Artykuł metodologiczny

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

DOI:

10.3791/55001

⸱

27 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agregaty neuronalnego białka Tau znajdują się w neuronach pacjentów z chorobą Alzheimera. Rozwojowi choroby towarzyszy wzmożona, nieprawidłowa fosforylacja Tau. W trakcie badań molekularnych funkcji i dysfunkcji Tau w chorobie stosuje się spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w celu identyfikacji wielorakich fosforylacji Tau. Przedstawiamy szczegółowe protokoły rekombinowanej produkcji Tau w bakteriach, z wzbogacaniem izotopowym do badań NMR. Opisano etapy oczyszczania, które wykorzystują stabilność cieplną Tau i wysoki punkt izoelektryczny. Protokół fosforylacji Tau in vitro przez rekombinowany aktywowany ERK2 pozwala na generowanie wielu fosforylacji. Próbka białka jest gotowa do pozyskania danych na etapie tych kroków. Następnie rozważana jest konfiguracja parametrów w celu rozpoczęcia nagrywania na spektrometrze. Na koniec wyjaśniono strategię identyfikacji miejsc fosforylacji zmodyfikowanego Tau na podstawie danych NMR. Omówiono korzyści płynące z tej metodologii w porównaniu z innymi technikami stosowanymi do identyfikacji miejsc fosforylacji, takimi jak immunodetekcja lub spektrometria mas (MS).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań opieki zdrowotnej w XXIwieku są choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD). Tau jest białkiem związanym z mikrotubulami, które stymuluje tworzenie mikrotubul (MT). Tau jest w równym stopniu zaangażowane w kilka zaburzeń neurodegeneracyjnych, tak zwanych tauopatii, z których najbardziej znaną jest AD. W tych zaburzeniach Tau samoczynnie agreguje się w sparowanych spiralnych włóknach (PHF) i jest modyfikowany na wielu resztach przez modyfikacje potranslacyjne (PTM), takie jak fosforylacja1. Fosforylacja białka Tau jest zaangażowana zarówno w regulację jego fizjologicznej funkcji stabilizacji MT, jak i patologiczną utratę funkcji, która charakteryzuje neurony AD.

Ponadto, białko Tau, gdy jest zintegrowane z PHF w chorych neuronach, jest niezmiennie hiperfosforylowane2. W przeciwieństwie do normalnego Tau, który zawiera 2-3 grupy fosforanowe, hiperfosforylowane Tau w PHF zawiera od 5 do 9 grup fosforanowych3. Hiperfosforylacja Tau odpowiada zarówno wzrostowi stechiometrii w niektórych miejscach, jak i fosforylacji dodatkowych miejsc, które nazywane są patologicznymi miejscami fosforylacji. Jednak istnieje nakładanie się na siebie między AD a normalnymi wzorcami fosforylacji u dorosłych, pomimo różnic ilościowych na poziomie4. To, w jaki sposób określone zdarzenia fosforylacji wpływają na funkcję i dysfunkcję Tau, pozostaje w dużej mierze nieznane. Naszym celem jest rozszyfrowanie regulacji Tau przez PTM na poziomie molekularnym.

Aby pogłębić zrozumienie molekularnych aspektów Tau, musimy zmierzyć się z wyzwaniami technicznymi. Po pierwsze, Tau jest białkiem wewnętrznie nieuporządkowanym (IDP) wyizolowanym w roztworze. Takie białka nie mają dobrze zdefiniowanej trójwymiarowej struktury w warunkach fizjologicznych i wymagają szczególnych metod biofizycznych do badania ich funkcji i właściwości strukturalnych. Tau jest paradygmatem dla rosnącej klasy osób wewnętrznie przesiedlonych, często kojarzonych z patologiami, takimi jak choroby neurodegeneracyjne, co zwiększa zainteresowanie zrozumieniem parametrów molekularnych leżących u podstaw ich funkcji. Po drugie, charakterystyka fosforylacji Tau jest wyzwaniem analitycznym, z 80 potencjalnymi miejscami fosforylacji wzdłuż sekwencji najdłuższej 441 aminokwasowej izoformy Tau. Opracowano szereg przeciwciał przeciwko fosforylowanym epitopom Tau i są one wykorzystywane do wykrywania patologicznego Tau w neuronach lub tkance mózgowej. Zdarzenia fosforylacji mogą zachodzić w co najmniej 20 miejscach, do których skierowane są kinazy skierowane na prolinę, większość z nich znajduje się w bliskiej odległości w regionie bogatym w prolinę. Charakterystyka jakościowa (które miejsca?) i ilościowa (jaka stechiometria?) jest trudna nawet przy użyciu najnowszych technik stwardnieniarozsianego 5.

Spektroskopia NMR może być używana do badania nieuporządkowanych białek, które są wysoce dynamicznymi systemami złożonymi z zespołów konformerów. Spektroskopia NMR o wysokiej rozdzielczości została wykorzystana do zbadania zarówno struktury, jak i funkcji białka Tau. Ponadto złożoność profilu fosforylacji Tau doprowadziła do opracowania narzędzi molekularnych i nowych metod analitycznych wykorzystujących NMR do identyfikacji miejsc fosforylacji 6-8. NMR jako metoda analityczna pozwala na identyfikację miejsc fosforylacji Tau w sposób globalny, wizualizację wszystkich modyfikacji w jednym miejscu w jednym eksperymencie oraz ilościowe określenie stopnia włączenia fosforanu. Punkt ten jest istotny, ponieważ chociaż badania nad fosforylacją Tau obfitują w literaturę, większość z nich przeprowadzono na przeciwciałach, co pozostawia duży stopień niepewności co do pełnego profilu fosforylacji, a tym samym prawdziwego wpływu poszczególnych zdarzeń fosforylacji. W formie aktywnej można przygotować kinazy rekombinowane, w tym PKA, kinazę syntazy glikogenu 3β (Gsk3β), kinazę zależną od cyklin 2/cyklinę A (CDK2/), białko aktywujące kinazę zależną od cykliny 5 (CDK5)/p25, kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym 2 (ERK2) i kinazę regulującą powinowactwo do mikrotubul (MARK), które wykazują aktywność fosforylacyjną w stosunku do Tau. Ponadto mutanty Tau, które pozwalają na generowanie specyficznych izoform białka Tau o dobrze scharakteryzowanych wzorcach fosforylacji, są wykorzystywane do rozszyfrowania kodu fosforylacji Tau. Spektroskopia NMR jest następnie wykorzystywana do charakteryzowania enzymatycznie modyfikowanych próbek Tau 6-8. Chociaż fosforylacja Tau in vitro jest trudniejsza niż pseudofosforylacja, np. poprzez mutację wybranego Ser/Thr do reszt kwasu glutaminowego (Glu), podejście to ma swoje zalety. Rzeczywiście, ani wpływ strukturalny, ani parametry interakcji fosforylacji nie zawsze mogą być naśladowane przez kwasy glutaminowe. Przykładem jest motyw skrętu obserwowany wokół fosfoseryny 202 (pSer202)/fosfotreoniny 205 (pThr205), który nie jest odtwarzany z mutacjami Glu9.

Tutaj najpierw zostanie opisane przygotowanie izotopowo znakowanego Tau do badań NMR. Białko Tau fosforylowane przez ERK2 jest modyfikowane w wielu miejscach opisywanych jako patologiczne miejsca fosforylacji, a zatem stanowi interesujący model hiperfosforylowanego Tau. Przedstawiono szczegółowy protokół fosforylacji Tau in vitro przez rekombinowaną kinazę ERK2. ERK2 jest aktywowany przez fosforylację przez kinazę białkową aktywowaną mitogenem/kinazę ERK (MEK)10-12. Oprócz otrzymywania zmodyfikowanego, znakowanego izotopowo białka Tau, opisano strategię NMR stosowaną do identyfikacji PTM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja 15N, 13C-Tau (Rysunek 1)

  1. Przekształć rekombinowany plazmid13,14 ekspresji T7 pET15b-Tau w kompetentne komórki bakteryjne Escherichia coli BL21(DE3)15,
    UWAGA: cDNA kodujące najdłuższą (441 reszt aminokwasowych) izoformę Tau jest klonowana między miejscami restrykcyjnymi NcoI i XhoI w plazmidzie pET15b.
    1. Delikatnie wymieszaj 50 μl kompetentnych komórek BL21(DE3), tworząc 1-5 x 107 kolonii na μg plazmidowego DNA, ze 100 ng plazmidowego DNA w plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Szczepy bakteryjne zoptymalizowane pod kątem użycia kodonów do eukariotycznej ekspresji cDNA nie są niezbędne do produkcji ludzkiego Tau.
    2. Umieść mieszaninę komórek na lodzie na 30 minut, a następnie poddaj szokowi termicznemu przez 10 sekund w temperaturze 42 °C. Umieść probówkę z powrotem na lodzie na 5 minut i dodaj 1 ml pożywki LB (Luria-Bertani) o temperaturze pokojowej. Zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem.
  2. Rozprowadzić za pomocą pętli inokulacyjnej 100 μl zawiesiny komórkowej równomiernie na płytce agarowej z pożywką LB zawierającą 100 μg/ml antybiotyku ampicyliny.
  3. Inkubować płytkę selekcyjną przez 15 godzin w temperaturze 37 °C.
  4. Przechowywać płytkę selekcyjną w temperaturze 4 °C do momentu przejścia do etapu hodowli, maksymalnie przez około 2 tygodnie.
    UWAGA: można przygotować zapas glicerolu w kulturze bakteryjnej (50% glicerolu), przechowywany w temperaturze -80 °C, w celu rozpoczęcia hodowli na późniejszym etapie.
  5. Dodać 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100 x dopełniacza witaminowego MEM, 1 ml 100 mg/ml ampicyliny do 1 l autoklawowanych soli M9 (6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl).
    UWAGA: Po dodaniu roztworu CaCl2 do soli M9 utworzy się biały osad, który szybko się rozprasza.
  6. Rozpuścić 300 mg pożywki 15N, 13C-complete, 1 g 15NH4Cl i 2 g 13C6-glukozy w 10 ml pożywki M9. Przefiltrować i wysterylizować roztwór izotopowy za pomocą filtra 0,2 μm, bezpośrednio do pożywki M9.
  7. Zawiesić za pomocą pętli inokulacyjnej jedną kolonię bakterii przekształconych w pET15b-Tau z płytki selekcyjnej w 20 ml pożywki LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny.
  8. Inkubować zaszczepioną pożywkę w temperaturze 37 °C przez około 6 godzin.
  9. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) na 1 ml dziesięciokrotnego rozcieńczenia kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru.
    UWAGA: Zmętnienie kultury bakteryjnej odpowiadające OD600 wynoszące 3,0-4,0 wskazuje, że osiągnięto fazę wzrostu nasycenia.
  10. Dodać 20 ml nasyconej kultury LB do 1 l pożywki wzrostowej M9 uzupełnionej ampicyliną (100 μg/ml stężenie końcowe) do 2 l plastikowej kolby hodowlanej Erlenmeyera.
  11. Umieścić kolbę hodowlaną w programowalnym inkubatorze ustawionym na 10 °C i 50 obr./min. Zaprogramować inkubator tak, aby przełączał się na 200 obr./min i 37 °C wcześnie rano następnego dnia.
  12. Zmierzyć OD600 na 1 ml kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru. Dodać 400 μl 1 M roztworu podstawowego IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu) (przechowywanego w temperaturze -20 °C), gdy OD600 osiągnie wartość około 1,0, w celu wywołania ekspresji rekombinowanego białka Tau.
  13. Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez kolejne 3 godziny. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 20 minut.
  14. Zamrozić granulat bakteryjny w temperaturze -20 °C. Przechowywać w stanie zamrożonym do momentu oczyszczenia, w razie potrzeby przez dłuższy czas.

2. Oczyszczanie 15 N, 13 C-Tau (Rysunek 2)

  1. do oczyszczania kationowymiennego w autoklawie (CEX) w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 psi przez 20 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozmrozić osad komórek bakteryjnych i dokładnie zawiesić w 45 ml ekstrakcji Bufor CEX A (50 mM NaPi, bufor pH 6,5, 1 mM EDTA) świeżo uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy 1x (1 tabletka) i DNAseI (2,000 jednostek).
  3. Rozbić komórki bakteryjne za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego o ciśnieniu 20 000 psi. Konieczne są 3-4 przejścia. Wirować przy 20 000 x g przez 40 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.
  4. Podgrzewać ekstrakt z komórek bakteryjnych przez 15 minut w temperaturze 75 °C w łaźni wodnej.
    UWAGA: po kilku minutach obserwuje się biały osad.
  5. Wirować przy 15 000 x g przez 20 minut i utrzymywać supernatant zawierający stabilne termicznie białko Tau.
  6. Przechowywać w temperaturze -20 °C do następnego etapu oczyszczania, jeśli jest to konieczne.
  7. Przeprowadzić chromatografię kationowymienną na mocnej żywicy CEX wypełnionej jako kolumna ze złożem o pojemności 5 ml przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) (Rysunek 3 A).
    1. Ustawić natężenie przepływu na 2,5 ml/min.
    2. Zrównoważyć kolumnę w buforze CEX A
    3. Załadować 60-70 ml podgrzanego ekstraktu zawierającego Tau za pomocą pompy do próbki lub alternatywnie pompy A, w zależności od systemu. Pobrać przepływ do analizy w celu sprawdzenia, czy białko Tau skutecznie wiąże się z żywicą (patrz 2.8).
    4. Przemyć żywicę buforem CEX A, aż absorbancja przy 280 nm powróci do wartości wyjściowej.
    5. Eluować Tau z kolumny za pomocą trzystopniowego gradientu NaCl otrzymanego przez stopniowe zwiększanie buforu CEX B (bufor CEX A z 1 M NaCl). Zaprogramuj FPLC w następujący sposób: pierwszy krok gradientu do 25% bufora CEX B w 10 objętościach kolumn (CV), aby osiągnąć 250 mM NaCl, drugi krok do 50% bufora CEX B w 5 CV, aby osiągnąć 500 mM NaCl, a trzeci krok do 100% bufora CEX B w 2 CV, aby osiągnąć 1 M NaCl. Zebrać 1,5 ml frakcji podczas etapów elucji.
  8. Przeanalizować 10 μl frakcji zebranych na etapie elucji za pomocą SDS-PAGE (12% SDS-akryloamidu w żelu) i barwienia Coomassie (ryc. 3 A)16. Sprawdź również stopień załadunku kolumny, analizując 10 μl przepływu.
  9. Wybierz frakcje zawierające Tau i połącz te frakcje w następnym kroku.
  10. Przeprowadzić wymianę buforową na frakcjach zbiorczych zawierających Tau (Rysunek 3 B).
    1. Wyrównać kolumnę odsalającą z 53 ml złoża wypełnionego żywicą G25 (26 x 10 cm) w 50 mM wodorowęglanu amonu (bufor lotny) za pomocą systemu FPLC.
    2. Ustawić natężenie przepływu na 5 ml/min. Wstrzyknąć próbkę Tau do kolumny za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 5 ml. Zebrać frakcje odpowiadające pikowi absorpcji przy 280 nm.
    3. Powtórzyć wstrzyknięcie 3-4 razy, w zależności od objętości początkowej puli CEX.
  11. Obliczyć ilość oczyszczonego białka Tau, wykorzystując pole piku chromatogramu przy 280 nm (1 mg Tau odpowiada 140 mAU*ml).
    UWAGA: Współczynnik ekstynkcji białka Tau przy 280 nm wynosi 7 550 M-1 cm-1. Tau nie zawiera żadnych pozostałości Trp.
  12. Zbierz wszystkie frakcje Tau.
  13. Podwielokrotność próbki rozmieścić w probówkach zawierających równoważnik 1-5 mg Tau. Należy wybrać te probówki tak, aby objętość roztworu była mała w porównaniu z objętością probówki (na przykład 5 ml roztworu w probówce o pojemności 50 ml).
  14. Przebij otwory w nakrętkach probówek za pomocą igły. Próbki Tau należy zamrozić w temperaturze -80 °C.
  15. Liofilizuj próbki Tau. Liofilizowane białko Tau może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez długi czas.

3. Fosforylacja in vitro 15N-Tau

  1. Rozpuścić 5 mg liofilizowanego Tau w 500 μl buforu do fosforylacji (50 mM Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
  2. Dodać 2,5 mM ATP (25 μl 100 mM roztworu podstawowego utrzymywanego w temperaturze -20 °C), 1 mM DTT (1 μl 1 M roztworu podstawowego utrzymywanego w temperaturze -20 °C), 1 mM EGTA (2 μl 0,5 M roztworu podstawowego), 1 x koktajl inhibitora proteazy (25 μl z 40 x roztworu podstawowego otrzymanego przez rozpuszczenie 1 tabletki w 1 ml buforu fosforylacyjnego) i 1 μM aktywowany His-ERK2 (250 μl w buforze konserwującym 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl i 10% glicerolu, przechowywanym w temperaturze -80 °C) w całkowitej objętości próbki 1 ml.
    UWAGA: Aktywowany His-ERK2 można wytworzyć we własnym zakresie5,8 przez fosforylację kinazą MEK.
  3. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Podgrzewać próbkę w temperaturze 75 °C przez 15 minut w celu inaktywacji kinazy ERK.
  5. Wirować przy 20 000 x g przez 15 minut. Zebrać i przechowywać supernatant.
  6. Odsalić próbkę białka do 50 mM wodorowęglanu amonu za pomocą kolumny wypełnionej żywicą G25 o pojemności 3,45 ml (1,3 x 2,6 cm), która jest odpowiednia dla próbki o objętości 1 ml.
  7. Uruchom 12% SDS-PAGE16 z 2,5 μl próbki białka, aby sprawdzić zarówno jej integralność, jak i wydajną fosforylację (ryc. 4).
  8. Liofilizuj ufosforylowaną próbkę Tau. Przechowywać proszek w temperaturze -20 °C.

4. Akwizycja widm NMR (Rysunek 5)

  1. Rozpuścić 4 mg liofilizowanego 15N, 13C ERK-fosforylowanego-Tau w 400 μl buforu NMR (50 mM NaPi lub 50 mM deuterowanego Tris-d11. Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA i 1 mM DTT).
  2. Dodać 5% D2O do blokowania pola spektrometru NMR i 1 mM TMSP (sól sodowa kwasu 3-(trimetylosililo)propionowego-2,2,3,3-d4)) jako wewnętrznego odniesienia sygnału NMR. Dodać 10 μl 40-krotnego roztworu podstawowego kompletnego koktajlu inhibitorów proteazy.
  3. Przenieść próbkę w probówce NMR o średnicy 5 mm za pomocą elektronicznej strzykawki z długą igłą lub pipety Pasteura. Zamknąć rurkę NMR za pomocą tłoka. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między tłokiem a cieczą za pomocą ruchów tłoka.
  4. Umieść probówkę NMR w wirówce. Dostosuj jego pionowe położenie w wirówce za pomocą odpowiedniego miernika dla używanej głowicy sondy NMR, tak aby większość roztworu próbki znajdowała się wewnątrz cewki NMR.
  5. Uruchom przepływ powietrza: kliknij przycisk lift w oknie systemu sterowania magnesami. Ostrożnie umieść kołpak z rurką w strumieniu powietrza w górnej części otworu magnesu. Zatrzymaj przepływ powietrza (kliknij podnoszenie) i pozwól, aby rurka opadła na miejsce wewnątrz głowicy sondy w magnesie.
  6. Ustawić temperaturę na 25 °C (298 K).
  7. Wykonaj półautomatyczne dostrajanie i dopasowywanie głowicy sondy, aby zoptymalizować przenoszenie mocy. Wpisz atmm w wierszu poleceń.
  8. Zablokować częstotliwość spektrometru za pomocą sygnału D2O próbki zarejestrowanej na kanale deuteru. Kliknij kłódkę w oknie systemu sterowania magnesami.
  9. Rozpocznij procedurę podkładkowania, aby zoptymalizować jednorodność pola magnetycznego w pozycji próbki. Wpisz topshim gui w wierszu poleceń, aby otworzyć okno podkładki. Kliknij przycisk start w oknie podkładki. Sprawdź resztkową wartość odchylenia standardu B0, aby upewnić się, że podkładki regulacyjne są optymalne (mniej niż 2 Hz jest dobre).
  10. Skalibruj parametr p1 (długość impulsu o częstotliwości radiowej protonu w μs), który jest niezbędny do uzyskania rotacji spinów protonów o 90°. Celuj w impuls 360° za pomocą widma 1D protonów wodnych (ryc. 6).
  11. Dostosuj przesunięcie częstotliwości, ustawiając parametr o1 (w Hz) na częstotliwość wody protonowej w widmie 1D (rysunek 6).
  12. Rozpocznij akwizycję widma protonów 1D (sekwencja impulsów z sekwencją watergate do tłumienia sygnału wodnego, na przykład zggpw5) w celu weryfikacji sygnałów z próbki (rysunek 7). Dostosuj liczbę skanów do względnego stężenia białka. Wpisz zg w wierszu polecenia, aby rozpocząć pobieranie.
  13. Ustaw dodatkowe parametry do akwizycji widma 2D [1 H,15N] HSQC (sekwencja impulsów hsqcetfpf3gpsi, rysunki 8-9).
    1. W przypadku próbki znakowanej 15 N,13C należy odsprzęgnąć 13C podczas pośredniej ewolucji 15N.
    2. Ustaw liczbę punktów i szerokość widmową (ppm) w wymiarach 1H (F2) i 15N (F1).
      UWAGA: Dostosuj liczbę punktów danych akwizycji do pola spektrometru, aby utrzymać podobną liczbę Hz na punkt i ograniczyć czasy rozprzęgania: użyj 3 072 punktów przy 900 MHz i 2 048 punktów przy 600 MHz, w wymiarze 1H.
    3. Zoptymalizuj dodatkowe parametry w sekwencjach impulsów, odpowiadające opóźnieniom, długościom impulsów, częstotliwościom przesunięcia, poziomom mocy. Wpisz ased w wierszu polecenia, aby wyświetlić wszystkie parametry istotne dla eksperymentu.
  14. Ustawić parametry akwizycji widma 3D [1 H,15 N,13C] HNCACB (sekwencja impulsów hncacbgpwg3d, rysunek 10A) przy 600 MHz.
  15. Ustaw parametry dla eksperymentu 3D [1 H,15 N,15N] HNCANNH (sekwencja impulsów hncannhgpwg3d) na częstotliwości 600 MHz. Ustaw liczbę punktów na 2048 w 1H oraz 64 i 128 punktów w dwóch wymiarach 15N. Zdefiniuj szerokości spektralne jako 14, 25, 25 części na milion (ppm) wyśrodkowane na 4,7, 119, 119 ppm w wymiarach 1H, 15N i 15N. Czas akwizycji z 16 skanami wynosi 1 dzień i 22 godziny.

5. Identyfikacja miejsc fosforylacji

  1. Przetwarzaj widma za pomocą oprogramowania do akwizycji i przetwarzania NMR.
    1. Wykonaj transformację Fouriera danych (Rysunek 7). Wpisz ft dla widma 1D, xfb dla widma 2D lub ft3d dla widma 3D w wierszu polecenia.
    2. Phase i odniesienie wszystkich widm (rysunek 7C) za pomocą okien interaktywnych.
  2. Zidentyfikuj interesujące rezonanse w 2D HSQC potencjalnie odpowiadające fosforylowanym resztom Ser i Thr (ryc. 9, czerwona ramka).
  3. Wyodrębnij płaszczyzny (tj. widma 2D 1 H-13C) z widma 3D 1 H-15 N-13C, wykorzystując 15N przesunięć chemicznych rezonansów będących przedmiotem zainteresowania w 2D. Użyj kursora wymiaru 2 (w2), aby wybrać częstotliwość 15N odpowiadającą płaszczyźnie (w1-w3), która ma być wizualizowana (Rysunek 10B).
  4. Wybierz częstotliwości rezonansowe jąder 'CA' i 'CB' 13C reszt 'i' i 'i-1' (słabszy zestaw sygnałów w porównaniu do reszt i) dla każdego [1H, 15N] rezonansu będącego przedmiotem zainteresowania w widmie HNCACB 3D, klikając na rezonans, w menu trybu wskaźnika znajdź/dodaj pik, , aby dodać wartość przesunięcia chemicznego w pliku listy pików.
    1. Zidentyfikować typ reszty i, pSer lub pThr, porównując przesunięcia chemiczne w wykazie pików ze znanymi wartościami przesunięć chemicznych CA i CB pSer i pThr17.
    2. Zidentyfikować obecność pozostałości Pro w pozycji i+1 poprzez charakterystyczne dodatkowe przesunięcie o +2 ppm wartości przesunięcia chemicznego CA18.
    3. Porównaj wartości przesunięcia chemicznego rezonansów CA i CB odpowiadających resztce i-1 z tabelą przesunięć chemicznych przewidywanych dla reszt aminokwasowych Tau19 w celu określenia charakteru reszty w pozycji i-1.
  5. Wybierz częstotliwości rezonansowe 15jąder N reszt "i" i "i-1" dla każdego [1H, 15N] rezonansu będącego przedmiotem zainteresowania w widmie HNCANNH.
  6. Porównaj wartości przesunięcia chemicznego 15N z przypisaniem przesunięcia chemicznego białka Tau20-23.
  7. Porównaj zidentyfikowane dipeptydy z sekwencją Tau, aby zdefiniować przypisanie specyficzne dla sekwencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3A przedstawia główny pik absorpcji przy 280 nm obserwowany podczas gradientu elucji. Pik ten odpowiada oczyszczonemu białku Tau, jak widać na żelu akrylowym powyżej chromatogramu. Rysunek 3B przedstawia dobrze oddzielony pik absorpcji przy 280 nm i pik przewodności, co zapewnia, że odsalanie białka jest wydajne. Rycina 4 przedstawia przesunięcie żelu białkowego obserwowane za pomocą analizy SDS-PAGE16 charakterystyczne dla fosforylacji wielu białek (porównaj pasy 2 i 3). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystaliśmy spektroskopię NMR do scharakteryzowania enzymatycznie modyfikowanych próbek Tau. Opisana tutaj rekombinowana ekspresja i oczyszczanie dla pełnowymiarowego ludzkiego białka Tau może być podobnie wykorzystane do produkcji zmutowanych Tau lub domen Tau. Do spektroskopii NMR potrzebne jest białko wzbogacone izotopowo, co wymaga ekspresji rekombinowanej. Identyfikacja miejsc fosforylacji wymaga przypisania rezonansu i podwójnie znakowanego białka 15N, 13C. Biorąc pod uwagę koszt izotopów,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urządzenia NMR zostały sfinansowane przez Région Nord, CNRS, Instytut Pasteura w Lille, Wspólnotę Europejską (FEDER), francuskie Ministerstwo Badań Naukowych oraz Uniwersytet Nauk i Technologii w Lille. Dziękujemy za wsparcie ze strony TGE RMN THC (FR-3050, Francja), FRABio (FR 3688, Francja) oraz głównego ośrodka Lille NMR i RPE Health and Biology. Nasze badania są wspierane przez granty z LabEx (Laboratory of Excellence), DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer's disease), EU ITN TASPPI oraz ANR BinAlz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pET15B rekombinowany plazmid ekspresji T7Novagen69257Przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
BL21(DE3) kompetentna transformacja E. bakterie coliNew England BiolabsC2527IPrzechowywać w temperaturze -80 ° C
Autoklawizowany bulion LB, Lennox DIFCO240210Pożywka bakteryjna MEM
Suplementy witaminowe 100xSigma58970CBakteryjna pożywka
15N, 13C-ISOGRO kompletne podłoże w proszkuSigma608297Suplement na pożywkę do wzrostu bakterii
15NH4Cl299251 Sigma
13C6-GlucoseSigma389374Tabletki
inhibitora proteazy izotopowej Roche5056489001Trzymaj na 4 & stopni; C
1 tabletka w 1 ml to 40x roztwór, który można przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C
DNaseIEUROMEDEX1307Przechowywać na poziomie -20 stopni;
C Homogenizator (EmulsiFlex-C3)AVESTINodbywa się w temperaturze 4 & stopni; C
Pierce™ Niebarwiony marker białkowy MWPierce266109
Aktywna ludzka kinaza MEK1, GST TaggedSigmaM8822Utrzymuj na poziomie -80 ° C
AKTÄ System chromatografii czystejGE HealthcareFPLC
HiTrap SP Sepharose FF (kolumna 5 ml)GE Healthcare17-5156-01Kolumny chromatografii kationowymiennej
HiPrep 26/10 OdsalanieGE Healthcare17-5087-01Kolumna do odsalania białek
PD MidiTrap G-25GE Healthcare28-9180-08Kolumna do odsalania białek
Tris D11, 97% DCortecnetCD4035P5Deuterowany bufor NMR
5 mm Symetryczna mikrorurka SHIGEMI D2O (zestaw 5 rurek wewnętrznych i zewnętrznych) Euriso-topBMS-005BNMR Shigemi
Tubes eVol kit-elektroniczny zestaw startowy strzykawkiCortecnet2910000Pipetowanie
Bruker 900 MHz AvanceIII z potrójnym rezonansem głowica sondy kriogenicznejSpektrometr NMR Brukerdo akwizycji danych
Bruker 600 MHz Avance z głowicą kriogeniczną z potrójnym rezonansemNMR Brukerdo akwizycji danych
TopSpin 3.1BrukerOprogramowanie do akwizycji i przetwarzania eksperymentów NMR
Sparky 3.114UCSF (T. D. Goddard i D. G. Kneller)Oprogramowanie do analizy danych NMR
wzrostowa Suplement Izotop Liza Spektrometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482(2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34(2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679(2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521(2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fosforylacja bia ka tauProdukcja bia ka rekombinowanegoWzbogacenie izotopoweChromatografia wymiany kationowejOczyszczanie metod stabilno ci termicznejFosforylacja in vitroPozyskiwanie danych NMRIdentyfikacja miejsc fosforylacji

Powiązane artykuły