Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

20.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55015

⸱

30 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.

Streszczenie

Limfocyty T regulatorowe (Treg) są integralną częścią tolerancji obwodowej, tłumiąc reakcje immunologiczne przeciwko własnym strukturom i zapobiegając w ten sposób chorobom autoimmunologicznym. Podejścia kliniczne mające na celu adoptywny transfer limfocytów Treg lub ich zubożenie w leczeniu raka są w toku, przynosząc obiecujące pierwsze wyniki.

Ponieważ liczba naturalnie występujących Treg (nTreg) jest bardzo ograniczona, badanie pewnych cech Treg za pomocą indukowanych in vitro Treg (iTregs) może być korzystne. Do tej pory najlepszym, choć nie do końca specyficznym markerem białkowym do wyznaczania limfocytów Treg, jest czynnik transkrypcyjny FOXP3. Pomimo znaczenia limfocytów Treg, w tym nieredundantnych ról limfocytów Treg indukowanych obwodowo, protokoły generowania limfocytów Treg są obecnie kontrowersyjne, szczególnie w przypadku komórek ludzkich. Protokół ten opisuje zatem różnicowanie in vitro ludzkich iTreg CD4 + FOXP3 + od ludzkich naiwnych limfocytów T przy użyciu szeregu czynników indukujących Treg (TGF-β plus tylko IL-2 lub ich kombinacji z kwasem retinowym, rapamycyną lub maślanem) równolegle. Opisano również fenotypowanie tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i qRT-PCR.

Te protokoły skutkują powtarzalną ekspresją FOXP3 i innych genów sygnatury Treg oraz umożliwiają badanie ogólnych mechanizmów regulacyjnych FOXP3, jak również efektów specyficznych dla protokołu, aby określić wpływ pewnych czynników. iTregi mogą być wykorzystywane do badania różnych aspektów fenotypowych, jak również molekularnych mechanizmów indukcji Treg. Szczegółowe badania molekularne ułatwiają stosunkowo duże liczby komórek, które można uzyskać.

Ograniczeniem dla stosowania iTreg jest względna niestabilność ekspresji FOXP3 w tych komórkach w porównaniu do nTreg. iTregi generowane przez te protokoły mogą być również wykorzystywane do testów funkcjonalnych, takich jak badanie ich funkcji supresyjnej, w których iTregi indukowane przez TGF-β plus kwas retinowy i rapamycyna wykazują wyższą aktywność tłumiącą. Jednak zdolność tłumienia iTreg może różnić się od nTreg, a zastosowanie odpowiednich kontroli ma kluczowe znaczenie.

Wprowadzenie

CD4+CD25+FOXP3+ regulatorowe limfocyty T (Treg) tłumią inne komórki odpornościowe i są krytycznymi mediatorami tolerancji obwodowej, zapobiegając autoimmunizacji i nadmiernemu zapaleniu1. Znaczenie limfocytów Treg ilustruje zespół sprzężony z chromosomem X choroby człowieka immunodysregulacji, poliendokrynopatii, enteropatii sprzężonej z chromosomem X (IPEX), w którym utrata limfocytów Treg z powodu mutacji w "głównym" skrzynce widłowej P3 czynnika transkrypcyjnego Treg (FOXP3) prowadzi do ciężkiej ogólnoustrojowej choroby autoimmunologicznej, śmiertelnej we wczesnym wieku. Jednak limfocyty Treg działają jak miecz obosieczny w układzie odpornościowym, ponieważ mogą również hamować odporność przeciwnowotworową w niektórych ustawieniach2. Terapeutyczna manipulacja liczbą i funkcją limfocytów Treg jest zatem przedmiotem licznych badań klinicznych. W przypadku nowotworów wyczerpanie limfocytów Treg może być pożądane, a pewne sukcesy metod klinicznych zachęcają do dalszych badań3. W chorobach autoimmunologicznych i zapalnych, oprócz terapeutycznych efektów Treg w kilku mysich modelach choroby, niedawne pierwsze badania na ludziach dotyczące adoptywnego transferu Treg w celu zapobiegania chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)4-7 i oceny bezpieczeństwa w leczeniu cukrzycy typu 18 wykazały bardzo obiecujące wyniki.

Naturalnie występujące Tregi (nTregs) składają się z tTreg pochodzących z grasicy i pTregów indukowanych obwodowo, z niezbędnymi podstawowymi funkcjami w utrzymaniu zdrowia 9-11. Jednak liczba nTreg jest ograniczona, co zachęca do komplementarnego podejścia polegającego na indukowaniu Treg (iTreg) in vitro z naiwnych prekursorów limfocytów T12. Nadal stabilność iTreg, prawdopodobnie z powodu braku demetylacji w tak zwanym regionie demetylowanym specyficznym dla Treg (TSDR) w locus13 genu FOXP3, pozostaje problemem, a kilka badań wskazuje, że Treg indukowane in vivo są bardziej stabilne14.

Do tej pory, FOXP3 pozostaje najlepszym markerem białkowym dla Treg, ale nie jest to absolutnie specyficzne, ponieważ ludzkie konwencjonalne limfocyty T CD4+CD25- przejściowo wyrażają pośrednie poziomy FOXP3 po aktywacji15,16. Chociaż poczyniono znaczne postępy w wyjaśnianiu regulacji ekspresji FOXP3, wiele pozostaje do odkrycia w zakresie indukcji, stabilności i funkcji FOXP3, szczególnie w komórkach ludzkich. Pomimo różnic w stosunku do nTreg, indukowane in vitro limfocyty T FOXP3 + CD4 + mogą być wykorzystywane jako system modelowy do badania mechanizmów molekularnych indukcji FOXP3 oraz jako punkt wyjścia do opracowania w przyszłości protokołów, które pozwalają na generowanie iTreg, które są bardziej podobne do Treg generowanych in vivo, co może mieć zastosowanie w strategiach transferu adoptywnego w przyszłości.

Nie ma 'złotego standardu' protokołu do indukowania ludzkich iTreg, a obecne protokoły zostały opracowane na podstawie naśladowania warunków indukujących Treg in vivo: sygnalizacja interleukiny 2 (IL-2) i transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) są kluczowe dla indukcji FOXP3 in vivo17, a kwas all-trans retinowy (ATRA) — który jest produkowany in vivo przez komórki dendrytyczne związane z jelitami — jest często stosowany w celu zwiększenia indukcji FOXP3 in vitro 18-21. Opracowaliśmy dodatkowe protokoły indukowania limfocytów Treg u ludzi przy użyciu maślanu22, krótkołańcuchowego kwasu tłuszczowego pochodzącego z mikrobioty jelitowej, który, jak wykazano niedawno, zwiększa indukcję mysiego Treg23,24. Niedawno ustaliliśmy również nowy protokół generowania iTreg o doskonałej funkcji supresyjnej in vitro przy użyciu kombinacji TGF-β, ATRA i rapamycyny22, przy czym ta ostatnia jest klinicznie zatwierdzonym celem inhibitora rapamycyny (mTOR) u ssaków, o którym wiadomo, że sprzyja utrzymaniu FOXP3 podczas ekspansji ludzkiego Treg25,26.

Ta metoda opisuje powtarzalne generowanie in vitro ludzkich iTreg CD4+FOXP3+ przy użyciu zestawu różnych warunków, a następnie ich fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) w celu ujawnienia specyficznych dla protokołu wzorców ekspresji FOXP3 i innych cząsteczek sygnatury Treg, takich jak CD25, CTLA-4, EOS, a także represjonowanie ekspresji IFN-γ i SATB1 22. Wygenerowane populacje komórek można wykorzystać do testów funkcjonalnych dotyczących aktywności supresyjnej lub do badań molekularnych, zarówno dotyczących ogólnych regulatorów FOXP3, jak i do badania efektów specyficznych dla niektórych związków, takich jak maślan lub rapamycyna. Pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów molekularnych kierujących różnicowaniem limfocytów Treg jest bardzo istotne dla przyszłych podejść terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych lub nowotworach, które mają być ukierunkowane na cząsteczki zaangażowane w wytwarzanie i funkcję limfocytów Treg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zostały świeżo wyizolowane z anonimowych, zdrowych dawców kożuchów zakupionych w Szpitalu Uniwersyteckim Karolinska w Szwecji. Pozwolenie etyczne na przeprowadzenie eksperymentów uzyskano od Regionalnej Komisji ds. Oceny Etycznej w Sztokholmie (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Szwecja (numer zgody: 2013/1458-31/1).

1. Izolacja limfocytów T z krwi obwodowej

  1. Izolacja PBMC
    1. Wstępnie umieść roztwór pożywki wirowej o gęstości 15 ml (takiej jak Ficoll) w probówkach o pojemności 50 ml (5 probówek na warstwę kożuchową). Podgrzej do temperatury pokojowej.
    2. Napełnij kożuchowy płaszcz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (temperatura pokojowa) do 180 ml. Jeśli używana jest świeża krew, rozcieńczyć krew o równej objętości PBS.
    3. Przechyl probówkę na bok i powoli nałóż gęstość pożywki wirowej na ~35 ml rozcieńczonej krwi na probówkę. Dodać krew bardzo ostrożnie, bez mieszania gęstości pożywki wirującej i warstwy krwi.
    4. Wirować 20 minut przy 1 150 x g w temperaturze pokojowej bez hamulca. Wirówkę należy uruchamiać bez hamulca i, jeśli to możliwe, z małym lub średnim przyspieszeniem, aby zapobiec mieszaniu się warstw.
    5. Wyjąć biały pierścień zawierający PBMC między pożywką wirującą o dużej gęstości a fazą plazmową. Przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml (1 raz pipetą 5 ml i 2 razy pipetą Pasteura o pojemności 2 ml z tworzywa sztucznego). Weź jak najmniej osocza i pożywki wirowej o dużej gęstości. Nie dotykać czerwonej osadki erytrocytów.
    6. Umyj PBMCs. Podziel PBMC na probówki o pojemności 50 ml (4 probówki na płaszcz buffy). Napełnij każdy do 50 ml PBS.
    7. Wirować 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Usunąć i wyrzucić supernatant, zebrać komórki w 1 probówce z 10 ml pożywki RPMI/10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i dobrze zawiesić. Jeśli obecne są grudki komórek, przecedź je przez sitko o wielkości 40 μm.
    9. Przenieść komórki w kolbie do hodowli komórkowej T175 dla komórek przylegających. Przepłukać probówki 40 ml pożywki i połączyć z komórkami (łącznie 50 ml). W razie potrzeby usunąć podwielokrotność do analizy metodą cytometrii przepływowej (patrz krok 1.4). Zwykle limfocyty T CD4 + stanowią około 30-40% komórek w bramie limfocytów, a naiwne limfocyty T stanowią około 30 do 60% limfocytów T CD4 + w zależności od dawcy.
    10. Inkubować komórki w kolbie nioski przez 45–90 minut w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Ten krok zużyje monocyty przez przyleganie plastiku. Nie jest to obowiązkowe, ale zwiększy procentową wydajność limfocytów T na ilość PBMC w kolejnych krokach.
    11. Zawiesić komórki (w 50 ml pożywki zawartej w kolbie) i dobrze wypłukać warstwę komórek na dnie kolby. Rozmieść komórki równomiernie w dwóch probówkach o pojemności 50 ml (poprzednie probówki mogą być ponownie użyte dla tego samego dawcy). Przepłukać kolbę 50 ml świeżej pożywki RPMI/10% FCS i przenieść równomiernie do tych samych 2 probówek.
      UWAGA: PBMC mogą być przechowywane przez noc w temperaturze 4 °C z rurkami ułożonymi na boku lub najlepiej bezpośrednio używane do izolacji limfocytów T.
  2. Izolacja nTreg poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie
    1. Przygotować bufor izolacyjny: 0,5% (w/v) albuminy surowicy ludzkiej i 2 mM EDTA w PBS. Należy zawsze przechowywać bufor w temperaturze 4 °C. Alternatywnie do albuminy ludzkiej należy stosować albuminę bydlęcą.
    2. Zawiesić i policzyć PBMC za pomocą automatycznego lub ręcznego licznika komórek w obecności błękitu trypanowego (nie liczyć małych płytek krwi). Jeśli zaobserwuje się grudki komórek, przecedź komórki przez sitko o wielkości 40 μm.
    3. Odwirować PBMC przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zawiesić komórki (za pomocą pipety o pojemności 1 ml) w 90 μl buforze izolacyjnym na 107 PBMC, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Przechowuj komórki w oryginalnych probówkach o pojemności 50 ml (2 probówki na płaszcz buffy).
    5. Dodać 2 μl kulek CD25 na 107 komórek, wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Napełnić PBS do 30 ml. Wirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotować kolumny LS (po 2 na warstwę kożuchową): zrównoważyć z 3 ml buforu izolacyjnego i przelać przepływ. Rurki mogą być ponownie wykorzystane do płukania kolejnych kolumn.
    8. Zawiesić komórki w 3 ml buforze izolacyjnym na probówkę (z pipetą o pojemności 1 ml). Przenieś komórki do kolumny LS i zbierz przepływ w świeżych probówkach o pojemności 15 ml.
    9. Przepłukać probówki o pojemności 50 ml każdą z 2 ml buforu izolacyjnego. Przenieść bufor płuczący do kolumn.
    10. Przepłukać kolumnę 2x po 3 ml buforu izolacyjnego. Zawsze poczekaj, aż kolumna przestanie kapać, zanim dodasz jakikolwiek nowy płyn. Przechowywać przepływ w temperaturze 4 °C do późniejszych etapów.
    11. Zdejmij kolumnę z magnesu. Eluować 2x z 3 ml buforem izolacyjnym na kolumnę do probówki 15 ml.
      UWAGA: Eluat z 2 kolumn na dawcę można łączyć. Nie zanurzaj kolumny w cieczy.
    12. Przygotuj i zrównoważ nowe kolumny LS (1 kolumna na płaszcz buffy). Przenieść eluat z ppkt 1.2.11 do kolumny. Przepływ można odrzucić. Po przejściu eluatu przez kolumnę, przepłukać probówkę i przepłukać kolumnę 3x 3 ml buforu izolacyjnego.
      UWAGA: Druga kolumna jest niezwykle potrzebna do zwiększenia czystości.
    13. Zdejmij kolumnę z magnesu. Elute CD25++ "nTregs" 2x z 3 ml buforem izolacyjnym.
    14. Wirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant.
    15. Przemyć komórki 15 ml pożywki do hodowli limfocytów T, odwirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant.
    16. Zawiesić komórki w 0,5 ml pożywki do hodowli limfocytów T, uzupełnionej 100 j.m./ml IL-2 każda. Przenieś komórki na płytkę 24-dołkową. Przepłukać probówkę 0,5 ml pożywki (+ 100 j.m./ml IL-2) i połączyć z płytką 24-dołkową.
    17. Policz nTreg (jak w kroku 1.2.2). Wydajność wynosi zwykle około 1-4 x 106 Treg na sierść kożuchową. Dostosuj gęstość limfocytów Treg do 1-2 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki do hodowli limfocytów T + 100 j.m./ml IL-2.
    18. Inkubować limfocyty limfocytów limfocytów w temperaturze 37 °C/5% CO2 aż do użycia.
  3. Naiwna izolacja limfocytów T CD4 + za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie
    UWAGA: Przeprowadź przepływ od kroku 1.2.8-1.2.10, aby kontynuować izolację komórek. Alternatywnie, jeśli nie wyizolowano żadnych nTreg, należy postępować bezpośrednio z PBMC.
    1. Połączyć 2 probówki na dawcę PBMC zubożonych w Treg w probówce o pojemności 50 ml. Napełnij PBS do 50 ml w temperaturze pokojowej.
    2. Odwirować PBMC przy 200 x g przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć i odrzucić supernatant. Zawieś komórki w 50 ml PBS.
    3. Powtórz krok 1.3.2 dwa razy.
      UWAGA: Popłuczki PBS mają kluczowe znaczenie dla usunięcia płytek krwi, które nie zostaną usunięte za pomocą następującego zestawu do izolacji ujemnej. Płytki krwi pozostają w supernatancie podczas wirowania z małą prędkością. Ubytek płytek krwi można monitorować w poszczególnych krokach na szkiełku mikroskopowym. Etapy te należy wykonać za pomocą PBS i wirowania w temperaturze pokojowej.
    4. Zawiesić PBMC w 50 ml PBS. Policz komórki jak w kroku 1.2.2.
    5. Odwirować PBMC przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 40 μl buforu izolacyjnego (4 °C) na10-7 komórek.
    6. Dodać 10 μl naiwnego koktajlu biotynowo-przeciwciałowego II z limfocytów T CD4+ na 107 komórek.
    7. Wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Przemyć komórki, dodając 40 ml PBS (4 °C) i odwirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 80 μl buforze izolacyjnym na10-7 komórek.
    9. Dodaj 20 μl mikrogranulek antybiotyny na 107 komórek. Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Napełnić do 50 ml zimnym PBS i odwirować 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
    11. Przygotować kolumny LS (zrównoważyć z 3 ml buforu izolacyjnego). Aby uniknąć przeciążenia kolumny, należy użyć jednej kolumny dla maksymalnie 250 x 106 PBMC lub mniej, jeśli PBMC zawierają wiele czerwonych krwinek.
    12. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml buforze izolacyjnym. Przenieś komórki do kolumny LS. Zebrać przepływ, który zawiera naiwne limfocyty T CD4 +, w probówkach o pojemności 15 ml.
    13. Przepłukać probówkę z 2 ml buforu izolacyjnego. Przenieś do kolumny.
    14. Przemyć kolumnę 3x 3 ml buforem izolacyjnym. Zawsze poczekaj, aż kolumna przestanie kapać, zanim dodasz jakikolwiek nowy płyn.
    15. Przepuścić przez (naiwne limfocyty T CD4+) i odwirować 450 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Kolumny można wyrzucić.
    16. Całkowicie usunąć supernatant. Przemyć komórki 15 ml pożywki, odwirować 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć sklarowany osad.
      UWAGA: Bufor izolacyjny zawiera EDTA, który chelatuje jony wapnia, a tym samym upośledza aktywację limfocytów T. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek prób stymulacji należy całkowicie usunąć bufor izolacyjny i dwukrotnie przemyć komórki 15 ml pożywki.
    17. Zawiesić komórki w pożywce do hodowli limfocytów T do 2-3 x10 6 komórek na ml. Komórki odpoczywać w odpowiedniej kolbie lub przez noc w inkubatorze. Jeśli komórki są używane bezpośrednio do testów stymulacji, przemyj je jeszcze raz pożywką.
  4. Barwienie kontrolujące czystość
    1. Weź ~ 50 000 komórek (naiwne; nTreg; PBMC) każdy, w ilości 20 μl.
      UWAGA: Jeśli zarówno panel Tnaïve, jak i nTreg mają być zabarwione, należy pobrać po 2 próbki.
    2. Przygotować 2x skoncentrowany premiks przeciwciał (w PBS) odpowiednio do urządzenia, na przykład: Panel naiwny: CD4-PerCP 1:5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1:5, CD8-eMąka450 1:8. W przypadku panelu Treg zastąp CD45RO-PE na CD25-PE, 1:10.
      UWAGA: Tylko niektóre przeciwciała CD25, które rozpoznają inne epitopy niż mikrogranulki CD25, mogą być używane do barwienia nTreg wyizolowanych za pomocą mikrogranulek CD25.
    3. Dodać 20 μl premiksu przeciwciał do 20 μl komórek. Należy również przygotować pojedyncze barwienia dla każdego fluorochromu (używając próbki zawierającej komórki dodatnie, np. PBMC) i próbkę niebarwioną, do ustawień cytometrii przepływowej i kompensacji.
    4. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Wypełnij każdą próbkę 200 μl PBS i odwiruj 450 x g przez 5-10 minut.
    6. Pobrać komórki do bufora sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (= bufor izolacyjny bez EDTA) i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej. Czystość naiwnych limfocytów T CD4 + wynosi zwykle >95% (patrz ryc. 2).

2. Hodowla indukcji limfocytów Treg

  1. Przygotowanie pożywek i płytek stymulacyjnych
    1. Przygotować i wstępnie ogrzać pożywkę do hodowli limfocytów T: pożywkę krwiotwórczą bez surowicy uzupełnioną 2 mM L-alanylo-L-glutaminą.
    2. Przygotuj stężenia cytokin, przeciwciał stymulujących i związków podstawowych.
      1. Przygotować roztwór podstawowy IL-2: 400 000 j.m./ml w sterylnie przefiltrowanym (z filtrem kwasoodpornym) 100 mM kwasu octowego (167 μg/ml, jeśli aktywność użytej partii wynosi 2 400 j.m./1 μg; potwierdzić z dostawcą). Podwielokrotność do sterylizowanych niskobiałkowych probówek o pojemności 0,5 ml, uszczelnić Parafilmem, zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania lub -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
      2. Przygotować roztwór podstawowy TGF-β1 (na fiolkę 10 μg, bez nośnika): Odwirować proszek TGF-β1 (1 000 x g 3 min), dodać 100 μl 4 mM HCl (sterylnie przefiltrowanego z filtrem kwasoodpornym) w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 100 μg/ml, pozostawić do całkowitego rozpuszczenia; wir. Podamy po 5 μl do wysterylizowanych niskobiałkowych probówek o pojemności 0,5 ml, uszczelnić Parafilmem, zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
      3. Przygotować roztwór podstawowy ATRA: Rozpuścić proszek w stężeniu 20 mg/ml (66,6 mM) w DMSO. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM przez dalsze rozcieńczenie w DMSO i przechowywać podwielokrotności, chroniąc przed światłem, w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku. ATRA jest wrażliwa na światło, ciepło i powietrze.
      4. Przygotować roztwór podstawowy rapamycyny: 1 mg/ml (1,11 mM) w DMSO, przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.
      5. Przygotować roztwór podstawowy maślanu sodu: 0,908 M (0,1 mg/ml) w sterylnym ultraczystymH2Oi sterylnym filtrze. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Przygotować 4 zagęszczone premiksy (50 μl na studzienkę) w pożywce do hodowli limfocytów T, jak w Tabeli 1.
    4. Poprzedniego dnia pokryj płytki przeciwciałem anty-CD3. Pokryj żądaną liczbę dołków z 96 płytek U-dołkowych 5 μg / ml przeciwciała anty-CD3 w PBS, 65 μl / basenik. Owinąć płytkę folią i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie używaj studzienek brzegowych płytek 96-dołkowych. Można używać większych studzienek, ale studzienki w kształcie litery U ułatwiają korzystanie z tych samych liczb komórek na obszar we wszystkich eksperymentach. Jeśli potrzebnych jest więcej komórek, po hodowli zgromadź wymaganą ilość studzienek. Zwykle po 4-6 dniach ekspansji 2 studzienki na każdą próbkę wystarczają do analizy cytometrii przepływowej i analizy RNA.
      1. W dniu powlekania, na krótko przed posiewem, należy usunąć roztwór anty-CD3 ze studzienek. Napełnij studzienki 200 μl/studzienkę PBS. Usuń PBS. Powtórzyć mycie przy użyciu 200 μl/studzienkę PBS. Całkowicie usunąć PBS i natychmiast użyć płytek.
    5. Przygotuj talerze (nie używaj studzienek marginesowych):
      1. Do każdego dołka dodać 50 μl 4x premiksu anty-CD28/IL-2 (z wyjątkiem komórek "niestymulowanych", dodać pożywkę do hodowli komórek T), 50 μl 4x premiks TGF-β1 (dla wszystkich iTreg) lub 50 μl pożywki do hodowli komórek T do pozorowanej kontroli "tylko stymulacja", 50 μl 4x ATRA, ATRA/rapamycyna lub premiks maślanu (w stosownych przypadkach) lub pożywki
      2. Wypełnić wszystkie puste studzienki, w tym studzienki brzegowe, 200 μl PBS. Wstępnie podgrzane płyty w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
  2. Przygotowanie naiwnych limfocytów T do posiewu
    1. Po spoczynku komórek przenieść do probówki o pojemności 15 ml, przepłukać kolbę/studzienki wstępnie podgrzaną pożywką do hodowli limfocytów T i przelać do probówki. Napełnij probówkę do 15 ml pożywką do hodowli limfocytów T.
    2. Odwirować komórki przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usunąć pożywkę i pobrać komórki ze świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli limfocytów T do gęstości 2,2-2,6 x 106/ml. Policz komórki jak w kroku 1.2.2 i w razie potrzeby dostosuj gęstość.
    4. Dodać komórki do przygotowanych płytek stymulacyjnych (patrz 2.1), 50 μl komórek/studzienkę (110 000-130 000 komórek/studzienkę). Każda studzienka powinna teraz zawierać łączną objętość 200 μl.
    5. Owiń płytki folią aluminiową, aby chronić ATRA przed światłem; inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez żądany okres czasu.
  3. Monitoruj hodowlę indukcyjną limfocytów Treg
    1. Monitoruj hodowle limfocytów Treg za pomocą mikroskopii świetlnej (powiększenie 40x). Od około 2 do 3 dnia powinny stać się widoczne małe skupiska proliferujących komórek, które w późniejszych punktach czasowych łączą się w większe skupiska. Kultury wyhodowane z użyciem rapamycyny na ogół rosną mniej. Patrz również rysunek 3.
    2. W żądanych punktach czasowych należy pobrać próbki do ekstrakcji RNA lub fenotypowania metodą cytometrii przepływowej (patrz poniżej). W przypadku późniejszych punktów czasowych z proliferacją komórek wystarczy 1 studzienka każda, w przeciwnym razie weź 1 x 105-1 x 106 komórek dla RNA i 3 x 105-1 x 106 komórek do cytometrii przepływowej.
  4. Ocena stabilności FOXP3
    1. W celu oceny stabilności fenotypu iTreg, jak opisano wcześniej22,27, należy dwukrotnie przepłukać iTreg pożywką do hodowli komórek T, a następnie hodować iTreg dalej w pożywce do hodowli komórek T bez lub z ponowną stymulacją anty-CD3 i anty-CD28, jak opisano w 2.1 i 2.2. Dodaj cytokiny, takie jak 50 j.m./ml IL-2, aby zbadać ich wpływ na stabilność FOXP3.
    2. W żądanych punktach czasowych należy pobrać próbki do ekstrakcji RNA, fenotypowania cytometrii przepływowej (patrz poniżej) i analizy metylacji TSDR, jak opisano22,28.

3. Analiza fenotypowa iTreg metodą qRT-PCR

  1. Przygotowanie próbek
    1. W żądanych punktach czasowych weź 1 x 105 do 1 x 106 komórek na próbkę do ekstrakcji RNA. Przenieść komórki do probówki 1,5 ml wolnej od RNaz i odwirować przy 500 x g przez 5 minut.
    2. W razie potrzeby usunąć część supernatantu i zamrozić w celu przeprowadzenia testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub podobnej analizy. Całkowicie usunąć pozostały supernatant z komórek. Przejdź bezpośrednio do ekstrakcji RNA lub zamrażania osadów komórkowych na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze od -20 °C do -80 °C przez okres do 2 tygodni.
    3. Wyodrębnij RNA i wykonaj qRT-PCR dla FOXP3 i genu porządkowego (takiego jak RPL13A) zgodnie ze standardowymi protokołami. Ponadto należy zmierzyć ekspresję innych genów sygnatury Treg (na przykład genów "Treg up" IL2RA, CTLA4, IKZF4 i genów "Treg down" IFNG, SATB1).

4. Analiza fenotypowa za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem barwienia w formacie płytki dołkowej 96U z 3 x 105-1 x 106 komórek. Jeśli w jednym dołku jest mniej komórek, zacznij od kilku dołków i puli, jak opisano poniżej.

  1. Restymulacja komórek (opcjonalnie)
    1. Jeśli pożądane jest barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, pulsuj komórki za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu (PMA)/jonomycyny Phorbol w obecności inhibitora transportu białek.
      UWAGA: Ta procedura nie wpływa na ekspresję FOXP3 w wyżej opisanych kulturach iTreg, ale inne markery mogą się zmienić - na przykład CD4 jest regulowany w dół.
    2. Przygotować 10x premiks Brefeldin A/PMA/jonomycyna (20 μl na studzienkę) w pożywce do hodowli limfocytów T: roztwór podstawowy Brefeldin A 1:100, jonomycyna (zapasowa 5 μg/μl) 1:1,300, PMA (podstawowa 12,35 μg/μl, wstępnie rozcieńczona 1:1235) 1:100 wstępnie rozcieńczonego bulionu.
    3. Na 4 godziny przed barwieniem dodać 20 μl Brefeldin A/PMA/Ionomycin 10x mix do dołka, aby uzyskać końcowe stężenia 1:1,000 Brefeldin A, 0,5 μM (375 ng/ml) jonomycyny, 10 ng/ml PMA.
    4. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C/5% CO2
  2. Barwienie powierzchni
    UWAGA: Sugerowany tutaj panel jest sugestią; Inne panele mogą być używane w zależności od interesujących antygenów i konfiguracji instrumentu.
    1. Fajny PBS na lodzie. Przygotować bufor FACS (PBS z 0,5% albuminą surowicy ludzkiej, HSA) i ostudzić na lodzie. BSA lub FBS mogą być stosowane jako alternatywa dla HSA.
    2. Ponownie umieść komórki na płytce barwiącej: Ponownie zawieś komórki za pomocą pipety i przenieś komórki do nowej płytki dołka 96U, pozostawiając jedną studzienkę wolną wokół każdej studzienki (aby zapobiec rozlaniu się w późniejszej procedurze barwienia). Jeśli w pierwotnym dołku znajduje się mniejsza niż pożądana liczba komórek, należy usunąć część supernatantu przed ponownym zawieszeniem i umieścić kilka studzienek w studzience barwiącej.
    3. Płytka wirowa 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć supernatant. Wlej sklaratyn do pojemnika na odpady, pozostaw płytkę do góry nogami i natychmiast (bez odwracania talerza) postukaj raz w płytkę o chłonny papier. Następnie natychmiast odwróć talerz. Płytka wirowa do ponownego zawieszenia komórek w pozostałej cieczy.
    5. Dodać 25 μl premiksu do barwienia powierzchni (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1:5 w buforze FACS) i ponownie zawiesić.
      UWAGA: Należy również uwzględnić pojedyncze barwienia dla każdego z użytych fluorochromów z próbkami zawierającymi komórki dodatnie dla odpowiedniego antygenu; i dołączyć niebarwioną próbkę. Będą one potrzebne do konfiguracji kompensacji instrumentu. Alternatywnie użyj koralików kompensacyjnych.
    6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    7. Dodać 200 μl PBS, odwirować płytkę 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant zgodnie z opisem w kroku 4.2.4. Płyta wirowa.
    8. Powtórz krok 4.2.7 dwukrotnie.
  3. Barwienie żywotności
    UWAGA: Barwienie żywotności jest niezbędne, ponieważ po utrwaleniu/przepuszczalności martwe komórki nie mogą być wystarczająco wykluczone przez fsc/ssc i mogą powodować niespecyficzne sygnały. Należy użyć utrwalonego barwnika żywotności.
    1. Ponownie zawiesić komórki w 130 μl odżywczego premiksu barwienia (możliwy do utrwalenia barwnik żywotności-eFlour780 1:1,400 w PBS) i natychmiast ponownie zawiesić komórki za pomocą wielokanałowej pipety.
      UWAGA: Należy również uwzględnić pojedyncze barwienie barwnika żywotności zawierającego martwe komórki, np. niestymulowane limfocyty T hodowane przez kilka dni lub zabić komórki przez zastosowanie ciepła zgodnie z instrukcjami producenta. Będą one potrzebne do uzyskania odszkodowania.
    2. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    3. Odwirować płytkę o masie 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant jak w kroku 4.2.4. Płyta wirowa.
    4. Napełnij 200 μl buforem FACS. Powtórz krok 4.3.3.
    5. Napełnij 200 μl PBS. Powtórz krok 4.3.3.
  4. Barwienie wewnątrzkomórkowe za pomocą zestawu barwiących FOXP3
    1. Dla każdej studzienki przygotować: 150 μl buforu Fix/Perm (rozcieńczyć koncentrat Fix/Perm 1:4 z rozcieńczalnikiem); 850 μl 1x bufor permeabilizacyjny (rozcieńczyć 10x bufor permeabilizacyjny 1:10 z ultra czystymH2O).
    2. Po wirtowaniu ponownie zawiesić komórki w 150 μl buforze Fix/Perm i natychmiast ponownie zawiesić za pomocą pipety. Ważne jest, aby natychmiast ponownie zawiesić, aby uniknąć utrwalenia się grudek komórek.
      Uwaga: Bufor utrwalający zawiera paraformaldehyd i należy się z nim odpowiednio obchodzić i wyrzucać.
    3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    4. Dodać 100 μl zimnego PBS. Wirować przy 850 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Począwszy od tego etapu, prędkość wirowania jest zwiększana, aby uniknąć utraty komórek. Po utrwaleniu komórki stają się niewidoczne i należy zachować ostrożność w celu usunięcia supernatantów, jak opisano w kroku 4.2.4 oraz bezpośrednio po zakończeniu wirowania, aby zminimalizować utratę komórek.
    5. Usunąć supernatant zgodnie z opisem w kroku 4.2.4. Talerz wirowy.
      UWAGA: Barwienie można wstrzymać na tym etapie; w takim przypadku przemyć komórki dwukrotnie 200 μl PBS; następnie pobrać 250 μl PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Komórki można przechowywać przez kilka dni, a następnie przystąpić do przepuszczalności. Jednak optymalne wyniki osiąga się, gdy bezpośrednio kontynuuje się przepuszczalność.
    6. Po wirowaniu dodać 200 μl buforu przepuszczalnego. Wirować przy 850 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant zgodnie z opisem w kroku 4.2.4. Płyta wirowa.
    7. Dodać 200 μl buforu przepuszczalnego do resuspensend.
      UWAGA: Tutaj próbki można podzielić na barwienie wewnątrzkomórkowe i próbkę kontrolną izotypu (odjąć połowę każdej próbki). Jeśli liczba komórek jest ograniczona, można przygotować zbiorczą próbkę izotypu (pobrać 10-20 μl z każdej próbki i puli). Można również pobrać próbki do kontroli Fluorescence-Minus-One (FMO).
    8. Wirować przy 850 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant zgodnie z opisem w kroku 4.2.4. Płyta wirowa.
    9. Zawiesić osad w 44 μl buforu permeabilizacji plus 1 μl normalnej mysiej surowicy (premiksowanej), aby zablokować niespecyficzne wiązanie.
      UWAGA: Dotyczy to sytuacji, gdy przeciwciała użyte w następnym kroku są izotypem mysim. Jeśli stosowane są inne przeciwciała, takie jak pochodzące od szczurów, należy dołączyć odpowiednią surowicę do blokowania (np. surowicę szczura).
    10. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
    11. Dodaj przeciwciała:
      UWAGA: Zapytaj o stężenia przeciwciał dla konkretnych partii. Jeśli nie zostanie to zrobione w kroku 4.2 z przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym (np. CD4) z odpowiednimi fluorochromami, należy również dołączyć pojedyncze barwienia dla każdego z użytych fluorochromów próbkami zawierającymi dodatnie komórki w celu kompensacji.
      1. Dodać 15 μl premiksu przeciwciał do próbek (z wyjątkiem pojedynczych barwień, próbek niebarwionych, próbek kontrolnych izotypu i kontroli FMO): Premiks na próbkę: 0,7 μl (0,35 μg) anty-Interferon gamma (IFN-γ)-FITC (jeśli dotyczy po ponownej stymulacji), 2,3 μl (0,115 μg) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 μl (0,05 μg) Anti-FOXP3-APC, 10 μl PBS.
      2. Do izotypów próbek kontrolnych dodać 15 μl premiksu przeciwciała izotypowego, stosując takie same ilości przeciwciała, jak dla przeciwciał użytych w 4.4.11.1: Premiks na próbkę: 0,7 μl (0,35 μg) mysi IgG1 K kontrolny FITC (w stosownych przypadkach), 0,58 μl (0,115 μg) mysi izotyp IgG2a-BV421, 0,5 μl (0,05 μg) mysi izotyp IgG1 K kontrolny APC, 13,2 μl PBS.
      3. W przypadku kontroli FMO dodać przeciwciała jak w 4.4.11.1, zastępując każde po jednym przeciwciałie PBS.
    12. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
    13. Dodać 200 μl buforu permeabilizacyjnego. Odwirować, usunąć supernatant i wirować jak w kroku 4.4.8. Powtórz raz.
    14. Ponownie zawiesić komórki w zimnym buforze FACS (objętość w zależności od używanego instrumentu) i uzyskać, najlepiej natychmiast, na cytometrze przepływowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat układu eksperymentalnego. Rysunek 2 przedstawia reprezentacyjne barwienie kontrolne czystości dla magnetycznie izolowanych naiwnych limfocytów T CD4+ oraz nTregs.

Rysunek 3A przedstawia strategię bramkowania w cytometrii przepływowej, a rysunek 3B pokazuje reprezentatywne barwienia FOXP3 i CD25 w cytometrii przepływowej w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany protokół umożliwia silną indukcję ludzkich iTreg CD4 + FOXP3 + z ludzkich naiwnych limfocytów T CD4 + . Obejmuje on nowy protokół, który opisaliśmy niedawno, wykorzystujący kombinację TGF-β, ATRA i rapamycyny, do indukcji iTreg o lepszej funkcji supresyjnej in vitro 22. W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami, kolejną zaletą jest indukcja różnych populacji iTreg równolegle za pomocą różnych protokołów, co umożliwia bezpośrednie porównanie efektów niektórych czynników induku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Nina Nagel jest wdzięczna za pomoc techniczną podczas kręcenia filmu i przygotowań do eksperymentu. Dziękujemy Evie-Marii Weiss za pomoc w opracowaniu wewnątrzkomórkowego protokołu barwienia FOXP3 oraz Elisabeth Suri-Payer i Ninie Oberle za ustanowienie protokołu izolacji nTreg. Matilda Eriksson i Peri Noori są cenione za zarządzanie laboratorium.

Finansowanie: A.S. było wspierane przez Intraeuropejskie Stypendium Marie Curie w ramach 7 Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej, Fundację Dr. Ake Olssona oraz fundacje badawcze KI; A.S. i J.T. były wspierane przez grant CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease), J.T. był wspierany przez Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Fundacja Torstena Söderberga, 7PR STATegra, AFA Insurance i Rada Hrabstwa Sztokholm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas all-trans retinowySigma AldrichR2625-50MG   
Ludzki klon Foxp3-APC 236A/E7eBioscience17-4777-42
anty-ludzkie mikrogranulki CD25Miltenyi Biotec130-092-983
anty-ludzkie CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
anty-ludzkie CD28, LEAF Purified Biolegend302914
przeciwciało anty-ludzkie CD3, LEAF Purified Biolegend317315
anty-ludzki CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
anty-ludzki klon CD45RO PE UCHL1BD Biosciences555493
anty-ludzki klon CD4-PerCP SK3; mIgG1BD Biosciences345770
anty-ludzki CD8-eFluor 450 (klon OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
anty-ludzki CTLA-4 (CD152), klon BNI3, mIgG2ak, fioletowy brylantowy 421BD Biosciences562743
anty-ludzki klon IFN-g FITC 4S. Klasa B3; mIgG1keBioscience11-7319-81 
Roztwór zawierający Brefeldin A: GolgiPlugBD Biosciences555029
zestaw do syntezy cDNA: SuperScript VILO (odwrotna transkryptaza) Zestaw do syntezy cDNAInvitrogen11754-250
Podłoże do wirowania gęstości: Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99,7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, inaktywowany termicznieInvitrogen10082-147
Utrwalany barwnik żywotności, eFluor 780   eBioscience65-0865-14 lub 65-0865-18 
Zestaw barwiących Foxp3eBioscience00-5523-00Uwaga: zawiera paraformaldehyd. Można go również kupić w zestawie łączonym z przeciwciałami; 77-5774-40 Zestaw do barwienia anty-ludzkiego Foxp3 Klon APC: 236A/E7 Zestaw
GlutaMAX (200 mM L-alanylo-L-glutamina)Invitrogen35050-061
Zestaw do izolacji ludzkich naiwnych limfocytów T CD4 IIMiltenyi Biotec130-094-131
Albumina surowicy ludzkiej 50 g/LBaxter1501057
Jonomycyna ze Streptomyces conglobatus >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LS-columnsMiltenyi Biotec130-042-401
mysz IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
mysz IgG1 K Isotype Control FITC 50 μ geBioscience11-4714-81 
kontrola izotypu myszy IgG2a, fiolet brylantowy 421, klon MOPC-173BD Biosciences563464
pipeta Pasteura plastikowa, pakowana pojedynczoSarstedt86.1172.001   
PMA Phorbol 12-mirystynian 13-octanSigma AldrichP1585-1MG 
RapamycynaEMD (Merck)553210-100UG
Rekombinowana ludzka IL-2, CFR& D202-IL-050/CF
Rekombinowany ludzki TGF-beta 1, CFRnD240-B-010/CF
Zestaw do izolacji RNA: RNAqueous-Micro KitAmbionAM1931   
RPMI 1640 Średni Invitrogen72400-054 
Maślan soduSigma AldrichB5887-250MG 
Pożywka do hodowli limfocytów T: pożywka X-Vivo 15, z gentamycyną + fenolemLonza04-418Q
FOXP3 (najlepsze pokrycie) Identyfikator testu Applied Biosystems4331182: Hs01085834_m1Uwaga: zawiera paraformaldehyd
Test ekspresji genów TaqMan, RPL13A (najlepsze pokrycie)Identyfikator testu 4351370 Biosystems Applied Biosystems: Hs04194366_g1   Uwaga: zawiera paraformaldehyd
TaqMan Gene Expression Master mixApplied Biosystems4369514
przeciwciało Test ekspresji genów ,

Bibliografia

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152(2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474(2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90(2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

naiwne limfocyty T CD4protok TGF betaanaliza cytometrycznaanaliza qRT PCRmononuklearne kom rki krwi obwodowejizolacja za pomoc kulek magnetycznychekspresja FOXP3r nicowanie Treginkubacja hodowli kom rkowych
In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.