Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55022

⸱

30 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, University of Cologne

W tym artykule

Podsumowanie

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Streszczenie

Potrzebne są nowe terapie do leczenia zakażeń Clostridium difficile, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Metaloproteaza C. difficile PPEP-1 jest celem dla przyszłych prac nad inhibitorami zmniejszającymi zjadliwość patogenu. Do przeprowadzenia charakterystyki biofizycznej i strukturalnej, a także badań przesiewowych inhibitorów, potrzebne będą duże ilości czystego i aktywnego białka. Opracowaliśmy protokół wydajnej produkcji i oczyszczania PPEP-1 poprzez wykorzystanie E. coli jako gospodarza ekspresji, dającego wystarczające ilości i czystość białka do krystalizacji i określenia struktury. Dodatkowo, za pomocą mikrosiewu, silnie przerośnięte kryształy PPEP-1 mogą być hodowane do dobrze uporządkowanych kryształów odpowiednich do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Metody te mogą być również wykorzystane do produkcji innych rekombinowanych białek oraz do badania struktur innych białek wytwarzających przerośnięte kryształy.

Wprowadzenie

Clostridium difficile jest jedną z głównych przyczyn szpitalnych zakażeń biegunką związaną z antybiotykami1. Ta Gram-dodatnia bakteria beztlenowa jest przenoszona przez formę przetrwalników drogą fekalno-oralną. W ciągu ostatniej dekady nowe szczepy "epidemiczne" lub "hiperwirulentne" (np. BI/NAP1/027) spowodowały drastyczny wzrost liczby nowych zakażeń i śmiertelności w Ameryce Północnej i Europie2. Choroba związana z C. difficile (CDAD) jest zagrażającym życiu zapaleniem jelita grubego o wysokiej śmiertelności3. Objawy wahają się od biegunki4 do rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego5 i często śmiertelnej toksycznej okrężnicy6.

Leczenie CDAD jest trudne, ponieważ zjadliwe szczepy są wielolekooporne, a częstość nawrotów jest wysoka7. W chwili obecnej terapia obejmuje antybiotyki metronidazol, fidaksomycynę lub wankomycynę, a w powtarzających się przypadkach przeszczep mikrobioty kałowej. Pilnie potrzebne są nowe strategie terapeutyczne8. Odnotowuje się pewien postęp, ponieważ terapeutyczne przeciwciało monoklonalne Bezlotoxumab, skierowane przeciwko toksynie C. difficile B9, niedawno pomyślnie przeszło badania kliniczne III fazy i zostało złożone w celu uzyskania zgody FDA i EMA. Dodatkowo, nowe antybiotyki są obecnie testowane na różnych etapach badań klinicznych10.

Aby opracować skuteczne leczenie, muszą zostać zidentyfikowane nowe cele terapeutyczne. Niedawno odkryta proteaza C. difficile endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1; CD2830/ZMP1; E.C. 3.4.24.89) jest tak obiecującym celem, ponieważ brak PPEP-1 w szczepie knock-out zmniejsza zjadliwość C. difficile in vivo11. PPEP-1 jest wydzielaną metaloproteazą12,13 rozszczepiającą dwie adhezyny C. difficile na ich C-końcu13, uwalniając w ten sposób przylegające bakterie z ludzkiego nabłonka jelitowego. Dlatego bierze udział w utrzymaniu równowagi między fenotypem siedzącym i ruchliwym C. difficila. Aby opracować selektywne inhibitory przeciwko PPEP-1 i zrozumieć, w jaki sposób rozpoznaje on swoje substraty, niezbędna jest dogłębna wiedza na temat jego trójwymiarowej struktury. Rozwiązaliśmy pierwszą strukturę krystaliczną PPEP-1 samodzielnie i w kompleksie za pomocą peptydu substratowego14. PPEP-1 jest pierwszą znaną proteazą, która selektywnie rozszczepia wiązania peptydowe między dwiema resztami proliny15. Wiąże substrat w sposób podwójnie zagięty i stabilizuje go poprzez rozszerzoną alifatyczno-aromatyczną sieć reszt zlokalizowanych w pętli S, która pokrywa miejsce aktywne proteazy14. Ten tryb wiązania substratu jest unikalny dla PPEP-1 i do tej pory nie znaleziono go w ludzkich proteazach. To sprawia, że jest to obiecujący cel dla leków, a niezamierzone efekty inhibitorów są bardzo mało prawdopodobne.

Aby w przyszłości opracować i przebadać selektywne inhibitory PPEP-1, potrzebna jest duża ilość czystego i monodyspersyjnego białka PPEP-1. Ponadto, aby określić sposób wiązania pierwszych inhibitorów, konieczne będzie określenie struktur kokrystalicznych z PPEP-1. W naszych rękach PPEP-1 stale wytwarza przerośnięte kryształy. W związku z tym opracowaliśmy procedurę optymalizacyjną do produkcji pojedynczych kryształów PPEP-1 o jakości dyfrakcyjnej. W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy wytwarzanie, oczyszczanie, krystalizację i strukturę roztworu PPEP-114. Używamy wewnątrzkomórkowej ekspresji w Escherichia coli wariantu PPEP-1 bez sekwencji sygnału wydzielania, chromatografii powinowactwa i chromatografii wykluczania wielkości z usunięciem znacznika oczyszczania, a następnie mikrosiewu16 do ekranu optymalizacyjnego i określenia struktury za pomocą anomalnej dyspersji o pojedynczej długości fali (-SAD)17. Protokół ten można dostosować do produkcji i określania struktury innych białek (np. metaloproteaz), a w szczególności do białek wytwarzających przerośnięte kryształy. Na życzenie można dostarczyć plazmidowe DNA konstruktu (pET28a-NHis-rPPEP-1) oraz dane dyfrakcyjne do celów edukacyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Klonowanie i projektowanie konstruktu

  1. Klonować zoptymalizowaną pod kątem kodonów (dla E. coli) sekwencję PPEP-1 z C. difficile bez peptydu sygnałowego [aminokwasy 27-220, zwany dalej rekombinowanym PPEP-1 (rPPEP-1)11] do wektora pET28a z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych NdeI i XhoI (Rysunek 1), z kodonem stop na końcu 3' (powstały wektor pET28a-NHis-rPPEP-1). Pozwala to na otrzymanie białka z tagiem 6xHis na N-końcu (NHis-rPPEP-1) z miejscem cięcia trombina, umożliwiającym usunięcie tagu podczas oczyszczania (Rysunek 1). Plazmid zawiera kasetę oporności na kanamycynę służącą do selekcji. Primery użyte do klonowania zostały opisane w innym opracowaniu14.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja konstruktu pET28a-NHis-rPPEP-1 oraz analiza SDS-PAGE ekspresji i wszystkich etapów oczyszczania. (A) Mapa wektora NHis-rPPEP-1 sklonowanego do wektora pET28a przy użyciu NdeI/XhoI, stworzona w programie PlasMapper. (B) Schematyczna reprezentacja konstruktu NHis-rPPEP-1 (panel górny) oraz końcowego konstruktu po odcięciu znacznika 6xHis przez trombinę, z resulting dodatkową sekwencją GSHM na N-końcu (panel dolny). Analiza SDS-PAGE (C) ekspresji w szczepie BL21 (DE3) Star w 37 °C przez 4 hr oraz (D) próbek ze wszystkich etapów oczyszczania (M: marker masy cząsteczkowej). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Ekspresja i oczyszczanie rPPEP-1

  1. Ekspresja NHis-rPPEP-1
    1. Przygotować i autoklawować pożywkę LB (lysogeny broth) (10 g/L tryptony, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl, pH dostosować do 7,5 za pomocą NaOH). Tuż przed użyciem uzupełnić siarczanem kanamycyny (50 µg/ml) (pożywka LB/Kan).
    2. Zaszczepić 200 ml kultury nocnej ze świeżo transformowanych E. coli w pożywce LB/Kan. Inkubować przez noc w 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 220 rpm.
    3. Następnego dnia rano sprawdzić OD600 (gęstość optyczna przy długości fali 600 nm) kultury nocnej. Zaszczepić dwie kolby z przegrodami o pojemności 2,8 L, zawierające po 1 L pożywki LB/Kan, kulturą nocną do uzyskania OD600 = 0,1. Dodać trzy krople emulsji wodno-silikonowej, aby zapobiec nadmiernemu pienieniu. Hodować komórki w 37 °C przy wytrząsaniu 180 rpm, aż OD600 osiągnie wartość 0,6.
    4. Pobrać próbkę przed indukcją do analizy SDS-PAGE (równowartość 1 ml z kultury o OD600 = 1); dodać IPTG do stężenia końcowego 0,5 mM, aby zaindukować ekspresję NHis-rPPEP-1. Kontynuować hodowlę w 37 °C/180 rpm przez 4 h.
    5. Wyznaczyć OD600 w rozcieńczeniu 10x i pobrać próbkę do zbioru (równowartość 1 ml z kultury o OD600 = 1).
    6. Zebrać komórki przez wirowanie przez 20 min przy 7 000 x g i 4 °C. Aby usunąć resztki pożywki LB, osad komórkowy z 1 L kultury zawiesić w 40 ml buforu TBS (Tris-buffered saline: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl) i przenieść do probówki wirówkowej 50 ml. Zebrać komórki przez wirowanie przez 10 min przy 10 000 x g i 4 °C i przechowywać w -80 °C do czasu użycia. Analizować ekspresję (lizaty całkowite i frakcje rozpuszczalne) metodą SDS-PAGE18.
  2. Oczyszczanie nieoznaczonego rPPEP-1
    1. Pobrać próbki o objętości 50 µl z każdego etapu oczyszczania do analizy SDS-PAGE. Osad komórkowy z 1 L kultury zawiesić w buforze TBS uzupełnionym o 10 µg/ml DNaseI. Stosować 5 ml TBS/DNaseI na g komórek.
      1. Zlizować komórki poprzez sonikację w lodzie/wodzie przy amplitudzie 30% przez 15 min (impulsy 2 s z 2 s przerwą). Usunąć zanieczyszczenia przez wirowanie przez 10 min przy 10 000 x g i 4 °C i przenieść nadsącz do probówki do ultrawirowania. Oczyścić lizat w ultrawirowarce przez 30 min przy 165 000 x g i 4 °C.
    2. Pracować w temperaturze 4-6 °C. Używając pompy perystaltycznej lub systemu chromatograficznego, zrównoważyć 2 ml żywicy niklowo-nitrylotriacetic acid (NiNTA) w kolumnie szklanej buforami TBS uzupełnionymi o 10 mM imidazolu, pH 7,5. Alternatywnie można zastosować przepływ grawitacyjny.
      1. Dostosować oczyszczony lizat za pomocą 1 M imidazolu pH 7,5 do stężenia końcowego 10 mM. Nałożyć lizat na kolumnę i przemywać stopniowo buforem TBS uzupełnionym odpowiednio o 10 mM i 30 mM imidazolu, aż absorbancja UV przy 280 nm osiągnie poziom linii bazowej.
      2. Eluować białko buforem TBS z dodatkiem 250 mM imidazolu. Ponownie zrównoważyć kolumnę buforem TBS uzupełnionym o 10 mM imidazolu i przechowywać przez noc.
    3. Wyznaczyć stężenie białka przy 280 nm, korzystając z współczynnika ekstynkcji 25 900 M-1 cm-1, lub dowolną inną metodą (np. metodą Bradforda19). Dodać 2 jednostki trombiny na mg białka i dializować roztwór białka przez noc w 4 °C przeciwko 50-krotnej objętości TBS (50x objętości elucji z NiNTA).
      UWAGA: Należy użyć odpowiedniej próby ślepej do wyznaczania stężenia białka, ponieważ imidazol silnie absorbuje przy 280 nm.
    4. Przepuścić roztwór białka przez zrównoważoną żywicę NiNTA, aby usunąć nieprzecięte białko. Następnie nałożyć na kolumnę taką samą objętość TBS uzupełnionego o 10 mM imidazolu, aby odzyskać całe przecięte białko. Aby oczyścić kolumnę, eluować pozostałe białko 250 mM imidazolu. Próbki analizować metodą SDS-PAGE (Rycina 1).
    5. Skoncentrować roztwór białka do 4 ml w odstępach 10 min przy 4 000 x g i 4 °C, używając odwirującej jednostki ultrafiltracyjnej. Mieszać koncentrowane białko po każdym przedziale czasowym, aby zapobiec wytrącaniu i agregacji. Na tym etapie, mimo procedury mieszania, okazjonalnie obserwuje się wytrącanie rPPEP-1.
      1. Nałożyć skoncentrowane białko na uprzednio zrównoważoną kolumnę do chromatografii wykluczania rozmiarów (w buforze TBS) w 4-6 °C. Eluować kolumnę buforem TBS, zbierać frakcje o objętości 1 ml i poddać analizie SDS-PAGE 5 µl z każdej drugiej frakcji. rPPEP-1 eluje w pojedynczym piku odpowiadającym monomerowi (Rycina 2). Okazyjonalnie obserwuje się niewielki pik przy większej masie cząsteczkowej (pik czołowy), który odpowiada dimerowi białka. Wydajność powinna wynosić około 50 mg czystego białka na L kultury. Wszystkie próbki analizować metodą SDS-PAGE18 (Rycina 2).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Reprezentatywna analiza rPPEP-1 przy użyciu chromatografii wykluczania sterycznego i SDS-PAGE. Chromatogram wykluczania sterycznego (A280; absorbancja przy 280 nm) oczyszczonego rPPEP-1 bez znacznika, z wykorzystaniem kolumny (16/600) w buforze Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl w temperaturze 6 °C. Na podstawie objętości elucji rPPEP-1 migruje zgodnie z oczekiwaniami dla białka o masie 22 kDa, co sugeruje, że występuje ono głównie w formie monomeru. Rzadko pojawia się niewielki pik frontowy odpowiadający dimerowi. (wstawka) Analiza SDS-PAGE frakcji z chromatografii wykluczania sterycznego (M; marker masy cząsteczkowej). Naniesiono co drugą frakcję. Słabe prążki poniżej głównego prążka rPPEP-1 odpowiadają sporadycznie występującym niewielkim zanieczyszczeniom. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

3. Krystalizacja i optymalizacja kryształów z wykorzystaniem mikrosiewania

UWAGA: rPPEP-1 krystalizuje w warunkach, w których stale powstają silnie zrośnięte kryształy, nieprzydatne do analizy dyfrakcyjnej rentgenowskiej (Rysunek 3). W związku z tym opracowano strategię optymalizacji (Rysunek 4), aby uzyskać kryształy wysokiej jakości (Rysunek 5).

  1. Wstępne przesiewanie rPPEP-1 przy użyciu komercyjnych zestawów przesiewowych
    UWAGA: Próby krystalizacji należy przeprowadzić w formacie siedzącej kropli, stosując standardowe, dostępne komercyjnie zestawy przesiewowe oraz robot do krystalizacji.
    1. Skoncentrować oczyszczone białko do stężenia 12 mg/ml za pomocą urządzenia do ultrafiltracji odśrodkowej w interwałach 5-minutowych przy 4,000 x g i 4 °C. Po każdym interwale należy wymieszać koncentrowane białko, aby zapobiec wytrącaniu i agregacji. Stężenie białka należy oznaczyć przy 280 nm, korzystając z współczynnika ekstynkcji 25,900 M-1 cm-1, lub dowolną inną metodą (np. metodą Bradforda). Doprowadzić białko do stanu równowagi w temperaturze 20 °C. Usunąć wszystkie cząstki i kurz poprzez wirowanie przez 10 min przy 16,000 x g i 20 °C.
    2. Należy użyć albo wcześniej napełnionych płytek do krystalizacji, zapieczętowanych i przechowywanych w 4 °C, albo napełnić dołki zbiornicze płytek po 70 µl każdego warunku krystalizacji. Wszystkie płytki do krystalizacji należy doprowadzić do stanu równowagi w temperaturze 20 °C. Należy pracować szybko, ponieważ małe objętości szybko wysychają. Jeśli to możliwe, należy zastosować komorę wilgotności wokół gniazda robota.
      UWAGA: Jako standardową procedurę należy stosować następujące zestawy: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal, Wizard, PACT++, JCSG++.
    3. Przygotować przesiewanie, pipetując białko i roztwór ze zbiornika do poddołków 2-4. Objętość kropli wynosi 300 nl, a stosunki (białko:zbiornik) to odpowiednio 200:100 (poddołek 2), 150:150 (poddołek 3) i 100:200 (poddołek 4) (w nl). Natychmiast zapieczętować płytkę i umieścić ją w komorze w temperaturze 20 °C.
    4. Tace należy sprawdzić natychmiast po przygotowaniu, a następnie codziennie w ciągu pierwszego tygodnia, a później raz w tygodniu.
  2. Kokrystalizacja rPPEP-1 z ligandami
    1. W przypadku kokrystalizacji kompleksów peptyd substratowy-rPPEP-1, wymieszać rPPEP-1 o stężeniu 24 mg/ml w stosunku 1:1 (v/v) z 7-krotną nadwyżką molową roztworu peptydu (proszek liofilizowany Ac-EVNPPVPD-NH2 rozpuszczony w buforze TBS), co zapewni końcowe stężenie białka r-PPEP-1 wynoszące 12 mg/ml oraz 7-krotną nadwyżkę molową peptydu względem PPEP-1. Inkubować przez 30 min w 20 °C, a następnie usunąć wszystkie cząstki i kurz poprzez wirowanie przez 10 min przy 16,000 x g i 20 °C. Przystąpić do krystalizacji, stosując procedurę mikrosiania opisaną dla niezwiązanego białka r-PPEP-1.

figure-protocol-3
Rycina 3: Reprezentatywne kryształy z wstępnych przesiewów. Zrośnięte kryształy rPPEP-1 przy 12 mg/ml wyhodowane w warunkach: (A) Crystal screen I/38 (1,4 M cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny, 0,1 M HEPES sodowy pH 7,5; 200 nl:100 nl). (B) SaltRx screen/52 (2,4 M fosforan amonu dwuzasadowy, 0,1 M Tris pH 8,5; 100 nl:200 nl) oraz (C) (200 nl:100 nl). (D) SaltRx screen/96 (60% v/v Tacsimate pH 7,0, 0,1 M BIS-TRIS propan pH 7,0; 200 nl:100 nl). Pasek skali = 0,2 mm. Stosunki objętości określono zawsze jako białko:roztwór buforowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Procedura optymalizacji krystalizacji rPPEP-1. Pierwotne kryształy rPPEP-1 o stężeniu 12 mg/ml, charakteryzujące się niską jakością dyfrakcji i obecnością wielu sieci (zrośnięte), odtworzono w ekranie optymalizacyjnym obejmującym 24 warunki. Ponownie zaobserwowano jedynie kryształy zrośnięte w warunkach zawierających 2,55 M fosforanu dwuwodorowego amonu. Z pojedynczego zrośniętego kryształu przygotowano roztwór zaprawowy (seed stock), który rozcieńczono 1:1000 w tym samym warunku (mikrozaprawianie). Do pozostałych klarownych kropel dodano objętość 0,5 µl rozcieńczonego roztworu zaprawowego, w wyniku czego w niemal wszystkich warunkach wyrosły pojedyncze kryształy. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1. Optymalizacja kryształów z wykorzystaniem mikrosiania
    UWAGA: Silnie zrośnięte kryształy rPPEP-1 pojawiają się po dwóch dniach w warunkach zawierających 2,4 M fosforanu amonu dwuzasadowego, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 (przesiew SaltRx, warunek E4, wszystkie trzy mikrowyrobiska) (Rycina 3). Zastosowano procedurę optymalizacji z wykorzystaniem przesiewu siatkowego wokół warunku początkowego w połączeniu z mikrosianiem (Rycina 4).
    1. Przygotować przesiew siatkowy (Rycina 4>) obejmujący 24 warunki z 1,8 – 2,55 M fosforanu amonu dwuzasadowego (w krokach co 0,15 M) i 0,1 M Tris-HCl pH 7,5–9,0 (w krokach co 0,5 jednostki pH) z odpowiednich roztworów zapasowych (4 M fosforanu amonu i 1 M buforu Tris).
      UWAGA: Należy użyć aplikacji Make Tray (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) do obliczenia objętości i schematu pipetowania, aby uzyskać 2 ml każdego warunku, co pozwala na przeprowadzenie 10 przesiewów optymalizacyjnych. Roztwór zapasowy 4 M fosforanu amonu jest trudny do przygotowania. Należy podgrzewać roztwór podczas mieszania, aby całkowicie rozpuścić proszek w wodzie.
    2. Napippetować 200 µl każdego roztworu z przesiewu siatkowego do wyrobisk płytki 24-dołkowej i doprowadzić do równowagi w temperaturze 20 °C.
    3. Ręcznie przygotować płytkę krystalizacyjną. Objętość kropli wynosi 3 µl, a stosunki (białko:rezerwuar) to 2:1, 1,5:1,5 oraz 1:2 (w µl). W tym celu należy użyć pipety o wyporze dodatnim, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Natychmiast zamknąć płytkę i umieścić w komorze w temperaturze 20 °C. Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Po upływie od jednego do czterech dni silnie zrośnięte kryształy pojawiają się w czterech warunkach zawierających 2,55 M fosforanu amonu dwuzasadowego i 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 – 9,0 (Rycina 4). W pozostałych 20 warunkach z koncentracjami fosforanu amonu poniżej 2,55 M nie powstają kryształy. Procedura mikrosiania jest wykorzystywana do uzyskania pojedynczych kryształów rPPEP-1 w tych warunkach.
    4. Przygotować zapas mikrosiań poprzez pobranie pojedynczego zrośniętego kryształu z jednego z dwóch warunków z 2,55 M fosforanu amonu dwuzasadowego i 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 lub 8,5. Kryształy mogą być przyczepione do plastikowej powierzchni. Ostrożna deformacja otaczającego plastiku za pomocą igły do akupunktury pomaga odczepić kryształy.
      1. Przenieść 50 µl odpowiedniego roztworu macierzystego do probówki 1,5 ml zawierającej małą, wysoko wypolerowaną szklaną kuleczkę (beads-for-seeds). Używając zamontowanej pętli nylonowej, przenieść kryształ do 1 µl roztworu macierzystego umieszczonego na szklanym szkiełku nakrywkowym.
      2. Przenieść ciecz zawierającą kryształ do probówki i mieszać w wortexie z dużą prędkością przez 30 s. Przygotować rozcieńczenie zapasu siań 1:1 000 w nowej probówce 1,5 ml zawierającej ten sam świeżo przygotowany warunek i dokładnie mieszać w wortexie przez 5 sekund.
        UWAGA: Zapasy siań można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
    5. Zdjąć uszczelkę z płytki obejmującej 20 warunków z przezroczystymi kroplami i napippetować 0,5 µl zapasu siań (rozcieńczenie 1:1 000) do wyrobisk. Zamknąć płytkę i umieścić w komorze w temperaturze 20 °C. Pojedyncze kryształy o wysokiej jakości dyfrakcyjnej pojawiają się w ciągu 2–7 dni (Rycina 5).

figure-protocol-5
Rycina 5: Reprezentatywne kryształy z przesiewu optymalizacyjnego. Pojedyncze kryształy rPPEP-1 o stężeniu 12 mg/ml, zaszczepione roztworem startowym w rozcieńczeniu 1:1 000, wyhodowane w następujących warunkach: (A) 2,1 M fosforanu dwuamonowego, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 µl:1,5 µl; (B) 2,1 M fosforanu dwuamonowego, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 µl:1 µl; (C) 2,25 M fosforanu dwuamonowego, 0,1 M Tris pH 8; 2 µl:1 µl; (D) 2,1 M fosforanu dwuamonowego, 0,1 M Tris pH 8; 1 µl:2 µl. (E) Kryształ zamontowany w nylonowej pętli 0,1-0,2 µm, wyhodowany w 2,1 M fosforanie dwuamonowym, 0,1 M Tris pH 8 (2 µl:1 µl) i krio-chroniony w 2,1 M fosforanie dwuamonowym, 0,1 M Tris pH 8, 20% glicerolu. Pasek skali = 0,2 mm na (A-D). Stosunki objętości podano zawsze jako białko:roztwór rezerwuarowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Montaż kryształu i zbieranie danych

UWAGA: Aby uzyskać najwyższą jakość danych dyfrakcyjnych, kryształy należy montować w momencie ich najlepszej jakości i rozmiaru. Kryształy można przechowywać w ciekłym azocie do czasu przeprowadzenia analizy dyfrakcyjnej rentgenowskiej w temperaturze 100 K. W związku z tym warunki, w których powstały, muszą zostać dostosowane do warunków kriogenicznych. Kryształy rPPEP-1 można krioprotekować poprzez dodanie 20% glicerolu lub 30% sacharozy (zastąpienie wody w roztworze krioprotektantem).

  1. Montaż kryształów
    UWAGA: Wszystkie etapy manipulacji kryształami należy przeprowadzać pod stereomikroskopem.
    1. Wybierz optymalną wielkość nylonowej pętli, dostosowaną do maksymalnej długości wybranych kryształów. Typowa najdłuższa oś kryształów rPPEP-1 wynosi około 100-200 µm (Rysunek 5). Przygotuj szkiełko nakrywki oraz odpowiedni roztwór krioprotekcyjny (np. 2,1 M fosforanu amonu dwuzasadowego, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glicerolu).
      1. Wypełnij piankowe naczynia Dewar z ciekłym azotem, umieść fiolkę w uchwycie i schłodź ją wstępnie w 800 ml piankowym naczyniu Dewar z ciekłym azotem. Umieść tulejkę kriogeniczną oraz uchwyt do prętów kriogenicznych, oznaczony odpowiednim identyfikatorem, w 2 L piankowym naczyniu Dewar z ciekłym azotem. Zamocuj nylonową pętlę na pręcie magnetycznym.
        UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odzież ochronną (osłony oczu/okulary, rękawice). Przedmioty o temperaturze pokojowej zanurzone w ciekłym azocie mogą spowodować rozpryski.
    2. Przetnij taśmę uszczelniającą ostrym skalpelem i usuń ją za pomocą pęsety. Naniieś pipetą 1 µl roztworu krioprotekcyjnego na szkiełko nakrywki (lub alternatywnie do pustej studzienki na tej samej płytce) i wyjmij kryształ z kropli, wyłapując go za pomocą zamocowanej pętli nylonowej (Rysunek 5). Kryształy przywierające do dna można łatwo oddzielić, odkształcając otaczający plastik za pomocą igły do akupunktury.
      1. Szybko przenieś kryształ do kropli roztworu krioprotekcyjnego i pozostaw go na 1 sekundę w celu wyrównania stanu równowagi. Jak najszybciej wyjmij kryształ i zamroź go metodą gwałtownego schładzania (plunge-freeze) w ciekłym azocie.
      2. Gdy ciekły azot wokół zamocowanej pętli przestanie wrzeć, umieść pętlę w fiolce. Umieść fiolkę w uchwycie do prętów kriogenicznych, a po załadowaniu 6 fiolek nałóż tulejkę kriogeniczną na uchwyt. Przechowuj kryształy w zbiorniku wypełnionym ciekłym azotem do czasu użycia.
  2. Kolekcjonowanie danych
    UWAGA: Kolekcjonowanie danych może być przeprowadzone na dyfraktometrze stacjonarnym, jeśli jest dostępny, lub na linii synchrotronowej. Dla rPPEP-1 dane zbierano na linii X06DA w Swiss Light Source, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Szwajcaria, używając detektora hybrydowego do zliczania fotonów. Oryginalne dane oraz wszystkie pliki wykorzystane do wyznaczenia struktury mogą zostać udostępnione na żądanie.
    1. Ustaw długość fali wiązki na 1,282 Å (9,667 keV), co odpowiada charakterystycznej energii krawędzi absorpcji promieni rentgenowskich (piku) dla cynku. rPPEP-1 jest metaloproteazą zawierającą jedną cząsteczkę cynku w centrum aktywnym.
    2. Zbierz dane w temperaturze 100 K w trybie wiązki odwróconej (inverse-beam mode) w klinach 10° dla łącznego kąta 270° w każdym kierunku. Czas ekspozycji wynosi 0,1 s przy rotacji 0,1° na obraz. Ustaw transmisję na 14% (0,14).
    3. Aby zebrać natywny zestaw danych o wysokiej rozdzielczości z drugiego kryształu pochodzącego z tych samych warunków krystalizacji, ustaw długość fali wiązki na 1,00 Å (12,398 keV). Zbierz dane w temperaturze 100 K. Czas ekspozycji wynosi 0,1 s przy rotacji 0,1° na obraz. Ustaw transmisję na 70% (0,7).

5. Wyznaczanie struktury metodą Zinc-SAD

UWAGA: Aby określić strukturę rPPEP-1 za pomocą metody zinc-SAD, wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu krystalografii oraz pakiety oprogramowania XDS20, Phenix21 i program Coot22. Do wizualizacji struktur niezbędny jest program PyMOL23 lub Chimera24. Dane zebrane przy długości fali odpowiadającej piku na krawędzi absorpcyjnej cynku mogą zostać wykorzystane do anomalnej dyspersji jednofalowej (SAD)25 w celu uzyskania informacji o fazie, którą można rozszerzyć na wszystkie atomy białka.

  1. Przetwarzanie danych
    1. Przetwórz dwa zestawy danych szczytowych (normalny i odwrócony) przy użyciu oprogramowania XDS (alternatywnie iMosflm lub HKL3000) w grupie przestrzennej P212121 (grupa przestrzenna 19), rozdzielając odbicia Friedela (dane anomalne). Parametry komórki elementarnej powinny wynosić około a, b, c (Å) = 43.17, 71.68, 117.70 oraz α=β=γ (°) = 90. Pozwala to na uzyskanie dwóch plików HKL (plików z refleksjami).
    2. Przejrzyj plik CORRECT.LP. Wykorzystaj dane do rozdzielczości, przy której CC1/2 wynosi co najmniej 50%. Skaluj wspólnie oba zestawy danych/pliki refleksji (pliki HKL) za pomocą programu XSCALE. Przejrzyj plik XSCALE.LP. Sprawdź, jak daleko sięga sygnał anomalny (SigAno) i odnotuj rozdzielczość z korelacją anomalną (Anomal Corr) na poziomie około 30%, która w przypadku danych użytych tutaj, zebranych do 1.67 Å, wynosi 2 Å. Jest to granica rozdzielczości dla sygnału anomalnego wykorzystywanego w Phenix AutoSol.
    3. Konwertuj (skalowany) plik HKL na plik refleksji w formacie CCP4 (nazwany na przykład peak_anom.mtz) za pomocą XDSCONV, tworząc podzbiór Rfree o wielkości 5% i zachowując dane anomalne (FRIEDEL'S_LAW=FALSE). Sprawdź spójność pliku mtz za pomocą programu mtzdmp, analizując parametry komórki elementarnej, grupę przestrzenną oraz istnienie podzbioru Rfree (etykieta FreeRflag) i danych anomalnych (etykiety DANO/SIGDANO). Przygotuj również dodatkowy plik mtz za pomocą XDSCONV bez wyodrębniania danych anomalnych (FRIEDEL'S_LAW=TRUE; nazwany na przykład peak_native.mtz) do późniejszego etapu rafinacji.
  2. Rozwiązanie podstruktury (wyznaczenie faz)
    1. Uruchom Phenix AutoSol, korzystając z pliku refleksji peak_anom.mtz. Wybierz SAD/MAD peak jako typ danych i wskaż 2 centra cynku (ponieważ w asymetrycznej jednostce znajdują się dwie cząsteczki). Wybierz albo dokładniejsze wartości eksperymentalne dla parametrów f'/f'' (wyznaczone podczas skanowania fluorescencyjnego na linii wiązki), albo wartości teoretyczne f' = -8.245 i f'' = 3.887. Załaduj również plik FASTA zawierający sekwencję aminokwasową krystalizowanego białka.
    2. Ustaw limit rozdzielczości na rozdzielczość z korelacją anomalną (Anomal Corr) około 30% (wyznaczoną w punkcie 5.1.2), w tym przypadku 2 Å, i wybierz opcję „autobuild model”. Wykorzystując fazy dwóch centrów cynku znalezionych przez Phenix HySS (część potoku Phenix AutoSol), można wyznaczyć fazy dla całego białka i zbudować model (za pomocą Phenix RESOLVE) w gęstości elektronowej. Najlepszy model jest nazywany „overall_best.pdb”.
  3. Budowanie modelu, rafinacja i walidacja
    1. Wybierz opcję „autobuild model”, aby automatycznie zbudować większość modelu rPPEP-1. Przeanalizuj gęstość elektronową na poziomie konturu 1.0 σ za pomocą programu Coot (Rysunek 6). Powinna być ona ciągła i otaczać atomy modelu. Idealnie do modelu powinny zostać wbudowane również niektóre cząsteczki wody (przy rozdzielczości lepszej niż 2.5 Å). Woda objętościowa (przestrzeń między cząsteczkami) nie powinna wykazywać gęstości.
    2. Sprawdź, czy cały model jest kompletny (wszystkie aminokwasy wbudowane w gęstość elektronową). Jeśli nie, zbuduj je ręcznie, korzystając z narzędzi dostarczonych przez Coot. Rafinuj strukturę, przeprowadzając iteracyjne rundy Phenix Refine (po 5 rund rafinacji każda), wykorzystując plik modelu overall_best.pdb, plik refleksji peak_native.mtz oraz plik sekwencji FASTA, a także ręcznie budując model w programie Coot.
    3. Zwaliduj jakość modelu strukturalnego za pomocą odpowiednich narzędzi w programie Coot.

figure-protocol-6
Rysunek 6: Eksperymentalna mapa gęstości elektronowej i model rPPEP-1 po uruchomieniu programu Phenix Autosol. Gęstość elektronowa zaznaczona na niebiesko przy poziomie konturu 1,0 σ wyświetlona w programie Coot. Na tej wstępnej mapie gęstość elektronowa jest wyraźnie rozdzielona, a model został wbudowany w gęstość elektronową. Powiększenie pokazuje reszty His142 i Glu189, a także cząsteczkę wody. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

6. Wyznaczanie struktury w wysokiej rozdzielczości metodą zamiany molekularnej

UWAGA: W celu uzyskania informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości dla rPPEP-1 zebrano zestaw danych natywnych. Następnie przeprowadzono procedurę wymiany molekularnej z wykorzystaniem oprogramowania Phaser26,27 (w ramach pakietu oprogramowania Phenix) jest wykorzystywany z zastosowaniem struktury wyznaczonej metodą zinc-SAD jako modelu. Procedura ta może być również wykorzystana w późniejszym etapie podczas rozwiązywania struktur rPPEP-1 w kompleksie z małymi cząsteczkami.

  1. Aby uzyskać strukturę krystaliczną o wyższej rozdzielczości (w tym przypadku do 1,4 Åprzetworzyć natywny zestaw danych przy użyciu oprogramowania XDS (alternatywnie iMosflm lub HKL3000) w grupie przestrzennej P212121 (grupa przestrzenna 19). Parametry komórki elementarnej powinny wynosić około a, b, c (Å) = 43,17, 71,77, 117,80 oraz α=β=γ (°) = 90. W wyniku tego powstaje jeden plik HKL (plik refleksów).
  2. Przejrzyj plik CORRECT.LP. Użyj danych do rozdzielczości, w której CC1/2 wynosi co najmniej 50%. Przekonwertuj plik HKL na plik refleksów w formacie CCP4 (nazwany na przykład native.mtz) za pomocą programu XDSCONV, tworząc Rbezpłatny podzbiór 5%. Sprawdzić spójność pliku mtz za pomocą programu mtzdmp, weryfikując parametry komórki elementarnej, grupę przestrzenną oraz obecność Rbezpłatny podzbiór (etykieta FreeRflag).
  3. Przygotuj plik PDB zawierający model z wcześniej wyznaczonego pliku overall_best.pdb, a następnie usuń z niego wszystkie cząsteczki wody oraz wszystkie ligandy (t.j. (atom cynku). Należy również wczytać plik FASTA zawierający sekwencję aminokwasową krystalizowanego białka. Uruchom program Phaser w pakiecie Phenix, korzystając z pliku refleksji native.mtz. Przeszukaj strukturę pod kątem obecności dwóch cząsteczek na jednostkę asymetryczną.
  4. Po pomyślnym rozwiązaniu struktury (wynik TFZ większy niż 8; w tym przypadku 10,2) należy sprawdzić model (nazwany native_phaser.1.pdb) oraz mapę gęstości elektronowej w programie Coot. Należy zbudować i udoskonalić strukturę, przeprowadzając iteracyjne rundy programu Phenix Refine (po 5 rund rafinacji w każdej), wykorzystując plik modelu native_phaser.1.pdb, plik refleksów native.mtz oraz plik sekwencji FASTA, a także wykonując ręczne budowanie modelu w programie Coot.
  5. Zweryfikuj jakość modelu strukturalnego za pomocą odpowiednich narzędzi w programie Coot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

rPPEP-1 ulega nadekspresji w kilku szczepach E. coli, z najwyższą wydajnością w E. coli BL21 (DE3) Star (Rysunek 1C). Po pierwszym etapie chromatografii powinowactwa NiNTA znacznik 6xHhis można z powodzeniem odciąć od większości białka, a w drugim etapie NiNTA niestrawione białko można całkowicie oddzielić od białka trawionego trombiną (ryc. 1D). Na nieoznakowanej kolumnie S200 16/600 rPPEP-1 migruje jako monomer z okazjonalnym frontem, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krystalografia rentgenowska pozostaje najszybszą i najdokładniejszą metodą wyznaczania struktur białek o niemal atomowej rozdzielczości trójwymiarowej28. Wymaga ona jednak wyhodowania dobrze uporządkowanych monokryształów. Są one często trudne do uzyskania, a stan krystaliczny jest sztuczny. Niemniej jednak porównanie struktur białek wyznaczonych za pomocą krystalografii rentgenowskiej z tymi wyznaczonymi innymi metodami, zwłaszcza NMR, wykazuje zazwyczaj bardzo dobrą zgodność. W przypadku PPEP-1 niedawno opub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy personelowi linii badawczej X06DA w Swiss Light Source, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Szwajcaria za wsparcie podczas zbierania danych synchrotronowych. Jesteśmy wdzięczni Monice Gompert za doskonałe wsparcie techniczne. Projekt był wspierany przez Uniwersytet w Kolonii i grant INST 216/682-1 FUGG od Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych. Stypendium doktoranckie z International Graduate School in Development, Health and Disease dla C.P. jest potwierdzone. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o dofinansowanie nr 283570 (BioStruct-X).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Geny / Wektory / szczepy komórek
pET28a wektorMerck-Millipore69864Zakrzep rozszczepialny N-końcowy His-tag
E. coli szczep BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003niedoborem RNazy H
(dla E. coli) PPEP-1 (CD630_28300)Geneart (Thermo Fisher Scientific)niestandardoweaminokwasy 27-220
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Ekstrakt drożdżowydowolny
Tryptondowolny
Przeciwpieniący BSigma-AldrichA5757wodno-silikonowa emulsja
Agarz
Kanamycynąwedług
IPTGAppliChemA1008
Tris-HClAppliChemA1087Klasa buforu
NaCldowolnaklasa buforu
DNaseIAppliChemA3778
ImidazolAppliChemA1073Klasa buforowa
TrombinaSigma-AldrichT4648
Fosforan amonu dwuzasadowySigma-Aldrich215996
Glicerol 100%najczystszy gatunek
SacharozaSigma-Aldrich84097
Płyn dowolnydo przechowywania i kriochłodzenia kryształów
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Sprzęt (ogólny)
Inkubator z wytrząsaniemotemperaturze 20 ° C - 37 & C
Naczynia szklanedowolnekolby Erlenmeyera z przegrodami (50 ml - 2,8 l)
Wirówka do dużych objętości kulturdowolnawirówka do objętości przetwarzania do 12 l
Sonicator Vibra-Cell VCX500SonicsSO-VCX500lub dowolny inny sonikator / zakłócacz komórek
UltrawirówkaDowolnawirówka zapewnia prędkość do 150 000 x g
Żywica NiNTA SuperflowQiagen
Pusta szklana kolumna ekonomicznaBio-Rad7371007lub dowolna inna pusta szklana lub plastikowa
kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiar HiLoad Superdex 200 16/600GE Healthcare28989335
System chromatograficzny i Auml; kta PurifierGE Healthcare28406264lub dowolny inny system chromatograficzny
Rurki do dializy Spectra/Por 3Spectrum Labs132724
Zamknięcia węży do dializySpectrum Labs132738
Jednostki ultrafiltracji (koncentratory) 10 000 NWCOdowolny
spektrofotometr UV-Visdowolny
< strong>Nazwa>FirmaNumer katalogowyUwagi
>Sprzęt (krystalografia)
Pipeta o małej objętości 0,1-10 i mikro; ldowolna
pipeta wyporowa Microman M10GilsonF148501
Robot do krystalizacjidowolna
96-dołkowa płytka krystalizacyjna TTP IQ z trzema dołkami białkowymiTTP4150-05810lub dowolna inna 96-dołkowa płytka krystalizacyjna 
24-dołkowa płytka CombiClover Junior JenaBioscienceEB-CJR
Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniającaHampton ResearchHR3-511
Szkiełka osłonowe ze szkła silikonowanegoHampton ResearchHR3-225
Komercyjne ekrany krystalizacji: SaltRx, Index, PEG/Ion, CrystalHampton Researchróżnorodne
komercyjne ekrany krystalizacji: Czarodziej, PACT++, JCSG++JenaBiosciencediverse
JBS Koraliki do nasionJena BioscienceCO-501
CrystalCap SPINE HT (nylonowe pętelki)Hampton Researchróżnerozmiary pętli 0,025 mm - 0,5 mm
Fiolka CrystalCapHampton ResearchHR4-904
Pianka kriogeniczna Dewar 800 mlHampton ResearchHR4-673
Pianka kriogeniczna Dewar 2 LHampton ResearchHR4-675
Zacisk do fiolek, prostyHampton ResearchHR4-670
CrystalWand Magnetyczny, prostyHampton ResearchHR4-729
CryoCane 6 Uchwyt na fiolkiHampton ResearchHR4-711
CryoSleeveHampton ResearchHR4-708
CryoCane Koder kolorów - białyHampton ResearchHR4-713
Skalpeldowolny
Prosty mikrokleszczdowolnydo manipulacji taśmą uszczelniającą. etc.
Igła do akupunkturydowolnanp. z apteki
Mikroskop stereoskopowydowolnydo inspekcji płytek krystalizacyjnych i montażu kryształowego, powiększenie do 160X
Gen zoptymalizowany pod kątem kodonów z dowolny azot

Bibliografia

  1. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
  2. O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).
  3. Mitchell, B. G., Gardner, A. Mortality and Clostridium difficile infection: a review. Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).
  4. George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease. J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).
  5. George, R. H., et al. Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis. Br Med J. 1 (6114), 695(1978).
  6. Bartlett, J. G. Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease. Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).
  7. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).
  8. Ünal, C. M., Steinert, M. Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections. Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).
  9. Kelly, C. P., et al. The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes. Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).
  10. Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review. Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).
  11. Hensbergen, P. J., et al. Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831. FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).
  12. Cafardi, V., et al. Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins. PLoS One. 8 (11), e81306(2013).
  13. Hensbergen, P. J., et al. A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins. Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).
  14. Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile. Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).
  15. Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).
  16. Bergfors, T. Seeds to crystals. J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
  17. Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. Jolly SAD. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).
  18. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
  21. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  22. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  23. The PyMOL Molecular Graphics System. , Schrödinger, LLC. (2002).
  24. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  25. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  27. Zwart, P. H., et al. Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).
  28. Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).
  29. Rubino, J. T., et al. Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile. J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).
  30. Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. His-tag impact on structure. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).
  31. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
  32. Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors. Microb Cell Fact. 4, 34(2005).
  33. Stura, E. A., Wilson, I. A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krystalizacja białektechnika mikrosiańciadyfrakcja rentgenowskametoda Zinc-SADprodukcja białek rekombinowanychwyznaczanie struktury krystalicznejwarunki z fosforanem amonupH buforu Trismontaż w pętli nylonowej
Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.