Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Limfocyty T regulatorowe (Treg) są integralną częścią tolerancji obwodowej, tłumiąc reakcje immunologiczne przeciwko własnym strukturom i zapobiegając w ten sposób chorobom autoimmunologicznym. Podejścia kliniczne mające na celu adoptywny transfer limfocytów Treg lub ich zubożenie w leczeniu raka są w toku, przynosząc obiecujące pierwsze wyniki.
Ponieważ liczba naturalnie występujących Treg (nTreg) jest bardzo ograniczona, badanie pewnych cech Treg za pomocą indukowanych in vitro Treg (iTregs) może być korzystne. Do tej pory najlepszym, choć nie do końca specyficznym markerem białkowym do wyznaczania limfocytów Treg, jest czynnik transkrypcyjny FOXP3. Pomimo znaczenia limfocytów Treg, w tym nieredundantnych ról limfocytów Treg indukowanych obwodowo, protokoły generowania limfocytów Treg są obecnie kontrowersyjne, szczególnie w przypadku komórek ludzkich. Protokół ten opisuje zatem różnicowanie in vitro ludzkich iTreg CD4 + FOXP3 + od ludzkich naiwnych limfocytów T przy użyciu szeregu czynników indukujących Treg (TGF-β plus tylko IL-2 lub ich kombinacji z kwasem retinowym, rapamycyną lub maślanem) równolegle. Opisano również fenotypowanie tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i qRT-PCR.
Te protokoły skutkują powtarzalną ekspresją FOXP3 i innych genów sygnatury Treg oraz umożliwiają badanie ogólnych mechanizmów regulacyjnych FOXP3, jak również efektów specyficznych dla protokołu, aby określić wpływ pewnych czynników. iTregi mogą być wykorzystywane do badania różnych aspektów fenotypowych, jak również molekularnych mechanizmów indukcji Treg. Szczegółowe badania molekularne ułatwiają stosunkowo duże liczby komórek, które można uzyskać.
Ograniczeniem dla stosowania iTreg jest względna niestabilność ekspresji FOXP3 w tych komórkach w porównaniu do nTreg. iTregi generowane przez te protokoły mogą być również wykorzystywane do testów funkcjonalnych, takich jak badanie ich funkcji supresyjnej, w których iTregi indukowane przez TGF-β plus kwas retinowy i rapamycyna wykazują wyższą aktywność tłumiącą. Jednak zdolność tłumienia iTreg może różnić się od nTreg, a zastosowanie odpowiednich kontroli ma kluczowe znaczenie.
Wprowadzenie
CD4+CD25+FOXP3+ regulatorowe limfocyty T (Treg) tłumią inne komórki odpornościowe i są krytycznymi mediatorami tolerancji obwodowej, zapobiegając autoimmunizacji i nadmiernemu zapaleniu1. Znaczenie limfocytów Treg ilustruje zespół sprzężony z chromosomem X choroby człowieka immunodysregulacji, poliendokrynopatii, enteropatii sprzężonej z chromosomem X (IPEX), w którym utrata limfocytów Treg z powodu mutacji w "głównym" skrzynce widłowej P3 czynnika transkrypcyjnego Treg (FOXP3) prowadzi do ciężkiej ogólnoustrojowej choroby autoimmunologicznej, śmiertelnej we wczesnym wieku. Jednak limfocyty Treg działają jak miecz obosieczny w układzie odpornościowym, ponie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zostały świeżo wyizolowane z anonimowych, zdrowych dawców kożuchów zakupionych w Szpitalu Uniwersyteckim Karolinska w Szwecji. Pozwolenie etyczne na przeprowadzenie eksperymentów uzyskano od Regionalnej Komisji ds. Oceny Etycznej w Sztokholmie (Regionala etikprövningsnämnden i Stockholm), Szwecja (numer zgody: 2013/1458-31/1).
1. Izolacja limfocytów T z krwi obwodowej
- Izolacja PBMC
- Wstępnie umieść roztwór pożywki wirowej o gęstości 15 ml (takiej jak Ficoll) w probówkach o pojemności 50 ml (5 probówek na warstwę kożuchową). Podgrzej do temperatury pokojowej.
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia schemat układu eksperymentalnego. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne barwienie kontrolne czystości dla magnetycznie wyizolowanych naiwnych limfocytów T CD4+ oraz nTregs.
Rysunek 3A przedstawia strategię bramkowania w cytometrii przepływowej, a rysunek 3B ukazuje reprezentatywne barwienia cytometryczne FOXP3 i CD25 w 6. dniu hodo.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany protokół umożliwia silną indukcję ludzkich iTreg CD4 + FOXP3 + z ludzkich naiwnych limfocytów T CD4 + . Obejmuje on nowy protokół, który opisaliśmy niedawno, wykorzystujący kombinację TGF-β, ATRA i rapamycyny, do indukcji iTreg o lepszej funkcji supresyjnej in vitro 22. W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami, kolejną zaletą jest indukcja różnych populacji iTreg równolegle za pomocą różnych protokołów, co umożliwia bezpośrednie porównanie efektów niektórych czynników induku.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Nina Nagel jest wdzięczna za pomoc techniczną podczas kręcenia filmu i przygotowań do eksperymentu. Dziękujemy Evie-Marii Weiss za pomoc w opracowaniu wewnątrzkomórkowego protokołu barwienia FOXP3 oraz Elisabeth Suri-Payer i Ninie Oberle za ustanowienie protokołu izolacji nTreg. Matilda Eriksson i Peri Noori są cenione za zarządzanie laboratorium.
Finansowanie: A.S. było wspierane przez Intraeuropejskie Stypendium Marie Curie w ramach 7 Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej, Fundację Dr. Ake Olssona oraz fundacje badawcze KI; A.S. i J.T. były wspierane przez grant CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascul....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas all-trans retinowy | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |
| Ludzki klon Foxp3-APC 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |
| anty-ludzkie mikrogranulki CD25 | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |
| anty-ludzkie CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |
| anty-ludzkie CD28, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |
| przeciwciało anty-ludzkie CD3, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |
| anty-ludzki CD45RA, FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |
| anty-ludzki klon CD45RO PE UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |
| anty-ludzki klon CD4-PerCP SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |
| anty-ludzki CD8-eFluor 450 (klon OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |
| anty-ludzki CTLA-4 (CD152), klon BNI3, mIgG2ak, fioletowy brylantowy 421 | BD Biosciences | 562743 | |
| anty-ludzki klon IFN-g FITC 4S. Klasa B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |
| Roztwór zawierający Brefeldin A: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |
| zestaw do syntezy cDNA: SuperScript VILO (odwrotna transkryptaza) Zestaw do syntezy cDNA | Invitrogen | 11754-250 | |
| Podłoże do wirowania gęstości: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |
| DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |
| FBS, inaktywowany termicznie | Invitrogen | 10082-147 | |
| Utrwalany barwnik żywotności, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 lub 65-0865-18 | |
| Zestaw barwiących Foxp3 | eBioscience | 00-5523-00 | Uwaga: zawiera paraformaldehyd. Można go również kupić w zestawie łączonym z przeciwciałami; 77-5774-40 Zestaw do barwienia anty-ludzkiego Foxp3 Klon APC: 236A/E7 Zestaw |
| GlutaMAX (200 mM L-alanylo-L-glutamina) | Invitrogen | 35050-061 | |
| Zestaw do izolacji ludzkich naiwnych limfocytów T CD4 II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| Albumina surowicy ludzkiej 50 g/L | Baxter | 1501057 | |
| Jonomycyna ze Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |
| MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| mysz IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |
| mysz IgG1 K Isotype Control FITC 50 μ g | eBioscience | 11-4714-81 | |
| kontrola izotypu myszy IgG2a, fiolet brylantowy 421, klon MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |
| pipeta Pasteura plastikowa, pakowana pojedynczo | Sarstedt | 86.1172.001 | |
| PMA Phorbol 12-mirystynian 13-octan | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |
| Rapamycyna | EMD (Merck) | 553210-100UG | |
| Rekombinowana ludzka IL-2, CF | R& D | 202-IL-050/CF | |
| Rekombinowany ludzki TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |
| Zestaw do izolacji RNA: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| RPMI 1640 Średni | Invitrogen | 72400-054 | |
| Maślan sodu | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |
| Pożywka do hodowli limfocytów T: pożywka X-Vivo 15, z gentamycyną + fenolem | Lonza | 04-418Q | |
| FOXP3 (najlepsze pokrycie) | Identyfikator testu Applied Biosystems | 4331182: Hs01085834_m1 | Uwaga: zawiera paraformaldehyd |
| Test ekspresji genów TaqMan, RPL13A (najlepsze pokrycie) | Identyfikator testu 4351370 Biosystems Applied Biosystems | : Hs04194366_g1 | Uwaga: zawiera paraformaldehyd |
| TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |
Bibliografia
- Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
- DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the litera....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
