Artykuł metodologiczny

Eksperymentalny projekt mikrodysekcji laserowej RNA-Seq: wnioski z analizy rozwoju liści kukurydzy

DOI:

10.3791/55004

⸱

5 marca 2017

 ,  , 
1Plant Biology Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University, 2Department of Developmental Genetics, University of Wyoming

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele ważnych rozwojowo genów ma specyficzne dla komórek lub tkanek wzorce ekspresji. W artykule opisano eksperymenty LM RNA-seq w celu identyfikacji genów, które ulegają zróżnicowanej ekspresji na granicy blaszki liściowej kukurydzy i pochwy oraz w mutantach lg1-R w porównaniu z typem dzikim. Omówione tu rozważania eksperymentalne odnoszą się do analiz transkryptomicznych innych zjawisk rozwojowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geny odgrywające ważną rolę w rozwoju często mają przestrzennie i/lub czasowo ograniczone wzorce ekspresji. Często te transkrypty genów nie są wykrywane lub nie są identyfikowane jako wyrażane różnicowo (DE) w analizach transkryptomicznych całych organów roślinnych. Laserowa mikrodysekcja RNA-Seq (LM RNA-Seq) jest potężnym narzędziem do identyfikacji genów, które są DE w określonych domenach rozwojowych. Jednak wybór domen komórkowych do mikrodysekcji i porównania oraz dokładność mikrodysekcji mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentów. W tym miejscu przedstawiono dwa przykłady ilustrujące rozważania projektowe dotyczące eksperymentów transkryptomicznych; analiza sekwencyjna LM RNA w celu identyfikacji genów, które są DE wzdłuż osi proksymalno-dystalnej liści kukurydzy, oraz drugi eksperyment w celu identyfikacji genów, które są DE w mutantach bezjęzycznych1-R (lg1-R) w porównaniu z typem dzikim. Kluczowymi elementami, które przyczyniły się do sukcesu tych eksperymentów, były szczegółowe analizy histologiczne i hybrydyzacyjne in situ analizowanego regionu, selekcja zawiązków liści na równoważnych etapach rozwoju, wykorzystanie morfologicznych punktów orientacyjnych do wyboru regionów do mikrodysekcji oraz mikrodysekcja precyzyjnie zmierzonych domen. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół analizy domen rozwojowych za pomocą LM RNA-Seq. Przedstawione tu dane obrazują, w jaki sposób region wybrany do mikrodysekcji wpłynie na uzyskane wyniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liść kukurydzy jest idealnym modelem do badania powstawania pól rozwojowych podczas morfogenezy, ponieważ posiada wyraźną granicę między ostrzem a osłoną, która jest podatna na genetyczne rozwarstwienie (Rysunek 1A). We wczesnych stadiach rozwoju liścia liniowy pas mniejszych komórek, pasmo preliguli (PLB), dzieli zawiązki liścia na domeny przed ostrzem i pochewką. Z PLB rozwija się języczek przypominający frędzle i trójkątne małżowiny uszne (ryc. 1A, C, D). Badania genetyczne zidentyfikowały mutacje, które zaburzają granicę między ostrzem a osłoną. Na przykład recesywne mutacje liguleless1 (lg1) usuwają ligule i małżowiny uszne1,2,3,4 (Rysunek 1B). Hybrydyzacja in situ ujawniła, że transkrypt lg1 gromadzi się w PLB i wyłaniającym się ligule, co czyni go doskonałym markerem rozwoju liguli5,6 (Figura 1E).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Liście kukurydzy typu dzikiego i bezjęzycznego 1-R. (A) Obszar graniczny blaszki i pochewki dojrzałego liścia typu dzikiego, z widocznymi strukturami języczków i małżowiny usznej. (B) Obszar graniczny pochewki źdźbła dojrzałego liścia bezjęzycznego 1-R wykazujący brak struktur języczka i małżowiny usznej. Liście w A i B zostały przecięte na pół wzdłuż nerwu środkowego. (C) Przekrój wzdłużny przez zawiązki liści typu dzikiego. Próbka została przetworzona i wybarwiona do analizy histologicznej. Języczek inicjujący jest widoczny jako guzek wystający z płaszczyzny liścia (grot strzały). (D) Przekrój podłużny przez zawiązki liści typu dzikiego. Próbka została przetworzona dla LM zgodnie z opisem w tekście. Grot strzałki wskazuje rozpoczęcie ligule. (E) lg1 hybrydyzacja in situ bocznego przekroju podłużnego wierzchołka pędu. Gwiazdki wskazują na akumulację transkryptu lg1 w PLB zawiązka liścia P6. Strzałki wskazują podstawę zawiązka P6. Słupek wskazuje pomiar od podstawy zawiązka do PLB. Podziałka w A i B = 20 mm. Podziałka w C-E = 100 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z reference6(Copyright American Society of Plant Biologists). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W tym badaniu, LM RNA-Seq został wykorzystany do identyfikacji zestawu genów, które są różnie wyrażane (DE) na granicy ostrza i osłonki w stosunku do innych części zawiązka liścia oraz do identyfikacji genów, które są DE w mutantach lg1-R w stosunku do rodzeństwa typu dzikiego. LM RNA-Seq to metoda ilościowego określania akumulacji transkryptu w określonych komórkach lub domenach komórkowych7. Systemy LM łączą laser i mikroskop z kamerą cyfrową. Wyciętą tkankę umieszcza się na szkiełkach podstawowych i ogląda pod mikroskopem. Oprogramowanie LM zazwyczaj zawiera narzędzia do rysowania, które pozwalają użytkownikowi obrysować dowolny wybrany obszar do mikrosekcji. Laser tnie wzdłuż linii, a wybrana tkanka jest katapultowana ze zjeżdżalni do rurki zawieszonej nad zjeżdżalnią. LM pozwala użytkownikowi na mikroanalizę precyzyjnych domen, w tym określonych warstw komórek, a nawet pojedynczych komórek8,9. RNA można następnie wyekstrahować z mikrowypreparowanej tkanki. Następnie komponent RNA-Seq wykorzystuje sekwencjonowanie nowej generacji do sekwencjonowania bibliotek cDNA wygenerowanych z wyekstrahowanego RNA10,11.

Kluczowymi zaletami sekwencjonowania LM RNA są możliwość ilościowego określania akumulacji transkryptu w precyzyjnie zdefiniowanych domenach oraz możliwość jednoczesnego profilowania całego transkryptomu7. Technika ta jest szczególnie przydatna do badania wczesnych zdarzeń rozwojowych, w których obszar zainteresowania jest często mikroskopijny. W poprzednich badaniach wykorzystano LM w połączeniu z technologią mikromacierzy do badania procesów rozwojowych w roślinach9,12,13. RNA-Seq ma tę zaletę, że określa ilościowo transkrypty w szerokim zakresie dynamiki, w tym geny o niskiej ekspresji, a wcześniejsze informacje o sekwencji nie są wymagane10,11. Co więcej, LM RNA-Seq ma potencjał do uwypuklenia ważnych dla rozwoju genów, które mogą zostać pominięte w badaniach przesiewowych mutagenezy z powodu redundancji genetycznej lub śmiertelności mutanta powodującego utratę funkcji.

Geny ważne dla rozwoju, takie jak wąska osłona1 (ns1) i liścienie w kształcie miseczki2 (cuc2), często mają specyficzne wzorce ekspresji tylko jednej lub kilku komórek17,18,19,20. Wiele z nich ulega ekspresji tylko we wczesnych stadiach rozwoju, a nie w dojrzałym narządzie. Kiedy analizowane są całe narządy lub duże domeny, te specyficzne dla komórek transkrypty są rozcieńczane i mogą nie być wykryte w bardziej konwencjonalnych analizach. Umożliwiając analizę precyzyjnie zdefiniowanych domen, LM RNA-Seq umożliwia identyfikację i ilościowe określenie tych specyficznych tkankowo genów.

Kluczowymi czynnikami sukcesu opisanych tutaj eksperymentów były dokładna analiza histologiczna, która kierowała wyborem odpowiedniego etapu rozwoju i domeny do analizy, oraz precyzyjny pomiar domen komórkowo-tkankowych dla LM. Aby upewnić się, że dla wszystkich kontrprób pobrano próbki równoważnych domen, tkankę pobrano z zawiązków liści na tym samym etapie rozwoju, a mikrowypreparowane domeny zmierzono w stosunku do morfologicznych punktów orientacyjnych, takich jak wyłaniająca się ligule (ryc. 2). Wiadomo, że niektóre geny ulegają ekspresji w gradiencie od czubka do podstawy liścia. Dzięki precyzyjnemu pomiarowi domen, zmienność spowodowana pobieraniem próbek z różnych miejsc wzdłuż osi proksymalno-dystalnej liścia została ograniczona do minimum (ryc. 3A). Poprzez mikropreparację domen o tej samej wielkości, zmienność spowodowana zróżnicowanym rozcieńczeniem transkryptów specyficznych dla komórki została również zmniejszona (Figura 3B). Do wszystkich mikrodysekcji wykorzystano boczne przekroje podłużne wierzchołka pędu. Są to odcinki prostopadłe do osi nerwu środkowego (rysunek 4). Używanie tylko sekcji, które zawierają SAM, zapewnia, że analizowane są równoważne boczne obszary zawiązków liści.

W próbkach przetworzonych i podzielonych na sekcje dla LM, pierwszą morfologiczną oznaką rozrostu języczka jest guzek po stronie przyosiowej spowodowany podziałami komórek peryklinalnych w naskórku adaksjalnym (Rysunek 1D, Rysunek 2). Ustalono, że wyłaniający się języczek można wiarygodnie zidentyfikować w zawiązkach liści w stadium plastochron 7. Interesowały nas geny ulegające ekspresji w całym regionie ligułu, w tym w wyłaniającym się języczku i komórkach bezpośrednio dystalnych, które będą tworzyć małżowinę uszną. Aby upewnić się, że dokonano równoważnych selekcji tkanek, guzek liguli został użyty jako morfologiczny punkt orientacyjny, a prostokąt 100 μm wyśrodkowany na guzku liguli został wybrany dla LM (ryc. 2A, 2B). Jednakowej wielkości prostokąty przedostrza i pochwy zostały wybrane z tych samych zawiązków liściowych.

Analizy zmutowanych roślin bez języczków stanowiły inne wyzwanie; Mutanty lg1-R nie tworzą języczka, dlatego ta cecha morfologiczna nie mogła być wykorzystana do wybrania regionu dla LM. Zamiast tego określono domenę akumulacji transkryptu lg1 w zawiązkach liści typu dzikiego i zdefiniowano region, który obejmowałby tę domenę. Te wstępne analizy przeprowadzono na siewkach z tych samych nasadzeń, które zostały wykorzystane do końcowej analizy, ponieważ wcześniejsze prace wykazały, że lokalizacja PLB różni się w zależności od warunków wzrostu. Hybrydyzacja in situ wykazała, że transkrypty lg1 gromadzą się w PLB zawiązków liści P6 (ryc. 1E). Wybraliśmy domenę 400-900 μm od podstawy zawiązków liści, która obejmowała domenę ekspresji lg1 (fioletowe prostokąty, ryc. 2A) i przechwyciliśmy te równoważne regiony z roślin typu dzikiego i lg1-R. Aby zminimalizować różnice w tle genetycznym i warunkach wzrostu podczas porównywania akumulacji transkryptu w lg1-R i roślinach typu dzikiego, zastosowano segregację rodzin mutantów i rodzeństwa typu dzikiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Napraw tkankę do analizy histologicznej w tym samym czasie, w którym tkanka jest ustalana dla LM. Zbadaj wybarwione skrawki pod kątem cech morfologicznych, które poprowadzą później LM. Porównując mutanta z typem dzikim, przeprowadź hybrydyzację in situ lub immunolokalizację, aby zdefiniować domenę, w której dochodzi do ekspresji interesującego genu (w tym przypadku lg1).

1. Utrwalanie i przetwarzanie tkanek

  1. Sadzonki kukurydzy uprawiane są na równinach do dwóch tygodni w standardowych warunkach6.
  2. Wypreparuj wierzchołki pędów dla odcinków bocznych (ryc. 4).
    1. Wyciąć sadzonkę tuż poniżej linii gleby.
    2. Za pomocą żyletki usuń cienkie plasterki z podstawy łodygi (nacięcia 1, ryc. 4A), aż zobaczysz owal łodygi otoczony jednym lub dwoma dojrzałymi liśćmi (ryc. 4B).
    3. Wykonaj kolejne cięcie około 10 mm powyżej podstawy (cięcie 2, Rysunek 4A). Ten 10-milimetrowy segment będzie zawierał SAM i zawiązki młodych liści.
    4. Obróć segment 10 mm tak, aby podstawa była skierowana do góry. Wykonaj dwa cięcia równolegle do osi bocznej, tak aby uzyskać wycinek tkanki o grubości 2-3 mm (nacięcia 3 i 4, ryc. 4B). Wyrzuć dwie zewnętrzne części i zachowaj środkową kromkę do utrwalenia i osadzenia.
      UWAGA: Zewnętrzne liście można przyciąć i wyrzucić.
  3. Napraw tkankę i proces osadzania.
    1. Upewnij się, że wszystkie materiały, które mają być użyte w kolejnych krokach, są wolne od RNazy. Roztwory należy traktować pirowęglanem dietylu (DEPC) (1 ml DEPC na litr roztworu. Inkubować przez noc z okazjonalnym wstrząsaniem i autoklawować). Piecz szklane naczynia w piekarniku w temperaturze 200 °C lub wyższej przez co najmniej 6 godzin i traktuj plastikowe naczynia roztworem do odkażania RNazy.
    2. Dzień 1: Zanurz plastry tkanki w ~ 10 ml Farmer's fix (3:1 Etanol: kwas octowy) w szklanej fiolce na lodzie. Po wypreparowaniu wszystkich próbek należy zastosować próżnię, aby usunąć pęcherzyki powietrza i ułatwić penetrację utrwalacza. Trzymaj pod próżnią przez 10 minut, a następnie powoli zwalniaj odkurzacz. Wymienić utrwalacz i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie wstrząsając.
    3. Dzień 2: Inkubować w następujących seriach roztworów, po ~10 ml każdy, po 1 godzinie każdy, wszystkie delikatnie wstrząsając; 85% etanol w 4 °C, 95% etanol w 4 °C, 100% etanol w 4 °C, 100% etanol w 4 °C, 100% etanol w 4 °C, etanol 1:1: ksyleny w temperaturze pokojowej, 100% ksyleny w temperaturze pokojowej, 100% ksylenów w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Ksyleny są toksyczne przez kontakt i wdychanie. Pracuj pod wyciągiem i używaj odpowiednich rękawic.
    4. Dodać osadzanie w tkance parafinowej do około połowy objętości ksylenów i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
    5. Dzień 3: Przenieść fiolkę do piekarnika o temperaturze 60 °C, aż granulki się rozpuszczą. Odlej roztwór i zastąp świeżo stopionym podłożem do zatapiania tkanek. Zmieniaj podłoże jeszcze dwa razy w ciągu dnia.
    6. Dzień 4: Raz rano należy zmienić podłoże do zatapiania tkanek. Przywrócić piekarnik do 60 °C do popołudnia.
  4. Bloki odlewane
    1. Umieść formy do zatapiania na gorącej płycie stacji zatapiania tkanek. Za pomocą kleszczy przenieś próbki tkanek do form do zatapiania powierzchnią cięcia skierowaną w dół. Uzupełnij formę stopioną parafiną i umieść pierścień do zatapiania na wierzchu formy. Przenieś na zimną płytę, aż parafina zastygnie. Bloki parafiny przechowywać w temperaturze 4 °C w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym.

2. Sekcja i przygotowanie slajdów

  1. Wytnij odcinki 10 μm na mikrotomie25.
  2. Sprawdź wstążki i wybierz sekcje mediany. Sekcje środkowe to te, które zawierają SAM, który pojawia się jako kopuła komórek otoczona zawiązkami liści.
  3. Zamontuj sekcje na zjeżdżalniach.
    1. Umieść szkiełka nadające się do LM (bez RNaz lub upieczone) na podgrzewaczu do szkiełek o temperaturze 42 °C i nałóż kilka kropli 50% roztworu etanolu, aby przykryć szkiełko.
    2. Pływaj sekcje na roztworze etanolu, aż sekcje się rozszerzą.
      UWAGA: Pływające sekcje na roztworze etanolu, a nie na wodzie, utrzymują RNA w stanie wytrąconym, zmniejszając degradację RNA.
    3. Przechylić, przesunąć i usunąć nadmiar roztworu etanolu przez zassanie za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Używaj niestrzępiących się chusteczek, aby usunąć nadmiar roztworu etanolu.
    4. Suszyć szkiełka w temperaturze 42 °C przez kilka godzin lub przez noc. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym.
  4. Odparafinować szkiełka w dniu użytkowania.
    1. Przygotuj trzy szklane słoiki Coplin zawierające: 100% ksylenów (ksyleny I), 100% ksylenów (ksyleny II) i 100% etanolu (~50 ml każdego roztworu).
    2. Używając czystych kleszczy do przenoszenia szkiełek, zanurz szkiełka w ksylenach I na 2 minuty, ksylenach II na 2 minuty i 100% etanolu na 1 minutę.
    3. Odcedź szkiełka na niestrzępiących się chusteczkach i wysusz na powietrzu w temperaturze pokojowej.

3. Mikrodysekcja próbek ostrza, języczka i pochewki z Plastochron 7 Primordia Liści

  1. Zabezpiecz szkiełka na stoliku mikroskopu LM. Użyj pięciu lub sześciu slajdów dla każdej repliki, wykorzystując pięć sekcji na każdą prowadnicę.
    UWAGA: Łączenie tkanek dla pojedynczej kontrpróby zilustrowano na rysunku 5.
  2. Zbadaj slajdy i zidentyfikuj pięć najbardziej medianowych sekcji na każdym slajdzie, używając wierzchołka SAM jako centralnego punktu odniesienia.
    UWAGA: Można to zrobić przy małym powiększeniu, zwykle wystarczy obiektyw 5X.
  3. Używając obiektywu 10X lub 20X, określ położenie języczka na zawiązku liścia plastochron 7 każdej sekcji. Języczek będzie widoczny jako guzek wystający z przyosiowej powierzchni zawiązka liścia. Zaznacz tę pozycję za pomocą narzędzia do rysowania w oprogramowaniu LM; Wybierz ikonę ołówka, przesuń kursor w odpowiednie miejsce, a następnie kliknij i przeciągnij mysz, aby rysować.
    UWAGA: Obiektyw 10X lub 20X jest odpowiedni do tego i kolejnych kroków. W przypadku stosowania odcinków bocznych, dwie strony każdego zawiązka liścia będą obecne w każdej sekcji (ryc. 2A).
  4. Za pomocą linijki i prostokątnego narzędzia do rysowania zmierz prostokąty o wysokości 100 μm wyśrodkowane na języczku każdej sekcji (czerwone prostokąty, rysunek 2A, 2B). Będzie to próbka "Ligule".
    1. Aby użyć narzędzia linijki, wybierz ikonę linijki, przesuń kursor na jeden koniec mierzonego obiektu, kliknij i przeciągnij, aby zmierzyć obiekt. Długość linijki zostanie pokazana na ekranie.
    2. Aby narysować prostokąt, wybierz ikonę prostokąta, przesuń kursor do punktu, który będzie jednym z rogów prostokąta, kliknij i przeciągnij, aby narysować prostokąt o odpowiednim rozmiarze. Możesz też wybrać narzędzie do rysowania linii prostych i narysować cztery linie proste.
    3. Zmierz prostokąty o średnicy 100 μm umieszczone 50 μm powyżej i poniżej prostokąta "Ligule".
      UWAGA: Będą to odpowiednio próbki "Ostrze" i "Pochwa" (zielone i niebieskie prostokąty, rysunek 2A, 2B). Na podstawie naszych danych histologicznych prostokąt o wielkości 100 μm obejmuje cały obszar liguli. Wybrano porcje ostrza i pochwy o równoważnej wielkości, aby zapewnić pobranie podobnych ilości tkanki dla każdej z nich. Zastosowano przekładki o grubości 50 μm, aby upewnić się, że żadna tkanka obszaru liguli nie zostanie przypadkowo włączona do mikrodysekcji ostrza lub pochewki.
    5. Mikroanaliza zmierzonych prostokątów (Rysunek 2D-2F)7,8,9, zbierając próbki Ligule, Blade i Strap w oddzielnych probówkach.
  5. Użyj funkcji cięcia laserowego, aby przeciąć przekrój tkanki wzdłuż konturu wybranej domeny. Użyj funkcji katapulty, aby zepchnąć prostokąt tkanki ze szkiełka do pokrywy rurki (Rysunek 2D-2F).

4. Mikrodysekcja próbek naskórka osiowego ostrza, liguli i pochewki z Plastochron 7 Primordia

liści
  1. Wybierz sekcje i za pomocą linijki zmierz segmenty o wysokości 100 μm wyśrodkowane na języczku plastochron 7, jak opisano w sekcji 3 (powyżej).
    1. Zaznacz tylko nadosiowe komórki naskórka z każdego segmentu "ostrza" i "osłonki" o wysokości 100 μm (zielone i niebieskie zaznaczenia, rysunek 2C), obrysowując je za pomocą narzędzia do rysowania. Naskórek jest zewnętrzną warstwą komórkową; strona adaksjalna jest tą, która znajduje się najbliżej SAM.
    2. Do próbki "Ligule" należy wybrać tylko komórki powstającego guzka liguli, jak opisano w sekcji 3.3 (czerwony wybór, rysunek 2C).
  2. Mikropreparować wybrane obszary, pobierając próbki naskórka ostrza, języczka i pochewki w oddzielnych probówkach, jak opisano w sekcji 3.5.

5. Mikrodysekcja Primordii Plastochron 6 z lg1-R i rodzeństwa typu dzikiego

  1. Uprawiaj segregujące rodziny zmutowanych (lg1-R) i roślin typu dzikiego.
  2. Napraw i przetwórz wierzchołki strzeleckie dla LM, zgodnie z opisem w sekcjach 1.2-1.4. Napraw wierzchołki pędów typu dzikiego i zmutowanego w osobnych fiolkach, aby je rozdzielić. Próbki z tego samego sadzenia powinny być utrwalone i przetworzone do hybrydyzacji in situ.
  3. Określ, gdzie lg1 jest transkrybowany w rodzeństwie typu dzikiego, wykonując hybrydyzację lg1 in situ6,26,27. Zmierz pozycję akumulacji transkryptu lg1 od podstawy zawiązka liścia w wielu próbkach (ryc. 1E).
  4. Na podstawie danych z hybrydyzacji in situ wybierz część zawiązka liści, która obejmuje region, w którym lg1 jest transkrybowany. W tym przypadku 400-900 μm od podstawy plastochronu 6 zawiązków liściowych (fioletowe prostokąty, ryc. 2A).
  5. Mikrodysekcja wybranej części zawiązków liści, jak opisano w sekcji 3.5, zbierając próbki lg1-R i typu dzikiego w oddzielnych probówkach.

6. Zastosuj bufor do ekstrakcji RNA

  1. Nałożyć 50 μl buforu do ekstrakcji RNA na mikrowypreparowaną tkankę i przystąpić ekstrakcję RNA. Kontynuuj ekstrakcję RNA, amplifikację RNA, budowę biblioteki, sekwencjonowanie i analizę bioinformatyczną zgodnie z opisem w reference6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając ze schematu LM opisanego na rysunku 2, zebrano około 1 000 000-1 500 000 μmtkanki 2 dla każdej repliki w warstwach wszystkich komórek LM (Rysunek 5) i 200 000 μm2 na powtórzenie dla LM naskórka adaksjalnego. Zebrano około 2 500 000μm2 tkanki dla każdej kontrpróby w LM lg1-R i zawiązków liści typu dzikiego. Dwie rundy liniowej amplifikacji RNA dały mikrogramowe ilości RNA dla każdej kontrpróby. Ilość RN...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt eksperymentalny jest krytycznym czynnikiem w eksperymentach sekwencyjnych RNA. Kluczowymi kwestiami są dokładna dziedzina (dziedziny) i etap rozwoju (etapy) rozwoju, które mają być analizowane, oraz porównania, które zostaną dokonane. Ważne jest, aby myśleć w kategoriach porównań, ponieważ wynikiem jest zazwyczaj lista genów, które są DE między dwoma lub więcej warunkami. Podobnie jak w przypadku wszystkich eksperymentów, ważne jest, aby zmieniać tylko jedną zmienną na raz. Na przykład, porównując różne domeny li...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują S. Hake za ciągłą współpracę i stymulowanie dyskusji na temat rozwoju liguli. Praca ta jest wspierana przez National Science Foundation Grants MCB 1052051 i IOS-1848478.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pirowęglan dietyluSigma-Aldrich159220Stosowany do leczenia roztworów RNaza
Żyletki Mikroskopia elektronowa Nauki72000
RNase ZapSigma-AldrichR2020-250MLRoztwór do dekontaminacji RNazy
Absolut etanolu 200 proofFisher ScientificBP28184
Kwas octowy, lodowatySigma-AldrichA6283
Fiolki szklane - 22 mlVWR470206-384
Ksyleny klasy histologicznejSigma-Aldrich534056-4L
Paraplast plusSigma-AldrichP3683-1KG
Jednorazowe formy podstawowe, 15 mm x 15 mm x 5 mmVWR15154-072
Pierścienie do zatapianiaVWR15154-303
Saszetki z żelem krzemionkowymMikroskopia elektronowa Sciences71206-01Środek osuszający do przechowywania bloków parafinowych
PiekarnikFisher Scientific15-103-0503Piekarnik musi utrzymywać temperaturę 60 & stopni; C
Stacja osadzania parafinyLeica EG1160
MikrotomLeica RM2235
Podgrzewacz do szkiełekMikroskopia elektronowa Nauki71317-10
Słoiki z koplinyMikroskopia elektronowa Nauki70316-02
Mikrodysektor laserowyZeiss
KIMWIPES™ Wycieraczki do delikatnych zadańKimberly-Clark Professional34120Niestrzępiące się chusteczki do odprowadzania nadmiaru roztworów ze szkiełek mikroskopowych
Szkiełko membranowe 1.0 PENZeiss415190-9041-000Szkiełka do mikrodysekcji laserowej
Samoprzylepna nasadka 200 nieprzezroczystaZeiss415190-9181-000Rurki do mikrodysekcji laserowej
Zestaw do izolacji RNA PicoPureThermoFisher ScientificKIT0204

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development. Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).
  2. Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development. Development. 110 (3), 985-1000 (1990).
  3. Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis. Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).
  4. Emerson, R. A. The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves. Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).
  5. Moon, J., Candela, H., Hake, S. The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth. Development. 140 (2), 405-412 (2013).
  6. Johnston, R., et al. Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation. Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  7. Schmid, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLoS One. 7 (1), e29685(2012).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).
  10. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).
  11. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  12. Brooks, L., et al. Microdissection of shoot meristem functional domains. PLoS Genet. 5 (5), e1000476(2009).
  13. Cai, S., Lashbrook, C. C. Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2. Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).
  14. Li, P., et al. The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).
  15. Eveland, A. L., et al. Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture. Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).
  16. Takacs, E. M., et al. Ontogeny of the maize shoot apical meristem. Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).
  17. Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes. Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).
  18. Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).
  19. Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).
  20. Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems. Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).
  21. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  22. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  23. Brady, S. M., et al. A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns. Science. 318 (5851), 801-806 (2007).
  24. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  25. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. New York; Oxford. (1999).
  26. Jackson, D., Veit, B., Hake, S. Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot. Development. 120, 405-413 (1994).
  27. Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants. J Vis Exp. (57), e3328(2011).
  28. Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm. Int J Plant Genomics. , 61028(2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie RNAkrojenie tkanekzatapianie w parafiniemarkery morfologiczneidentyfikacja liguliekstrakcja RNAanaliza r nicowej ekspresjihybrydyzacja in situ

Powiązane artykuły