Method Article

Eksperymentalny protokół wykrywania sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

DOI:

10.3791/54994

⸱

February 7th, 2017

 ,  , 
1Department of Molecular Evolution, Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecność toksyn cyjanobakteryjnych w zbiornikach słodkiej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi jest głównym problemem dla organów zarządzających gospodarką wodną. Aby ocenić ryzyko zanieczyszczenia wody, w artykule opisano protokół wykrywania w terenie szczepów sinic w próbkach ciekłych i stałych przy użyciu chipa mikromacierzy przeciwciał.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Globalne ocieplenie i eutrofizacja sprawiają, że niektóre ekosystemy wodne zachowują się jak prawdziwe bioreaktory, które powodują szybki i masowy wzrost sinic; ma to istotne konsekwencje zdrowotne i ekonomiczne. Wiele szczepów sinic jest producentami toksyn i tylko kilka komórek jest niezbędnych do wywołania nieodwracalnych szkód w środowisku. W związku z tym władze i administracje jednolitych części wód wymagają szybkich i skutecznych systemów wczesnego ostrzegania, dostarczających wiarygodnych danych wspierających ich decyzje zapobiegawcze lub lecznicze. Niniejszy manuskrypt przedstawia eksperymentalny protokół wykrywania w terenie szczepów sinic wytwarzających toksyny przy użyciu mikromacierzy przeciwciał z 17 przeciwciałami (Abs) o rozdzielczości taksonomicznej (CYANOCHIP). W tym miejscu opisano multipleksowy test immunologiczny typu sandwich microarray (FSMI) do jednoczesnego monitorowania 17 szczepów sinic często występujących w ekosystemach słodkowodnych, z których niektóre są producentami toksyn. Mikromacierz z wieloma identycznymi powtórzeniami (do 24) CYANOCHIP została wydrukowana na pojedynczym szkiełku mikroskopowym w celu jednoczesnego przetestowania podobnej liczby próbek. Próbki cieczy można badać albo przez bezpośrednią inkubację z przeciwciałami (Abs), albo po zagęszczeniu komórek przez filtrację przez filtr od 1 do 3 μm. Próbki stałe, takie jak osady i zmielone skały, są najpierw homogenizowane i dyspergowane za pomocą ręcznego ultrasonografu w buforze inkubacyjnym. Następnie są one filtrowane (5 - 20 μm) w celu usunięcia gruboziarnistego materiału, a filtrat jest inkubowany z Abs. Reakcje immunologiczne ujawnia się przez końcową inkubację z mieszaniną 17 znakowanych fluorescencyjnie Abs i odczytuje się je za pomocą przenośnego detektora fluorescencji. Cały proces trwa około 3 godzin, z czego większość odpowiada dwóm 1-godzinnym okresom inkubacji. Wynikiem jest obraz, na którym jasne punkty odpowiadają dodatniemu wykrywaniu markerów sinicowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie i monitorowanie mikroorganizmów w złożonych naturalnych zbiorowiskach mikroorganizmów jest kluczowe w wielu dziedzinach, w tym w biomedycynie, ekologii środowiska i astrobiologii. Sinice to mikroorganizmy prokariotyczne dobrze znane ze swojej zdolności do tworzenia zakwitów (nadmiernej proliferacji) komórek w słodkiej wodzie. Są wszechobecne, a wiele gatunków jest w stanie wytwarzać toksyny, co prowadzi nie tylko do potencjalnego zagrożenia dla zdrowia ludzkiego, ale także do wpływu na środowisko. W związku z tym konieczne jest opracowanie szybkich i czułych metod wczesnego wykrywania sinic i/lub ich toksyn w glebie i wodzie. W tym celu opracowano multipleksowy test immunologiczny z mikromacierzą warstwową (FSMI), który jest narzędziem dla osób zarządzających zasobami wodnymi, które pomaga im w podejmowaniu decyzji, a w konsekwencji we wdrażaniu odpowiednich programów gospodarki wodnej.

Opracowano różnorodny zakres metod wykrywania i identyfikacji komórek sinic i cyjanotoksyn w glebie i wodzie, w tym mikroskopia optyczna, biologia molekularna i techniki immunologiczne. Metody te mogą się znacznie różnić pod względem dostarczanych informacji. Techniki mikroskopowe opierają się na morfologii komórek i wykrywaniu fluorescencji in vivo z pigmentów cyjanobakteryjnych, takich jak fikocyjanina lub chlorofil a1. Chociaż są to szybkie i tanie metody częstego monitorowania w czasie rzeczywistym, które informują o rodzaju i liczbie sinic obecnych w próbce, nie dają informacji o potencjalnej toksyczności. Ponadto wymagają pewnego poziomu wiedzy specjalistycznej, biorąc pod uwagę, że często bardzo trudno jest rozróżnić blisko spokrewnione gatunki2. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, mikroskopii świetlnej muszą towarzyszyć zarówno biologiczne, jak i biochemiczne testy przesiewowe oraz metody fizykochemiczne do identyfikacji i kwantyfikacji cyjanotoksyn.

Testy immunoenzymatyczne (ELISA), testy hamowania fosforanów białkowych (PPIA) i testy neurochemiczne u myszy są przykładami biochemicznych testów przesiewowych do wykrywania cyjanotoksyn. Podczas gdy pierwsze dwie są szybkimi i czułymi metodologiami, opisano wyniki fałszywie dodatnie, gdy testy ELISA i PPIA są ograniczone do trzech rodzajów toksyn. Test biologiczny na myszach jest techniką jakościową o niskiej czułości i precyzji, dlatego wymagane są specjalne licencje i szkolenia. Ponadto nie podaje informacji o rodzaju toksyn obecnych w próbce. Sinice można zidentyfikować i określić ilościowo za pomocą innych metod analitycznych, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS), chromatografia gazowa (GC), chromatografia gazowa ze spektrometrią mas (GC-MS) lub czas przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI-TOF). Jest to jednak możliwe tylko wtedy, gdy dostępne są wzorce referencyjne, które są potrzebne do określenia indywidualnych stężeń toksyn w złożonych próbkach3,4. Co więcej, metody te są czasochłonne; wymagają kosztownego sprzętu, materiałów eksploatacyjnych i przygotowania próbek; i muszą być wykonywane przez doświadczony i wyspecjalizowany personel.

Metody oparte na molekularnych są stosowane od dziesięcioleci do wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania cyjanobakterii i odpowiadających im cyjanotoksyn dzięki informacjom o sekwencji publikowanym w bazach danych genomu (np. National Center for Biotechnology Information, NCBI). Wśród tych metod znajdują się te oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która wymaga zaprojektowania zestawów starterów do amplifikacji DNA i zależy od wcześniejszej wiedzy na temat sekwencji DNA różnych gatunków sinic. Podczas gdy wykrywanie genów, podobnie jak operon fikocyjaniny, prowadzi do dokładnej identyfikacji na poziomie rodzaju, niektóre gatunki lub szczepy nie są wykrywane tą metodą. Jednak geny kodujące toksyny, takie jak te należące do operonu mikrocystyny, ułatwiają identyfikację toksyn w próbkach, których producentów jest mało5. Niemniej jednak wykrycie markerów toksyn za pomocą PCR niekoniecznie oznacza toksyczność w środowisku. Co więcej, zestaw starterów opracowanych do analizy całej gamy gatunków cyjanobakterii i producentów toksyn obecnych w próbce jest nadal niekompletny i konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań w celu zidentyfikowania nieznanych gatunków. Inne techniki molekularne nie są oparte na PCR, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i mikromacierze DNA.

W ciągu ostatnich dwóch dekad technologia mikromacierzy zyskała na znaczeniu w wielu dziedzinach zastosowań, szczególnie w monitorowaniu środowiska. Mikromacierze DNA pozwalają na rozróżnianie gatunków i analitów4,6,7,8,9,10, ale są uważane za bardzo pracochłonne i czasochłonne zadania, które obejmują wiele kroków (np. wydajność mikromacierzy, ekstrakcja DNA, amplifikacja PCR i hybrydyzacja). Z tego powodu mniej czasochłonne testy oparte na przeciwciałach, takie jak mikromacierze kanapkowe i konkurencyjne mikromacierze immunologiczne, stały się niezbędną i niezawodną metodą o wysokiej przepustowości do wykrywania wielu analitów środowiskowych11,12,13. Zdolność przeciwciał do specyficznego rozpoznawania swoich związków docelowych i wykrywania niewielkich ilości analitów i białek, wraz z możliwością wytwarzania przeciwciał przeciwko prawie każdej substancji, sprawiają, że mikromacierze przeciwciał są potężną techniką do celów środowiskowych. Ponadto jedną z głównych zalet tej >

Biosensory oparte na przeciwciałach okazały się czułymi i szybkimi narzędziami do wykrywania szerokiej gamy patogenów i toksyn w monitorowaniu środowiska15,16,17,18,19,20,21. Podczas gdy metody DNA obejmują kilka etapów, mikromacierze oparte na przeciwciałach wymagają jedynie przygotowania małej próbki, która opiera się głównie na krótkim etapie lizy w odpowiednim buforze roztworu. Delehanty i Ligler15 opisali jednoczesne wykrywanie białek i analitów bakteryjnych w złożonych mieszaninach w oparciu o test immunologiczny typu sandwich z przeciwciałami, który był w stanie wykryć stężenie białka 4 ppb i 104 jtk/ml komórek. Szkoła i wsp.21 opracowali tanią i niezawodną mikromatrycę multipleksową do jednoczesnego wykrywania proteotoksyn i małych toksyn, związków, które mogą być używane w wojnie biologicznej. Wykryli stężenie toksyny rycynowej, z granicą wykrywalności 3 ppb, w czasie krótszym niż 20 minut. Niedawno opisano CYANOCHIP, bioczujnik oparty na mikromacierzy przeciwciał do wykrywania in situ toksycznych i nietoksycznych cyjanobakterii22. Ta mikromacierz pozwala na identyfikację potencjalnych zakwitów sinic, głównie w środowiskach wodnych, które są trudne do zidentyfikowania pod mikroskopem. Granica wykrywalności mikromacierzy wynosi 102 - 103 komórki dla większości gatunków, co czyni ten bioczujnik opłacalnym narzędziem do multipleksowego wykrywania i identyfikacji sinic, nawet na poziomie gatunku. Wszystkie te właściwości sprawiają, że technika mikromacierzy przeciwciał, a w szczególności metoda przedstawiona w niniejszej pracy, jest szybsza i prostsza w porównaniu z wyżej wymienionymi technikami.

Ta praca przedstawia dwa przykłady eksperymentów, które wykorzystują biosensor oparty na mikromatrycy przeciwciał do wykrywania obecności cyjanobakterii w próbkach gleby i wody. Jest to prosta i niezawodna metoda oparta na formacie testu immunologicznego typu sandwich, która wymaga bardzo małych objętości próbek i bardzo podstawowego przygotowania próbki. Metoda wymaga krótkiego czasu i może być łatwo wykonana w terenie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie immunogenów

  1. Hodować każdy szczep sinic w odpowiednim pożywce hodowlanej w warunkach opisanych w tabeli 1.
    UWAGA: Pożywka wzrostowa i warunki hodowli dla każdego szczepu sinic są wymienione w Tabeli 1. Wszystkie szczepy sinic, z wyjątkiem K17, należą do grupy Antonio Quesady z Uniwersytetu Autonoma (Madryt, Hiszpania). Przeciwciało przeciwko Planktothrix rubescens zostało wytworzone z naturalnej próbki monospecyficznego zakwitu tej sinicy ze zbiornika Vilasouto (północna Hiszpania).
  2. Określ ilościowo liczbę komórek za pomocą komory do liczenia komórek za pomocą mikroskopii optycznej, aby uzyskać około10-8 komórek/ml z hodowli w późnej wykładniczej lub stacjonarnej fazie wzrostu.
  3. Zebrać komórki z 5 ml kultury przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 5 minut.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w probówce o pojemności 10 ml z 5 ml soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (1x PBS), aby uzyskać około 10-8 komórek/ml.
  5. Homogenizować i lizować komórki zawiesiny za pomocą sonikacji przez 5 cykli, z 30 s każdy, z 30-60-sekundową przerwą na lodzie, przy użyciu przenośnego, ręcznego procesora ultradźwiękowego lub zanurzając rurkę w łaźni wodnej rozdrabniacza komórek przy maksymalnej amplitudzie (30 kHz).
  6. Powtórz kroki 1,3 - 1,5 dla każdego szczepu cyjanobakterii.
    UWAGA: Sonikacja powoduje rozerwanie komórek i uwolnienie zawartości komórkowej. Podczas gdy białka i polisacharydy są dobrymi immunogenami, określone cząsteczki, takie jak lipidy i kwasy nukleinowe, same w sobie nie wywołują humoralnej odpowiedzi immunogennej. Dlatego muszą wiązać się z nośnikami, takimi jak polisacharydy lub białka, aby zwiększyć złożoność molekularną. Ponadto sonikacja uwalnia materiał wewnątrzkomórkowy, który może wywołać produkcję przeciwciał.

2. Produkcja przeciwciał poliklonalnych

  1. Przygotować pierwszą dawkę immunogenu przez zmieszanie 0,5 ml ultradźwiękowego lizatu komórkowego otrzymanego w kroku 1.5 z 0,5 ml kompletnego adiuwantu Freunda. Dostarczyć go do operatora zakładu hodowli zwierząt w celu produkcji poliklonalnych przeciwciał króliczych.
  2. Przygotować trzy kolejne dawki, tak jak poprzednio, do dalszego użycia w celu poprawy pamięci w procesie produkcji przeciwciał, mieszając 0,5 ml tego samego homogenatu/lizatu otrzymanego w kroku 1,5 z 0,5 ml niekompletnego adiuwantu Freunda. Przekaż je do zakładu zwierzęcego, aby przeprowadzić proces produkcji przeciwciał.
  3. Powtórz kroki 2.1 i 2.2 dla każdego nowego procesu produkcji przeciwciał.
    UWAGA: Zwykle produkcja przeciwciał jest powierzana wyspecjalizowanym zakładom lub firmom zajmującym się zwierzętami, ponieważ do pracy ze zwierzętami wymagane są odpowiednie licencje i szkolenia. Firmy dostarczają względny test immunoenzymatyczny (ELISA) mierzący ilość przeciwciał specyficznych dla antygenu obecnych w próbce surowicy.

3. Oczyszczanie przeciwciał

  1. Oczyść frakcję immunoglobuliny G (IgG) zarówno z surowicy immunologicznej, jak i przedimmunologicznej zebranej w kroku 2 za pomocą chromatografii powinowactwa białka-A. Niektóre komercyjne zestawy do oczyszczania, oparte na systemach wkładów, działają dobrze; Postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy.
  2. Jeżeli zestaw do oczyszczania nie zapewnia systemu odsalania, należy zmienić bufor po wymyciu oczyszczonych przeciwciał do 0,1x PBS, albo przez dializę, albo przez użycie odśrodkowych urządzeń filtrujących o wielkości porów membrany 100 kDa (lub niższej).
  3. Stężenie przeciwciał należy oznaczyć, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm lub stosując metody kolorymetryczne, takie jak Bradford23, Lowry24 lub kwas bicinchoninowy (BCA)25.
    UWAGA: Ważne jest, aby unikać włączania grup aminowych do buforu elucyjnego (np. Tris), ponieważ konkurują one z przeciwciałem o wiązanie się z powierzchniami stałymi aktywowanymi grupami epoksydowymi. Po oczyszczeniu ważne jest, aby zbadać aktywność przeciwciał za pomocą testu ELISA.

4. Znakowanie przeciwciał fluorescencyjnych

  1. Oczyszczone przeciwciała otrzymane w sekcji 3 oznaczyć fluorochromem (np. barwnikiem fluorescencyjnym dalekiej czerwieni) poprzez rozpuszczenie dostępnej w handlu fiolki zawierającej barwnik do znakowania 1 mg białka w 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Dodać 2 μl rozpuszczonego barwnika do każdego preparatu przeciwciała w stężeniu 2 mg/ml w końcowej objętości 50 μl w 50 mM roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (pH 8,5).
  2. Reakcje etykietowania należy utrzymywać w ciągłym mieszaniu przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia i 1 200 obr./min na platformie wibracyjnej.
  3. Oczyścić znakowane przeciwciała za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość (np. przy użyciu żelu o zakresie frakcjonowania od 1,5 do 30 kDa uwięzionego w kolumnie), zgodnie z zaleceniami dostawcy.
  4. Zmierzyć absorbancję przy 280 nm i przy 650 nm w eluatach i obliczyć skuteczność etykietowania zgodnie z zaleceniami dostawcy.
    UWAGA: Do 50 x 50 μL reakcji znakowania przeciwciał można przeprowadzić za pomocą jednej fiolki barwnika fluorescencyjnego do znakowania 1 mg białka. Zaleca się przykrycie probówek folią aluminiową lub, alternatywnie, użycie nieprzezroczystych probówek o pojemności 0,5 ml, aby uniknąć procesów hartowania po kroku 4.3. W przypadku przeciwciał IgG optymalne znakowanie uzyskuje się przy 3-7 molach barwnika na mol przeciwciała.

5. Produkcja CYANOCHIP

  1. Przeciwciała i kontrole w roztworze do drukowania
    1. Przygotuj 30 μl każdego oczyszczonego przeciwciała w roztworze drukującym, mieszając każde przeciwciało w stężeniu 1 mg / ml w komercyjnym buforze do drukowania 1x białka z 0,01% (v/v) Tween 20 (detergent niejonowy), wszystkie jako stężenia końcowe.
      UWAGA: Alternatywnie, roztwór przeciwciała może zawierać 20% glicerolu, 1% (w/v) sacharozy (lub trehalozy, jako środka konserwującego) i 0,01% (v/v) Tween 20 w buforze węglanowym (pH 8,5).
    2. Przygotuj 30 μl roztworu do drukowania jako kontrole: (a) 1x białkowy bufor drukujący z 0,01% (v/v) Tween 20, (b) białko-A oczyszczona surowica przedimmunologiczna o stężeniu 1 mg / ml w 1x białkowy bufor drukujący z 0,01% (v/v) Tween 20, i (c) albumina surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1 mg / ml w 1x bufor do drukowania białka z 0,01% (v/v) Tween 20.
    3. Przygotować 30 μl znakowanej fluorescencyjnie, oczyszczonej surowicy przedimmunologicznej o różnych stężeniach (np. od 50 μg/ml do 1 μg/ml) w 1x buforze do drukowania białek za pomocą Tween 20, jak w kroku 5.1.1. Próbki te zostaną wykorzystane jako markery ramki fluorescencyjnej oraz do względnej kwantyfikacji fluorescencji po wykryciu.
    4. Dodać 30 μl roztworów drukarskich przygotowanych w krokach 5.1.1, 5.1.2 i 5.1.3 do najwyższej jakości 384-dołkowych mikropłytek do produkcji mikromatryc, takich jak polipropylen.
      UWAGA: Bufor do drukowania białek zwiększa jakość i stabilność przeciwciał, a Tween 20 homogenizuje morfologię plamki i buduje sprzężenie białek. Zaleca się utrzymywanie mikropłytki 384-dołkowej w temperaturze 4 °C przed użyciem. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas. Polipropylen ma niską zawartość DNA, białka, ekstraktu komórkowego i wewnętrznego wiązania małych cząsteczek.
  2. Drukowanie przeciwciał na szkiełku mikroskopowym
    UWAGA: Wydrukuj przeciwciała na aktywowanych szkiełkach mikroskopowych przy użyciu różnych platform matrycowych, takich jak urządzenia kontaktowe, dzielone igły lub bezdotykowe, takie jak drukarki piezoelektryczne lub technologie "atramentowe". W tej pracy CYANOCHIP został rutynowo wydrukowany kontaktowo przy użyciu systemu robotycznego (macierzy) zdolnego do wykrywania ilości nL przeciwciał w skali μm.
    1. Ustaw warunki środowiskowe w drukarni na 20 °C i 40 - 50% wilgotności względnej.
    2. Ustaw podłoża szkiełek (np. szkiełka mikroskopowe aktywowane żywicą epoksydową o wymiarach 75 x 25 mm), aby wykonać kilka identycznych matryc przeciwciał na każdym szkiełku.
    3. Każde oczyszczone przeciwciało, łącznie z kontrolami i układem odniesienia, należy umieścić w potrójnym układzie plamki; w tych warunkach plamki mają średnicę 180 - 200 μm.
    4. Po wydrukowaniu należy pozostawić szkiełka na co najmniej 30 minut w temperaturze otoczenia, aby mogły wyschnąć, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C; do pracy w terenie preparaty można transportować i przechowywać w temperaturze otoczenia przez kilka miesięcy.
      UWAGA: CYANOCHIP jest drukowany w formacie potrójnej mikromacierzy punktowej z 3 x 8 identycznymi mikromatrycami na szkiełku lub 9 identycznymi tablicami w formacie mikromacierzy 1 x 9. Każdy rozmiar matrycy nie może być większy niż wymiary komory reakcyjnej dla uszczelki 24-dołkowej (zwykle 7,5 x 6,5 mm w komorze hybrydyzacyjnej 3 x 8).
    5. Przed użyciem mikromacierzy do analizy próbek środowiskowych należy użyć FSMI do określenia roboczego rozcieńczenia dla każdego przeciwciała na krzywej miareczkowania. Dla każdego przeciwciała należy użyć standardowego stężenia odpowiedniego immunogenu (103 - 104 komórek/ml) i seryjnych rozcieńczeń przeciwciała fluorescencyjnego (od 1:500 do 1:32 000). Optymalne stężenie przeciwciał odpowiada 50% maksymalnego natężenia sygnału uzyskanego w krzywej miareczkowania. Należy również określić czułość i swoistość dla każdego przeciwciała, jak opisano w Blanco i wsp.22.

6. Przygotowanie środowiskowych ekstraktów multianalitowych do testu immunologicznego z mikromacierzą fluorescencyjną typu sandwich (FSMI)

  1. Ekstrakt multianalitowy z próbki cieczy
    1. Pobrać 1 - 100 ml płynnej próbki za pomocą sterylnej strzykawki (np. woda z brzegu zbiornika wodnego); ilość próbki zależy w dużym stopniu od potencjalnego stężenia celów.
    2. Zagęścić komórki, przepuszczając próbkę wody przez filtr poliwęglanowy o wielkości porów 3 μm i średnicy 47 mm; stężenie komórkowe między 103 - 108 komórek / ml jest pożądane dla pozytywnego wykrywania, ale rzeczywiste stężenie jest nieznane.
    3. Odzyskaj biomasę zebraną w filtrze za pomocą 1 ml zmodyfikowanego buforu soli fizjologicznej buforowanego Tris, buforu wzmocnionego Tween 20 (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl i 0,1% Tween 20), zeskrobując ją szpatułką do probówki o pojemności 15 ml.
    4. Homogenizować i dezagregować za pomocą ręcznego procesora ultradźwiękowego, jak opisano w kroku 1.5, lub po prostu przez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół; w ten sposób przygotowuje się próbkę do analizy za pomocą mikromacierzy.
  2. Ekstrakt multianalitowy z próbki stałej
    1. Odważyć do 0,5 g próbki stałej (np. skały, gleby lub osadów) do probówki o pojemności 10 ml i dodać do 2 ml TBSTRR.
    2. Sonikację należy przeprowadzić poprzez zanurzenie sondy sonikatora w probówce, zanurzenie rurki w łaźni wodnej silnego rogu sonikołatora lub za pomocą ręcznego sonikatora. Wykonaj co najmniej 5 cykli po 30 sekund przy 30 kHz, zatrzymując się na 30 s na lodzie.
    3. Filtr do usuwania piasku, gliny i innych gruboziarnistych materiałów za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml połączonej z nylonowym uchwytem filtra o średnicy od 10 do 12 mm i porach od 5 do 20 μm. Przepchnij próbkę przez filtr do probówki o pojemności 1,5 ml. Jeśli filtr się nasyci, wymieszać zawiesinę w strzykawce i przenieść ją do nowej; W ten sposób przygotowuje się materiał filtratu do testu immunologicznego (etap 7).
      UWAGA: Pojemność buforowa TBSTRR zależy od rodzaju próbki. Ważne jest, aby przeprowadzić test immunologiczny natychmiast po przygotowaniu ekstraktu środowiskowego, aby uniknąć wpływu degradacji enzymatycznej na anality. Alternatywnie, dodać inhibitory proteazy do ekstraktu środowiskowego i zamrozić w temperaturze -80 °C do następnego etapu.

7. Test immunologiczny fluorescencyjnego mikromacierzy kanapkowej (FSMI)

  1. Blokowanie CYANOCHIP
    UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem należy potraktować wydrukowane preparaty w celu zablokowania wszystkich wolnych grup epoksydowych na szkiełku i usunięcia nadmiaru przeciwciał niezwiązanych kowalencyjnie.
    1. Zanurzyć mikromacierz w 0,5 M Tris-HCl (pH 9) z 5% (w/v) roztworem BSA na czystej powierzchni (np. szalce Petriego lub probówce 50 ml) z łagodnym mieszaniem z platformy kołyskowej na 5 minut. Alternatywnie, połóż szkiełko na kropli od 100 do 200 μl powyższego roztworu tak, aby plamki mikromacierzy były skierowane do niego. Pozostaw na 3 - 5 minut, a następnie kontynuuj.
    2. Ostrożnie podnieś szkiełko za pomocą kleszczyków z plastikową końcówką; staraj się unikać dotykania stref mikromacierzy. Wyeliminuj nadmiar płynu, delikatnie uderzając szkiełkiem o ręcznik papierowy. Zanurz go w 0,5 M Tris-HCl (pH 8) z 2% (w/v) roztworem BSA na 30 minut z łagodnym mieszaniem z platformy kołyskowej.
    3. Wysuszyć szkiełko, wykonując krótkie wirowanie (200 - 300 x g przez 1 min) za pomocą dostępnej w handlu mikrowirówki przystosowanej do szkiełek mikroskopowych. Alternatywnie osusz szkiełko, delikatnie stukając w ręcznik papierowy.
  2. Inkubacja ekstraktu próbki multianalitu z mikromacierzą
    1. Ustaw szkiełko w komercyjnej kasecie hybrydyzacyjnej mikromacierzy z 24 dołkami dla wielu mikromacierzy; postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy.
    2. Po zmontowaniu szkiełka i kasety należy odpipetować do 50 μl ekstraktu próbki lub rozcieńczyć go w TBSTRR do każdej studzienki kasety.
    3. Powtórzyć krok 7.2.2 dla każdej próbki, która ma być poddana analizie.
    4. Jako ślepą próbę należy odpipetować 50 μl buforu TBSTRR do co najmniej dwóch oddzielnych studzienek kasety.
    5. Inkubować w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę z mieszaniem przez pipetowanie co 15 minut lub pozostawić pod łagodnym wstrząsaniem. Alternatywnie inkubować przez 12 godzin w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Użyj innych uszczelek inkubacyjnych w funkcji wzoru mikromacierzy. Czas i temperatura inkubacji w kroku 7.2.5 są parametrami empirycznymi, które zwykle zależą od powinowactwa i kinetyki wiązania każdego sparowanego antygenu-przeciwciała.
  3. mycie
    1. Wyjmij próbki, odkładając kasetę i ostrożnie uderzając nią o czysty, chłonny papier.
    2. Umyj studzienki, dodając do każdej z nich 150 μl TBSTRR i wyeliminuj bufor, jak powyżej.
    3. Powtórz krok 7.3.2 jeszcze trzy razy.
  4. Inkubacja z przeciwciałami detektora fluorescencyjnego
    1. Dodać 50 μl mieszaniny przeciwciał zawierającej 17 przeciwciał przeciwko szczepowi sinic, z których każde jest znakowane fluorochromem w TBSTRR z 1% (w/v) BSA. Określić stężenie każdego przeciwciała fluorescencyjnego w mieszaninie (od 0,7 do 2 μg/ml), wykonując eksperymenty miareczkowania każdej pary antygen/przeciwciało22.
    2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze otoczenia, jak opisano w kroku 7.2.5, lub przez 12 godzin w temperaturze 4 °C.
  5. Wymywanie przeciwciał fluorescencyjnych
    1. Usunąć fluorescencyjne niezwiązane przeciwciała, jak w kroku 7.3.
    2. Zdemontuj kasetę i zanurz szkiełko w 0,1x PBS (np. w probówce 50 ml) w celu szybkiego spłukania.
    3. Wysuszyć szkiełko jak w kroku 7.1.3.

8. Skanowanie w poszukiwaniu fluorescencji

  1. Zeskanuj szkiełko w poszukiwaniu fluorescencji przy maksymalnym piku fluorescencji emisyjnej dla barwnika fluorescencyjnego dalekiej czerwieni w skanerze fluorescencji. Wykonaj kilka zdjęć mikromacierzy przy różnych parametrach skanowania, zazwyczaj poprzez obniżenie wartości wzmocnienia lasera.
    UWAGA: Unikaj nasyconych plam (> 65 000 zliczeń fluorescencji) — są one poza skalą i mogą powodować błędy ilościowe.

9. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

  1. Do analizy i kwantyfikacji obrazu należy użyć komercyjnego oprogramowania; oprogramowanie zapewnia pomiary intensywności fluorescencji (FI; mediana lub średnia wszystkich pikseli z jednego miejsca) dla każdej plamki całej mikromacierzy. Odejmij lokalne tło wokół plam: FI =FI spot - FIlokalne tło.
  2. Zapisz dane FI i otwórz je za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
  3. Użyj wartości uzyskanych dla pustych tablic jako kontroli ujemnej, aby zidentyfikować i odrzucić wyniki fałszywie dodatnie. Zastosuj następujące równanie, aby obliczyć FI dla każdej plamki przeciwciała: FI = (próbka FI -ślepa próba FI), gdziepróbka FI =plamka FI -FI lokalne tło w mikromacierzach przebieg z ekstraktami próbek, aślepa próba FI =plamka FI -lokalne tło FI w ślepych mikroukładach.
  4. Zastosuj dodatkowy próg odcięcia od 2 do 3 razy większy od średniej FI całej mikromacierzy, aby zminimalizować prawdopodobieństwo wyników fałszywie dodatnich; jest to szczególnie istotne w przypadku obrazów mikromacierzy o niskiej jakości i niskich proporcjach sygnału do szumu.
  5. Twórz wykresy i/lub przeprowadzaj dalsze analizy, jeśli to konieczne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje multipleksowy test immunologiczny do jednoczesnej identyfikacji najbardziej istotnych gatunków sinic słodkowodnych (Tabela 1) przy użyciu mikromacierzy przeciwciał CYANOCHIP. Mikromacierz może być w formacie 3 x 8 wydrukowanym na szkiełkach mikroskopowych. Każda mikromacierz składa się z zestawu 17 przeciwciał wydrukowanych w potrójnym układzie punktowym, odpowiadających im przeciwciał przedimmunologicznych i BSA jako kontroli negatywnych. Mikromacierze z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tymartykule opisano multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny typu sandwich z wykorzystaniem CYANOCHIP, mikromacierzy 17 przeciwciał do wykrywania i identyfikacji szerokiego zakresu rodzajów sinic. Sinice te reprezentują najczęstsze rodzaje bentosu i planktonu w siedliskach słodkowodnych, a niektóre z nich są producentami toksyn. Ostatnio format fluorescencyjnego testu immunologicznego typu sandwich został wykorzystany do identyfikacji mikroorganizmów i/lub bioanalitów w zastoso...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Antonio Quesada z Universidad Autónoma de Madrid za dostarczenie szczepów sinic. Prace te zostały sfinansowane przez Subdirección General de Proyectos de Investigación hiszpańskiego Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), dotacje nr. AYA2011-24803 oraz ESP2014-58494-R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Filtry o średnicy porów 0,22 mmMilliporeGSWP04700Do wytwarzania immunogenów
Eppendorf  5424R mikrowirówkaFisher ScientificDo wytwarzania immunogenów
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) pH 7,4 (10x)Thermo Fisher Scientific7001103650 mM fosforan potasu, 150 mM NaCl, pH 7,4
Procesor ultradźwiękowy UP50HHielscherDo przygotowania immunogenów
Kompletny adiuwant Freunda Sigma-AldrichF5881Immunopotencjolitr
Niekompletny adiuwant FreudaSigma-Aldrich F5506Do zastrzyków wzmacniających
Zestaw do oczyszczania przeciwciał A z białkiem A   Sigma-AldrichPURE1A Do izolacji IgG
Odśrodkowe urządzenia filtracyjne MWCO< 100 kDaMiliporeUFC510096-96KDo izolacji
przewodów do dializy IgG, benzoilowanySigma-AldrichD7884-10FTDo izolacji kolumn IgG
Illustra Microspin G-50 GE-HealthCareGE27-5330-02Do izolacji odczynnika IgG
BradfordSigma-AldrichB6916-500 mlDo ilościowego określenia stężenia przeciwciał
Zestaw do oznaczania białka MicroBCA Thermo Scientific23235Do ilościowego oznaczania stężenia przeciwciał
Bufor do układania białek 2xWhatman (Sigma Aldrich) S00537Bufor drukarski; 30 - 40% glicerol w 1x PBS z 0,01% Tween
20 Tween 20 Sigma-Aldrich P9416Niejonowy detergent
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich A9418Kontrola  do drukowania; odczynnik blokujący
384-dołkowa mikropłytkaGenetixX6004Do drukowania przeciwciał
Robot macierzujący do wielu szkiełekMatryca MicroGrid II TAS firmy DigilabDo drukowania przeciwciał
Szkiełka epoksydowe z podłożemArrayit corporationVEPO25CSolidne wsparcie do drukowania przeciwciał
Alexa Fluor-647 Ester sukcynimidylu Sondy molekularneA20006Fluorochrom
DMSO Sigma-Aldrich D8418Rozpuszczalnik fluorochromowy
Wytrząsarka wibracyjna Heidolph TitramaxFisher ScientificDo znakowania przeciwciał 
Kolumny Illustra Microspin G-50 Opieka zdrowotna27-5330-01Do oczyszczania znakowanych przeciwciał
Bezpieczne brązowe probówki 0,5 mlSarstedt72,704,001Do przechowywania znakowanych przeciwciał 
Spektrofotometr Nanodrop 1000Thermo ScientificDo ilościowego określania stężenia przeciwciał i skuteczności znakowania
3 i mikro; m Rozmiar porów Filtr z poliwęglanu o średnicy 47 mmMilliporeTMTP04700Do koncentracji komórek
1 M Roztwór chlorowodorku Trizma pH 8Sigma-Aldrich T3038Do preparatu TBSTRR; do blokowania slajdów
Chlorek soduSigma-Aldrich S7653Do preparatu TBSTRR
20 i mikro; Filtry nylonowe M MilliporeNY2004700Do przygotowania ekstraktu środowiskowego
Uchwyty filtrów 10 - 12 mmMilliporeSX0001300Do przygotowania ekstraktu środowiskowego
Koktajl inhibitorów proteazySigma-Aldrich P8340Do przechowywania ekstraktu środowiskowego
1 M roztwór chlorowodorku Trizma pH 9Sigma-Aldrich T2819Do blokowania zjeżdżalni
Wytrząsarka z platformą wahadłową Heidolph Duomax 1030VWRDo blokowania zjeżdżalni; do procesów inkubacji 
Mikrowirówka minimacierzowa VWR GalaxyVWRC1403-VWRDo suszenia szkiełek
Kaseta do hybrydyzacji mikromacierzy Multi-WellArrayit corporationAHC1X24Kaseta do 24 testów na szkiełku
Skaner mikromatrycowy GenePix 4100A molekularneSkaner do fluorescencji
Oprogramowanie GenePix ProOprogramowanie do urządzeńdo analizy obrazu i kwantyfikacji
Urządzenia molekularnych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
  2. Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
  3. Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
  4. Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
  5. Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
  6. Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
  7. Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
  8. Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
  9. Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
  10. Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
  11. Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
  12. Parro, V. Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).
  13. Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
  14. Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
  15. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
  16. Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
  17. Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
  18. Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
  19. Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
  20. Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
  21. Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
  22. Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
  23. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
  24. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
  27. Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180(2014).
  28. Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
  29. Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
  30. McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cyanobacteria DetectionAntibody Microarray ChipFluorescent Sandwich ImmunoassayCyanobacterial Strain IdentificationLiquid Sample FiltrationSolid Sample HomogenizationHandheld UltrasonicatorPortable Fluorescence DetectorMultiplex Immunoassay ProtocolEnvironmental Monitoring

Related Articles