Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54981

⸱

10 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

W tym artykule

Podsumowanie

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Streszczenie

W chorobie Parkinsona (PD) występuje rozległa utrata neuronów w całym mózgu z wyraźną degeneracją neuronów dopaminergicznych w SNc, co prowadzi do bradykinezji, sztywności i drżenia. Identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w pierwotnych hodowlach brzusznego śródmózgowia (VM) przy użyciu markera fluorescencyjnego zapewnia alternatywny sposób badania selektywnej wrażliwości tych neuronów bez polegania na barwieniu immunologicznym utrwalonych komórek. Tutaj izolujemy, dysocjujemy i hodujemy mysie neurony VM przez 3 tygodnie. Następnie identyfikujemy neurony dopaminergiczne w kulturach za pomocą fluorescencji eGFP (napędzanej przez promotor hydroksylazy tyrozyny (TH)). Pojedyncze neurony są zbierane do probówek mikrowirówkowych za pomocą szklanych mikropipet. Następnie poddajemy lizie zebrane komórki i przeprowadzamy syntezę cDNA oraz "tagmentację" za pośrednictwem transpozonów, aby wytworzyć biblioteki RNA-Seq pojedynczej komórki1,2,3,4,5. Po przejściu kontroli jakości, biblioteki jednokomórkowe są sekwencjonowane, a następnie przeprowadzana jest analiza w celu zmierzenia ekspresji genów. Przedstawiamy wyniki transkryptomu dla poszczególnych neuronów dopaminergicznych i GABA-ergicznych wyizolowanych z kultur śródmózgowia. Donosimy, że 100% żywych komórek TH-eGFP, które zostały zebrane i zsekwencjonowane, było neuronami dopaminergicznymi. Techniki te będą miały szerokie zastosowanie w neuronauce i biologii molekularnej.

Wprowadzenie

Choroba Parkinsona (PD) jest nieuleczalną, związaną z wiekiem chorobą neurodegeneracyjną. Przyczyna tego stosunkowo powszechnego zaburzenia pozostaje słabo poznana. Dochodzi do rozległej utraty neuronów w całym mózgu, z wyraźną degeneracją neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej (SNc), co prowadzi do diagnostycznych cech klinicznych bradykinezji, sztywności i drżenia.

Pierwotne mieszane kultury zawierające neurony dopaminergiczne SNc są szczególnie istotne dla choroby Parkinsona. Neurony dopaminergiczne brzusznego obszaru nakrywki (VTA) są zaangażowane w nagrodę i uzależnienie. Pierwotne mieszane kultury embrionalne brzusznego śródmózgowia (VM) zawierają zarówno neurony dopaminergiczne (DA) SNc i VTA, jak i neurony GABA-ergiczne. Hodowle pierwotne VM mogą być przydatne do testów neuroprotekcyjnych i wyjaśnienia selektywnej wrażliwości neuronów dopaminergicznych. Nie ma wiarygodnego sposobu identyfikacji komórek dopaminergicznych w hodowli na podstawie morfologii. Tutaj opracowujemy techniki identyfikacji i pozyskiwania pojedynczych neuronów dopaminergicznych oraz konstruujemy jednokomórkowe biblioteki sekwencjonowania RNA o wysokiej wydajności.

Raportujemy reprezentatywne dane transkryptomu RNA dla pojedynczych neuronów dopaminergicznych i GABA-ergicznych wyizolowanych z kultur śródmózgowia. Protokół ten może być stosowany do neuroprotekcji, neurodegeneracji i testów farmakologicznych w celu zbadania wpływu różnych metod leczenia na transkryptom DA / GABA. Ponieważ neurony dopaminergiczne stanowią niewielką mniejszość neuronów ulegających ekspresji w pierwotnych kulturach VM, zdolność do wiarygodnej identyfikacji tych neuronów w żywych kulturach umożliwi rozszerzony zakres badań jednokomórkowych. Te nowatorskie techniki ułatwią postęp w zrozumieniu mechanizmów zachodzących na poziomie komórkowym i mogą mieć zastosowanie w innych dziedzinach neuronauki i biologii molekularnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt dostarczonymi przez National Institutes of Health, a protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Kalifornijskim Instytucie Technologii.

1. Pochodzenie pierwotnych kultur komórek dopaminergicznych z embrionalnego mózgu myszy

  1. Roztwory i pożywka hodowlana
    1. Przygotowanie roztworu podstawowego kwasu askorbinowego
      1. Odważyć 352 mg kwasu askorbinowego. Dodać sterylnyH2Odo końcowej całkowitej objętości 20 ml. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia. Przefiltrować przez końcówkę strzykawki 0,2 μm i przechowywać w 500 μl porcji w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotowanie roztworu podstawowego papainy
      1. Rozcieńczyć papainę do 15 jednostek/ml w 1x zbilansowanym roztworze soli Hanksa (HBSS). Pipetuj pipetą w górę i w dół 5 razy, aby dokładnie wymieszać. Przygotuj się w dniu sekcji.
    3. Przygotowanie roztworu podstawowego DNazy
      1. Odważyć 20 mg DNazy. Dodać sterylneH2Odo całkowitej końcowej objętości 20 ml. Sterylny filtr z końcówką filtra strzykawkowego 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
    4. Przygotowanie roztworu zatrzymującego
      1. Rozcieńczyć 5 ml surowicy koni dawcy do 10% w 45 ml 1x HBSS. Sterylny filtr z końcówką filtra strzykawkowego 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotowanie 4% roztworu podstawowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA)
      1. Odważyć 2 g BSA i dodać 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do całkowitej końcowej objętości 45 ml. Sterylizuj filtr za pomocą końcówki filtra strzykawkowego 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotowanie podłoża galwanicznego
      1. Do pożywki o objętości 494 ml dodaj 1,25 ml pożywki zawierającej L-alanylo-L-glutaminę (stabilizowane źródło L-glutaminy) i 5 ml surowicy koni dawcy. Sterylizuj filtr za pomocą końcówki filtra strzykawkowego 0,2 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowych
      1. Do 196 ml pożywki galwanicznej dodać 4 ml witaminy B27 i 200 μl kwasu askorbinowego. Filtr sterylizować filtrem 0,2 μm. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia.
    8. Przygotowanie 4% roztworu paraformaldehydu (PFA
      Ostrzeżenie: Ogólne środki ostrożności dotyczące stosowania paraformaldehydu są następujące: Używaj dygestorium, unikaj kontaktu ze skórą i oczami, unikaj wdychania pary, trzymaj z dala od źródeł ciepła lub otwartego ognia. Nosić odpowiednią odzież ochrony osobistej. PFA może powodować uczulenie i zapalenie skóry, dlatego po użyciu dokładnie umyj ręce.
      1. Dodaj 10 ml 16% PFA do 30 ml 1x PBS, pH 7,4.
    9. Przygotowanie 0,1% Triton X-100
      1. Odpipetować 1 ml Triton X-100 do 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 10% roztwór. Pipetować powoli, aby lepki roztwór wypełnił końcówkę pipety. Podgrzej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozpuszczenia. Przechowywać 10% zapasu w temperaturze 4 °C.
      2. Rozcieńczyć 10% zapasu do 0,01% (np. wykonując 2 seryjne rozcieńczenia 1:10: rozcieńczyć 1 ml 10% roztworu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 1% roztwór; 1 ml 1% roztworu w 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 0,1% roztwór).
    10. Przygotowanie 10% i 1% surowicy osła
      1. Dodaj 1 ml osiej surowicy do 9 ml 1x PBS, aby uzyskać 10% roztwór. Dodaj 0,5 ml surowicy osła do 49,5 ml 1x PBS o pH 7,4, aby uzyskać 1% roztwór.
    11. Przygotowanie 1x PBS
      1. Rozcieńczyć 10x PBS do 1x, dodając 50 ml do 450 mlH2O. Dostosować pH roztworu do pH 7,4 za pomocą pH-metru.
  2. Powlekanie naczyń kulturowych
    1. Powłoka z poli-L-ornityny
      1. Pokryj tylko szklane dno o średnicy 10 mm pośrodku wszystkich naczyń o średnicy 35 mm 120 μl poli-L-ornityny przy użyciu sterylnej techniki. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Użyć aspiratora próżniowego do zasysania poli-L-ornityny. Opłucz naczynia dwukrotnie sterylnymH2O.
    2. Powłoka z laminy (stężenie podstawowe 1 mg/ml)
      1. Rozcieńczyć 20 μl lamininy w 2 ml sterylnegoH2O(stężenie końcowe 0,01 mg/ml).
      2. Tylko szklane dno o średnicy 10 mm pośrodku wszystkich szalek pokryć 120 μl lamininy rozcieńczonej do 0,01 mg/ml przy użyciu sterylnej techniki i inkubować przez 1 godzinę lub O/N w temperaturze 37 °C przed użyciem.
  3. Sekcja myszy
    UWAGA: Metody stosowane w tej sekcji są zaprojektowane z myślą o minimalnym narażeniu komórek, ponieważ są one przenoszone z worków embrionalnych do inkubatora hodowlanego. Żywotność komórek jest zachowana poprzez usunięcie tylko części mózgu w celu rozwarstwienia śródmózgowia. Izolacja śródmózgowia przebiega szybciej bez konieczności preparowania całego mózgu w celu uzyskania dostępu do tego obszaru. Zobacz tabelę materiałów dla szczepu myszy użytego w tym badaniu.
    1. Poddaj eutanazji ciężarną mysz w 14. dniu ciąży za pomocą CO2 .
    2. Spryskaj brzuch uśpionej myszy 70% etanolem. Chwyć skórę dolnej części brzucha za pomocą kleszczy z zębami 2 x 3 i otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek chirurgicznych o ostrzu. Wykonaj dwa cięcia, poruszając się na boki i proksymalnie z każdej strony. Złóż ścianę brzucha za pomocą kleszczy, aby odsłonić jamę brzuszną.
      UWAGA: Macica jest teraz odsłonięta. Odsłonięcie jamy opłucnej i powstanie odmy opłucnowej zapewnia również, że zwierzę nie dojdzie do siebie.
    3. Przetnij oba końce rogu macicy, aby oddzielić macicę. Umieścić na szalce Petriego w sterylnym kapturze.
    4. Używając kleszczyków z prostą końcówką w każdej ręce, otwórz worek zarodkowy i usuń zarodek. Szybko odetnij głowę, ściskając głowę na szyi kleszczami. Ustabilizuj głowę kleszczami mocno umieszczonymi na pysku, tak aby powierzchnia grzbietowa była dostępna.
    5. Za pomocą kleszczy trzymanych w drugiej ręce uszczypnij warstwę skóry i czaszkę tuż przed grzbietem śródmózgowia. Oderwij skórę i czaszkę doogonowo wzdłuż linii środkowej. Umieść kleszcze wokół grzbietu, jedną końcówką między korą a śródmózgowiem, a drugą nad móżdżkiem.
    6. Uszczypnij i usuń całe śródmózgowie, pozostawiając przodomózgowie po stronie rostralnej i móżdżek po stronie ogonowej. Umieścić na szalce Petriego z zimnym HBSS pod mikroskopem preparacyjnym.
    7. Powtórz procedurę dla pozostałych zarodków.
    8. Pod mikroskopem preparacyjnym odwróć segment mózgu tak, aby strona brzuszna była teraz dostępna. Widoczne są teraz 4 ćwiartki. Usuń wszystkie opony mózgowe i naczynia krwionośne, delikatnie chwytając opony mózgowe i ciągnąc w górę od mózgu.
    9. Użyj kleszczy, aby ustabilizować segment mózgu podczas oddzielania śródmózgowia. Umieść jeden szczypiec kleszczy w komorze mniej więcej pośrodku segmentu. Wykonaj pierwsze uszczypnięcie grzbietowo, kierując się do naczynia, a następnie przyśrodkowo z każdej strony. Weź dwie dolne ćwiartki, wykonując boczne nacięcia po obu stronach.
      UWAGA: Tkanka będąca przedmiotem zainteresowania znajduje się w brzusznej części dolnej, która wydaje się gęsta. Region ten zawiera zarówno VTA, jak i SNc.
    10. Przytnij i wyrzuć tkankę, która jest mniej gęsta: obejmuje to górne i dolne colliculi. Umieścić wypreparowaną tkankę zawierającą zarówno VTA, jak i SNc w świeżym HBSS w oddzielnym obszarze szalki Petriego.
      UWAGA: Na tym etapie rozwoju mózgu myszy (E14) obszar zainteresowania w brzusznej części śródmózgowia jest oddzielony komorą od strefy wewnętrznej i innych grup komórek podwzgórza. Bardziej wydłużona struktura rozwijającego się embrionalnego mózgu myszy pozwala na rozróżnienie tych obszarów, które znajdują się bliżej siebie w mózgu dorosłej myszy.
    11. Powtórz te czynności dla wszystkich pozostałych segmentów mózgu.
    12. Po wypreparowaniu wszystkich segmentów mózgu użyj kleszczy i skalpela nr 11, aby poćwiartować każdą sekcję śródmózgowia na kawałki o mniej więcej równej wielkości.
  4. Dysocjacja komórek
    1. Leczenie enzymatyczne komórek
      1. Użyj końcówki pipety P1000 o szerokim otworze, aby zebrać wszystkie poćwiartowane segmenty śródmózgowia w HBSS i umieścić je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pozwól segmentom osiąść na dnie rurki i usuń HBSS, który został wchłonięty wraz z ćwiartkami.
      2. Dodać 500 μl roztworu papainy do probówki i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut. Ponownie zawiesić komórki, przesuwając palcem po probówce po 7,5 minuty.
      3. Używając końcówki P1000 o szerokim otworze, odpipetować tylko segmenty śródmózgowia do 1 ml porcji roztworu deoksyrybonukleazy I (DNazy). Pozwól, aby segmenty osiadły na dnie rurki.
      4. Używając końcówki P1000 o szerokim otworze, przenieś tylko segmenty śródmózgowia do 15 ml probówki zawierającej 1 ml zimnego roztworu w celu spłukania. Pozwól segmentom osiąść na dnie rurki i powtórz płukanie jeszcze raz.
    2. Mechaniczne rozcieranie zawiesiny komórek
      1. Zastąp ostatnie płukanie 1 ml świeżego roztworu zatrzymującego i pipetuj w górę iw dół 7x za pomocą końcówki do pipety P1000, aby rozdzielić komórki. Unikaj nadmiernego rozcierania, aby zminimalizować lizę komórek.
      2. Zawiesinę komórek należy podłożyć, powoli pipetując 200 μl 4% roztworu BSA na dno probówki. Ostrożnie wyjmij końcówkę pipety, aby uniknąć przerwania warstwy zawiesiny komórek. Po odwirowaniu przy 280 x g przez 6 minut, odessać supernatant za pomocą P1000 i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki galwanicznej.
  5. Liczenie i powlekanie komórek
    1. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 1 000 komórek/μl za pomocą pożywki galwanicznej.
    2. Za pomocą aspiratora próżniowego odessać lamininę z pokrytych naczyń partiami po maksymalnie trzy szalki. Płytkę 120 μL (1,2 x 105 komórek/szalkę (78,5 mm2)) zawiesiny komórek na powlekanej powierzchni szalek natychmiast po zassaniu każdej partii. Zapobiega to wysychaniu naczyń i tworzeniu się nierównej powierzchni.
    3. Po 1 godzinie ostrożnie dodaj 3 ml pożywki hodowlanej do nieobsianego obszaru naczynia hodowlanego, aby zminimalizować zakłócenie komórek.
    4. Wykonaj od połowy do pełnej zmiany pożywki na szalkach do hodowli komórkowych w odstępach 3 dni przez 3 tygodnie.

2. Pobieranie hodowanych neuronów dopaminergicznych do sekwencjonowania RNA

UWAGA: Przegląd protokołu pobierania komórek i sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek znajduje się na rysunku 1.

  1. Kroki, które należy wykonać przed dniem eksperymentu
    1. Oczyść rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego przez sonikację w 100% etanolu przez 15 minut, a następnie ponownie w destylowanymH2Oprzez 15 minut. Opróżnij rurkę i piecz przez noc w piekarniku w temperaturze 200 °C, aby dezaktywować RNazę.
    2. Za pomocą świeżo otwartych końcówek pipet wolnych od RNaz przygotować roztwór podstawowy 10-krotnego buforu reakcyjnego, mieszając 19 μl 10-krotnego buforu do lizy z zestawu do sekwencjonowania z 1 μl roztworu inhibitora RNazy (całkowita objętość 20 μl) w probówce do mikrowirówki. Krótko odwiruj mieszaninę za pomocą mikrowirówki i trzymaj na lodzie.
    3. Dodać 2 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego do każdej z pojedynczych probówek PCR o pojemności 0,2 ml (używanych do zbierania pobranych neuronów). Oznaczyć probówki odpowiednimi znacznikami identyfikującymi neurony, które mają zostać pobrane i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze 4 °C.
    2. Kroki, które
  2. należy wykonać w dniu eksperymentu
    1. Produkcja pipet żniwnych.
      1. Wyciągnąć mikropipety o dużej średnicy końcówki (2 - 8 μm) z wypalonej rurki kapilarnej za pomocą ściągacza do mikroelektrod i pokrytego szkłem żarnika grzewczego mikrokuźni. Ustaw ściągacz tak, aby formował mikropipety z długim stożkiem. Za pomocą mikrokuźni wyposażonej w skalibrowaną siatkę okularową i obiektyw o dużej mocy należy rozbić końcówkę mikropipety do żądanego rozmiaru końcówki (10 - 20 μm).
      2. Zamocuj mikropipetę w uchwycie na pipety microforge i zamontuj uchwyt na mikrokuźni. Ustaw ostrość końcówki mikropipety nad szklanym włóknem grzewczym za pomocą mechanicznego manipulatora mikrokuźni i włącz prąd do żarnika, aby go podgrzać. Przyłóż końcówkę pipety do podgrzanego filamentu. Wyłącz prąd, gdy końcówka pipety stopi się do odpowiedniej średnicy.
        NUTA. Odcięcie prądu spowoduje, że żarnik nagle przesunie się w dół i odłączy się od końcówki pipety, tworząc dużą, otwartą pipetę o pożądanej średnicy.
      3. Gotowe mikropipety należy przechowywać w zamkniętym pudełku do czasu, aż będą potrzebne.
    2. Zbieranie neuronów.
      NUTA. Wyhodowane neurony pobrano zgodnie ze zmodyfikowaną wersją wcześniej opublikowanego protokołu6.
      1. Dokładnie wyczyść wszystkie powierzchnie pomieszczenia do pobierania komórek, które mają kontakt z kulturami, naczyniami i probówkami zbiorczymi, za pomocą płynnego środka dezynfekującego i wody, a następnie spłucz wodą. Przetrzyj zdezynfekowane powierzchnie 80% etanolem, a następnie chusteczką nasączoną inhibitorem RNazy.
      2. Napełnij dwa izolowane pojemniki lodem, jeden zwykłym lodem (wodnym), a drugi suchym lodem. Umieść 0,2 ml probówek zbiorczych PCR wypełnionych wcześniej 2 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego na zwykłym lodzie.
      3. Wyjąć z inkubatora naczynie hodowlane zawierające neurony, odcedzić pożywkę hodowlaną z naczynia, przepłukać 2 ml wolnego od RNaz PBS Dulbecco (DPBS) i zastąpić 1 ml DPBS do zbioru.
      4. Zidentyfikuj fluorescencyjne, TH-dodatnie neurony w pierwotnych kulturach śródmózgowia za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw fazowy 40X, lampę Hg i zestaw filtrów GFP.
      5. Umieść pipetę nad somą komórkową za pomocą zmotoryzowanego lub ręcznego mikromanipulatora. Zassać neuron do szklanej mikropipety za pomocą delikatnego ssania podawanego doustnie przez plastikową rurkę przymocowaną do bocznego portu uchwytu mikropipety. Natychmiast wyjąć mikropipetę zawierającą komórkę z roztworu do kąpieli.
      6. Umieść końcówkę pipety w probówce do PCR o pojemności 0,2 ml zawierającej bufor reakcyjny i oderwij końcówkę od boku probówki, w pobliżu dna. Usunąć pozostały płyn (0,5 - 1,5 μl) ze złamanej końcówki mikropipety, umieszczając sterylną igłę strzykawkową 21 G z tyłu mikropipety i wywierając nacisk na zewnątrz.
      7. Odwiruj probówkę zbiorczą przez 5 sekund za pomocą mikrowirówki biurkowej i zamroź ją w suchym lodzie. Probówki zawierające pojedyncze komórki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Zazwyczaj pobiera się 5 komórek z jednego naczynia przez okres 1 godziny w temperaturze otoczenia.

3. Generacja biblioteki sekwencyjnej RNA dla pojedynczej komórki

  1. Wytwarzanie pierwszej nici cDNA
    UWAGA: Do poniższych kroków należy użyć odczynników z dostępnego w handlu zestawu do sekwencjonowania.
    1. Przynieś poniższe odczynniki na lodzie do szafki PCR. Przygotuj pierwszą nić mieszanki głównej plus 10%, łącząc następujące odczynniki w temperaturze pokojowej w komorze PCR: 2 μl 5x bufor pierwszej nici, 0,25 μl DTT (100 mM), 1 μl mieszanki dNTP (10 mM), 1 μl oligonukleotydu (12 μM), 0,25 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (100 jednostek). Jest to główna mieszanina odwrotnej transkryptazy (5,5 μl całkowitej objętości na reakcję).
    2. Pobrać próbki z temperatury -80 ̊C na suchy lód i przenieść do szafki PCR. Do próbki jednokomórkowej dodać następujące składniki: 1 μl 3' starter 1 i 1 μl ilościowo oznaczonych kolców RNA. Przenieść próbki z bloku agregatu chłodniczego do termocyklera z gorącą pokrywą ustawionego na 72 °C.
    3. Inkubować probówki w termocyklerze przez 3 minuty w temperaturze 72 °C, a następnie umieścić próbki na stojaku chłodzącym do PCR. Dodać 5,5 μl mieszanki wzorcowej (z kroku 3.1.1) do każdej probówki reakcyjnej i delikatnie wymieszać, pipetując. Wirować probówki o pojemności 0,2 μl przez 5 s i inkubować w termocyklerze w następujący sposób: 42 °C przez 90 min, 70 °C przez 10 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Oczyszczanie amplifikowanej pierwszej nici cDNA.
    UWAGA: CDNA amplifikowane PCR jest oczyszczane przez unieruchomienie na kulkach magnetycznych. Użyj urządzenia do separacji magnetycznej do probówek o pojemności 0,2 ml.
    1. Podziel kulki magnetyczne na probówki o pojemności 1,5 ml. Przed każdym użyciem doprowadź porcje kulek do temperatury pokojowej na co najmniej 30 minut i dobrze wymieszaj do rozproszenia. Wiruj koraliki magnetyczne, aż do równomiernego wymieszania.
    2. Do każdej próbki dodać 25 μl kulek magnetycznych. Mieszać, pipetując całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby cDNA związało się z kulkami.
  3. Przygotowanie PCR Master Mix
    1. Przygotuj główną mieszaninę amplifikacji PCR ds-cDNA dla wszystkich reakcji z dodatkowymi 10%, mieszając 5 μl 10x buforu PCR, 2 μl mieszaniny dNTP (10 mM), 2 μl startera PCR 2 (12 μM), 2 μl mieszanki polimerazy 50x 2 i 39 μl wody wolnej od nukleaz (50 μl całkowitej objętości/reakcji).
  4. Wzmocnienie pierwszej nici
    1. Umieścić próbki i kulki magnetyczne na urządzeniu do separacji magnetycznej ≥5 minut, aż ciecz stanie się całkowicie przezroczysta, a w supernatancie nie pozostaną żadne kulki.
    2. Trzymając próbki na urządzeniu rozdzielającym, odpipetować supernatant i wyrzucić. Obracaj próbki przez 5 sekund, aby zebrać płyn z boku probówki. Umieścić próbki na urządzeniu do separacji magnetycznej na 30 s, a następnie usunąć cały pozostały supernatant za pomocą pipetora P10.
    3. Dodać 50 μl głównej mieszanki PCR do każdej probówki zawierającej DNA związane z kulkami z poprzedniego etapu. Umieścić probówkę w nagrzanym termocyklerze (95 °C) z podgrzewaną pokrywką. Rozpocznij cykl termiczny za pomocą następującego programu: 95 °C przez 1 min, 26 cykli po 95 °C przez 15 s, 65 °C przez 30 s, 68 °C przez 6 min. Następnie 72 °C 10 min. Utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi sekwencjonowania, aby uzyskać więcej informacji i zoptymalizować sample ustawienia.
  5. Oczyszczanie amplifikowanego dwuniciowego cDNA
    1. Do każdej próbki dodać 90 μl kulek. Mieszać, pipetując całą objętość w górę i w dół co najmniej 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut, aby cDNA związało się z kulkami. Umieścić próbki wraz z kulkami na urządzeniu do separacji magnetycznej na ≥5 minuty, aż ciecz stanie się całkowicie klarowna, a w supernatancie nie pozostaną żadne kulki.
    2. Gdy próbki znajdują się w urządzeniu do separacji magnetycznej, należy usunąć supernatant i wyrzucić. Przechowywać próbki w urządzeniu do separacji magnetycznej. Do każdej próbki dodać 140 μl świeżo przygotowanego 85% etanolu, nie naruszając kulek. Poczekaj 30 sekund. Odpipetować supernatant. cDNA pozostanie związane z kulkami podczas procesu prania.
    3. Powtórz płukanie etanolem jeszcze raz.
    4. Krótko obrócić próbki, aby zebrać ciecz z boku probówki. Umieść próbki na urządzeniu do separacji magnetycznej na 30 s, a następnie usuń cały pozostały etanol za pomocą pipety. Próbki należy umieszczać w temperaturze pokojowej przez 2 - 2,5 minuty, aż osad wyschnie i przestanie być błyszczący (tj. zanim pojawi się pęknięcie).
      UWAGA: Suszyć pellet tylko do momentu, gdy wyschnie. Pellet będzie wyglądał matowo bez połysku. Jeśli osad nie jest suchy, etanol pozostanie w dołkach na próbki, co zmniejszy szybkość odzyskiwania amplifikowanego cDNA i wydajność. Jeśli pellet jest nadmiernie suchy, pojawią się w nim pęknięcia. Ponowne nawodnienie zajmie więcej niż 2 minuty i może zmniejszyć odzysk amplifikowanego cDNA i wydajność.
    5. Po wyschnięciu kulek dodać 22,5 μl buforu elucyjnego, aby przykryć granulkę kulki. Wyjmij próbki z urządzenia do separacji magnetycznej i dokładnie wymieszaj, aby ponownie zawiesić kulki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu nawodnienia.
    6. Obracaj próbki przez 5 sekund, aby zebrać płyn z boku probówki. Umieść próbki z powrotem na urządzeniu do separacji magnetycznej na ≥1 minuty, aż roztwór będzie całkowicie klarowny.
      UWAGA: Niewielka populacja koralików nie może opierać się o magnes podczas inkubacji. Pipetować te niegranulowane kulki w górę iw dół, aby ponownie zawiesić je z supernatantem, a następnie pipetować je w kierunku magnesu, w którym reszta kulek już się granulowała (bez naruszania istniejącej granulki).
    7. Kontynuować inkubację do momentu, gdy w supernatancie nie pozostaną żadne kulki. Przenieś przezroczysty supernatant zawierający oczyszczone cDNA z każdej probówki do probówki o niskiej adhezji bez nukleaz. Oznaczyć każdą probówkę informacjami o próbce i przechowywać w temperaturze -20 °C. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.
  6. Pomiar stężenia DNA i wielkości fragmentu
    1. Przeprowadzić kontrolę jakości, oznaczając ilościowo 1 μl podwielokrotności cDNA na fluorometrze. Oceń 1 μl (3 ng) ds-cDNA za pomocą systemu elektroforezy (zgodnie z opisem w1).
  7. Fragmentacja DNA
    UWAGA: Użyj zestawu do przygotowywania próbek DNA.
    1. Dodać 20 μl cDNA (łącznie 35 ng) do probówki. Dodać 25 μl buforu Tagment DNA (TD) do probówki zawierającej cDNA.
    2. Dodać 5 μl TDE1 (Tagment DNA Enzyme) do probówki. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Użyj nowej końcówki dla każdej próbki. Wirować przy 280 x g w temperaturze 20 °C przez 1 min.
    3. Umieścić próbki w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką i uruchomić go w temperaturze: 55 °C, 5,5 min. Szybko dodać 50 μl roztworu QG (zestaw do ekstrakcji żelu). Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Przejdź bezpośrednio do następnego kroku.
  8. Oczyszczanie rozdrobnionego DNA
    1. Dodaj 170 μl kulek, pipetuj 10x w górę i w dół do wymieszania. Pozostaw na 10 minut. Umieść rurki na magnesie. Pozostaw rurki na magnesie na 10 minut. Gdy próbki znajdują się w urządzeniu do separacji magnetycznej, odpipetować supernatant i wyrzucić.
    2. Pozostaw rurkę na magnesie i dodaj 200 μl 85% etanolu. Odstaw na 30 sekund, a następnie usuń etanol. Powtórz płukanie etanolem. Zakręć rurkę 1,000 x g przy RT.
    3. Umieść rurkę z powrotem na magnesie. Odpipetować resztki etanolu. Pozostawić próbki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    4. Dodać 21 μl buforu elucyjnego z zestawu do ekstrakcji żelu. Pozwól probówce osiąść na magnesie, pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby wymieszać. Pozostaw rurkę w pozycji RT na 15 minut.
    5. Umieść probówkę z powrotem w magnesie na 5 minut. Odpipetować 20 μl roztworu (oczyszczone DNA) do nowej probówki.
  9. Znakowanie i amplifikacja PCR fragmentowanego DNA
    UWAGA: Na tym etapie oczyszczone DNA jest amplifikowane za pomocą programu PCR o ograniczonym cyklu. Etap PCR dodaje również indeks 1 (i7) i indeks 2 (i5), a także wspólne adaptery (P5 i P7) (wymagane do generowania i sekwencjonowania klastrów). Więcej informacji można znaleźć w przewodniku po przygotowywaniu próbek DNA.
    1. Do nowej probówki dodać 5 μl starterów indeksu 2 (biała nakrętka). Za pomocą nowej końcówki do pipet dodać 5 μl startera indeksu 1 (pomarańczowa nakrętka). Do każdej probówki dodać 15 μl głównej mieszanki PCR.
    2. Do każdej probówki dodać 5 μl koktajlu startera PCR. Dodać 20 μl oczyszczonego DNA do probówki. Delikatnie pipetować w górę i w dół 3 - 5 razy.
    3. Wykonaj PCR przy użyciu następującego programu na termocyklerze: 72 °C przez 3 min, 98 °C przez 30 s, 5 cykli po 98 °C przez 10 s, 63 °C przez 30 s, 72 °C przez 3 min. Przytrzymaj w temperaturze 10 °C. Natychmiast przystąp do oczyszczania PCR lub przechowuj próbkę w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 dni.
  10. Oczyszczanie amplifikowanych fragmentów DNA
    1. Przynieś koraliki do RT. Przygotuj świeży 85% etanol. Wyjmij próbki z maszyny do PCR i krótko odwiruj.
    2. Dodaj 30 μl kulek do probówki. Delikatnie odpipetować mieszanie w górę i w dół 10 razy. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 5 minut. Umieść z powrotem na magnesie na 5 minut. Trzymając probówkę na magnesie, użyj pipety, aby wyrzucić supernatant.
    3. Do każdej probówki dodać 200 μl 85% etanolu. Odpipetować etanol po 30 sekundach. Powtórz pranie 85% etanolem. Odpipetować etanol po 30 sekundach.
    4. Trzymając rurki nadal na magnesie i otwarte nasadki, pozostaw koraliki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut. Wyjmij rurki z magnesu.
    5. Dodać 32,5 μl buforu elucyjnego. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy. Inkubuj magnes przez 10 - 15 minut.
    6. Umieść probówki z powrotem w magnesie na 2 minuty lub do momentu, gdy supernatant się oczyści. Ostrożnie przenieść 30 μl supernatantu do nowej probówki.
  11. Pomiar stężenia DNA i wielkości fragmentu
    1. Przeprowadzić kontrolę jakości, określając ilościowo stężenie DNA w 1 μl cDNA na fluorometrze. Określ wielkość fragmentu DNA za pomocą elektroforezy. Oceń 1 μl (3 ng) ds-cDNA.
  12. Sekwencjonowanie
    1. Przenieś biblioteki RNA-Seq z pojedynczą komórką do zakładu sekwencjonowania. Generuj odczyty sekwencjonowania 100 bp na sekwencerze zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem4.
      UWAGA: Każda biblioteka sekwencjonowania generuje >20 milionów unikatowych odczytów mapowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wykazującej ekspresję eGFP sterowaną przez sekwencję promotora hydroksylazy tyrozynowej, izolowania pojedynczych fluorescencyjnych neuronów z hodowli oraz pomiaru ich transkryptomu RNA przy użyciu metody RNA-seq (Rysunek 1). Dane wykazały, że 100% izolowanych i sekwencjonowanych komórek dodatnich dla TH-eGFP stanowiły neurony dopaminergiczne, co stwierdzono na podstawie obecn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj izolujemy pojedyncze komórki z niejednorodnej populacji za pomocą znacznika fluorescencyjnego, a następnie badamy każdą komórkę za pomocą sekwencji RNA pojedynczej komórki. Donosimy, że 100% żywych komórek TH-eGFP, które zebraliśmy i zsekwencjonowaliśmy, były rzeczywiście neuronami dopaminergicznymi, w oparciu o obecność następujących trzech transkryptów genów związanych z DA, TH, DDC i slc6a3. Wszystkie komórki TH-eGFP dodatnie wykazywały ekspresję tych trzech genów, co oceniano za pomocą RNA-Seq. Było to zgodne z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), Fundacji Michaela J. Foxa oraz Caltech Innovation Initiative finansującej Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory w California Institute of Technology. Dziękujemy Brianowi Williamsowi za optymalizację protokołu bibliotecznego RNA-Seq i za udzielenie pomocy. Dziękujemy Henry'emu Amrheinowi za szkolenie obliczeniowe. Dziękujemy Barbarze J. Will za udostępnienie sprzętu i przestrzeni laboratoryjnej. Dziękujemy Igorowi Antoszeczkinowi za sekwencjonowanie biblioteki i zarządzanie obiektem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KorporacjaBiochemiczna Papaina Worthington 
Roztwór soli zbalansowany przez Hanksa (HBSS), 1xGibco 14175-095
Surowica dla koni od dawcówThermo Scientific SH30074.03
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma A7030-50G
Medium: Podłoże neuropodstawoweGibco 21103-049
Pożywki hodowlane zawierające stabilizowaną formę L-glutaminy, L-alanylo-L-glutaminy: GlutaMAX Gibco 35050-0610,5 mM stężenie końcowe.
Kwas L-askorbinowySigma A7506
B27Gibco 17504-04450x roztwór podstawowy, 1x stężenie końcowe.
Naczynia ze szklanym dnem 35 mmMatTek   P35GC-1.5-10-C
Poli-L-OrnitynaSigma P4957
LamininSigma L2020Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C w 20 i mikro; L podwielokrotności
Deoksyrybonukleaza I (DNaza)Sigma DN25
Niebieskie końcówki do pipet P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
płytka szalka Petriego 10 mmVWR 25384-324
37 ° C Łaźnia
37 & deg; C, inkubator
16% paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Nauki 15710
Triton X-100Sigma  X100-500ML
Serum osłaEquitech SD-0100HI100% roztwór podstawowy, 1% stężenie końcowe.
Nożyczki chirurgiczne o standardowym wzorzeFine Science Tools14000-14
Kleszcze - 2x3 zębyNarzędzia do nauki11022-14
Kleszcze - Dumont #55Narzędzia do nauki pięknej11295-51
Kleszcze - Dumont #5Narzędzia do nauki o naprawie11252-23
10x PBS, pH 7,4Gibco 70011-044
Dulbecco's Roztwór buforowany fosforanami (DPBS) 1xGibco14190-144500 mL
21 GIgła BD PrecisionGlide305167100 igieł
Ściągacz do mikropipetSutter Instrumentmodel P-87
Mikromanipulator Instrument Suttera  Zestaw do sekwencjonowania MP-285
: Zestaw SMARTer Ultra Low RNA do sekwencjonowania IlluminaClontech634936100 rnxs, w tym oligonukleotyd Advantage2PCR Kit
(12 i mikro; M): Oligonukleotyd SMARTer IIA (12 &mikro; m)Z zestawu SMARTer 
Odwrotna transkryptaza (100 jednostek)Odwrotna transkryptazaSMARTcribe z zestawu SMARTer 
Podkład 13' Podkład CDSIIa Z zestawu SMARTer Kit
Primer 2IS StarterZ zestawu SMARTer Kit
50x 2 mieszanina polimeraz50x Mieszanka polimerazZ zestawu SMARTer
10x bufor PCR10x BuforAdvantage 2 Z zestawu SMARTer
Kolce RNA Stojak chłodzącyThermoFisher4456740
PCRIsoFreeze PCR
Zestaw do przygotowania próbki DNA (Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 próbki
PCR master mixNextera PCR master mix (NPM)Z zestawu Nextera 
Koktajl starterowy PCR (PPC) Koktajl starterowy Nextera PCR (PPC) Z zestawu Nextera
FluorometrZestaw Qubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzerAgilent5067-4626110 rxns
System elektroforezy Bioanalizator Agilent 2100.G2938C
Koraliki magnetyczne: Agencourt AMPure Beckman CoulterA638805 ml
Chusteczka do usuwania RNA: Chusteczki RNAse ZapAmbionAM9786Rozmiar 100 arkuszy
Zestaw testowy Qubit ds HSSondy molekularne Q32854500 testy
Zestaw do ekstrakcji żelu: Zestaw do ekstrakcji żelu QiaquickQiagen 28704
Szklana rurka kapilarna(Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm średn.)
MicroforgeNarishige (lub odpowiednik) 
SekwencerInstrument Illumina HiSeq
GENSAT hydroksylaza tyrozynowa-eGFP szczep myszy Numer seryjny MMRRC: 000292-UNCStock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Regionalne Centrum Badawcze Mutant Mouse
LS003126wodnawilgotności 5% o wysokiej jakości PCR Advantage 2 do PCR Stojak chłodzący

Bibliografia

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja pojedynczych komórekkultury brzusznej części śródmózgowiaizolacja komórekmikroskopia fluorescencyjnasynteza cDNAanaliza ekspresji genów
Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.