Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Podsumowanie

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Streszczenie

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. Mikroskopia fluorescencyjna jest niezastąpionym narzędziem do bezpośredniej oceny struktury i funkcji mitochondriów w żywych komórkach oraz do badania zależności struktura-funkcja mitochondriów, która jest przede wszystkim modulowana przez cząsteczki rządzące rozszczepieniem i fuzją między mitochondriami. W pracy opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych, jak i utrwalonych tkankach w organizmie modelowym Drosophila melanogaster. Tkanką z wyboru jest tutaj jajnik Drosophila, który można wyizolować i poddać działaniu mikroskopii konfokalnej ex vivo na żywo. Ponadto w artykule opisano, jak genetycznie manipulować białkiem rozszczepienia mitochondriów, Drp1, w jajnikach Drosophila w celu zbadania udziału rozszczepienia mitochondriów napędzanego przez Drp1 w modulowaniu relacji struktura-funkcja mitochondriów. Szerokie zastosowanie takich metod znajduje odzwierciedlenie w już opublikowanych, a także w nowych danych. Opisane metody można dalej rozszerzyć w celu zrozumienia bezpośredniego wpływu składników odżywczych i/lub czynników wzrostu na właściwości mitochondriów ex vivo. Biorąc pod uwagę, że dysregulacja mitochondriów leży u podstaw etiologii różnych chorób, oczekuje się, że opisane innowacyjne metody opracowane w genetycznie podatnym organizmie modelowym, Drosophila, znacząco przyczynią się do zrozumienia mechanistycznych szczegółów relacji między strukturą a funkcją mitochondriów oraz do opracowania strategii terapeutycznych ukierunkowanych na mitochondria.

Wprowadzenie

Mitochondria są klasycznie opisywane jako komórkowa elektrownia, ponieważ są głównymi miejscami produkcji energii w zróżnicowanych komórkach. Ponadto mitochondria odgrywają kluczową rolę w metabolizmie, wytwarzaniu ciepła, modyfikacji lipidów, homeostazie wapnia i redoks, orkiestracji procesów sygnalizacji komórkowej itp^. Mitochondria odgrywają również aktywną rolę w indukcji śmierci komórki², a także w regulacji cyklu komórkowego³. Taka wielofunkcyjność rodzi następujące fundamentalne pytania: a) w jaki sposób mitochondria wykonują wszystkie te funkcje jednocześnie i b) czy istnieją określone pule lub podstrefy mitochondrialne, które są wyspecjalizowane dla różnych funkcji? W tym kontekście ważne jest, aby zauważyć, że wielofunkcyjne mitochondria są dynamiczne pod względem kształtu, wielkości i struktury w poszczególnych komórkach oraz że kształt mitochondriów w stanie ustalonym może się różnić w zależności od typu komórki. Dziesięciolecia badań z różnych laboratoriów sugerują, że zmiana kształtu, rozmiaru i struktury mitochondriów, zwana zbiorczo dynamiką mitochondriów, ma kluczowe znaczenie dla utrzymania różnych funkcji mitochondriów^4,5,6_. Odkrycia te wskazują na możliwość, że mitochondria mogą osiągać swoją wielofunkcyjność dzięki swojej dynamice strukturalnej.

Trwają intensywne wysiłki mające na celu zrozumienie zależności między strukturą a funkcją mitochondriów. Dynamika struktury mitochondriów jest utrzymywana przede wszystkim przez ich zdolność do ulegania ze sobą rozszczepieniu i fuzji. Rozszczepienie dużych mitochondriów przekształca je w mniejsze elementy mitochondrialne, podczas gdy fuzja między dwoma mniejszymi mitochondriami łączy je w większy element mitochondrialny⁷. Co więcej, może dojść do przejściowego zespolenia dwóch mitochondriów, aby umożliwić mieszanie ich zawartości. Zdarzenia rozszczepienia i fuzji wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej są starannie regulowane przez określone zestawy białek. Podstawowa maszyneria rozszczepienia składa się z białka związanego z dynaminą 1 (Drp1), które jest rekrutowane z cytozolu do mitochondriów poprzez interakcję z niektórymi białkami mitochondrialnymi w dobrej wierze (np. Fis1 lub Mff1), podczas gdy funkcja Drp1 może być również regulowana przez inne białka na powierzchni mitochondriów⁴. Chociaż Drp1 działa na błonie zewnętrznej, jego zdolności rozszczepienia wpływają również na błonę wewnętrzną. Orkiestracja rozszczepienia zewnętrznych i wewnętrznych błon mitochondrialnych nie jest dobrze poznana. Z drugiej strony, fuzja błony wewnętrznej jest regulowana w rdzeniu przez aktywność Opa1, podczas gdy mitofuzyny regulują fuzję błony zewnętrznej⁵. Równowaga przeciwdziałających zdarzeń rozszczepienia i fuzji mitochondriów dyktuje kształt mitochondriów w stanie ustalonym. Na przykład zahamowanie rozszczepienia mitochondriów skutkowałoby całkowitą i nieprzeciwstawną fuzją, podczas gdy nadmierna aktywność rozszczepienia mitochondriów skutkowałaby fragmentacją mitochondriów³.

Badanie relacji między strukturą a funkcją mitochondriów obejmuje przede wszystkim dwa uzupełniające się podejścia: a) analizy fenotypów komórkowych i organizmów po manipulacji genetycznej mitochondrialnych białek rozszczepienia/fuzji oraz b) bezpośrednie oceny struktury i funkcji mitochondriów. Warto zauważyć, że analizy genetyczne nie zawsze mogą ujawnić bezpośrednią funkcjonalność danej cząsteczki (w tym przypadku białek rozszczepienia/fuzji mitochondriów), ponieważ fenotypy mogą powstać w wyniku efektów wtórnych. Dlatego niezwykle ważne jest opracowanie i wykorzystanie narzędzi do bezpośredniego badania struktury i funkcji mitochondriów. Każda ocena struktury mitochondriów wymaga różnych narzędzi mikroskopowych. Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek znacznie posunęło naprzód badania dynamiki mitochondriów, ponieważ dynamikę mitochondriów można monitorować zarówno jakościowo, jak i ilościowo przy użyciu odpowiednich narzędzi i technik mikroskopii fluorescencyjnej⁸. Narzędzia oparte na mikroskopii fluorescencyjnej zostały opracowane w celu zbadania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych tkankach Drosophila melanogaster, wyjaśniając znaczenie dynamiki mitochondriów in vivo⁹. Te i pokrewne metody opisano tutaj, a ich celem jest zbadanie struktury i funkcji mitochondriów w jajniku Drosophila.

Jajnik Drosophila składa się z linii zarodkowej i linii somatycznej, które wywodzą się z odpowiednich dorosłych komórek macierzystych rezydujących w germarium^10,11. Szesnaście syncytialnych komórek rozrodczych (GC) zostaje otoczonych przez somatyczne komórki pęcherzykowe (FC), tworząc indywidualne komory jajowe, które wyłaniają się z zarodka (ryc. 1). Jedna z 16 GC zostaje zaangażowana, aby stać się oocytem, a pozostałe 15 GC przekształca się w komórki pielęgniarskie, które wspierają wzrost komory oocytowej, ułatwiając dojrzewanie komórki jajowej przed jej złożeniem. Większość FC przechodzi 9 rund podziałów mitotycznych przed wyjściem z mitotycznego cyklu komórkowego, aby ostatecznie różnicować się w wzorzystą warstwę komórek nabłonka składającą się z komórek pęcherzyków przednich (AFC), tylnych komórek pęcherzykowych (PFC) i komórek głównego ciała (MBC). Kolejne komory jajowe są połączone komórkami łodygowymi, które są zróżnicowanymi komórkami, które również pochodzą z FC we wczesnym okresie rozwoju. Kształt mitochondriów regulowany przez białko rozszczepienia mitochondriów Drp1 bierze czynny udział w procesie różnicowania podczas prawidłowego rozwoju warstwy FC jajnika Drosophila ^9,12. Metody stosowane w tych badaniach w celu identyfikacji udziału Drp1 w rozwoju warstwy komórek pęcherzykowych Drosophila opisano tutaj.

Protokół

1. Przygotowanie Drosophila (wymagane narzędzia są przedstawione na rysunku 2A)

1. W każdym z opisanych eksperymentów należy zebrać Drosophila (utrzymywane w temperaturze pokojowej lub 25 ºC) w ciągu 5 dni od zaniku i umieścić je w fiolce wypełnionej 5 - 7 ml pokarmu Drosophila (patrz Tabela Materiałów), z nie więcej niż 25 muchami w każdej fiolce; utrzymuj stosunek samic do samców 2:1.
2. Posyp niewielką ilością drożdży granulowanych, aby pobudzić produkcję jaj Drosophila. Wykonaj eksperymentalną manipulację w ciągu 2 - 4 dni.

2. Sekcja jajników Drosophila (wymagane narzędzia są przedstawione na rysunku 2A)

1. Ciepłe podłoże do badania owadów (patrz tabela materiałów) do temperatury pokojowej, 25 °C. Napełnić trzy dołki ośmiodołkowego szklanego naczynia preparacyjnego 200 μl pożywki w każdym dołku.
2. Znieczulić Drosophila _CO2, umieszczając igłę pistoletu do przedmuchiwania pod zatyczką fiolki. Umieść je na podkładce muchowej. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego posortuj 5 samic i umieść je w pierwszym dołku naczynia preparacyjnego. Dotykaj jednej Drosophila na raz podczas wykonywania mikroskopii na żywo.
3. Patrząc przez okular mikroskopu preparacyjnego, odetnij klatkę piersiową od brzucha za pomocą dwóch par kleszczy. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś brzuchy do drugiej studzienki naczynia.
4. Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać brzuch na tylnym końcu i powoli wypchnij jajniki (wraz z drugą zawartością brzuszną) drugą parą kleszczy. Jeśli ta próba się nie powiedzie, ostrożnie usuń egzoszkielet brzuszny, wkładając kleszcze do przedniego końca, aby uwolnić jajniki.
5. Za pomocą kleszczy przytrzymaj pojedynczy jajnik za nieprzezroczysty tylny koniec (tj. wypełnione żółtkiem, jaja w późnym stadium) i ostrożnie przenieś go do trzeciego dołka naczynia w celu drażnienia w celu przetworzenia go pod mikroskopem na żywo (krok 3) lub do utrwalenia w celu przeprowadzenia barwienia immunologicznego (krok 7).
6. Ostrożnie drażnij osłonkę ochronną wokół jajników, lekko przesuwając igłę drażniącą od tylnego do przedniego końca każdego jajnika, jednocześnie trzymając ją za tylny koniec parą kleszczy.
   nuta: Aby zminimalizować uszkodzenia podczas drażnienia, zegnij końcówkę igły i powiększ każdy jajnik, zwiększając powiększenie mikroskopu (ryc. 2A). Dokuczanie powinno być wystarczająco skuteczne, aby złamać osłonkę, ale powinno być również wykonane ostrożnie, aby zachować integralność jajników.

3. Przygotowanie do mikroskopii żywych tkanek

UWAGA: Wymagane narzędzia są przedstawione na rysunku 2A.

1. Przed sekcją Drosophila przygotuj komory pokryte poliL-lizyną. W tym celu umieścić dwie krople poliL-lizyny (0,1 mg/ml) o pojemności 20 μl na szkle nakrywkowym (14 mm, nr 0) płytki Petriego ze szklanym dnem (35 mm) w rozsądnej odległości od siebie, aby zapobiec łączeniu się kropli. Płytki suszyć na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze 37 ºC i zaznaczyć krawędzie białej folii poliL-lizyny na spodniej stronie płytki ścieralnym markerem.
   nuta: Komory pokryte poliL-lizyną mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez tydzień. Jeśli używasz wcześniej pokrytej komory, doprowadź ją do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem sekcji Drosophila.
2. Ustaw parametry skanowania w mikroskopie konfokalnym, aby upewnić się, że próbka może zostać zobrazowana natychmiast po zakończeniu sekcji i montażu, jak poniżej.
3. Umieścić jeden wycięty i wycięty jajnik (zgodnie z krokiem 2 i zabarwiony, jeśli to konieczne, zgodnie z krokiem 5) na zaznaczonym obszarze pokrytym poliL-lizyną i rozprowadzić jajnik za pomocą igły do drażnienia, aby oddzielić jajniki. Umieść 10 μl kropli pożywki preparacyjnej na owadzie na wierzchu jajnika, upewniając się, że pokryłeś cały obszar pokryty poliL-lizyną. Przykryj szalkę Petriego.
4. Natychmiast wykonać mikroskopię konfokalną zamontowanej próbki w temperaturze pokojowej.
   nuta: Tylko jedna Drosophila powinna być preparowana, przetwarzana i obrazowana na raz. Nie należy również wykonywać mikroskopii w temperaturze 37 °C, która będzie naśladować środowisko szoku cieplnego dla tkanki Drosophila.

4. Test utraty fluorescencji w teście fotowybielania (FLIP) do oceny ciągłości macierzy mitochondrialnej

UWAGA: Ciągłość macierzy mitochondrialnej w połączonej strukturze mitochondrialnej jest ustalana po całkowitym połączeniu wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej, po przejściu przez etapy pośrednie. Rozszczepienie mitochondriów może przebiegać w tych samych etapach, ale w odwrotnym kierunku (ryc. 3A). FLIP to półilościowa metoda oparta na mikroskopii poklatkowej, którą można wykorzystać do oceny ciągłości macierzy mitochondrialnej w końcowym stanie zespolenia mitochondriów ex vivo (kroki 3 i 4 na rysunku 3A) w żywych jajnikach Drosophila ⁹. Test FLIP jest wykonywany jako mały obszar zainteresowania (ROI) mitochondriów wyrażający cząsteczkę fluorescencyjną w macierzy mitochondrialnej, która jest fotowybielana w regularnych odstępach czasu (FLIP ROI na rysunku 3A). W rezultacie, każdy otaczający region mitochondrialny, który jest ciągły z FLIP ROI (eksperymentalny ROI na rysunku 3A), straci sygnał z powodu wymiany cząsteczek w ciągłej macierzy mitochondrialnej. Przedstawione tutaj eksperymenty FLIP są przeprowadzane na transgenicznej Drosophila eksprymującej mitoYFP, która zawiera mitochondrialną sekwencję celującą ludzkiej podjednostki oksydazy cytochromowej VIII oznaczonej YFP w celu skierowania jej do macierzy mitochondrialnej w swobodnie dyfuzyjnej formie. Podobny eksperyment można również przeprowadzić z transgenem mito pUASP-mito-GFP, o czym informowano wcześniej⁹. Podobny protokół FLIP może być stosowany z sondą skierowaną do mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, aby móc wykryć ciągłość wynikającą z fuzji zewnętrznych, ale nie wewnętrznych błon mitochondrialnych (krok 2 na rysunku 3A).

1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu w mikroskopie konfokalnym i ustaw odpowiednie parametry skanowania w zakładce "Akwizycja" (Tabela 1). Zaznacz pola "Szeregi czasowe", "Wybielanie" i "Regiony", aby otworzyć poszczególne karty. Umieść odpowiednie wartości parametrów akwizycji w każdej zakładce (Tabela 1).
   nuta: Otwór powinien pozostać otwarty, ponieważ ten eksperyment ma na celu monitorowanie ogólnego sygnału z całej populacji mitochondrialnej w poszczególnych komórkach.
2. Użyj okularu, aby szybko zlokalizować pole zainteresowania w zamontowanej żywej tkance.
   nuta: Wybierz jajniki, które są dobrze rozprowadzone na naczyniu ze szklanym dnem, ponieważ mikroskopii konfokalnej nie można wykonać na pływających jajnikach.
3. Kliknij "na żywo", aby uzyskać obraz na żywo wybranego pola zainteresowań. Kliknij "zatrzymaj", aby zatrzymać skanowanie na żywo.
4. W razie potrzeby dostosuj parametry akwizycji tak, aby wykryty sygnał fluorescencyjny był poniżej poziomów nasycenia (wskazywanego przez brak czerwonych pikseli, gdy zaznaczona jest opcja "wskaźnik zasięgu"), ze zdefiniowanym tłem ustawionym przez regulację wartości przesunięcia.
5. Narysuj mały zwrot z inwestycji za pomocą narzędzia do rysowania Beziera z zakładki "Regiony", aby wyznaczyć strefę fotowybielania na obrazie uzyskanym przez skanowanie na żywo.
   nuta: Wielkość ROI powinna wynosić około 20 - 50% całkowitego fluorescencyjnego sygnału mitochondrialnego w komórce.
6. Wykonaj akwizycję obrazu, klikając "rozpocznij eksperyment".
7. Określ ilościowo intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania zastrzeżonego lub otwartego (patrz tabela materiałów). Zapisz średni sygnał z ROI, w którym ukierunkowane jest powtarzalne wybielanie (FLIP); ROI, w przypadku gdy wybielanie nie zostało przeprowadzone w tej samej komórce (eksperymentalne); zwrot z inwestycji z innej niebielonej komórki w tym samym polu widzenia, w celu oceny ogólnego bielenia w okresie eksperymentalnym (bielenie); i ROI w obszarze tła (Tło). Odejmij średni uzyskany sygnał tła od średniego sygnału w innych ROI. Znormalizuj sygnał fluorescencyjny początkowym sygnałem przed wybielaniem dla odpowiedniej komórki.
8. Wykreśl znormalizowane dane przy użyciu dowolnego standardowego oprogramowania do kreślenia.

5. Barwienie na żywo fluorescencyjnymi barwnikami mitochondrialnymi

UWAGA: Struktura i potencjał mitochondriów w stanie ustalonym mogą być oceniane za pomocą barwników, które specyficznie włączają się do mitochondriów w żywych komórkach i tkankach. Żywe jajniki Drosophila można barwić ex vivo fluorescencyjnymi barwnikami mitochondrialnymi w celu wizualizacji mitochondriów, oceny produkcji mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (mito-ROS) oraz oceny potencjału mitochondriów na jednostkę masy. Można to osiągnąć poprzez współbarwienie za pomocą mitochondrialnego barwnika potencjometrycznego estru etylowego tetrametylorodaminy (TMRE) i kompatybilnego żywego barwnika mitochondrialnego reprezentującego masę mitochondrialną (patrz Tabela materiałów dla określonych barwników).

1. Rozcieńczyć zapas plam w ciepłym podłożu preparacyjnym dla owadów do końcowych stężeń roboczych: barwienie mitochondrialne, 250 nM; TMRE, 50 nM; i barwienie mito-ROS, 5 μM.
2. Po rozbiorze i oczyszczeniu jajników zgodnie z krokiem 2, umieść jajniki w 200 μl dowolnego roztworu barwiącego w studzience naczynia rozwarstwiającego. Inkubuj je przez 10 minut z naczyniem przykrytym odpowiednim pudełkiem owiniętym folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Umyj poplamione jajniki, przesuwając je ostrożnie kleszczami do 3 kolejnych studzienek zawierających pożywkę bez plamy.
3. W przypadku barwienia za pomocą TMRE i zgodnego ogólnego barwienia mitochondrialnego, postępuj zgodnie z powyższym protokołem, aby najpierw zabarwić za pomocą TMRE, a następnie natychmiast za pomocą ogólnego barwienia mitochondrialnego (bez żadnych etapów prania pomiędzy nimi).
4. Zamontuj jajniki na naczyniu ze szklanym dnem pokrytym poliL-lizyną zgodnie z krokiem 3 i przygotuj się do mikroskopii konfokalnej z odpowiednimi parametrami skanowania (Tabela 1), wykonując kroki 4.2-4.4.
   nuta: Sygnał z włączonych barwników nie trwał długo podczas próby zamontowania barwionych próbek w podłożu montażowym.
5. Zaznacz pole Przekrój Z, aby otworzyć kartę. Obróć pokrętło ostrości w kierunku dolnej części próbki podczas skanowania na żywo i kliknij "ustaw najpierw", aby zdefiniować najniższy przekrój Z. Zrób to samo, przesuwając pokrętło ostrości w przeciwnym kierunku, aby zdefiniować najwyższą sekcję.
6. Wykonaj akwizycję obrazu, klikając "rozpocznij eksperyment".
7. Określ ilościowo intensywność fluorescencji z korekcją tła na podstawie ROI dla sygnału tła i poszczególnych komórek (jak w kroku 4.7) i wykreśl dane za pomocą dowolnego oprogramowania do kreślenia.

6. Generacja Drp1 Null Mosaics

UWAGA: Strategia klonalna użyta tutaj wprowadza zerowe klony Drp1 z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) ujemnym na tle GFP-dodatniego, fenotypowo dzikiego tła, które jest genotypowo heterozygotyczne dla mutacji zerowej Drp1⁹. Rekombinacja mitotyczna za pośrednictwem celu rozpoznawania flflippazy-flippazy indukowanej szokiem cieplnym (FLP-FRT) tworzy homozygotyczne klony funkcjonalnie zerowego allelu drpKG03815. Genotyp Drosophila będący nosicielem mutanta Drp1 to drpKG03815 FRT40A/CYO, natomiast genotyp przenoszący FLP wywołany szokiem cieplnym (hsFLP) i marker klonalny UbiGFP to hsflp; ubikwityna nls-GFP (UbiGFP) FRT 40A/CyO. Genotyp wybranego potomstwa ze skrzyżowania powyższych genotypów to hsFLP/+; drpKG03815 powiedział:FRT40A/UbiGFPFRT40A.

1. Zsynchronizuj Drosophila do pobrania z pierwszego tłoczenia, przenosząc je do nowych fiolek ze świeżą karmą co 2 do 3 dni. Codziennie monitoruj fiolki do przepoczwarzania w celu zebrania pojawiających się dziewiczych samic.
2. Zbieraj czerwonookie, dziewicze samice o kędzierzawych skrzydłach ze zmutowanego genotypu Drp1 codziennie, raz rano i raz wieczorem, i umieść je w osobnej fiolce. Równolegle zbieraj samce Drosophila o ciemnoczerwonych oczach i prostych skrzydłach przenoszące hsflp i UbiGFP w ciągu 5 dni od eclosion.
3. Ustaw krzyż, dodając samce do dziewiczych samic ze stosunkiem samic do samców wynoszącym 2:1.
4. Posyp niewielką ilością drożdży granulowanych, aby pobudzić produkcję jaj.
   nuta: Ostrożnie przenoś Drosophila do świeżej fiolki z pożywką co 2 do 3 dni, aby zwiększyć ilość potomstwa i zmniejszyć stłoczenie fiolki.
5. Znieczulij, posortuj i zbierz potomstwo samic o prostych skrzydłach, czerwonych oczach w ciągu 5 dni od ekleksji.
6. W przypadku szoku cieplnego umieść zebrane Drosophila w pustych fiolkach z niewielką ilością granulowanych drożdży i małą, miękką chusteczką (w celu wchłonięcia wilgoci podczas szoku cieplnego). Umieścić fiolkę z Drosophila w łaźni wodnej w temperaturze 38 ºC na 1 godzinę, aby wytworzyć głównie klony komórek pęcherzykowych, i w temperaturze 37 ºC przez 1 godzinę dwa razy dziennie (pozostawiając co najmniej 5 godzin między 2 szokami cieplnymi) przez 2 kolejne dni, aby wytworzyć zarówno klony linii zarodkowej, jak i komórek pęcherzykowych.
   nuta: Upewnij się, że fiolka jest całkowicie zanurzona w wodzie do poziomu korka.
7. Szok cieplny może sprawić, że Drosophila będzie unieruchomiona. Pozwól zszokowanej cieplnie Drosophila dojść do siebie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, gdy ponownie staną się mobilne.
8. Dodać samce z powrotem do samic w tej samej proporcji co w krzyżówce i przenieść je do świeżych fiolek z podłożem posypanych niewielką ilością drożdży granulowanych. Utrzymuj Drosophila przez co najmniej 5 dni.
9. Wypreparuj jajniki w razie potrzeby do żywego lub ustalonego eksperymentu.
   nuta: Jajniki wyizolowane od rodzicielskiej Drosophila wykazującej ekspresję UbiGFP powinny być stosowane jako kontrola ujemna w celu potwierdzenia skutecznej indukcji klonów GFP-ujemnych przez szok cieplny.

7. Barwienie koimmunologiczne dla cykliny E i mitochondriów

UWAGA: Aby wykryć Drosophila Cyclin E (dCyclinE), użyliśmy komercyjnie uzyskanego przeciwciała wyhodowanego specjalnie przeciwko dCyklinE⁹ (zobacz Tabelę Materiałów). Jako marker mitochondrialny użyliśmy przeciwciała przeciwko ATP-B (podjednostce mitochondrialnego kompleksu syntazy ATP)⁹.

1. Podgrzej 4% paraformaldehydu (PFA) do temperatury pokojowej, 25 °C. Uwaga! Paraformaldehyd jest toksyczny.
   nuta: Po otwarciu ampułki PFA należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 7 dni. Dzieje się tak, ponieważ przechowywanie PFA może pozwolić na utlenianie do metanolu, który radykalnie zmieniłby błony mitochondrialne podczas wiązania, nawet jeśli jest obecny w śladowych ilościach.
2. Natychmiast po rozbiorze należy naprawić wypreparowane jajniki, umieszczając je w 200 μl świeżego PFA w studzience szklanego naczynia preparacyjnego (bez drażnienia). Przechowywać naczynie w dygestorium przez 15 minut. Umyj utrwalone jajniki, przesuwając je ostrożnie kleszczami do 3 kolejnych studzienek, z których każda zawiera 200 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   nuta: W tym miejscu eksperyment można przerwać, a próbki pozostawić w temperaturze 4 ºC na 1 dzień.
3. Dokładniej drażnić jajniki w PBS (podobnie jak w kroku 2.6), aby ostrożnie usunąć ochronną włóknistą osłonkę, która może utrudniać dostęp przeciwciała do antygenu.
4. Udrażnione jajniki należy ukrwić, umieszczając je w probówce z mikrofugą zawierającą 500 μl świeżo przygotowanego 0,5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) i inkubować przez 30 minut, kołysząc się z prędkością 25 obr.
   nuta: Podczas kołysania ułóż rurki równolegle do ruchu kołysania; Umieszczenie ich prostopadle może pozwolić na przyklejenie się tkanki do nasadki rurek, powodując w ten sposób utratę tkanki.
5. Aby wyjąć PBS-TX, umieść probówki do mikrofuge w stojaku, aby chusteczka mogła osiąść na dnie probówek. Sprawdź je wizualnie i w razie potrzeby postukaj w rurki, aby sprowadzić unoszące się chusteczki na dno. Ostrożnie zassać roztwór od góry, upewniając się, że tkanka na dnie probówek pozostaje nienaruszona.
6. Zablokować jajniki, dodając 200 μl 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczonej w 0,5% PBS-TX i inkubować ją na bujaczku w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Usunąć środek blokujący, wykonując krok 7.5.
7. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe w 200 μl świeżego środka blokującego: przeciwciało anty-królicze dCyklinE (1:100) i przeciwciało anty-mysie ATP-B (1:100). Inkubuj tkanki na bujaczku przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
8. Przemyj jajniki PBS-TX 3 razy po 15 minut, postępując zgodnie z krokiem 7.5.
9. Dodać 200 μl odpowiednich przeciwciał drugorzędowych do świeżego PBS-TX: anty-myszy-CY3 (1:1,000) i anty-królików-CY5 (1:500). Inkubować na bujaczku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Przemyj jajniki PBS-TX 3 razy po 15 minut, postępując zgodnie z krokiem 7.5.
11. Aby wybarwić DNA, dodaj Hoechst (rozcieńczenie 1:1,000) do końcowego płukania PBS-TX.
12. Na koniec pozostaw tkankę w 500 μl 1x PBS.
13. Za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml usunąć wybarwione immunologicznie jajniki z probówki do mikrofuge do świeżego dołka szklanego naczynia preparacyjnego zawierającego 200 μl PBS.
14. Dodać jedną kroplę pożywki montażowej na bazie glicerolu do szkiełka podstawowego i dodawać jajniki wybarwione immunologicznie jeden po drugim do podłoża mocującego.
    nuta: Upewnij się, że jajniki są rzeczywiście przeniesione do podłoża mocującego. Niezastosowanie się do tego doprowadzi do utraty tkanki.
15. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, delikatnie wyrwij przezroczyste jajniki (młodsze stadia) z nieprzezroczystych komór dojrzałych jaj za pomocą igły do drażnienia, jednocześnie przytrzymując nieprzezroczystą część jajnika kleszczami. Wyjmij komory dojrzałych jaj z podłoża montażowego.
16. Umieść szkiełko nakrywkowe (22 mm, nr 1) na szkiełku podstawowym i lekko dociśnij, aby upewnić się, że podłoże montażowe jest równomiernie rozprowadzone pod spodem.
    nuta: Dociśnięcie szkła nakrywkowego zapewnia również prawidłowe ułożenie tkanki wzdłuż szkła nakrywkowego. Niewykonanie tego w sposób optymalny może spowodować, że mniejsze stadia będą unosić się w podłożu mocującym, uniemożliwiając optymalną mikroskopię tych tkanek.
17. Próbki należy suszyć na powietrzu przez 15 minut i starannie uszczelnić krawędzie szkła nakrywkowego lakierem do paznokci.
18. Wykonać mikroskopię konfokalną zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi (Tabela 1).

Wyniki

Opisane metody mogą być używane do badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila (Rysunek 2B). Podano kilka przykładów przewidywanych wyników uzyskanych opisanymi metodami.

Rozwarstwienie jajnika Drosophila: Po dalszym rozbiorze, odcięte odwłoki (Ryc. 3B) od całej Drosophila (Ryc. 3A) powinny uwolnić zawar...

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Fotowybielanie: Zapobieganie nadmiernemu fotowybielaniu próbek fluorescencyjnych jest absolutnie niezbędne do przeprowadzenia skutecznej mikroskopii konfokalnej. W związku z tym czas potrzebny na zlokalizowanie próbek przez okular lub ustawienie parametrów akwizycji obrazu w trybie skanowania na żywo powinien być zminimalizowany, aby zminimalizować fotowybielanie.

Uszkodzenie tkanek: Ponieważ mitochondria są ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Grace's Media (medium do preparowania owadów)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyd AQ	Mikroskopia elektroniczna Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (ogólne barwienie mitochondriów)	Life Technologies	m7514	Rekonstytucja i podajenie
nadchloranu estru etylowego tetrametylorodaminy	Sigma Aldrich	87917-25MG	Rekonstytucja i podwielokrotnienie
MitoSox (barwienie Mito-Ros)	Life Technologies	m36008	Rekonstytucja i podwielokrotnienie
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fiolki na muchy	Fisher Scientific	AS-515
Stożkowe muchy	Fisher Scientific	AS-355
Fiolka muchowa Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Pokarm Drosophila (pokarm Drosophila)	Fisher Scientific	AS153
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma Aldrich	A9647-50G
Przeciwciało cykliny E (d-300)	Przeciwciało Santa Cruz	sc-33748
ATPB [3D5] - Marker mitochondrialny	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Szkiełka
Azer Scientific EverMark Select	Fisher Scientific	22-026-252
Szklana osłona mikroskopu	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp  Naczynie Mircrowell ze szklanym dnem	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Aktywne suszone drożdże	Fisher Scientific ICN10140001
Kleszcze	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Fine	Science Technologies	11251-20
Niklowany uchwyt na szpilki Moria	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly	Pad Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Igła do dmuchawki	Flystuff	54-119
Mikroskop preparacyjny	Carl Zeiss	Stemi 2000
Oprogramowanie do analiz	Carl Zeiss	Zen
Oprogramowanie analityczne	Open source	Image J
Research Mikroskop Macro Zoom	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Chłodzony aparat cyfrowy, 12-bitowy, mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging