Method Article

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

DOI:

10.3791/55022

⸱

December 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, University of Cologne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potrzebne są nowe terapie do leczenia zakażeń Clostridium difficile, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Metaloproteaza C. difficile PPEP-1 jest celem dla przyszłych prac nad inhibitorami zmniejszającymi zjadliwość patogenu. Do przeprowadzenia charakterystyki biofizycznej i strukturalnej, a także badań przesiewowych inhibitorów, potrzebne będą duże ilości czystego i aktywnego białka. Opracowaliśmy protokół wydajnej produkcji i oczyszczania PPEP-1 poprzez wykorzystanie E. coli jako gospodarza ekspresji, dającego wystarczające ilości i czystość białka do krystalizacji i określenia struktury. Dodatkowo, za pomocą mikrosiewu, silnie przerośnięte kryształy PPEP-1 mogą być hodowane do dobrze uporządkowanych kryształów odpowiednich do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Metody te mogą być również wykorzystane do produkcji innych rekombinowanych białek oraz do badania struktur innych białek wytwarzających przerośnięte kryształy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile jest jedną z głównych przyczyn szpitalnych zakażeń biegunką związaną z antybiotykami1. Ta Gram-dodatnia bakteria beztlenowa jest przenoszona przez formę przetrwalników drogą fekalno-oralną. W ciągu ostatniej dekady nowe szczepy "epidemiczne" lub "hiperwirulentne" (np. BI/NAP1/027) spowodowały drastyczny wzrost liczby nowych zakażeń i śmiertelności w Ameryce Północnej i Europie2. Choroba związana z C. difficile (CDAD) jest zagrażającym życiu zapaleniem jelita grubego o wysokiej śmiertelności3. Objawy wahają się od biegunki4 do rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego5

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie i projektowanie konstrukcji

  1. Sklonuj zoptymalizowaną pod kątem kodonów sekwencję (dla E. coli) C. difficile PPEP-1 bez peptydu sygnałowego [aminokwasy 27-220, nazwane dalej rekombinowanym PPEP-1 (rPPEP-1)11] do wektora pET28a przy użyciu miejsc restrykcyjnych NdeI i XhoI (ryc. 1) z kodonem stop na końcu 3' (wektor wynikowy pET28a-NHis-rPPEP-1). W ten sposób powstaje N-końcowe białko znakowane 6xHhis (NHis-rPPEP-1) z miejscem rozszczepienia trombiny, co umożliwia usunięcie znacznika podczas oczyszczania (Figura 1). Plazmid zawiera kasetę oporności na kanamycynę do ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rPPEP-1 ulega nadekspresji w kilku szczepach E. coli, z najwyższą wydajnością w E. coli BL21 (DE3) Star (Rysunek 1C). Po pierwszym etapie chromatografii powinowactwa NiNTA znacznik 6xHhis można z powodzeniem odciąć od większości białka, a w drugim etapie NiNTA niestrawione białko można całkowicie oddzielić od białka trawionego trombiną (ryc. 1D). Na nieoznakowanej kolumnie S200 16/600 rPPEP-1 migruje jako monomer z okazjonalnym frontem, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia rentgenowska jest nadal najszybszą i najdokładniejszą metodą określania trójwymiarowych struktur białek o rozdzielczości zbliżonej do atomowej28. Wymaga to jednak wzrostu dobrze uporządkowanych monokryształów. Są one często trudne do zdobycia, a stan krystaliczny jest sztuczny. Jednak porównanie struktur białkowych wyznaczonych za pomocą krystalografii rentgenowskiej z tymi wyznaczonymi innymi metodami, zwłaszcza NMR, wykazuje ogólnie bardzo dobrą zgodność. W przypadku PPEP-1, struktura NMR opub.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy personelowi linii badawczej X06DA w Swiss Light Source, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Szwajcaria za wsparcie podczas zbierania danych synchrotronowych. Jesteśmy wdzięczni Monice Gompert za doskonałe wsparcie techniczne. Projekt był wspierany przez Uniwersytet w Kolonii i grant INST 216/682-1 FUGG od Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych. Stypendium doktoranckie z International Graduate School in Development, Health and Disease dla C.P. jest potwierdzone. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o dofinansowanie nr 283570 (BioStru....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Geny / Wektory / szczepy komórek
pET28a wektorMerck-Millipore69864Zakrzep rozszczepialny N-końcowy His-tag
E. coli szczep BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003niedoborem RNazy H
(dla E. coli) PPEP-1 (CD630_28300)Geneart (Thermo Fisher Scientific)niestandardoweaminokwasy 27-220
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Ekstrakt drożdżowydowolny
Tryptondowolny
Przeciwpieniący BSigma-AldrichA5757wodno-silikonowa emulsja
Agarz
Kanamycynąwedług
IPTGAppliChemA1008
Tris-HClAppliChemA1087Klasa buforu
NaCldowolnaklasa buforu
DNaseIAppliChemA3778
ImidazolAppliChemA1073Klasa buforowa
TrombinaSigma-AldrichT4648
Fosforan amonu dwuzasadowySigma-Aldrich215996
Glicerol 100%najczystszy gatunek
SacharozaSigma-Aldrich84097
Płyn dowolnydo przechowywania i kriochłodzenia kryształów
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Sprzęt (ogólny)
Inkubator z wytrząsaniemotemperaturze 20 ° C - 37 & C
Naczynia szklanedowolnekolby Erlenmeyera z przegrodami (50 ml - 2,8 l)
Wirówka do dużych objętości kulturdowolnawirówka do objętości przetwarzania do 12 l
Sonicator Vibra-Cell VCX500SonicsSO-VCX500lub dowolny inny sonikator / zakłócacz komórek
UltrawirówkaDowolnawirówka zapewnia prędkość do 150 000 x g
Żywica NiNTA SuperflowQiagen
Pusta szklana kolumna ekonomicznaBio-Rad7371007lub dowolna inna pusta szklana lub plastikowa
kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiar HiLoad Superdex 200 16/600GE Healthcare28989335
System chromatograficzny i Auml; kta PurifierGE Healthcare28406264lub dowolny inny system chromatograficzny
Rurki do dializy Spectra/Por 3Spectrum Labs132724
Zamknięcia węży do dializySpectrum Labs132738
Jednostki ultrafiltracji (koncentratory) 10 000 NWCOdowolny
spektrofotometr UV-Visdowolny
< strong>Nazwa>FirmaNumer katalogowyUwagi
>Sprzęt (krystalografia)
Pipeta o małej objętości 0,1-10 i mikro; ldowolna
pipeta wyporowa Microman M10GilsonF148501
Robot do krystalizacjidowolna
96-dołkowa płytka krystalizacyjna TTP IQ z trzema dołkami białkowymiTTP4150-05810lub dowolna inna 96-dołkowa płytka krystalizacyjna 
24-dołkowa płytka CombiClover Junior JenaBioscienceEB-CJR
Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniającaHampton ResearchHR3-511
Szkiełka osłonowe ze szkła silikonowanegoHampton ResearchHR3-225
Komercyjne ekrany krystalizacji: SaltRx, Index, PEG/Ion, CrystalHampton Researchróżnorodne
komercyjne ekrany krystalizacji: Czarodziej, PACT++, JCSG++JenaBiosciencediverse
JBS Koraliki do nasionJena BioscienceCO-501
CrystalCap SPINE HT (nylonowe pętelki)Hampton Researchróżnerozmiary pętli 0,025 mm - 0,5 mm
Fiolka CrystalCapHampton ResearchHR4-904
Pianka kriogeniczna Dewar 800 mlHampton ResearchHR4-673
Pianka kriogeniczna Dewar 2 LHampton ResearchHR4-675
Zacisk do fiolek, prostyHampton ResearchHR4-670
CrystalWand Magnetyczny, prostyHampton ResearchHR4-729
CryoCane 6 Uchwyt na fiolkiHampton ResearchHR4-711
CryoSleeveHampton ResearchHR4-708
CryoCane Koder kolorów - białyHampton ResearchHR4-713
Skalpeldowolny
Prosty mikrokleszczdowolnydo manipulacji taśmą uszczelniającą. etc.
Igła do akupunkturydowolnanp. z apteki
Mikroskop stereoskopowydowolnydo inspekcji płytek krystalizacyjnych i montażu kryształowego, powiększenie do 160X
Gen zoptymalizowany pod kątem kodonów z dowolny azot

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
  2. O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epid....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C difficile PPEP 1Protein CrystallizationMicroseeding TechniqueX ray DiffractionZinc SAD MethodRecombinant Protein ProductionCrystal Structure DeterminationAmmonium Phosphate ConditionsTris Buffer pHNylon Loop Mounting

Related Articles