Czujnik fototermicznego kątowego rozpraszania światła (PT-AS) umożliwia szybkie i wolne od chemikaliów oznaczanie hemoglobiny w próbkach krwi w skali nanolitrów. Tutaj znajdują się szczegółowe informacje na temat konfiguracji PT-AS i protokołu pomiaru stężenia hemoglobiny we krwi. Przedstawiono również reprezentatywne wyniki dla próbek krwi z niedokrwistością.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybki i wolny od chemikaliów test hemoglobiny z fototermicznym rozpraszaniem kątowym światła
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Fototermiczne kątowe rozpraszanie światła (PT-AS) to nowatorska metoda optyczna do pomiaru stężenia hemoglobiny ([Hb]) w próbkach krwi. Na podstawie wewnętrznej odpowiedzi fototermicznej cząsteczek hemoglobiny, czujnik umożliwia bardzo czuły, wolny od chemikaliów pomiar [Hb]. Zdolność wykrywania [Hb] z limitem 0,12 g/dl w zakresie 0,35 - 17,9 g/dl została już wcześniej wykazana. Metodę tę można łatwo wdrożyć za pomocą niedrogich urządzeń elektronicznych użytku, takich jak wskaźnik laserowy i kamera internetowa. Zastosowanie rurki mikrokapilarnej jako pojemnika na krew umożliwia również oznaczanie hemoglobiny z objętością krwi w skali nanolitrów i niskimi kosztami operacyjnymi. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji optycznej PT-AS i procedur przetwarzania sygnału. Podano również protokoły doświadczalne i reprezentatywne wyniki dla próbek krwi w warunkach niedokrwistości ([Hb] = 5,3, 7,5 i 9,9 g/dl), a pomiary porównano z pomiarami z analizatora hematologicznego. Jego prostota w implementacji i obsłudze powinna umożliwić jego szerokie zastosowanie w laboratoriach klinicznych i warunkach o ograniczonych zasobach.
Wprowadzenie
Powszechnie przeprowadza się badanie krwi w celu oceny ogólnego stanu zdrowia człowieka i wykrycia biomarkerów związanych z pewnymi chorobami. Na przykład stężenie cholesterolu we krwi służy jako kryterium hiperlipidemii, która jest ściśle związana z chorobami układu krążenia i zapaleniem trzustki. Zawartość glukozy we krwi powinna być często mierzona, ponieważ poziom glukozy wiąże się z powikłaniami, takimi jak cukrzycowa kwasica ketonowa i zespół hiperglikemiczny. Poważne choroby, takie jak malaria, ludzki wirus niedoboru odporności i zespół nabytego niedoboru odporności, są diagnozowane na podstawie badań krwi, a oznaczanie ilościowe składników krwi, w tym erytrocytów, trombocytów i leukocytów, umożliwia badania przesiewowe chorób trzustki i nerek.
Hemoglobina (Hb), kluczowy składnik krwi, stanowi około 96% erytrocytów i transportuje tlen do ludzkich organów. Znaczna zmiana jego stężenia masowego ([Hb]) może wskazywać na zmiany metaboliczne, choroby wątroby i dróg żółciowych oraz zaburzenia neurologiczne, sercowo-naczyniowe i endokrynologiczne1. [Hb] jest zatem rutynowo mierzone w badaniach krwi. W szczególności pacjentom z niedokrwistością, pacjentom dializowanym i kobietom w ciąży zdecydowanie zaleca się monitorowanie [Hb] jako kluczowe zadanie2.
W ten sposób opracowano różne metody wykrywania [Hb]. Metoda cyjanku hemoglobiny, jedna z najczęstszych technik oznaczania ilościowego [Hb], wykorzystuje cyjanek potasu (KCN) do niszczenia dwuwarstwy lipidowej erytrocytów3. Hemoglobina cyjankowa wytwarzana przez substancję chemiczną wykazuje wysoką absorpcję około 540 nm; w związku z tym pomiary [Hb] można wykonywać za pomocą analizy kolorymetrycznej. Metoda ta jest szeroko stosowana ze względu na swoją prostotę, ale stosowane substancje chemiczne (np. KCN i tlenek dimetylolauryloaminy) są toksyczne dla ludzi i środowiska. Schemat hematokrytu mierzy stosunek objętości czerwonych krwinek w porównaniu z całkowitą objętością krwi poprzez separację odśrodkową; Wymaga jednak stosunkowo dużej objętości krwi (50-100 μl)4. Metody spektrofotometryczne mierzą [Hb] precyzyjnie bez żadnych substancji chemicznych, ale wymagane są pomiary na wielu długościach fal i przy dużej objętości krwi5,6. Podobnie, zaproponowano kilka optycznych metod pomiaru [Hb], w tym metody detekcji oparte na rozpraszaniu światła, ale ich dokładność pomiaru zależy silnie od dokładności teoretycznego modelu krwi.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, niedawno zaproponowano metody wykrywania [Hb] oparte na fototermicznym (PT) efekcie Hb7. Hb, który składa się głównie z tlenków żelaza, pochłania światło o długości fali 532 nm i zamienia energię świetlną na ciepło8-10. Ten wzrost temperatury PT można wykryć optycznie, mierząc zmianę indeksu refrakcji (RI) próbek krwi. Yim i in. zastosowali optyczną koherentną reflektometrię koherentną w domenie spektralnej do pomiaru zmiany długości ścieżki optycznej PT w komorze zawierającej krew11. Chociaż metoda umożliwia bezchemiczny i bezpośredni pomiar [Hb], zastosowanie spektrometru i układu interferometrycznego może utrudnić jej miniaturyzację. Niedawno zaprezentowaliśmy alternatywną metodę detekcji [Hb], określaną jako czujnik fototermicznego kątowego rozpraszania światła (PT-AS), która jest bardziej odpowiednia do miniaturyzacji urządzeń12. Czujnik PT-AS wykorzystuje wysoką czułość RI interferometrii rozpraszania wstecznego (BSI) do pomiaru zmian PT w RI próbki krwi wewnątrz rurki kapilarnej. BSI wykorzystano do pomiaru RI różnych roztworów13-15 oraz do monitorowania oddziaływań biochemicznych w wolnym roztworze16. Czujnik PT-AS wykorzystuje podobny układ optyczny jak w BSI, ale łączy układ wzbudzenia fototermicznego w celu pomiaru wzrostu PT RI w próbkach krwi. Zasada działania czujników BSI i PT-AS jest szczegółowo opisana w innym miejscu12,15. Czujnik PT-AS wykazał się wysoką czułością pomiaru [Hb] w szerokim zakresie detekcji (0,35-17,9 g/dl) i jest zdolny do pracy z objętościami próbek <100 nl. Nie jest wymagane wstępne kondycjonowanie próbki krwi, a czas pomiaru wynosi tylko ~5 sekund. W tym miejscu opisana jest konfiguracja eksperymentalna i szczegółowy protokół pomiarowy. Reprezentatywne wyniki PT-AS są dostarczane na podstawie próbek krwi od pacjentów z niedokrwistością, a wyniki są porównywane z wynikami z analizatora hematologicznego w celu oceny dokładności czujnika PT-AS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty z próbkami krwi przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi przepisami prawa i wytycznymi instytucjonalnymi. Próbki były pozostałościami próbek krwi, które zostały pobrane i przetworzone w testach klinicznych w instytucji.
1. Konfiguracja optyczna PT-AS
UWAGA: Do wstępnej konfiguracji PT-AS można użyć pustej rurki mikrokapilarnej.
- Zamontuj pustą rurkę mikrokapilarną o średnicy wewnętrznej i zewnętrznej odpowiednio 200 i 330 μm i długości większej niż ~5 cm na uchwycie rurki kapilarnej. Dostępne na rynku oprawy światłowodowe mogą być używane jako oprawa rurowa.
- Bezpiecznie zakotwicz wskaźnik laserowy 650 nm, tj. źródło światła sondy, aby oświetlić rurkę kapilarną. Wiązka sondy powinna być większa niż rurka kapilarna. Umieść ekran (np. biały papier) za rurką kapilarną, aby obserwować kątowy wzór okresowy.
- W przypadku części detekcyjnej usuń wszystkie soczewki z kamery internetowej, aby bezpośrednio uchwycić wzór rozpraszania. Ustaw kamerę internetową za rurką kapilarną pod kątem 25-35° w stosunku do kierunku wiązki sondy. Upewnij się, że kątowy wzór okresowy wytwarzany przez rurkę kapilarną można zmierzyć za pomocą detektora (rysunek 1). Obserwuj kątowy wzór okresowy w środku przetwornika obrazu, gdy przetwornik obrazu jest prawidłowo ustawiony.
- Ustaw źródło światła wzbudzającego PT o długości fali 532 nm, aby oświetlić rurkę kapilarną. Ustaw źródło światła PT pod dowolnym kątem, o ile światło wzbudzenia PT nakłada się na wiązkę sondy na rurce kapilarnej i nie dociera bezpośrednio do detektora. Wzbudzenie PT próbek krwi przy użyciu dużej mocy optycznej zazwyczaj poprawia czułość PT-AS, ponieważ prowadzi do większej zmiany w RI.
- Użyj najwyższej mocy optycznej zastosowanego źródła światła wzbudzenia PT. Ponadto upewnij się, że światło wzbudzenia PT nakłada się na światło sondy na rurce kapilarnej. Użyj wiązki światła wzbudzenia PT co najmniej dwukrotnie większej niż światło sondy, aby podgrzać całą objętość sondy.
- Umieść filtr długoprzepustowy przed detektorem, aby zablokować światło 532 nm i mierzyć tylko światło sondy 650 nm.
- Zainstaluj rozdrabniacz optyczny na ścieżce światła wzbudzenia PT przed oświetleniem rurki kapilarnej. Przerywacz optyczny służy do modulacji natężenia światła wzbudzenia PT.
2. Przygotowanie próbki krwi
- Pobrać 6 ml świeżej krwi pełnej w stanie niedokrwistości do probówek do pobierania próbek krwi z kwasem etylenodiaminotetraoctowym i dobrze wymieszać próbki. Nie jest wymagane żadne inne przetwarzanie.
- Zmierz próbki krwi za pomocą czujnika PT-AS w ciągu 24 godzin od ekstrakcji, aby zapobiec krzepnięciu.
3. Protokoły pomiarowe PT-AS
- Załaduj rurkę mikrokapilarną próbką krwi do pomiaru. Napełnij rurkę kapilarną krwią poprzez działanie kapilarne, umieszczając rurkę w próbce krwi. Minimalna objętość próbki wymagana do pomiaru zależy od wewnętrznej średnicy rurki kapilarnej i rozmiaru wiązki sondy.
- Zastosować rurkę o średnicy wewnętrznej 200 μm. Rozmiar wiązki sondy wynosił 2 mm w reprezentatywnych wynikach, co sugeruje, że pomiar można wykonać przy objętości próbki >63 nl.
- Zamontuj rurkę kapilarną w wyznaczonym miejscu w urządzeniu.
- Włącz laser z sondą 650 nm, aby oświetlić rurkę mikrokapilarną obciążoną krwią. Kątowy wzór okresowy należy obserwować za pomocą kamery internetowej.
- Włącz laser wzbudzający PT 532 nm, aby oświetlić lampę.
- Uruchom chopper optyczny, aby modulować intensywność światła wzbudzenia PT przy 2 Hz.
UWAGA: Uzasadnienie wyboru tego warunku operacyjnego opisano w Dyskusja i Kim et al. Rozdział 12.- Zamontuj koło rozdrabniacza w zespole głowicy silnika optycznego układu rozdrabniacza.
- Włącz skrzynkę sterującą choppera i użyj pokrętła sterującego w konsoli, aby ustawić częstotliwość modulacji.
- Uruchom rozdrabniacz za pomocą pokrętła sterującego.
- Nagrywaj zmienny wzór rozpraszania za pomocą kamery internetowej przez 5 sekund w formacie MPEG-4 (mp4).
4. Przetwarzanie sygnału
Uwaga: Przetwarzanie sygnału PT-AS zostało przeprowadzone przy użyciu kodu MATLAB opracowanego w laboratorium.
- Załaduj plik wideo, aby wyodrębnić obrazy. Dla każdego obrazu [zob. rysunek 2(a) dla reprezentatywnego obrazu] należy uzyskać uśredniony wzór rozpraszania, obliczając średnią wartości pikseli w kierunku pionowym [Rysunek 2(b), c)].
- Oceń transformatę Fouriera uśrednionego wzorca rozpraszania i oblicz fazę przy szczytowej częstotliwości przestrzennej. Wykonaj te operacje dla wszystkich klatek wszystkich zarejestrowanych obrazów.
- Korzystając z wartości faz uzyskanych ze wszystkich obrazów, wykreśl czasowe fluktuacje faz [Rysunek 2(d)]. Należy pamiętać, że faza zmienia się przy częstotliwości modulacji PT. Weźmy transformację Fouriera fluktuacji fazowej w dziedzinie czasu i uzyskajmy wielkość przy częstotliwości modulacji. Sygnał ten jest określany jako sygnał PT-AS [Rysunek 2(e)].
- Zmierzyć [Hb] próbki krwi, przekształcając jej sygnał PT-AS na odpowiadający mu sygnał [Hb] przy użyciu krzywej kalibracyjnej uzyskanej w Protokole 5.
5. Kalibracja PT-AS
- Przygotować próbki krwi o wartościach [Hb], które są równomiernie rozłożone w zakresie wykrywania czujnika PT-AS (np. 0 - 18 g/dl).
- Przed kalibracją należy określić ilościowo wartości [Hb] próbek za pomocą referencyjnego analizatora hematologicznego. Zmierz sygnały PT-AS próbek.
- Wyprowadzić krzywą kalibracyjną odnoszącą się [Hb] do sygnału PT-AS, wykonując liniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów, [Hb] = A[Sygnał PT-AS] + B wyników doświadczalnych. Dla warunków pracy określonych w tabeli 1 stwierdzono, że zależność między [Hb] a sygnałem PT-AS wynosi [Hb] = 5,13 [sygnał PT-AS] - 0,09. Użyj kodu MATLAB, aby wykonać dopasowanie liniowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przeprowadzono oznaczenie hemoglobiny za pomocą czujnika PT-AS, a jego pomiary porównano z wynikami analizatora hematologicznego. Eksperyment przeprowadzono przy natężeniu światła wzbudzającego PT wynoszącym 1,4 W/cm2, częstotliwości modulacji PT równej 2 Hz oraz czasie pomiaru 5 sekund. Tabela 1 zawiera podsumowanie warunków eksperymentalnych. Średnice wiązek światła probnego i wzbudzającego PT wynosiły odpowiednio 5,5 i 2 mm. Kamera internetowa rejestrowała o...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Czujnik PT-AS jest w pełni optyczną metodą zdolną do bezpośredniego pomiaru [Hb] nieprzetworzonych próbek krwi. Metoda określa ilościowo [Hb] we krwi przy użyciu wewnętrznej odpowiedzi PT cząsteczek hemoglobiny w erytrocytach. Pod wpływem oświetlenia światłem o długości 532 nm cząsteczki Hb pochłaniają energię świetlną i wytwarzają ciepło. Wynikający z tego wzrost temperatury zmienia RI próbki krwi. Wysoka czułość RI BSI została wykorzystana do pomiaru tej zmiany RI we krwi. Wcześniej wykazaliśmy, że czujnik PT-AS umożli...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłasza się konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez programy badawcze Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 i NRF-2015R1A5A1037668).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wskaźnik laserowy 650 nm | LASMAC | LED-1 | Światło sondy |
| Puste okrągłe szklane kapilary | VitroCom | CV2033 | Pojemnik na próbki krwi |
| Kamera internetowa | Logitech | C525 | Czujnik optyczny CMOS |
| Układ rozdrabniacza optycznego | Thorlabs | MC2000-EC | Chopper optyczny |
| Plastikowy filtr długoprzepustowy | Edmund Optics | #43-942 | Aby odrzucić światło wzbudzenia PT 532 nm |
| Zacisk światłowodowy | Thorlabs | SM1F1-250 | Oprawa rurki kapilarnej |
| Probówka do pobierania krwi pokryta EDTA | Greiner Bio-One | VACUETTE 454217 | pobierania próbek krwi i antykoagulacji |
| Siemens AG | ADVIA 2120i | Referencyjny analizator hematologiczny |
Bibliografia
- Mokken, F. C., Kedaria, M., Henny, C. P., Hardeman, M., Gelb, A. The clinical importance of erythrocyte deformability, a hemorrheological parameter. Ann. Hematol. 64 (3), 113-122 (1992).
- Rosenblit, J., et al. Evaluation of three methods for hemoglobin measurement in a blood donor setting. Sao Paulo Medical Journal. 117 (3), 108-112 (1999).
- Van Kampen, E., Zijlstra, W. Standardization of hemoglobinometry II. The hemiglobincyanide method. Clin. Chim. Acta. 6 (4), 538-544 (1961).
- Billett, H. H. Hemoglobin and hematocrit. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3, (1990).
- Kuenstner, J. T., Norris, K. H., McCarthy, W. F. Measurement of hemoglobin in unlysed blood by near-infrared spectroscopy. Appl. Spectrosc. 48 (4), 484-488 (1994).
- Zwart, A., et al. A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives. Clin. Chem. Lab. Med. 19 (7), 457-464 (1981).
- Kwak, B. S., et al. Direct measurement of the in vitro hemoglobin content of erythrocytes using the photo-thermal effect of the heme group. Analyst. 135 (9), 2365-2371 (2010).
- Lapotko, D., Lukianova, E. Laser-induced micro-bubbles in cells. International Journal of Heat Mass Transfer. 48 (1), 227-234 (2005).
- Lapotko, D. O. Laser-induced bubbles in living cells. Lasers in surgery and medicine. 38 (3), 240-248 (2006).
- Lapotko, D. O., Romanovskaya, T. yR., Shnip, A., Zharov, V. P. Photothermal time-resolved imaging of living cells. Lasers in surgery and medicine. 31 (1), 53-63 (2002).
- Yim, J., et al. Photothermal spectral-domain optical coherence reflectometry for direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes. Biosens. Bioelectron. 57, 59-64 (2014).
- Kim, U., et al. Capillary-scale direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes using photothermal angular light scattering. Biosens. Bioelectron. 74, 469-475 (2015).
- Sørensen, H. S., Larsen, N. B., Latham, J. C., Bornhop, D. J., Andersen, P. E. Highly sensitive biosensing based on interference from light scattering in capillary tubes. Appl. Phys. Lett. 89 (15), 151108(2006).
- Swinney, K., Markov, D., Bornhop, D. J. Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry. Rev. Sci. Instrum. 71 (7), 2684-2692 (2000).
- Tarigan, H. J., Neill, P., Kenmore, C. K., Bornhop, D. J. Capillary-scale refractive index detection by interferometric backscatter. Anal. Chem. 68 (10), 1762-1770 (1996).
- Bornhop, D. J., et al. Free-solution, label-free molecular interactions studied by back-scattering interferometry. science. 317 (5845), 1732-1736 (2007).
- Yang, X., et al. Simple paper-based test for measuring blood hemoglobin concentration in resource-limited settings. Clin. Chem. 59 (10), 1506-1513 (2013).
- Zhu, H., et al. Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone. Lab Chip. 13 (7), 1282-1288 (2013).
- Pogačnik, L., Franko, M. Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor. Biosens. Bioelectron. 18 (1), 1-9 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
