RNAi, iniekcji, opieki po wstrzyknięciu i analizy fenotypowej. Przedstawione tutaj metody knockdownu i analizy genów za pośrednictwem dsRNA nie tylko dostarczają szczegółowych informacji potrzebnych do odpowiedzi na pytania dotyczące D. maculatus, ale mają również potencjalne znaczenie dla zastosowania RNAi u innych niemodelowych gatunków chrząszczy/owadów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla D. maculatus

UWAGA: Kolonia hodowlana D. maculatus została założona w laboratorium autorów przy użyciu dorosłych osobników i larw zakupionych komercyjnie. Tożsamość gatunku zweryfikowano za pomocą kodu kreskowego DNA53.

  1. Aby ustawić nową klatkę w laboratorium, rozłóż cienką warstwę wiórów drzewnych w średniej wielkości klatce na owady (30,5 x 19 x 20,3 cm3). Umieść w klatce kawałek styropianu o wymiarach ~ 10 x 6 x 3 cm3 cm, aby larwy mogły się ukryć w celu przepoczwarzenia. Dodaj 20 - 50 chrząszczy (dorosłych lub larw w późnym stadium rozwojowym). Chrząszcze chowają się w wiórach drzewnych.
  2. Dodaj mokrą karmę dla kotów na szalkę Petriego lub łódkę do ważenia. Przykryj klatkę siatkową szmatką i umieść klatkę w inkubatorze.
  3. Aby utrzymać kolonię lęgową w laboratorium, ustaw temperaturę między 25 a 30 °C. D. maculatus rośnie szybciej w wyższych temperaturach, ale sprzyja to również rozwojowi grzybów i roztoczy. Aby utrzymać zdrową kolonię, należy stosować 25 - 28 °C do regularnej pielęgnacji stada i 30 °C do szybkiego powiększania kolonii. Cykl życia trwa około trzech tygodni do czterech miesięcy, w zależności od czynników środowiskowych50 (ryc. 2).

figure-protocol-1
Ryc. 2: Kolonia laboratoryjna D. maculatus.Pokazano fotografię typowej klatki dla owadów D. maculatus. Wióry drzewne są rozrzucane, aby chrząszcze mogły się ukryć. Karmę dla kotów dodaje się na małej szalce Petriego lub łódce do ważenia. Styropian umieszcza się w klatce jako schronienie dla ostatnich larw w stadium rozwojowym do przepoczwarzenia. Pokazana tutaj klatka ma wymiary 30,5 x 19 x 20,3cm3 i mieści kilkaset larw, poczwarek i dorosłych osobników. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Pozostaw jaja w klatce, aby dojrzały. Aby powiększyć kolonię, należy założyć nowe klatki z jajami (zebranymi zgodnie z opisem w sekcji 2), larwami lub dorosłymi osobnikami, jak powyżej. D. maculatus składa jaja w całej klatce, zwłaszcza w pobliżu źródła pożywienia.
  2. Wymieniaj mokrą karmę dla kotów około dwa razy w tygodniu.
    UWAGA: Ze względu na nieprzyjemny zapach mokrej karmy dla kotów, przetestowano również alternatywne źródła pożywienia (patrz Dyskusja).

2. Pobieranie zarodków

  1. Aby założyć kolekcję, oddziel od kolonii co najmniej 50 samców i 50 samic. Najlepsi są młodzi dorośli. Umieść dorosłe osoby w mini klatce (17,8 x 10,2 x 12,7 cm3) bez wiórów drzewnych. Dodaj karmę dla kotów do łódki do ważenia.
  2. Przed rozpoczęciem pobierania należy dokładnie sprawdzić, czy w klatce nie ma zarodków i usunąć je. Włożyć rozciągnięty wacik do klatki i pozostawić klatkę w inkubatorze o temperaturze 30 °C. Po upływie odpowiedniego okna czasowego wacik będzie gotowy do pobrania zarodka.
  3. Złóż kawałek czarnego papieru budowlanego (rozmiar A4) na pół, aby utworzyć zagięcie, a następnie rozłóż.
  4. Wyjmij rozciągnięty wacik z klatki. Wyjmij dorosłe osobniki z wacika i włóż je z powrotem do klatki.
  5. Bardzo delikatnie ściskając rozciągnięty wacik, powoli rozdzieraj go na cienkie bawełniane włókna, aby jajka spadły na papier.
    UWAGA: Zarodki D. maculatus są delikatne i trudne do zauważenia w bawełnie. Można je łatwo zmiażdżyć, jeśli zbyt mocno trzyma wacik.

3. Przygotowanie dsRNA

  1. Przygotowanie matrycy DNA do syntezy dsRNA
    1. Przeprowadź 4 - 6 reakcji PCR po 50 μl przy użyciu starterów zawierających sekwencje promotora T7 na obu końcach 5' w celu amplifikacji matrycy DNA zgodnie z protokołem producenta.
    2. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Idealne stężenie końcowe matrycy DNA wynosi ≥ 100 ng/μl.
  2. Przygotowanie buforu do wstrzykiwań
    1. Przygotować 100 ml buforu do wstrzykiwań (0,1 mM NaH2PO4, 5 mM KCl). Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 5 M NaOH.
    2. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  3. Synteza dsRNA
    1. Ustawić reakcję w probówce PCR o pojemności 0,2 ml na lodzie i przeprowadzić reakcję transkrypcji in vitro z polimerazą T7, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, używając matrycy ~ 500 ng na reakcję.
    2. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Strawić matrycę DNA za pomocą DNazy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Podgrzej probówkę do temperatury 94 °C i przytrzymaj w temperaturze 94 °C przez 3 minuty.
    5. Aby wyżarzać dsRNA, powoli schładzaj probówkę o 1 °C/min, aż osiągnie 45 °C po 1 godz.
      UWAGA: Kroki od 3.3.2 do 3.3.5 można wykonać w termocyklerze.
    6. Do osadu etanolowego dsRNA dodać 280 μl wody wolnej od RNaz do 20 μl reakcji, aby dostosować do końcowej objętości 300 μl. Dodać 30 μl 3 M NaOAc (pH 5,2) i 650 μl etanolu. Umieść probówkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C na noc.
    7. Po odwirowaniu w stężeniu 15,682 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, przepłukać osad dsRNA 70% etanolem. Wysuszyć osad i rozpuścić w 20 μl buforu iniekcyjnego.
    8. Zmierzyć stężenie dsRNA za pomocą spektrofotometru przy A260. Idealne stężenie to 3 - 5 μg/μl. Sprawdź jakość, uruchamiając 5 μl dsRNA w rozcieńczeniu 1:25 na 1% żelu agarozowym pod napięciem 90 V przez 30 minut. Pojedynczy pasek o oczekiwanym rozmiarze będzie dobrze widoczny.
    9. Przechowuj dsRNA w temperaturze -20 °C lub niższej.
      UWAGA: Do każdego eksperymentu z knockdownem RNAi należy dołączyć kontrolny dsRNA, który nie powinien mieć wpływu na badany proces. gfp dsRNA jest doskonałą kontrolą dla większości eksperymentów. Przygotuj i wstrzyknij kontrolny dsRNA obok eksperymentalnego dsRNA.

4. Montaż mikrowtryskiwacza i mikromanipulatora

UWAGA: Zobacz Rysunek 3.

  1. Podłączyć dopływ azotu lub innego powietrza do wejścia ciśnienia pompy pneumatycznej. Jeśli pompa pneumatyczna nie jest dostępna, należy zastosować ciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml podłączonej do drobnej rurki.
  2. Podłącz przełącznik nożny do złącza zdalnego sterowania pompy, aby kontrolować przepływ ciśnienia wyrzutu.
  3. Przymocuj szklany uchwyt kapilarny do portu ciśnienia wyrzutu pompy z rurką.
  4. Zamocuj uchwyt kapilarny na mikromanipulatorze w pobliżu mikroskopu preparacyjnego.

5. Embrionalne RNAi

UWAGA: Rysunek 4 pokazuje schemat blokowy embrionalnego RNAi D. maculatus.

  1. Przygotowanie eRNAi
    1. Przygotować pokrywkę do pobierania zarodków na szalkę Petriego (średnica 90 mm). Umieść kawałek czarnej bibuły filtracyjnej, aby przykryć wnętrze pokrywy. Umieść standardowe szkiełko mikroskopowe na czarnym papierze.
    2. Rozcieńczyć dsRNA do odpowiedniego stężenia za pomocą buforu do wstrzykiwań. Użyj 2 - 3 μg/μl do wstępnych eksperymentów. Przed wstrzyknięciem należy zawsze przechowywać dsRNA na lodzie.
    3. Dodaj barwnik spożywczy w rozcieńczeniu 1:40 do dsRNA i delikatnie odpipetuj kilka razy, aby dobrze wymieszać.
  2. Pobieranie zarodków do iniekcji
    UWAGA: W temperaturze 25 °C jądra w zarodkach 6 - 8 godzin po złożeniu jaj (AEL) migrują w kierunku obrzeża jaja53. Blastoderma komórkowa powstaje w ciągu 8 - 10 godzin AEL53. Aby upewnić się, że zarodki przed etapem blastodermy komórkowej są używane do wstrzykiwań, zaleca się stosowanie zarodków AEL w ciągu 0 - 3 godzin53. Pobranie, przygotowanie i wstrzyknięcie zarodka trwa zwykle mniej niż 2 godziny, jeśli szklane naczynia włosowate są w dobrym stanie. Dzięki temu cały proces można zakończyć w ciągu 5 godzin AEL.
    1. Pobrać zarodki zgodnie z opisem w krokach 2.2-2.5.
    2. Postukaj w papier budowlany, aby przenieść zarodki do pokrywy szalki Petriego.
    3. Przyklej taśmę dwustronną wzdłuż krawędzi zjeżdżalni.
    4. Za pomocą pędzla wyrównaj zarodki na taśmie prostopadle do krawędzi szkiełka z przednim lub tylnym końcem na krawędzi. Należy pamiętać, że przedni i tylny koniec wczesnych zarodków nie jest łatwy do odróżnienia, dlatego średnio połowa zostanie wstrzyknięta na tylnym końcu, co jest idealne.
  3. Ładowanie dsRNA do szklanej kapilary
    1. Pobrać 2 - 4 μl dsRNA do końcówki do pipety do mikroładowarki o pojemności 20 μl.
    2. Włóż końcówkę do wstępnie naciągniętej szklanej kapilary (zwanej igłą) i delikatnie pipetuj roztwór dsRNA do kapilary. Przygotuj igły z dostępnych w handlu szklanych naczyń włosowatych za pomocą ściągacza do mikropipet. Przykład idealnej igły ciągnionej pokazano na rysunku 5. Długość i stożek igieł mogą wymagać optymalizacji po próbach iniekcji.
    3. Zamocuj szklaną kapilę w szklanym uchwycie kapilary.
    4. Zamontuj uchwyt kapilarny w mikromanipulatorze.
  4. Wstrzykiwanie dsRNA do zarodków
    1. Ostrożnie przenieś szkiełko z zarodkami na stolik mikroskopu preparacyjnego.
    2. Przesuń szkiełko, aby przesunąć jeden zarodek do środka pola i ustawić ostrość mikroskopu.
    3. Ustaw końcówkę kapilary za pomocą mikromanipulatora, patrząc w mikroskop preparacyjny. Zbliż końcówkę do końca pierwszego zarodka w rzędzie.
    4. Włączyć dopływ azotu lub innego powietrza.
    5. Ustaw przełącznik wyboru wejścia elektromagnesu w pozycji podciśnienia.
    6. Ustaw regulator ciśnienia wyrzutu na 10 - 15 psi. Dostosuj ciśnienie w zależności od urządzenia.
    7. W razie potrzeby otwórz kapilarę. Gdy końcówka zostanie otwarta, kolorowy roztwór dsRNA wypełni końcówkę.
    8. Przesuń końcówkę naczynia włosowatego do przodu, aby nakłuć zarodek. Jeśli ustawienie ciśnienia jest idealne, płyn embrionalny nie wpłynie do naczynia włosowatego.
    9. Naciśnij przełącznik nożny, aby wyrzucić roztwór dsRNA do zarodka, aż zostanie wyrzucona odpowiednia ilość roztworu. Rycina 5 przedstawia przykłady morfologii zarodka po wstrzyknięciu odpowiednich i niewłaściwych ilości roztworu.
    10. Trzymaj końcówkę naczynia włosowatego wewnątrz zarodka przez ~ 2 sekundy, a następnie usuń ją.
    11. Przesunąć naczynia włosowate do następnego zarodka i powtarzać kroki 5.4.8 - 5.4.10, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte. Wymień szklaną kapilę, jeśli zostanie zatkana lub pęknie.
  5. Odzysk i inkubacja po wstrzyknięciu
    1. Po wstrzyknięciu umieścić szkiełko na szalce Petriego.
    2. Dodaj mokry wacik do szalki Petriego. Nie pozwól, aby wacik dotykał zjeżdżalni.
    3. Przykryj szalkę Petriego i owiń ją folią uszczelniającą. Oznacz naczynie nazwą dsRNA, stężeniem, datą, godziną i liczbą wstrzykniętych zarodków.
    4. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze o temperaturze 30 °C do momentu wyklucia się zarodków.

6. Rodzicielskie RNAi

  1. Izolowanie poczwarek dla pRNAi
    1. Zbierz poczwarki z kolonii.
    2. Sortuj poczwarki męskie i żeńskie pod mikroskopem (patrz ryc. 6). Umieścić je na dwóch oddzielnych szalkach Petriego w inkubatorze o temperaturze 30 °C, aby upewnić się, że przed wstrzyknięciem nie dojdzie do krycia.
    3. Sprawdzaj codziennie, czy nie ma zamkniętych dorosłych. Przepoczwarzenie trwa zwykle 5 - 7 dni w temperaturze 30 °C.
    4. Zamknięte samce i samice należy przenieść na dwie oddzielne szalki Petriego i karmić je karmą dla kotów co drugi dzień, aż będą gotowe do wstrzyknięcia.
    5. Przystąpić do wstrzykiwania, gdy będzie wystarczająca liczba samic i mężczyzn w odpowiednim wieku. Najlepsze są samice od 4 do 8 dni po eklozji. Do typowej analizy używa się 8 - 12 samic. Do krycia potrzebna jest taka sama liczba samców54.
  2. Wstrzykiwanie dsRNA do kobiecego brzucha
    1. Przygotować dsRNA na lodzie (5.1.2 i 5.1.3).
    2. Podłączyć igłę o rozmiarze 32 do strzykawki o pojemności 10 μl.
    3. Znieczulać samice na etapie CO2 .
    4. Załadować roztwór dsRNA do strzykawki bez pobierania powietrza.
    5. Jedną ręką trzymaj kobietę brzuszną stroną do góry, a drugą trzymaj strzykawkę.
    6. Delikatnie wbić się w segmacorię (błonę) między sternitami 2 i 3 za pomocą końcówki igły. Rycina 7 przedstawia kobietę podczas wstrzyknięcia. Jeśli igła nie wnika łatwo w tkankę, skieruj igłę do góry i powoli dociśnij. Wprowadzić około 2 mm igły do korpusu.
    7. Sprawdzić skalę strzykawki, powoli naciskając tłok, wstrzykując ~ 2 μl na samicę.
    8. Po wstrzyknięciu należy przytrzymać igłę nieruchomo przez co najmniej 5 sekund przed wyjęciem jej z brzucha samicy.
    9. Przenieś samice, którym wstrzyknięto szczepionkę, na szalkę Petriego (o średnicy 90 mm) i podawaj karmę dla kotów.
    10. Oznacz szalkę Petriego nazwą dsRNA, ilością wstrzykniętego mięsa, datą i liczbą samic.
  3. Odzysk i krycie po wstrzyknięciu
    1. Inkubować szalkę Petriego w inkubatorze o temperaturze 30 °C.
    2. Po 24 godzinach przenieś wstrzyknięte samice do mini klatki.
    3. Dodaj do klatki równą liczbę młodych samców, którym nie wstrzyknięto zastrzyku, i oznacz klatkę.
    4. Dodaj do klatki łódkę wagową z karmą dla kotów.
    5. Pozostawić klatkę w inkubatorze o temperaturze 30 °C, aby umożliwić krycie. Po 24 godzinach samice powinny zacząć składać jaja, a zarodki można zbierać codziennie lub w wymaganych odstępach czasu.

7. Analiza fenotypowa po RNAi

UWAGA: W temperaturze 30 °C, potrzeba ~ 55 godzin, aby jaja wykluły się50.

  1. Analiza żywotności eRNAi
    1. Oblicz wskaźnik wylęgu, porównując liczbę wyklutych larw z całkowitą liczbą wstrzykniętych zarodków. Należy pamiętać o dołączeniu wstrzyknięcia kontroli ujemnej, ponieważ zarodki mogą zostać uszkodzone lub zabite w wyniku procedury wstrzyknięcia. Typowe wskaźniki wylęgu wahają się od 30% do 60%. Uważaj na wyklute larwy zjadające niewyklute jaja.
  2. Analiza żywotności pRNAi
    UWAGA: Jeśli na żywotność samic wpływa gen ukierunkowany przez RNAi, samice, którym wstrzyknięto specyficzne dsRNA, ale nie dsRNA z kontroli negatywnej, zaczną umierać. Jeśli ma to wpływ na produkcję jaj lub składanie jaj, samice będą wykazywać częściową lub całkowitą bezpłodność. Oceń przeżywalność samic w porównaniu z kontrolami ujemnymi lub porównaj całkowitą liczbę jaj złożonych przez samice doświadczalne i kontrolne (7.2.3).
    1. Rozpocznij pobieranie zarodków zgodnie z krokiem 2.2.
    2. Po 24 godzinach zbierz zarodki, wykonując kroki 2.4 - 2.5.
    3. Policz całkowitą liczbę zarodków.
    4. Przenieść zarodki na szalkę Petriego o średnicy 90 mm. Oznacz szalkę Petriego docelowym genem, datą pobrania i liczbą zarodków.
    5. Inkubować zarodki w inkubatorze w temperaturze 30 °C aż do wyklucia. Ponieważ wyklute larwy żywią się niewyklutymi zarodkami, należy często sprawdzać szalkę Petriego i oddzielać wyklute larwy od niewyklutych zarodków za pomocą kleszczy (patrz Dyskusja).
    6. Policz liczbę wyklutych zarodków i oblicz wskaźnik wylęgu
      7. .
  3. Badanie wad skórek u wyklutych larw
    1. Zebrać wyklute larwy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Do dygestorium dodać 1 ml roztworu utrwalającego.
    3. Pozostawić probówkę do mikrowirówki w temperaturze 4 °C co najmniej na noc, aby roztwór mógł przeniknąć do tkanki larwalnej.
    4. Aby to zobrazować, usuń jak najwięcej utrwalacza z tubki.
    5. Opłucz larwy co najmniej trzy razy PBST.
    6. Przenieść larwy na wielodołkową szklaną płytkę z PBST za pomocą końcówki pipety P-1000 z odciętym końcem w celu jej poszerzenia.
    7. Pod mikroskopem preparacyjnym rozciągnij larwy za pomocą kleszczy, aby zbadać wady. Bardzo ważne jest, aby rozciągnąć larwy w celu zbadania defektów, ponieważ ich ciała kurczą się w utrwalaczu.
  4. Badanie wad skórek u niewyklutych larw<br /> Uwaga: Ta procedura jest przydatna do badania wczesnych fenotypów embrionalnych, szczególnie w przypadku zarodków, które nie przeżywają do wyklucia.
    1. W przypadku pRNAi dodać PBST do płytki Petriego (7.2.4) i przenieść niewyklute zarodki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki pipety P-1000 z odciętym końcem. W przypadku eRNAi dodać PBST do szalki Petriego (5.5.4), zetrzeć niewyklute zarodki ze szkiełka mikroskopowego i przenieść je do probówki do mikrowirówki.
    2. Utrwalić zarodki roztworem utrwalającym i spłukać je PBST w celu wizualizacji, wykonując kroki 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Za pomocą kleszczy wypreparuj zarodki ze skorupki jaja pod mikroskopem preparacyjnym w PBST.
    4. Przenieś zarodki z powrotem do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (~ 200 μl zarodków w każdej probówce).
    5. Usuń jak najwięcej roztworu.
    6. Dodać 1 ml 90% kwasu mlekowego/10% EtOH. Probówkę wirówkową należy pozostawić w inkubatorze w temperaturze 60 °C co najmniej na noc.
      UWAGA: Zarodki można pozostawić w temperaturze 60 °C na kilka dni.
    7. Aby zamontować zarodki, należy je pipetować na szkiełku mikroskopowym za pomocą końcówki do pipety P-1000 z odciętym końcem.
    8. Ręcznie ustaw zarodki za pomocą kleszczy w idealnej orientacji.
    9. Przykryj zarodki szkiełkiem nakrywkowym i zwizualizuj pod mikroskopem za pomocą DIC.
  5. Badanie defektów komórkowych i molekularnych
    UWAGA: Ta procedura jest przydatna do badania podstawowych przyczyn fenotypów naskórka lub śmiertelności, której nie towarzyszą wady naskórka.
    1. W przypadku pRNAi należy oddzielić zarodki od wacików na odpowiednim etapie rozwoju i przenieść je do kosza do pobierania zarodków. Kosz do pobierania może być taki sam lub podobny do kosza używanego do pobierania zarodków Drosophila.
      1. Przygotuj koszyk na jajka z plastikowej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 25 ml z usuniętym dnem fiolki i kółkiem wyciętym z pokrywki (o średnicy około 1 cm). Umieść okrąg o bardzo drobnych oczkach o średnicy około 2,5 cm wewnątrz pokrywki, a następnie przykręć fiolkę scyntylacyjną i użyj do góry nogami.
      2. Ponieważ siatkę można łatwo usunąć po umyciu zarodków, zanurz siatkę w probówce do mikrowirówki z wodą, aby odzyskać wszelkie zarodki przyklejające się do siatki.
    2. W przypadku eRNAi, na odpowiednim etapie, dodaj PBST do szalki Petriego. Zetrzyj zarodki ze szkiełka mikroskopowego i przenieś je do kosza do pobierania zarodków.
      UWAGA: Protokoły fiksacji, hybrydyzacji in situ, barwienia przeciwciał i barwienia jądrowego można znaleźć w Xiang i wsp. 201553.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium autorów wykorzystało technologię RNAi do zbadania funkcjonalnej ewolucji genów regulujących segmentację u owadów53,55. Podczas gdy wszystkie owady są podzielone na segmenty, wydaje się, że geny regulujące ten proces rozdzieliły się podczas promieniowania owadów26,38,56-63. Badania genetyczne u Drosophila zidentyfikowały zestaw dziewięciu genów segmentacji par, które są odpowiedzialne za promowanie tworzenia segmentów ciała64-70. W tym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy niewielka liczba wyrafinowanych systemów modelowych (myszy, muchy, robaki) została opracowana wXX wieku, w XXIwieku pojawiła się fala nowych systemów zwierzęcych opracowywanych w laboratoriach na całym świecie. Te nowe systemy pozwalają naukowcom na rozwiązywanie porównawczych, ewolucyjnych pytań, których nie można zbadać wyłącznie za pomocą "standardowych" systemów modelowych. To wdrożenie nowych modeli wymaga szybkiego rozwoju metod hodowli laboratoryjnej, identyfikacji genów i podejść...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Alison Heffer i Yong Lu za ustawienie aparatu do mikroiniekcji i podzielenie się swoją bezcenną wiedzą i doświadczeniem z RNAi owadów. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (R01GM113230 do L.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dermestes maculatus żywe chrząszczeNasze laboratorium lub Carolina Biological Supply#144168Nasz szczep laboratoryjny został zweryfikowany za pomocą kodu kreskowego COI; nie można wykluczyć odmiany szczepu z Karoliny
Mokrą karmę dla kotówFancy FeastKawałki mięsa z sosem. Można kupić w większości sklepów z karmą dla zwierząt i sklepach spożywczych
Sucha karma dla psówPurina Puppy ChowMożna kupić w większości sklepów z karmą dla zwierząt i sklepach spożywczych
Klatka na owady (rozmiar średni, 30,5 x 19 x 20,3 cm)Exo TerraPT2260Do utrzymania kolonii. W razie potrzeby można użyć większej klatki
Klatka na owady (rozmiar mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)Exo TerraPT2250Do pobierania zarodków
szalka PetriegoVWR89038-968
WacikFisher22-456-883
Zestaw do transkrypcji Megascript T7FisherAM1334Na 40 reakcji
Pompa pneumatycznaWPIPV830
Uchwyt kapilarnyWPI
MikromanipulatorNARISHIGEMN-151
Bibuła filtracyjna (90  mm)VWR28342-010
Barwnik spożywczy (zielony)McCormick
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoHilgenberg1406119
Ściągacz igieł (ściągacz do mikropipet)Sutter Instrument Co.P-97
Szkiełko mikroskopoweWorldWide Life Sciences Division41351157
Folia uszczelniająca (Parafilm M)Fisher13-374-12
Model 801 Strzykawka (10  &mikro; l)Igła Hamilton7642-01
(rozmiar 32) Hamilton7762-05
Roztwór utrwalający (Pampel's)BioQuip Products, Inc.1184CToksyczny, należy obchodzić się z nim pod wyciągiem
Kleszcz (DUMONT #5)Fine Science Tools11252-30
Szkiełko nakrywkowe (24 x 50 mm, nr 1.5)Globe Scientific1415-15
Eppendorf Femtotips Końcówka do pipet do mikroładowarekFisherE5242956003
Mikroskopia preparcyjna do wstrzykiwań zarodkówLeicaM420
Mikroskopia preparcyjna do wizualizacji fenotypowej larwZeissSteREO Discover. Mikroskopia V12
DICZeissAXIO Imager. M1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208(2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822(2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674(2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440(2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602(2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32(2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490(2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5(2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interferencja RNAembrionalne RNAirodzicielskie RNAihodowla chrz szczywstrzykiwanie dsRNAwstrzykiwanie do embrion wanaliza fenotypowaprzygotowanie kutykuli

Powiązane artykuły