Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Summary

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Abstract

Molekularne mechanizmy synaptyczne leżące u podstaw słuchowego uczenia się i pamięci pozostają w dużej mierze nieznane. W tym miejscu opisano przebieg badania proteomicznego dotyczącego uczenia się dyskryminacji słuchowej u myszy. W tym paradygmacie uczenia się, myszy są szkolone w zadaniu Go / NoGo w celu rozróżniania między rosnącymi i opadającymi tonami modulowanymi częstotliwością, aby uniknąć łagodnego wstrząsu elektrycznego stopą. Protokół polega na wzbogaceniu synaptosomów z czterech obszarów mózgu, a mianowicie kory słuchowej, kory czołowej, hipokampa i prążkowia, na różnych etapach treningu. Wzorce ekspresji białek synaptycznych uzyskane od wyszkolonych myszy są porównywane z naiwnymi kontrolami przy użyciu podejścia proteomicznego. Aby osiągnąć wystarczającą głębokość analityczną, próbki są frakcjonowane na trzy różne sposoby przed spektrometrią mas, a mianowicie trawienie 1D SDS-PAGE/w żelu, trawienie w roztworze i wzbogacanie fosfopeptydów.

Analiza proteomiczna o wysokiej rozdzielczości na spektrometrze masowym i kwantyfikacja bez znaczników są używane do badania profili białek synaptycznych we frakcjach zubożonych w fosfopeptydy i wzbogaconych w fosfopeptydy próbek białek synaptosomalnych. Komercyjny pakiet oprogramowania jest wykorzystywany do ujawniania białek i fosfopeptydów o znacznie regulowanych względnych poziomach obfitości synaptycznej (wyszkolone/naiwne kontrole). Zaobserwowano wspólne i zróżnicowane tryby regulacji proteomu synaptycznego w badanych obszarach mózgu myszy po treningu. Następnie stosuje się metaanalizy z wykorzystaniem kilku baz danych w celu zidentyfikowania podstawowych funkcji komórkowych i szlaków biologicznych.

Introduction

Uczenie się opiera się na tworzeniu śladów pamięciowych i ich utrzymywaniu. Powszechnie przyjmuje się, że jeden z podstawowych mechanizmów może reprezentować zależne od aktywności tworzenie nowych i/lub rearanżacji istniejących kontaktów synaptycznych między neuronami. Na poziomie molekularnym opisano różne modyfikacje białek, relokacje subkomórkowe i zmiany w obrocie białek synaptycznych^1-4 (Lamprecht, 2004 #8). Jednak większość dotychczasowych badań koncentrowała się na wybranych białkach, a nie na globalnym, ale złożonym składzie proteomu synaptycznego. Obecne podejście pozwala na bezstronne badanie przesiewowe pod kątem zmian proteomu synaptycznego w regionach mózgu myszy po eksperymencie edukacyjnym. Nadaje się do renderowania zależnych od punktu czasowego molekularnych migawek indukowanej uczeniem się reorganizacji architektury synaptycznej. Opisany przebieg pracy wymaga szczególnej pracy zespołowej różnych specjalistów w zakresie zachowania zwierząt, biochemii białek, spektrometrii mas i bioinformatyki.

Wybrany paradygmat uczenia się, tj. dyskryminacja tonów modulowana częstotliwościowo (FMTD), jest dobrze scharakteryzowanym zadaniem dyskryminacji słuchowej u gryzoni⁵. Uczenie się i tworzenie pamięci długotrwałej w tym zadaniu Go/No-Go obejmuje mechanizmy zależne od zwiększonej sygnalizacji korowej dopaminy i syntezy białek. W związku z tym ostatnie badania proteomiczne na myszoskoczkach i myszach ujawniły wywołane dopaminą i uczeniem się plastyczne rearanżacje składników synaptycznych w korze mózgowej, ale także w bardziej podstawowych obszarach mózgu, które rzekomo oddziałują podczas uczenia się i pamięci FMTD^6-8. Ilustruje to, że tworzenie pamięci obejmuje złożoną interakcję różnych regionów mózgu, a zatem może być różnie regulowane w tych regionach na poziomie proteomu. W związku z tym w procesie pracy uwzględniana jest sekcja wybranych obszarów mózgu myszy w korze korowej i podkorowej.

Ponadto, rzetelna charakterystyka nawet słabych zmian w składzie białek synaptycznych wymaga wzbogacenia przedziałów pre- i postsynaptycznych, a nie analizy homogenatów lub surowych frakcji błonowych⁹. W związku z tym opisano przygotowanie synaptosomów z wykorzystaniem ustalonych protokołów przed analizą proteomiczną w celu zwiększenia poziomu wykrywania i zakresu dynamicznego dla białek specyficznych dla synaps^10,11.

Podstawowym warunkiem koniecznym do korzystania z bezznacznikowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do celów ilościowych jest wysoki stopień podobieństwa próbek białek. Ponieważ oczekuje się, że po nauczeniu się wystąpią raczej niewielkie zmiany w składzie białek synaptycznych, odpowiednie będzie podejście bezznacznikowe do porównania odpowiednich próbek białek uzyskanych od wyszkolonych i niedoświadczonych myszy. Alternatywnie, strategie znakowania białek/peptydów w zależności od stanu przy użyciu stabilnych izotopów (np. TMT, iTRAQ, ICPL i SILAC), a także kwantyfikacja bez znaczników oparta na MS2 (SWATH) są przydatne, ale są droższe niż wybrane podejście bezznacznikowe lub wymagają specjalnego sprzętu do spektrometrii mas.

Ponieważ badania proteomiczne często dostarczają skomplikowanych zestawów danych, zaleca się przetwarzanie bioinformatyczne dla właściwej interpretacji danych. Dodatkowe metaanalizy mogą pomóc w lepszym zrozumieniu potencjalnych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian związanych z paradygmatem oraz w identyfikacji zaangażowanych kluczowych procesów komórkowych i szlaków sygnałowych. Odpowiednie metodologie są również opisane poniżej.

Protocol

Wszystkie zabiegi z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami niemieckiego prawa federalnego, odpowiednimi rozporządzeniami UE oraz wytycznymi NIH i zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Landesverwaltungsamt Sachsen/Anhalt (42502-2-1102 IfN).

1. Uczenie się słuchowe

1. Nauka dyskryminacji słuchowej w pudełku wahadłowym (paradygmat FMTD) Uwaga: Zawsze noś rękawiczki podczas obsługi myszy.
   1. Trzymaj myszy C57Bl6/J w grupach po trzy lub cztery osoby ze swobodnym dostępem do granulek spożywczych i wody z kranu w przezroczystych klatkach z poliwęglanu. Utrzymuj 12-godzinny cykl światło-ciemność w pomieszczeniu dla zwierząt. Jeśli zwierzęta pochodzą z innego laboratorium lub firmy, należy przeznaczyć na co najmniej tydzień aklimatyzacji i zadomowienia się.
   2. Wykonuj jedną sesję treningową w skrzynce wahadłowej dziennie.
      1. Wyjmij mysz z jej domowej klatki w pomieszczeniu dla zwierząt i umieść ją w słabo oświetlonym pudełku wahadłowym w dźwiękoszczelnej komorze.
      2. Korzystaj z w pełni sterowanego komputerowo harmonogramu nauki do nauki dyskryminacji słuchowej. Rozpocznij od okresu przyzwyczajenia trwającego 3 minuty ciszy, a następnie rozpocznij sesję treningową.
         1. Użyj sekwencji narastającego tonu (4 - 8 kHz, CS+) jako bodźca Go podczas prób Go: Zwierzę musi przekroczyć przeszkodę w ciągu 6 sekund od prezentacji tonu (prawidłowa odpowiedź, uderzenie). Ukaraj chybionego łagodnym wstrząsem stopy o natężeniu 50 - 300 μA, dostarczanym przez podłogę kratową skrzyni wahadłowej.
         2. Użyj sekwencji opadającego tonu (8 - 4 kHz, CS-) jako bodźca No-Go-Trial podczas prób No-Go: Zwierzę musi pozostać w komorze prądu w skrzynce wahadłowej przez 6 sekund prezentacji tonu. Ukarz fałszywy alarm łagodnym wstrząsem nożnym o natężeniu 50 - 300 μA, dostarczanym przez podłogę kratki skrzynki wahadłowej.
      3. Stosuj interwały międzypróbne 20 5 sek.
      4. Wykonaj 30 prób Go i 30 prób No-Go na sesję w pseudorandomizowanej kolejności, tak aby jedna sesja składała się z 60 prób i trwała około 25 minut.
   3. Umieść wyszkolone zwierzę z powrotem w jego domowej klatce w obiekcie dla zwierząt.
2. Rozwarstwienie mózgu
   1. Poddaj zwierzę eutanazji w żądanym momencie po określonej liczbie sesji treningowych z zastosowaniem zwichnięcia szyjki macicy (np. 24 godziny po zakończeniu pierwszej sesji). Odetnij głowę zwierzęciu.
   2. Szybko przeprowadź sekcję mózgu, wykonując następujące czynności: Najpierw przetnij skórę, a następnie czaszkę prostymi nożyczkami wzdłuż strzałki Shutura. Całkowicie usuń części kości, które pokrywają tkankę mózgową za pomocą silnych kleszczy. Wyjmij mózg szpatelką.
   3. W celu przeprowadzenia sekcji umieść mózg na szalce Petriego wypełnionej lodem. Przeanalizuj korę słuchową, korę czołową, prążkowie i hipokamp pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą skalpela i igły.
      1. Zlokalizuj korę słuchową za pomocą wizualnych punktów orientacyjnych na powierzchni mózgu, takich jak naczynia krwionośne i kształt powierzchni (Bregma -2,06 do -3,4, rozmiar rostrocaudal 2 mm, grzbietowo-brzuszny 1,3 mm) i obustronnie rozpreparuj jako prostokątny blok tkankowy o grubości kory.
      2. Przeanalizuj korę czołową jako wycinek mózgu między Bregma 3.56 i 1.54, używając chiasma opticum jako punktu orientacyjnego i wykluczając tkankę z bulbus olfactorius.
      3. Rozkrój prążkowie jako wycinek mózgu między Bregma 1,54 a 0,5 i ostrożnie usuń tkankę korową.
      4. Wypreparuj hipokamp, mocując mózg igłą przez móżdżek i rozwijając korę, zaczynając od płata potylicznego.
   4. Wypreparowane próbki mózgu należy zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie synaptosomów lub alternatywnie frakcji wzbogaconej o gęstość postsynaptyczną (PSD)

UWAGA: Podczas wszystkich procedur należy przechowywać próbki i w temperaturze 0 - 4 °C. zawierają świeżo rozcieńczone koktajle inhibitorów proteazy w celu zapobieżenia proteolitycznej degradacji białek. Jeśli badana jest również fosforylacja białek, należy dodać koktajle inhibitorów fosfatazy. Wszystkie wskazane wartości g są podawane jako g (średnia) w całym protokole.

1. Przygotowanie surowej frakcji membranowej (rysunek 3A)
   1. Przenieś wypreparowaną tkankę mózgową do naczynia homogenizacyjnego zawierającego 1 ml lodowatego buforu A (5 mM HEPES, 320 mM sacharozy, pH 7,4) i homogenizuj tkankę przy 900 obr./min za pomocą 12 uderzeń.
   2. Odwirować próbki o masie 1 000 x g przez 10 minut. Zachować supernatanty.
   3. Ponownie homogenizować granulki w tych samych warunkach w tej samej objętości buforu homogenizacyjnego co poprzednio i ponownie odwirować próbki przy 1 000 x g przez 10 minut. Połączyć odpowiednie supernatanty. Wyrzuć granulki P1, które zawierają głównie jądra i resztki komórek.
   4. Połączone supernatanty wirować przez 20 minut w temperaturze 12 000 x g. Odrzucić supernatanty lub użyć do dalszego frakcjonowania¹¹.
   5. Zawiesić granulki w tej samej objętości bufora homogenizacyjnego, co przed użyciem homogenizatora z 6 suwami przy 900 obr./min i wirować z prędkością 12 000 x g przez 20 min. Wyrzucić supernatanty. Granulki P2 reprezentują surowe frakcje membranowe.
2. Oczyszczanie synaptosomów z surowych frakcji błony mózgowej (ryc. 3A)
   UWAGA: Surowe frakcje błony mózgowej można rozdzielić na mielinę, błony świetlne, synaptosomy i mitochondria za pomocą ultrawirowania w gradientowym gradieniu gęstości sacharozy. W tym celu wymagane są 5 mM Tris/HCl pH 8,1 zawierające sacharozę o stężeniu 0,32 M, 1,0 M lub 1,2 M.
   1. Wykonując wirowanie w celu wytworzenia frakcji P2, należy przygotować stopniowe gradienty sacharozy w probówkach ultrawirówek. Rozpocząć od 2,5 ml 1,0 M buforu sacharozy i podwarstwy z 1,5 ml 1,2 M buforu sacharozy za pomocą szklanej pipety Pasteura.
   2. Ponownie homogenizuj frakcje P2 w 0,5 ml 0,32 M buforu sacharozy ręcznie za pomocą 6 pociągnięć i załaduj na górę gradientu.
   3. Wirować z prędkością 85 000 x g przez 2 godziny w ultrawirówce za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego.
   4. Odrzucić górną warstwę sacharozy o grubości 0,32 M, w tym materiał na granicy faz z buforem 1,0 M sacharozy (mielina, błony świetlne). Zbierz synaptosomy na granicy faz bufora sacharozy 1,0/1,2 M. Osad na dnie probówki zawiera mitochondria.
   5. Dodać 0,32 M buforu sacharozy do frakcji synaptosomalnej w stosunku 1:1, dokładnie wymieszać i wirować w temperaturze 150 000 x g przez 1 godzinę. Synaptosomy znajdują się w osadzie i mogą być teraz ponownie zawieszone w buforze wymaganym do dalszego przetwarzania.
3. Przygotowanie frakcji wzbogaconej w PSD (rysunek 3B)
   1. Homogenizuj każdy konkretny obszar mózgu pojedynczego zwierzęcia w buforze ekstrakcyjnym o pojemności 100 μl (5 mM Tris/HCl pH 8,1, 0,5% Triton X-100) w probówce ultrawirówkowej o pojemności 200 μl za pomocą tłuczka z PTFE (politetrafluoroetylenu) przy 2,000 obr./min z 12 suwami.
   2. Dodać 100 μl buforu ekstrakcyjnego, mieszać i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odwirować w temperaturze 100 000 x g przez 1 godzinę i ostrożnie zebrać supernatant S1 za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
   3. Ponownie homogenizować osad P1 w tej samej probówce z buforem ekstrakcyjnym o pojemności 100 μl za pomocą tłuczka z PTFE przy 2 000 obr./min z 12 suwami.
   4. Dodać 100 μl buforu ekstrakcyjnego, dobrze wymieszać pipetą i wirować w 100 000 x g przez 1 godzinę.
   5. Połączyć sklarowany S2 z S1 do rozpuszczalnej frakcji białkowej. Frakcja ta zawiera białka cytozolowe, 0,5% rozpuszczalnych białek błonowych Triton X-100 oraz cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej.
   6. Zawiesić pozostały osad w 50 μl 5 mM Tris/HCl pH 8,1. Frakcja ta zawiera PSD, błony odporne na detergenty, nierozpuszczalne elementy cytoszkieletu, mitochondria i szczątki komórkowe, w tym jądra. Jest wzbogacony w PSD, które stanowią rdzeń struktur postsynaptycznych, ale także ważne części cytomacierzy presynaptycznej w strefie aktywnej. Współczynnik wzbogacenia PSD wynosi około 4, a wzbogacenie elementów PSD zostało już wcześniej wykazane. ¹²

3. Przygotowanie próbki do spektrometrii mas

1. Liza i normalizacja próbki
   UWAGA: Normalizacja próbki dotycząca stężenia białka jest bardzo ważnym krokiem do uzyskania wiarygodnych danych ilościowych nawet dla słabych zmian ekspresji białek synaptycznych.
   1. Rozpuścić synaptosomy lub preparaty wzbogacone w PSD z każdego obszaru mózgu zwierzęcia w 20 - 50 μl (w zależności od całkowitej ilości materiału: dla kory słuchowej z tkanką 5 - 15 mg należy użyć 20 μl) 8 M mocznika i inkubować na lodzie przez 1 godzinę w kąpieli ultradźwiękowej.
      1. W celu trawienia w żelu należy rozpuścić synaptosomy bezpośrednio w buforze próbki SDS. Dokładnie oblicz załadowaną ilość, aby uniknąć przeciążenia żelu. Weź pod uwagę, że w tym przypadku bardzo obfite białka rusztowania zostaną utracone podczas elektroforezy żelu i trawienia w żelu.
   2. Rozcieńczyć 1% usuwalnego detergentu, aby uzyskać końcowe stężenie 2 M mocznika. Unikaj temperatur wyższych niż 30 °C, aby zapobiec karbamylacji białek.
   3. Wykonać SDS-PAGE z podwielokrotnością (np. 10 μl) próbki zgodnie ze standardowymi procedurami^13,14.
   4. Żel należy zabarwić kolorem Coomassie Blue zgodnie z protokołem producenta. Procedura łączy etap utrwalania i barwienia metanolem i kwasem octowym.
   5. Określić gęstość optyczną każdej próbki dla całego toru za pomocą skalibrowanego skanera żelowego w trybie transmisji i obliczyć względną ilość białka.
   6. Znormalizuj próbki zgodnie z tymi obliczeniami.
   7. Podziel każdą próbkę na dwie różne części. Użyć jednej trzeciej do trawienia w żelu i dwóch trzecich do trawienia w roztworze.
2. Trawienie w żelu
   1. Separacja żeli
      1. Wykonaj drugą SDS-PAGE z wykorzystaniem próbek o dostosowanym stężeniu. Odbarwić i określić ilościowo żele po raz drugi, aby sprawdzić jakość normalizacji.
      2. Wyciąć każdy pas próbki w żelu w różnych obszarach (8 na pas), ale wykluczyć zakres masy cząsteczkowej powyżej 170 kDa. Przenieś kawałki żelu do oddzielnych probówek.
      3. Pokrój obszary na mniejsze kawałki (ok. 1 x 1 mm) ostrym skalpelem, aby ułatwić skuteczne trawienie w żelu.
   2. Streszczenie¹⁵
      1. Kawałki żelu przemyć kilkakrotnie (w zależności od intensywności barwienia) przez 10 minut 50 - 150 μl buforu składającego się z 50% acetonitrylu (ACN) i 50 mM wodorowęglanu amonu (NH₄HCO₃).
      2. Usunąć supernatanty. Przykryj kawałki żelu ACN i inkubuj w temperaturze 20 °C, aż kawałki żelu staną się białe i skurczą się.
      3. Usuń ACN i ponownie nawodnij kawałki żelu przez 5 minut za pomocą 50 μl 0,1 M NH₄HCO_3. Dodać taką samą objętość ACN i inkubować przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 °C.
      4. Całkowicie usuń i wylej płyn. Wysuszyć kawałki żelu w wirówce próżniowej.
      5. Uwodnić kawałki żelu w 50 μl NH₄HCO₃ zawierającego 10 mM ditiotreitolu (DTT) i podgrzewać próbki przez 45 minut w temperaturze 56 °C w celu redukcji reszt cysteiny.
      6. Usunąć supernatanty i dodać 50 μl NH₄HCO₃ zawierającego 55 mM jodoacetamidu (IAA) przez 30 minut w ciemności do cystein zredukowanych przez karbamidometylan.
      7. Usuń i wylej cały płyn znajdujący się nad kawałkami żelu i umyj je dwukrotnie 50 μl NH₄HCO₃ i ACN (1:1) przez 10 minut, aby usunąć wszelkie pozostałości IAA. Suszyć próbki w wirówce próżniowej.
      8. W celu ograniczonego trawienia białek dodaj 25 mM NH₄HCO₃ zawierającego 12,5 ng/μl trypsyny. Wymagana objętość zależy od wielkości i ilości kawałków żelu. Inkubować przez kilka minut i sprawdzić, czy bufor został wchłonięty. W razie potrzeby dodaj więcej buforu, kawałki żelu powinny być całkowicie pokryte. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (min. 12 godzin).
   3. Ekstrakcja peptydów
      1. Nałożyć kawałki żelu na 10 - 20 μl 25 mM NH₄HCO₃ i dodać taką samą objętość ACN. Inkubować przez 10 minut na lodzie przy użyciu kąpieli ultradźwiękowej. Następnie usuń i zbierz supernatanty, które zawierają większość wytworzonych peptydów.
      2. Do kawałków żelu dodać 100 μl buforu ekstrakcyjnego zawierającego 30% ACN/0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA). Powtórzyć inkubację w kąpieli ultradźwiękowej i ostrożnie zebrać ten supernatant.
      3. Powtórz ostatnie etapy ekstrakcji, zwiększając stężenie ACN do 50%. Po 10 minutach kąpieli ultradźwiękowej odwirować i zebrać supernatanty.
      4. Połączyć wszystkie trzy odpowiednie supernatanty z etapów ekstrakcji i wysuszyć je w wirówce próżniowej. Należy zauważyć, że w wyniku separacji żelu 8 obszarów na pas/próbkę jest ponownie łączonych w jedną próbkę na tym etapie.
3. Podsumowanie w roztworze
   1. trawić
      1. Wykorzystać obliczoną ilość (np. 100 μl lizatu o stężeniu 150 μl, w zależności od ilości materiału i objętości wymaganej do ponownego zawieszenia próbki z określonego obszaru mózgu) znormalizowanych próbek w celu uzyskania materiału wyjściowego wystarczającego do przeprowadzenia co najmniej trzech kontrprób technicznych w celu przeprowadzenia spektrometrii mas bez znaczników.
      2. Dodać 2 mM DTT do 25 mM NH₄HCO₃ i delikatnie zagnowić próbkę. Redukować próbki przez 45 minut w temperaturze 20 °C.
      3. Dodać 10 mM IAA do karbamidometylanu reszty cysteiny. Mieszać i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 20 °C.
      4. Na koniec dodać 1 μl roztworu podstawowego trypsyny (1 μg/μl trypsyny w 25 mM kwasu octowego) i inkubować w temperaturze 20 °C przez 12 godzin.
   2. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)-Oczyszczanie
      1. W celu usunięcia kwaśnego detergentu należy dostosować próbki do końcowego stężenia 1% TFA i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C.
      2. Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 10 minut i ostrożnie zebrać supernatanty.
      3. Umieścić kolumnę SPE w stojaku i zrównoważyć matrycę z 2 ml metanolu. Przemyć dwa razy 2 ml 0,1% TFA w wodzie (bufor B).
      4. Dodać 2 ml buforu B i załadować próbkę. Umyj jeszcze trzy razy.
      5. Eluować peptydy, dodając 200 μl 70% ACN/0,1% TFA. Powtórz ten krok.
      6. Zebrać oba eluaty i wysuszyć je w wirówce próżniowej.
4. Wzbogacanie fosfopeptydów metodą chromatografii TiO ₂ ¹⁶
   1. Rozpuścić peptydy wytworzone w procesie trawienia w żelu lub w roztworze w 150 μl 80% ACN/2,5% TFA (bufor C) i zrównoważyć ~ 2 mg kulek TiO₂ w 50 μl buforu C.
   2. Dodać kulki do próbki i inkubować w urządzeniu obrotowym przez 1 godzinę w temperaturze 20 °C. Następnie odwirować kulki w dół (16 000 x g, 1 min) i zebrać supernatanty.
   3. Przemyć kulki trzykrotnie 100 μl buforu C, delikatnie mieszając i odwirowując po 5 minutach. Zebrać supernatanty. Powtórz ten krok trzy razy z 100 μl 80% ACN/0,1% TFA, a następnie trzy razy przemyj odpowiednio 100 μl 0,1% TFA (bez ACN).
   4. Połączyć wszystkie dziesięć supernatantów, wysuszyć je w wirówce próżniowej i obtraktować jako frakcję zubożoną w fosfopeptydy w celu dalszego oczyszczania zgodnie z krokiem 3.5.
   5. Eluować związane fosfopeptydy za pomocą 20 μl 400 mM NH₄OH/30% ACN z kulek. Powtórz ten krok trzy razy i zbierz wszystkie supernatanty po odkręceniu koralików.
   6. Połączyć eluaty z trawienia w żelu i z trawienia w roztworze próbki i traktować je jako frakcję wzbogaconą w fosfopeptydy. Wysuszyć je w wirówce próżniowej do końcowej objętości 4 - 8 μl.
5. Zagęszczanie i odsalanie frakcji zubożonych w fosfopeptydy metodą mikro-SPE
   1. Wysuszone peptydy rozpuścić w 20 μl 0,1% TFA.
   2. Zrównoważyć stałą matrycę C₁₈, pobierając 20 μl ACN do końcówki. Umyj matrycę, pobierając 0,1% TFA w wodzie do końcówki. Powtórz proces trzy razy.
   3. Powoli załaduj zakwaszoną próbkę do końcówki (powtórz ten krok trzy razy).
   4. Umyć matrycę C₁₈ trzykrotnie 20 μl 0,1% TFA w wodzie i wylać roztwór myjący.
   5. Eluować peptydy z końcówki pipety, wielokrotnie (3 razy) pobierając 20 μl 70% ACN/0,1% TFA i zebrać ten roztwór elucyjny do osobnej probówki.
   6. Połączyć eluaty z próbki i wysuszyć je w wirówce próżniowej.

4. Analiza proteomu

UWAGA: Analiza proteomu jest wykonywana na hybrydowym dwuciśnieniowym liniowym spektrometrze masowym pułapki jonowej/orbitrapu, wyposażonym w ultra HPLC. HPLC składa się z chłodzonego automatycznego podajnika próbek z pętlą wtryskową o pojemności 20 μl, binarnej pompy ładującej (zakres przepływu μl), binarnej pompy rozdzielającej przepływ nano, grzałki kolumnowej z dwoma mikrozaworami przełączającymi i odgazowywaczem. Próbki są najpierw poddawane kolumnie wychwytującej (np. 100 μm x 2 cm) przy natężeniu przepływu 7 μl/min, a następnie rozdzielane na kolumnie (np. 75 μm x 25 cm) przy 250 nl/min. Wylot kolumny separacyjnej jest bezpośrednio sprzężony z powlekaną końcówką emitera Pico umieszczoną w interfejsie nano-sprayu przy źródle jonizacji spektrometru mas.

1. Chromatografia nanocieczowa i tandemowa spektrometria mas
   1. Próbki peptydów rozpuścić w 12 μl 2% ACN/0,1% TFA przez co najmniej 30 minut. Odwirować przez 15 sekund i przenieść 11 μl supernatantu do fiolki z automatycznym samplerem (stożkowe, o zmniejszonej średnicy).
   2. Ustaw zautomatyzowany reżim nakładania próbek, rozdzielania chromatograficznego i tandemowej spektrometrii mas w oprogramowaniu sterującym (np. Xcalibur) w następujący sposób.
      1. Użyj następujących parametrów dla temperatury: Automatyczny podajnik próbek: 5 °C; Piec kolumnowy: 45 °C.
      2. Do wstrzykiwań należy użyć następujących składników: Objętość: 10 μl; Natężenie przepływu: 7 μl/min (2% ACN, 0,1% TFA); Czas : 8 min; Ustawienie zaworu: kolumna syfonu - odpad; Masowe pozyskiwanie specyfikacji: wyłączone.
      3. Do separacji należy użyć następujących elementów: Natężenie przepływu: 250 nl/min Ustawienie zaworu: kolumna separująca kolumnę pułapki; akwizycja specyfikacji masy: wł.
         0 min - 100 min: 2% ACN, 0,1% kwas mrówkowy - 40% ACN, 0,1% kwas mrówkowy
         100 min - 105 min: 40% ACN, 0,1% kwas mrówkowy - 95% ACN, 0,1% kwas mrówkowy
         105 min - 109 min: 95% ACN, 0,1% kwas mrówkowy
         109 min - 120 min: 2% ACN, 0,1% kwas mrówkowy
      4. Dla ustawień spektrometrii mas należy użyć następujących parametrów: Pełny MS: FTMS; rozdzielczość 60 000; zakres m/z 400 - 2 000; MS/MS: Liniowa pułapka jonowa; minimalny próg sygnału 500; szerokość izolacji 2 Da; dynamiczne ustawienie czasu wykluczenia 30 sek.; pojedynczo naładowane jony są wyłączone z selekcji; Znormalizowana energia zderzenia jest ustawiona na 35%, a czas aktywacji na 10 ms.
         UWAGA: Po pełnym skanowaniu MS następuje do 15 przebiegów LTQ MS/MS przy użyciu dysocjacji wywołanej kolizją (CID) najliczniej wykrywanych jonów peptydowych.
   3. Uruchom trzy repliki techniczne dla wszystkich próbek.
2. Identyfikacja białek i kwantyfikacja bez znakowania
   1. Przetwarzaj surowe dane ze spektrometrii mas w kierunku identyfikacji białek i kwantyfikacji bez znaczników przy użyciu komercyjnego pakietu oprogramowania (np. PEAKS Studio). W przeciwieństwie do większości innych pakietów oprogramowania proteomowego, to konkretne oprogramowanie wykorzystuje algorytm sekwencjonowania de novo przed dopasowaniem bazy danych białek. Jednak ten krok można łatwo zastąpić innymi popularnymi pakietami oprogramowania.
   2. Użyj podstawowych ustawień wymienionych w Tabeli 2.
3. Fosfoproteomika
   UWAGA: Wydajna i niezawodna akwizycja fosfopeptydów wymaga kilku istotnych zmian w konfiguracji przepływu pracy proteomicznej.
   1. Po wzbogaceniu fosfopeptydami nigdy nie susz całkowicie próbek. Próbki należy zawsze przechowywać rozpuszczone.
      UWAGA: Wiązanie fosforylowane treoniny lub seryny jest bardzo delikatne. Podczas fragmentacji wywołanej zderzeniem w pułapce jonowej powoduje to neutralną utratę fosforanu. Zapobiega to dalszej fragmentacji peptydu, który z kolei jest wymagany do identyfikacji. Dozwolona aktywacja szerokopasmowa w układzie spektrometrii mas pozwala na fragmentację fosfopeptydów nawet po obojętnej utracie grupy fosforanowej. Wykonuje on oszczędzający czas "pseudo-MS³". Oznaczanie fosfomiejsc w danych MS/MS wymaga szczególnej weryfikacji i oceny i może być przeprowadzone za pomocą phosphoRS 3.0.

5. Bioinformatyka - Meta-Analiza

UWAGA: Przed wykonaniem adnotacji funkcjonalnej i analizy sieciowej listy białek muszą zostać wstępnie przetworzone. Najpierw połącz listy regulowanych białek i fosfopeptydów dla każdego regionu mózgu z osobna. Następnie usuń wszystkie zduplikowane identyfikatory UniProt-ID dla każdej frakcji, aby zapobiec błędnej interpretacji.

1. Analiza wzbogacenia pojedynczego za pomocą GeneCodis ¹⁷
   1. Otwórz narzędzie internetowe GeneCodis (http://genecodis.cnb.csic.es)
   2. Wybierz "Mus musculus" jako organizm i "GO Biological Process" jako adnotację.
   3. Wklej listę identyfikatorów UniProt określonej frakcji. Prześlij i poczekaj, aż analiza zostanie wykonana. Kliknij na "Singular Enrichment Analysis of GO Biological Process" i zobacz wyniki.
   4. Powtórzyć krok 5.1.3 dla pozostałych trzech frakcji.
   5. Aby zobaczyć wszelkie duplikaty i przecięcia między listami wyników, użyj języka skryptowego, takiego jak Perl lub Python, aby przefiltrować potrzebne dane. Podobnymi narzędziami do analizy wzbogacania pojedynczych jednostek są DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) i Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) z wtyczkami BiNGO (http://apps.cytoscape.org/apps/bingo) i ClueGO (http://apps.cytoscape.org/apps/cluego).
2. Generowanie wykresu opartego na sile na podstawie danych GeneCodis za pomocą Gephi (https://gephi.org/)
   UWAGA: Dane do wykresów muszą być dostarczone przez użytkownika w formacie wykresu (.gexf, .graphml, .dot, .gv, .gml) lub wprowadzone ręcznie.
   1. Generowanie węzłów wykresu
      1. Ręcznie: Otwórz Gephi i kliknij "Laboratorium danych". Utwórz węzły. Kliknij "Węzły" po lewej stronie, aby przejść do tabeli "Węzły". Kliknij "Dodaj węzeł". Wprowadź nazwę terminu. Kliknij "OK"/naciśnij Enter.
      2. Alternatywnie: Zapisz wynik GeneCodis na komputerze. Otwórz .txt za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Usuń wszystkie wiersze z wyjątkiem "Item_Details" (nazwy terminów). Zmień nagłówek "Item_Details" na "Etykieta". Zapisz arkusz kalkulacyjny jako ".csv". Teraz w Gephi kliknij "Importuj arkusz kalkulacyjny". Wybierz arkusz kalkulacyjny z przeglądarki plików Gephi. Kliknij "Dalej". Kliknij "Zakończ".
   2. Łączenie węzłów za pomocą krawędzi.
      1. Kliknij "Krawędzie" po lewej stronie, aby przejść do tabeli "Krawędzie". Dla każdego węzła (terminu): wyszukaj nazwy genów w innych terminach. Jeśli jeden lub więcej genów jest wspólnych -> utwórz krawędź.
      2. Kliknij "Dodaj krawędź". Wybierz "Nieskierowany". Wybierz węzeł źródłowy i docelowy z list rozwijanych. Kliknij "OK"/naciśnij Enter. Jeśli wspólny jest więcej niż jeden gen, wprowadź obfitość w polu "Waga" (tabela).
   3. Wymuszony układ graficzny.
      1. Otwórz plik danych wykresu, ustaw typ wykresu na "nieskierowany" lub użyj danych wprowadzonych ręcznie, kliknij "Przegląd", jeśli nie jest jeszcze wybrany.
      2. Zmień rozmiar węzłów w zależności od obfitości wzajemnych połączeń. Kliknij Statystyki, uruchom "Średni stopień" (nieważone krawędzie) lub "Średni stopień ważony" (ważone krawędzie) w sekcji "Przegląd sieci". W "Wyglądzie" kliknij "Węzły", a następnie przycisk Rozmiar, a następnie wybierz "Atrybuty" i ustaw parametr Atrybuty na "Średni stopień ważony" lub "Średni stopień". Kliknij przycisk Zastosuj.
      3. Na koniec: Wybierz "Force Atlas" w "Układzie" i uruchom; zmień "Siłę odpychania", jeśli węzły kolidują ze sobą.
   4. Eksportuj do obrazu.
      1. Funkcja zrzutu ekranu: Kliknij "Przegląd", zmień układ wykresu, grubość krawędzi, rozmiar etykiety i skalowanie za pomocą menu na dole okna "Wykres". Kliknij lewy przycisk aparatu i zapisz zdjęcie.
      2. Funkcja eksportu "Podgląd": Kliknij "Podgląd". Zmień ustawienia wstępne na "Domyślne proste". Zmień ustawienia zgodnie z wybranymi preferencjami i kliknij "SVG/PDF/PNG", aby wyeksportować.

Results

Rysunek 1 podsumowuje cały proces ilościowego profilowania proteomu synaptycznego w regionach mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej. Zaczyna się od treningu zwierząt w pudełku wahadłowym. W przykładzie pokazanym na rysunku 2 myszy zaczęły wykazywać znaczną dyskryminację tonów FM podczas czwartej^{sesji treningowej}, co wskazuje na efektywne uczenie się. Zwierzęta są składane w ofierze w wybranych punktach czasowych w celu przeprowadzenia sekcji obszaru mózgu. Wymagane wzbogacenie synaps można osiągnąć albo przez przygotowanie synaptosomów, albo alternatywnie przez przygotowanie frakcji wzbogaconej w PSD, oba opisane szczegółowo na rycinie 3. Metoda wzbogacania PSD została opracowana dla małych ilości tkanek, np. 1-2 wycinków hipokampa z mózgu szczura^{12, 18}. Wymaga małych rurek, tłuczków PTFE pasujących do tych rurek oraz laboratoryjnego napędu wiertniczego do zasilania tłuczka.

Ze względu na szczególny skład białkowy synaptosomów, zdecydowanie zaleca się przygotowanie próbki na dwa różne, ale uzupełniające się sposoby. Rusztowania PSD są często białkami o bardzo dużej masie cząsteczkowej występującymi w wysokiej stechiometrii. Trawienie w roztworze jest najlepszym sposobem na ich efektywną ekstrakcję, ale może prowadzić do nadpróbkowania wygenerowanej mieszaniny peptydów. Trawienie w żelu przeprowadzane równolegle na tej samej próbce może wykluczyć te białka o dużej masie cząsteczkowej i faworyzować analizę białek o średniej i niższej masie cząsteczkowej. Do kompleksowej analizy zalecane są oba rodzaje trawień proteolitycznych.

Różne ilości tkanek badanych obszarów mózgu wymagają dostosowania zastosowanego materiału dla lepszego porównania. W czterech badanych obszarach mózgu kora słuchowa jest na ogół czynnikiem ograniczającym. Materiał wszystkich innych obszarów mózgu powinien być starannie dostosowany do ilości kory słuchowej po przygotowaniu synaptosomów lub frakcji wzbogaconych w PSD (patrz 3.1.1.). Typowe masy świeżo przygotowanych obszarów mózgu myszy są następujące: kora słuchowa (AC): ~ 50 mg; hipokamp (HIP): ~ 90 mg; prążkowie (STR): ~ 120 mg i kora czołowa (FC): ~ 100 mg.

Metoda wzbogacania PSD opisana w sekcji 2.3 pozwoliła na identyfikację około 1500 różnych białek i około 250 różnych fosfopeptydów na region mózgu na poziomie pojedynczego zwierzęcia (Tabela 1). Analiza proteomiczna przeprowadzona 24 godziny po pierwszej sesji treningowej wykazała, że 7,3% zidentyfikowanych białek i 5,8% fosfopeptydów wykazało istotne (p< 0,05) zmiany ilościowe w ich ekspresji synaptycznej w porównaniu z wcześniejszymi kontrolami (Tabela 1). Wyraźna tendencja do regulacji rusztowań synaptycznych w dół może wskazywać na wyraźną rearanżację architektury synaptycznej we wczesnych stadiach uczenia się FMTD. Zdecydowana większość regulowanych białek została zmieniona w sposób specyficzny dla regionu mózgu, podczas gdy tylko 22% stwierdzono, że jest regulowanych w dwóch lub więcej obszarach mózgu. Na rysunku 4 przedstawiono sześć wybranych przykładów.

Metaanaliza złożonych wyników za pomocą IPA dostarcza dowodów na szczególny udział/manipulację następujących szlaków kanonicznych: "Sygnalizacja endocytozy za pośrednictwem klatryny", "Sygnalizacja naprowadzania aksonalnego", "Sygnalizacja wapniowa", "Sygnalizacja RhoA", "Sygnalizacja Notch", "Przebudowa połączeń przylegających do nabłonka", "Sygnalizacja receptora glutaminianu", "Receptor GABA sygnalizacja", "sygnalizacja receptora dopaminy" i "synaptyczne długoterminowe wzmocnienie".

Analiza pojedynczego wzbogacenia ujawniła znaczące, nadreprezentowane procesy biologiczne w korze czołowej dotyczące transportu białek, adhezji komórek, fosforylacji, endocytozy, transportu za pośrednictwem pęcherzyków, rozwoju przodomózgowia i aksonogenezy (Ryc. 5). W korze słuchowej zauważalne były procesy biologiczne, w tym transport jonów, translacja, transport mRNA, transport białek i uczenie się. Analiza frakcji białkowej hipokampa wykrywa znacznie wzbogacone procesy związane z transportem jonów, cyklem komórkowym, translacją, fosforylacją i rozwojem układu nerwowego. W prążkowiu stwierdzono nadreprezentowane procesy biologiczne, w tym transport mRNA, transport za pośrednictwem pęcherzyków, aksonogenezę, proteolizę, transport białek i endocytozę.

Rysunek 1: Systematyczny przebieg pracy podejścia metodologicznego. Rysunek ten schematycznie podsumowuje przebieg procesu profilowania ilościowego w wysokiej rozdzielczości składu białek synaptycznych specyficznego dla obszaru mózgu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykład wydajności myszy w zadaniu dyskryminacji tonów FM. Zwierzęta wykazują rosnący wskaźnik trafień (niebieska krzywa) i malejący wskaźnik fałszywych alarmów (krzywa) w trakcie sesji treningowych. Znacząca dyskryminacja ma miejsce od czwartej sesji. Słupki błędów są dostarczane jako SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przygotowanie synaptosomu i frakcji wzbogaconej w PSD. A: Przygotowanie synaptosomu. Z punktu widzenia Preparat frakcji wzbogaconej PSD. Oba rysunki wyjaśniają szczegółowy przebieg przygotowania synaptosomów lub alternatywnie frakcji wzbogaconych PSD z tkanek mózgowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wybrane ilościowe wyniki proteomiczne. Względna obfitość synaps wybranych białek jest porównywana między myszami przeszkolonymi w zadaniu FMTD (AV, n = 6) a naiwnymi myszami kontrolnymi (NV, n = 6) 24 godziny po pierwszej sesji treningowej. Wartości liczebności obliczono jako medianę powierzchni pików trzech najbardziej intensywnych peptydów białka. Białka o istotnych zmianach liczebności (AV/NV; test t) są oznaczone na wykresach: * p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,005. Słupki błędów są dostarczane jako SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wizualizacja szlaków biologicznych dla kory czołowej za pomocą GeneCodis/Gephi. Pokazane są tutaj tylko istotne terminy z bazy danych Gene Ontology (GO) (http://geneontology.org) związane z "procesem biologicznym" z minimalną liczbą białka wynoszącą trzy. Węzły reprezentują terminy GO, rozmiar węzła, szerokość linii i liczbę połączeń określonego węzła przedstawiają liczbę białek, które dzielą ten termin GO z innymi węzłami. Ze względu na metodę "Atlasu Sił" Gephi, powiązane węzły grupują się blisko siebie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Region mózgu	AC	FC	BIODRA	STR	∑
zidentyfikowane białka	1435	1758	1572	1507	6272
regulowane białka (p<0.05)	59	130	162	108	459
↑ AV/NV	8	4	76	35	123
↓ AV/NV	51	126	86	73	336
zidentyfikowane fosfomotywy	197	361	273	278	1109
regulowane motywy fosfonowe (p<0.05)	8	22	21	14	65
↑ AV/NV	4	17	5	9	35
↓ AV/NV	4	5	16	5	30

Tabela 1: Podsumowanie wyniku proteomicznego. Poniższa tabela podsumowuje reprezentatywny eksperyment proteomiczny wyszkolonych myszy (AV, n = 6) 24 godziny po pierwszej sesji treningowej w porównaniu z ich naiwnymi kontrolami (NV, n = 6). Suma 459 regulowanych białek obejmuje nakładające się regulacje. 283 różne regulacje zostały określone jako specyficzne dla mózgu. W szczegółach, 57 białek jest regulowanych w dwóch regionach mózgu, 18 regulacji białek wykryto w trzech regionach mózgu i tylko 2 białka są regulowane we wszystkich czterech badanych obszarach mózgu.

Tolerancje błędów
Masa prekursora (spektrometria mas z transformacją Fouriera)	10 stron na minutę
masa jonów fragmentacyjnych (liniowa pułapka jonowa)	0,6 Da
Maksymalna pominięta frakcja na peptyd	3
Poprawione modyfikacje
do próbek trawionych w żelu	Karbamidometylacja cysteiny
do próbek trawionych w roztworze	Metylotiolacja cysteiny
Zmienne modyfikacje	Utlenianie metioniny
	Deamidacje asparaginy i/lub glutaminy
baza danych	Uniprot/Sprot
taksonomia	mysz
Ustawienia identyfikacji statystycznej i akceptacji
de novo średni lokalny poziom ufności (ALC)	> 50%
Wskaźnik fałszywych odkryć peptydów (FDR, na podstawie szacunkowej fuzji wabika)	< 1%
Znaczenie białka (-10logP, na podstawie zmodyfikowanego testu T)	> 20
unikalne peptydy / białko	≥ 1
Ustawienia kwantyfikacji:
Peptydy stosowane do oznaczania ilościowego, jeżeli:
Znaczenie peptydów (-10logP)	> 30
Identyfikacja peptydów w	≥ 50% próbek
Jakość sygnału peptydowego	>1
Średnia powierzchnia peptydu	> 1E5
Tolerancja czasu retencji peptydów	< 5 min
normalizacja	przez całkowity prąd jonowy (TIC)

Tabela 2: Ustawienia identyfikacji białek (krok 4.2.2).

Discussion

W badaniu przedstawiono metodologiczny przebieg pracy zoptymalizowany pod kątem dokładnego profilowania ilościowego zmian ekspresji białek synaptycznych podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w różnych obszarach mózgu myszy. Konfiguracja daje możliwość badania ekspresji białek na poziomie pojedynczego zwierzęcia, pomimo wymaganego zastosowania co najmniej trzech kontrprób technicznych na próbkę do analizy spektrometrii mas.

Metodologia uwzględnia szczególny skład białkowy pre- i postsynapsy składającej się z białek rusztowania o dużej masie cząsteczkowej, ale także z ważnych białek mediatorowych o średniej lub mniejszej masie cząsteczkowej. Trawienie w roztworze preparatów synaptosomalnych skutkuje wydajnym wytwarzaniem, a tym samym nadreprezentacją peptydów pochodzących z rusztowań. To z kolei może hamować analizę mniejszych lub mniej obfitych białek. Sugerowane przygotowanie frakcji SDS-PAGE z podwielokrotności każdej próbki w połączeniu z równoległą procedurą trawienia w żelu ułatwia analizę białek o średniej i niskiej liczebności i stanowi wysoce zalecaną metodę uzupełniającą. Po oddzielnym zastosowaniu spektrometrii mas wszystkich frakcji pochodzących z próbki (np. trawienie w roztworze, trawienie w żelu, połączone frakcje wzbogacone fosfo) odpowiednie zestawy danych MS/MS mogą być łączone i dalej obliczane w celu identyfikacji i kwantyfikacji białek za pomocą oprogramowania PEAKS lub alternatywnych popularnych pakietów oprogramowania.

Alternatywnie, indywidualne zastosowanie frakcji próbki pochodzących z trawienia w żelu (oddzielnie przetworzone obszary żelu na torze próbki) oraz frakcji wytworzonych z próbki wytrawionej w roztworze (np. metodą chromatografii jonowymiennej) do spektrometrii mas może zwiększyć głębokość analizy. Jednak ten rozszerzony przepływ pracy znacznie wydłuża czas wymagany do akwizycji danych LS-MS/MS. Do wygenerowania szczegółowej sekwencji molekularnej przegrupowań białek synaptycznych podczas uczenia się i tworzenia pamięci wymagany jest określony przebieg profilowania proteomicznego w określonym czasie. Ten kurs czasowy może rozpocząć się natychmiast po lub nawet w trakcie pierwszej sesji treningowej i obejmuje ściśle powiązane ramy czasowe, aż do momentu, gdy wyniki zwierząt osiągną asymptotyczny poziom krzywej uczenia się po ok. 8 - 10 dniach treningu (szczegóły na rysunku 2 ).

Analiza zmian fosforylacji białek synaptycznych wymaga szczególnego skupienia się na wybranych ramach czasowych podczas uczenia się FMTD. Z jednej strony kaskady sygnalizacyjne inicjujące rearanżacje białek synaptycznych, o których wiadomo, że są wywoływane przez fosforylację i defosforylację białek, są oczekiwane na bardzo wczesnych etapach treningu zwierząt. Z drugiej strony, znane są długotrwałe modyfikacje wielu fosforylowanych białek synaptycznych, które regulują łączność i składanie w architekturze synaptycznej^{19, 20}. Te modyfikacje potranslacyjne są oczekiwane nawet w późniejszych punktach konsolidacji pamięci.

Złożone zestawy danych generowane przez ten proteomiczny przepływ pracy wymagają przetwarzania bioinformatycznego w celu zidentyfikowania uczestniczących szlaków molekularnych i kluczowych cząsteczek. Metaanaliza pokazuje znaczące nadreprezentowane ścieżki, które odgrywają rolę w procesach uczenia się i zapamiętywania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M Empore Filtr do ekstrakcji do fazy stałej	3M Bioanalytical Technologies	4245SD	7 mm/3 ml
Uznanie PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164564	100 µ m x 2 cm, C18
Uznanie PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164569	75 & mikro; m x 25 cm, C18
Kwas octowy	Carl Roth GmbH	3738.1
Acetonitryl (ACN)	Carl Roth GmbH	AE70.2
Akrylamid (30%)	AppliChem	A0951
Wodorowęglan amonu	Fluka	9830
Wodorotlenek amonu	Fluka	44273
Nadsiarczan amonu  (APS)	AppliChem	A2941
Biofuge pico	Heraeus GmbH	75003280
Niebieski R-250	SERVA Electrophoresis GmbH	17525
Bromophenol Blue	Pharmacia Biotech	17132901
C57BL/6J myszy	Charles River
Kantarydyna	Carl Roth GmbH	3322.1
Probówki wirówkowe do MLS-50	Beckman Coulter	344057
Probówki wirówkowe do rotora TLA 100.1	Beckman Coulter	343776
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A1101
Wirówka Eppendorf 5417R	VWR	22636138
Eppendorf A-8-11 wirnik	VWR	5407000317
Kwas mrówkowy	Fluka	14265
GeneCodis	http://genecodis.cnb.csic.es/
Gephi	https://gephi.org/
Glycerol	AppliChem	A1123
Glycine	AppliChem	A1067
HALT Fosfataza Koktajl inhibitorów	Pierce /Thermo Scientific	78420
Roztwór buforowy HEPES	PAA Laboratories GmbH	S11-001
Naczynie homogenizacyjne 2 ml	Sartorius AG	854 2252
Kwas solny	Sigma-Aldrich	H1758
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
Analiza ścieżki Ingenuity	Jiagen
Jodoacetamid (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
Napęd wiertniczy laboratoryjny   K-ControlTLC 4957	Kaltenbach & Vogt GmbH	182997
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2	Thermo Scientific
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Scientific
Rotator rurowy Macs-mix	Miltenyi Biotech	130-090-753
Magic Scan 4.71	UMAX
Metanol	Carl Roth GmbH	AE71.2
MLS-50 rotor	Beckman Coulter	367280
Ultrawirówka Optima MAX	Beckman Coulter	364300
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PEAKS 7.5	Bioinformatatic Solutions
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3	Sigma-Aldrich	P0044
PhosphoRS 3.1	IMP/IMBA/GMI
PhosSTOP	Roche	4906845001
Tłok/tłuczek wykonany z PTFE	Sartorius AG	854 2651
Homogenizator PotterS	Sartorius AG	853 3024
Inhibitor proteazy kompletna ilość	mini Roche	4693159001
Jeden 4.5.1	BioRad
RapiGest	Waters	186002122
Shuttle	box Coulbourne Instruments
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	AppliChem	A1112
Molibdenian sodu	Carl Roth GmbH	274.2
Sód dwuwodny winian	Sigma-Aldrich	228729
SONOREX RK 156 Kąpiel ultradźwiękowa	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG	305
Komora dźwiękoszczelna	Akustyka przemysłowa Firma
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2
Tetrametyloetylen-1,2-diamina (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Thermomixer basic	CallMedia	111000
Titansphere TiO 5µ m	GL Sciences Inc. Japonia	502075000
Rotor TLA 100.1	Beckman Coulter	343840
Kwas trifluorooctowy  (Umowa o partnerstwie poufnym)	Sigma-Aldrich	T6508
Tris ( hydroksymetylo)aminometan (TRIS)	AppliChem	A1086
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Trypsin Gold	Promega	V5280
Ultimate 3000 Ultra HPLC	Dionex/Thermo Scientific
Ultrawirówka	rurka Beckman Coulter	343776
Aspirator z chłodzeniem Unijet II	Uniequip Laborgerä te- und Vertriebs GmbH
Wirówka koncentratorowa UNIVAPO 100 H	Uniequip Laborgerä te- und Vertriebs GmbH
Mocznik	AppliChem	A1049
Woda (wysokiej jakości oczyszczona)			Rezystywność: > 18,2 MΩ*cm przy 25 stopniach; C  Pirogeni: < 0,02 EU/ml                              Spis treści: < 10 ppb
Xcalibur 3.0.63	Thermo Scientific
ZipTipC18 Końcówki do pipet	MILLIPORE	ZTC18S960