Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Summary

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Abstract

Potrzebne są nowe terapie do leczenia zakażeń Clostridium difficile, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Metaloproteaza C. difficile PPEP-1 jest celem dla przyszłych prac nad inhibitorami zmniejszającymi zjadliwość patogenu. Do przeprowadzenia charakterystyki biofizycznej i strukturalnej, a także badań przesiewowych inhibitorów, potrzebne będą duże ilości czystego i aktywnego białka. Opracowaliśmy protokół wydajnej produkcji i oczyszczania PPEP-1 poprzez wykorzystanie E. coli jako gospodarza ekspresji, dającego wystarczające ilości i czystość białka do krystalizacji i określenia struktury. Dodatkowo, za pomocą mikrosiewu, silnie przerośnięte kryształy PPEP-1 mogą być hodowane do dobrze uporządkowanych kryształów odpowiednich do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Metody te mogą być również wykorzystane do produkcji innych rekombinowanych białek oraz do badania struktur innych białek wytwarzających przerośnięte kryształy.

Introduction

Clostridium difficile jest jedną z głównych przyczyn szpitalnych zakażeń biegunką związaną z antybiotykami¹. Ta Gram-dodatnia bakteria beztlenowa jest przenoszona przez formę przetrwalników drogą fekalno-oralną. W ciągu ostatniej dekady nowe szczepy "epidemiczne" lub "hiperwirulentne" (np. BI/NAP1/027) spowodowały drastyczny wzrost liczby nowych zakażeń i śmiertelności w Ameryce Północnej i Europie². Choroba związana z C. difficile (CDAD) jest zagrażającym życiu zapaleniem jelita grubego o wysokiej śmiertelności³. Objawy wahają się od biegunki⁴ do rzekomobłoniastego zapalenia jelita grubego⁵ i często śmiertelnej toksycznej okrężnicy⁶.

Leczenie CDAD jest trudne, ponieważ zjadliwe szczepy są wielolekooporne, a częstość nawrotów jest wysoka⁷. W chwili obecnej terapia obejmuje antybiotyki metronidazol, fidaksomycynę lub wankomycynę, a w powtarzających się przypadkach przeszczep mikrobioty kałowej. Pilnie potrzebne są nowe strategie terapeutyczne⁸. Odnotowuje się pewien postęp, ponieważ terapeutyczne przeciwciało monoklonalne Bezlotoxumab, skierowane przeciwko toksynie C. difficile B⁹, niedawno pomyślnie przeszło badania kliniczne III fazy i zostało złożone w celu uzyskania zgody FDA i EMA. Dodatkowo, nowe antybiotyki są obecnie testowane na różnych etapach badań klinicznych¹⁰.

Aby opracować skuteczne leczenie, muszą zostać zidentyfikowane nowe cele terapeutyczne. Niedawno odkryta proteaza C. difficile endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1; CD2830/ZMP1; E.C. 3.4.24.89) jest tak obiecującym celem, ponieważ brak PPEP-1 w szczepie knock-out zmniejsza zjadliwość C. difficile in vivo¹¹. PPEP-1 jest wydzielaną metaloproteazą^12,13 rozszczepiającą dwie adhezyny C. difficile na ich C-końcu¹³, uwalniając w ten sposób przylegające bakterie z ludzkiego nabłonka jelitowego. Dlatego bierze udział w utrzymaniu równowagi między fenotypem siedzącym i ruchliwym C. difficila. Aby opracować selektywne inhibitory przeciwko PPEP-1 i zrozumieć, w jaki sposób rozpoznaje on swoje substraty, niezbędna jest dogłębna wiedza na temat jego trójwymiarowej struktury. Rozwiązaliśmy pierwszą strukturę krystaliczną PPEP-1 samodzielnie i w kompleksie za pomocą peptydu substratowego¹⁴. PPEP-1 jest pierwszą znaną proteazą, która selektywnie rozszczepia wiązania peptydowe między dwiema resztami proliny¹⁵. Wiąże substrat w sposób podwójnie zagięty i stabilizuje go poprzez rozszerzoną alifatyczno-aromatyczną sieć reszt zlokalizowanych w pętli S, która pokrywa miejsce aktywne proteazy¹⁴. Ten tryb wiązania substratu jest unikalny dla PPEP-1 i do tej pory nie znaleziono go w ludzkich proteazach. To sprawia, że jest to obiecujący cel dla leków, a niezamierzone efekty inhibitorów są bardzo mało prawdopodobne.

Aby w przyszłości opracować i przebadać selektywne inhibitory PPEP-1, potrzebna jest duża ilość czystego i monodyspersyjnego białka PPEP-1. Ponadto, aby określić sposób wiązania pierwszych inhibitorów, konieczne będzie określenie struktur kokrystalicznych z PPEP-1. W naszych rękach PPEP-1 stale wytwarza przerośnięte kryształy. W związku z tym opracowaliśmy procedurę optymalizacyjną do produkcji pojedynczych kryształów PPEP-1 o jakości dyfrakcyjnej. W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy wytwarzanie, oczyszczanie, krystalizację i strukturę roztworu PPEP-1¹⁴. Używamy wewnątrzkomórkowej ekspresji w Escherichia coli wariantu PPEP-1 bez sekwencji sygnału wydzielania, chromatografii powinowactwa i chromatografii wykluczania wielkości z usunięciem znacznika oczyszczania, a następnie mikrosiewu¹⁶ do ekranu optymalizacyjnego i określenia struktury za pomocą anomalnej dyspersji o pojedynczej długości fali (-SAD)¹⁷. Protokół ten można dostosować do produkcji i określania struktury innych białek (np. metaloproteaz), a w szczególności do białek wytwarzających przerośnięte kryształy. Na życzenie można dostarczyć plazmidowe DNA konstruktu (pET28a-NHis-rPPEP-1) oraz dane dyfrakcyjne do celów edukacyjnych.

Protocol

1. Klonowanie i projektowanie konstrukcji

1. Sklonuj zoptymalizowaną pod kątem kodonów sekwencję (dla E. coli) C. difficile PPEP-1 bez peptydu sygnałowego [aminokwasy 27-220, nazwane dalej rekombinowanym PPEP-1 (rPPEP-1)¹¹] do wektora pET28a przy użyciu miejsc restrykcyjnych NdeI i XhoI (ryc. 1) z kodonem stop na końcu 3' (wektor wynikowy pET28a-NHis-rPPEP-1). W ten sposób powstaje N-końcowe białko znakowane 6xHhis (NHis-rPPEP-1) z miejscem rozszczepienia trombiny, co umożliwia usunięcie znacznika podczas oczyszczania (Figura 1). Plazmid zawiera kasetę oporności na kanamycynę do wyboru. Startery używane do klonowania są opisane w innym miejscu¹⁴.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie analizy ekspresji i wszystkich etapów oczyszczania za pomocą konstruktu pET28a-NHis-rPPEP-1 i SDS-PAGE. (A) Mapa wektorowa NHis-rPPEP-1 sklonowana do wektora pET28a przy użyciu NdeI/XhoI utworzonego za pomocą PlasMapper. (B) Schematyczne przedstawienie konstruktu NHis-rPPEP-1 (górny panel) i końcowego konstruktu po rozszczepieniu trombiny znacznika 6xHis, z wynikającą z tego dodatkową sekwencją GSHM na N-końcu (dolny panel). Analiza SDS-PAGE (C) ekspresji w BL21 (DE3) Star w temperaturze 37 °C przez 4 godziny i (D) próbek ze wszystkich etapów oczyszczania (M: marker masy cząsteczkowej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Ekspresja i oczyszczanie rPPEP-1

1. Ekspresja NHis-rPPEP-1
   1. Uzupełnić i autoklawować LB (bulion lizogeniczny) (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 10 g/l NaCl, dostosować do pH 7,5 za pomocą NaOH). Suplement z siarczanem kanamycyny (50 μg/ml) tuż przed użyciem (pożywka LB/Kan).
   2. Zaszczepić 200 ml kultury na noc ze świeżo przekształconych bakterii E. coli w pożywce LB/Kan. Rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
   3. Następnego ranka sprawdź OD₆₀₀ (gęstość optyczna przy długości fali 600 nm) nocnej hodowli. Zaszczepić dwie kolby z przegrodami o pojemności 2,8 l, zawierające 1 l pożywki LB/Kan, każda z nocną kulturą do OD₆₀₀ 0,1. Uzupełnij trzema kroplami emulsji wodno-silikonowej, aby zapobiec nadmiernemu tworzeniu się piany. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 180 obr./min, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,6.
   4. Pobrać próbkę przed indukcją do analizy SDS-PAGE (odpowiednik 1 ml z hodowli przy OD₆₀₀ = 1); dodać IPTG do końcowego stężenia 0,5 mM w celu wywołania ekspresji NHis-rPPEP-1. Kontynuuj uprawę w temperaturze 37 °C/180 obr./min przez 4 godziny.
   5. Oznaczyć OD₆₀₀ w 10-krotnym rozcieńczeniu i pobrać próbkę z zebrania (odpowiednik 1 ml z kultury o OD₆₀₀ = 1).
   6. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 20 minut w temperaturze 7 000 x g i temperaturze 4 °C. Aby usunąć resztki pożywki LB, należy zawiesić osadki komórkowe z 1 l kultury w 40 ml buforu TBS (sól fizjologiczna buforowana Tris: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl) i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i 4 °C i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Analizuj ekspresję (całkowite lizaty i frakcje rozpuszczalne) za pomocą SDS-PAGE¹⁸.
2. Oczyszczanie z nieoznakowanego rPPEP-1
   1. Pobrać 50 μl próbek z każdego etapu oczyszczania do analizy SDS-PAGE. Zawiesić osad komórkowy z 1 l kultury w buforze TBS uzupełnionym 10 μg/ml DNaseI. Użyć 5 ml TBS/DNaseI na g komórek.
      1. Lizuj komórki przez sonikację na lodzie/wodzie przy amplitudzie 30% przez 15 minut (impulsy 2 sekundy z 2 sekundową przerwą). Usunąć zanieczyszczenia przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do probówki ultrawirówkowej. Klarowny lizat w ultrawirówce przez 30 minut w temperaturze 165 000 x g i temperaturze 4 °C.
   2. Pracować w temperaturze 4-6 °C. Za pomocą pompy perystaltycznej lub systemu chromatograficznego zrównoważyć 2 ml żywicy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego (NiNTA) w szklanej kolumnie z buforem TBS uzupełnionym 10 mM imidazolem o pH 7,5. Alternatywnie użyj przepływu grawitacyjnego.
      1. Dostosować oczyszczony lizat za pomocą 1 M imidazolu o pH 7,5 do końcowego stężenia 10 mM. Nanieść lizat na kolumnę i przemywać stopniowo buforem TBS uzupełnionym odpowiednio 10 mM i 30 mM imidazolem, aż absorpcja UV przy 280 nm osiągnie linię podstawową.
      2. Eluować białko za pomocą buforu TBS plus 250 mM imidazolu. Ponownie wyrównać kolumnę do TBS uzupełnionego 10 mM imidazolem i przechowywać przez noc.
   3. Oznaczyć stężenie białka przy długości fali 280 nm, stosując współczynnik ekstynkcji wynoszący 25 900 ^{M-1 cm-1} lub inną metodę (np. metodę Bradforda¹⁹). Dodać 2 jednostki trombiny na mg białka i dializować roztwór białka przez noc w temperaturze 4 °C przy 50-krotnej objętości TBS (50-krotnej objętości elucji NiNTA).
      UWAGA: Weź właściwą ślepą próbę do określenia stężenia białka, ponieważ imidazol silnie wchłania się przy 280 nm.
   4. Przełóż roztwór białka na zrównoważoną żywicę NiNTA, aby usunąć nierozszczepione białko. Następnie nałóż tę samą objętość TBS uzupełnioną 10 mM imidazolem do kolumny, aby odzyskać całe rozszczepione białko. Aby oczyścić kolumnę, wymyj wszystkie pozostałe białka za pomocą 250 mM imidazolu. Analizuj próbki za pomocą SDS-PAGE (rysunek 1).
   5. Zagęścić roztwór białkowy do 4 ml w odstępach 10-minutowych w temperaturze 4 000 x g i temperaturze 4 °C za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji. Mieszaj białko zagęszczające po każdym interwale, aby zapobiec wytrącaniu się i agregacji. Na tym etapie od czasu do czasu obserwuje się pewne opady rPPEP-1 pomimo procedury mieszania.
      1. Umieścić skoncentrowane białko na kolumnie chromatograficznej wykluczającej o wstępnie zrównoważonej wielkości (w buforze TBS) w temperaturze 4-6 °C. Eluować kolumnę za pomocą buforu TBS, zebrać 1 ml frakcji i poddać 5 μl co drugiej frakcji analizie SDS-PAGE. rPPEP-1 eluuje w pojedynczym piku odpowiadającym monomerowi (Figura 2). Czasami obserwuje się niewielki pik o większej masie cząsteczkowej (pik czołowy), który odpowiada dimerowi białka. Wydajność powinna wynosić około 50 mg czystego białka na litr hodowli. Przeanalizuj wszystkie próbki za pomocą SDS-PAGE¹⁸ (Rysunek 2).

Rysunek 2: Reprezentatywna chromatografia wykluczania wielkości i analiza SDS-PAGE rPPEP-1. Chromatogram wykluczający wielkość (A280; absorbancja przy 280 nm) oczyszczonego, nieznakowanego rPPEP-1 przy użyciu kolumny (16/600) w Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl w temperaturze 6 °C. W oparciu o objętość elucji, rPPEP-1 migruje zgodnie z oczekiwaniami dla białka o masie 22 kDa, co sugeruje, że jest ono w przeważającej mierze monomeryczne. Rzadko pojawia się niewielki szczyt frontowy, który odpowiada ściemniaczowi. (wstawka) SDS-PAGE analiza frakcji z chromatografii wykluczania wielkości (M; marker masy cząsteczkowej). Stosowana jest co druga frakcja. Słabe pasma poniżej głównego pasma rPPEP-1 odpowiadają sporadycznie występującym drobnym zanieczyszczeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Krystalizacja i optymalizacja kryształów za pomocą mikrosiewu

UWAGA: rPPEP-1 krystalizuje w warunkach, które stale wytwarzają silnie przerośnięte kryształy, które nie nadają się do analizy dyfrakcji rentgenowskiej (Rysunek 3). W związku z tym opracowano strategię optymalizacji (rysunek 4) w celu uzyskania kryształów wysokiej jakości (rysunek 5).

1. Wstępne badanie przesiewowe rPPEP-1 przy użyciu komercyjnych ekranów
   UWAGA: Przeprowadzić próby krystalizacji w formacie siedzącej kropli przy użyciu standardowych dostępnych na rynku ekranów i robota krystalizacyjnego.
   1. Zagęścić oczyszczone białko do 12 mg/ml za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji w odstępach 5-minutowych w temperaturze 4 000 x g i temperaturze 4 °C. Po każdym okresie należy wymieszać zagęszczające białko, aby zapobiec wytrącaniu się i agregacji. Oznaczyć stężenie białka przy długości fali 280 nm, stosując współczynnik ekstynkcji wynoszący 25 900 ^{M-1 cm-1} lub stosując dowolną inną metodę (np. metodę Bradforda). Zrównoważyć białko do 20 °C. Usunąć wszystkie cząstki i pył przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 20 °C.
   2. Użyć już wstępnie napełnionych płytek krystalizacyjnych, szczelnie zamkniętych i przechowywanych w temperaturze 4 °C, albo napełnić studzienki zbiornikowe płytek 70 μl każdego warunku krystalizacji. Zrównoważyć wszystkie płytki krystalizacyjne do temperatury 20 °C. Pracować szybko, ponieważ małe objętości szybko wysychają. Jeśli to możliwe, użyj komory wilgotnościowej wokół stacji dokującej robota.
      UWAGA: Standardową procedurą należy używać następujących ekranów: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal, Wizard, PACT++, JCSG++.
   3. Ustawić sitko, pipetując białko i zbiornik do studzienek 2-4. Objętość kropli wynosi 300 nl, a proporcje (białko:zbiornik) wynoszą 200:100 (subdołek 2), 150:150 (subdonik 3) i 100:200 (subdonik 4) (w nl). Natychmiast zamknąć płytkę i umieścić w komorze o temperaturze 20 °C.
   4. Sprawdzaj tace natychmiast po ustawieniu, a następnie sprawdzaj je codziennie przez pierwszy tydzień, a następnie przeprowadzaj cotygodniową kontrolę.
2. Kokrystalizacja rPPEP-1 z ligandami
   1. Do kokrystalizacji kompleksów substrat peptyd-rPPEP-1 należy zmieszać rPPEP-1 w stężeniu 24 mg/ml w stosunku 1:1 (v/v) z 7-krotnym nadmiarem molowym roztworu peptydu (Ac-EVNPPVPD-NH₂) liofilizowanego proszku rozpuszczonego w buforze TBS), co da końcowe stężenie 12 mg/ml białka r-PPEP-1 i 7-krotny molowy nadmiar peptydu w stosunku do PPEP-1. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 20 °C i usuwać wszystkie cząstki i pył przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 20 °C. Kontynuować krystalizację, stosując procedurę mikrosiewu, jak opisano dla niezwiązanego białka r-PPEP-1.

Rysunek 3: Reprezentatywne kryształy z początkowych ekranów. Wyhodowane kryształy z rPPEP-1 w ilości 12 mg/ml wyhodowane w warunkach. (A) Ekran krystaliczny I/38 (1,4 M trizasadowy odwodniony cytrynian sodu, 0,1 M HEPES sodu pH 7,5; 200 nl: 100 nl). (B) Sito SaltRx/52 (2,4 M fosforan amonu dwuzasadowy, 0,1 M Tris pH 8,5; 100 nl: 200 nl) i (C) (200 nl: 100 nl). (D) Sito SaltRx/96 (60% v/v pH taksyminu 7,0, 0,1 M BIS-TRIS propan, pH 7,0; 200 nl: 100 nl). Podziałka = 0,2 mm. Proporcje objętości są zawsze białko do zbiornika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Procedura optymalizacji krystalizacji rPPEP-1. Początkowe kryształy z rPPEP-1 w stężeniu 12 mg/ml o niskiej jakości dyfrakcyjnej i z wieloma sieciami (przerośniętymi) odtworzono w 24-stanowym ekranie optymalizacyjnym. Ponownie, zaobserwowano tylko przerośnięte kryształy w warunkach zawierających 2,55 M dwuzasadowego fosforanu amonu. Materiał siewny przygotowano z pojedynczego przerośniętego kryształu i rozcieńczono w stosunku 1:1000 do tego samego stanu (mikrosiew). Objętość 0,5 μl rozcieńczonego materiału siewnego dodano do pozostałych klarownych kropli i monokryształy rosły w prawie każdych warunkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Optymalizacja kryształów za pomocą mikrosiewu
   UWAGA: Silnie przerośnięte kryształy rPPEP-1 pojawiają się po dwóch dniach w stanie zawierającym 2,4 M dwuzasadowego fosforanu amonu, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 (przesiewanie SaltRx, stan E4, wszystkie trzy poddołki) (Rysunek 3). Zastosowano procedurę optymalizacyjną z wykorzystaniem siatki wokół warunków początkowych w połączeniu z mikrosiewem (rysunek 4).
   1. Przygotować siatkę (Rysunek 4) składającą się z 24 warunków z 1,8 - 2,55 M dwuzasadowym fosforanem amonu (w krokach co 0,15 M) i 0,1 M Tris-HCl pH 7,5-9,0 (w krokach co 0,5 jednostki pH) z odpowiednich roztworów podstawowych (4 M fosforan amonu i 1 M Tris).
      UWAGA: Użyj apletu Make Tray (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx), aby obliczyć objętości i schemat pipetowania, aby uzyskać 2 ml każdego warunku, co pozwala na wykonanie 10 ekranów optymalizacyjnych. 4 M roztwór podstawowy fosforanu amonu jest trudny do przygotowania. Podgrzej roztwór podczas mieszania, aby całkowicie rozpuścić proszek w wodzie.
   2. Pobrać pipetę z 200 μl każdego roztworu sita siatkowego do studzienek na płytce 24-dołkowej i zrównoważyć w temperaturze 20 °C.
   3. Ręcznie ustaw płytkę krystalizacyjną. Objętość kropli wynosi 3 μl, a proporcje (białko do zbiornika) wynoszą 2:1, 1,5:1,5 i 1:2 (w μl). W tym przypadku należy użyć pipety wyporowej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Natychmiast zamknąć płytkę i umieścić w komorze o temperaturze 20 °C. Unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Po jednym do czterech dni pojawiają się silnie przerośnięte kryształy w czterech warunkach, zawierające 2,55 M dwuzasadowego fosforanu amonu i 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 - 9,0 (ryc. 4). W pozostałych 20 warunkach nie powstają kryształy o stężeniu fosforanu amonu poniżej 2,55 M. W tych warunkach stosuje się procedurę mikrosiewu w celu uzyskania monokryształów rPPEP-1.
   4. Przygotuj wywar mikronasion, zbierając pojedynczy przerośnięty kryształ z jednego z dwóch warunków o zawartości 2,55 M dwuzasadowego fosforanu amonu i 0,1 M Tris-HCl o pH 8,0 lub 8,5. Kryształy mogą być przymocowane do plastikowej powierzchni. Staranne odkształcenie otaczającego plastiku za pomocą igły do akupunktury pomaga oderwać kryształy.
      1. Przenieść 50 μl odpowiedniego roztworu macierzystego do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej mały, wysoce wypolerowany szklany koralik (kulki na nasiona). Za pomocą zamontowanej nylonowej pętli przenieść kryształ do 1 μl roztworu macierzystego umieszczonego na szkiełku podstawowym.
      2. Przenieś ciecz zawierającą kryształ do probówki i wiruj z dużą prędkością przez 30 sekund. Rozcieńczyć materiał siewny w stosunku 1:1 000 do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej ten sam świeżo przygotowany stan i dokładnie wirować przez 5 sekund.
         UWAGA: Zapasy nasion można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
   5. Usunąć uszczelkę płytki, pokrywając 20 warunków przezroczystymi kroplami i odpipetować 0,5 μl materiału siewnego (rozcieńczenie 1:1 000) do studzienek. Uszczelnić płytkę i umieścić w komorze o temperaturze 20 °C. Monokryształy o wysokiej jakości dyfrakcyjnej pojawiają się w ciągu 2-7 dni (ryc. 5).

Rysunek 5: Reprezentatywne kryształy z ekranu optymalizacji. Monokryształy z rPPEP-1 w stężeniu 12 mg/ml wysiane z materiału siewnego o rozcieńczeniu 1:1 000 uprawianego w następujących warunkach: (A) 2,1 M fosforan amonu dwuzasadowy, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 μl: 1,5 μl; (B) 2,1 M fosforan amonu dwuzasadowy, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 μl:1 μl; (C) 2,25 M fosforan amonu dwuzasadowy, 0,1 M Tris pH 8; 2 μl:1 μl; (D) 2,1 M fosforan amonu dwuzasadowy, 0,1 M Tris pH 8; 1 μl:2 μl. (E) Osadzony kryształ w nylonowej pętli 0,1-0,2 μm, wyhodowany w 2,1 M dwuzasadowym fosforanie amonu, 0,1 M Tris pH 8 (2 μl:1 μl) i zabezpieczony kriogenicznie w 2,1 M dwuzasadowym fosforanie amonu, 0,1 M Tris pH 8, 20% glicerolu. Podziałka = 0.2 mm cala (A). Racja objętościowa to zawsze białko do zbiornika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Montaż kryształów i zbieranie danych

UWAGA: Aby uzyskać najlepszą jakość danych dyfrakcyjnych, kryształy powinny być montowane na najwyższym poziomie swojej jakości i rozmiaru. Kryształy można przechowywać w ciekłym azocie do czasu poddania ich analizie dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze 100 K. Dlatego stan, z którego pochodzą, musi być dostosowany do warunków kriogenicznych. Kryształy rPPEP-1 mogą być chronione kriogenicznie przez dodanie 20% glicerolu lub 30% sacharozy (zastąpienie wody w stanie przez krioprotekcję).

1. Montaż kryształowy
   UWAGA: Wszystkie etapy manipulacji kryształami powinny być wykonywane pod mikroskopem stereoskopowym.
   1. Wybierz optymalny rozmiar nylonowej pętli dla maksymalnej długości wybranych kryształków. Typowa najdłuższa oś kryształów rPPEP-1 wynosi około 100-200 μm (ryc. 5). Przygotować szkiełko podstawowe i odpowiednie warunki kriogeniczne (np. 2,1 M dwuzasadowy fosforan amonu, 0,1 M Tris, pH 8,0, 20% glicerol).
      1. Napełnij piankowe dewary ciekłym azotem, załaduj zacisk fiolki fiolką i wstępnie schłodź go w 800 ml pianki Dewara wypełnionej ciekłym azotem. Umieść rękaw kriogeniczny i uchwyt na trzcinę kriogeniczną oznaczone odpowiednim identyfikatorem w piance dewara o pojemności 2 litrów wypełnionej ciekłym azotem. Załaduj różdżkę magnetyczną za pomocą zamontowanej nylonowej pętli.
         UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić odzież ochronną (osłona oczu/okulary, rękawice). Ciepłe przedmioty zanurzone w ciekłym azocie mogą powodować wycieki.
   2. Rozetnij taśmę uszczelniającą ostrym skalpelem i usuń ją kleszczami. Odpipetować 1 μl roztworu kriogenicznego na szkiełko podstawowe (lub alternatywnie do pustej studzienki na tej samej płytce) i usunąć kryształ z kropli, zanurzając go w zamontowanej nylonowej pętli (Rysunek 5). Dołączone kryształy można łatwo oderwać od podłoża poprzez deformację otaczającego go plastiku za pomocą igły do akupunktury.
      1. Szybko przenieś kryształ do kropli kriowaryzacji i pozwól mu się zrównoważyć przez 1 sekundę. Wyłów kryształ tak szybko, jak to możliwe i zanurz w ciekłym azocie.
      2. Gdy ciekły azot wokół zamontowanej pętli przestanie wrzeć, umieść pętlę w fiolce. Umieść fiolkę na uchwycie z trzciną kriograficzną, a po załadowaniu 6 fiolek umieść rękaw kriogeniczny wokół uchwytu. Przechowuj kryształy w zbiorniku wypełnionym ciekłym azotem do czasu użycia.
2. Gromadzenie danych
   UWAGA: Zbieranie danych można przeprowadzić na domowym dyfraktometrze, jeśli jest dostępny, lub na linii synchrotronowej. W przypadku rPPEP-1 dane zebrano na linii badawczej X06DA należącej do Swiss Light Source, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Szwajcaria przy użyciu hybrydowego detektora zliczającego fotony. Oryginalne dane i wszystkie pliki używane do określania konstrukcji mogą być dostarczone na żądanie.
   1. Ustaw długość fali wiązki na 1,282 A (9,667 keV), co jest charakterystyczną energią krawędzi absorpcji promieniowania rentgenowskiego (pikiem) pierwiastka. rPPEP-1 to metaloproteaza, która zawiera pojedynczy na cząsteczkę w miejscu aktywnym.
   2. Zbieraj dane w temperaturze 100 K w trybie wiązki odwróconej w klinach 10°, co daje łącznie 270° w każdym kierunku. Czas naświetlania wynosi 0,1 sekundy z obrotem o 0,1° na obraz. Ustaw transmisję na 14% (0,14).
   3. Aby zebrać natywny zestaw danych o wysokiej rozdzielczości z drugiego kryształu pochodzącego z tego samego stanu krystalizacji, ustaw długość fali wiązki na 1,00 A (12 398 keV). Zbieranie danych w odległości 100 KB. Czas naświetlania wynosi 0,1 sekundy z obrotem o 0,1° na obraz. Ustaw transmisję na 70% (0.7).

5. Określanie struktury za pomocą-SAD

UWAGA: Aby określić strukturę rPPEP-1 za pomocą-SAD, potrzebna jest podstawowa wiedza krystalograficzna, jak również pakiety oprogramowania XDS²⁰, Phenix²¹ i program Coot²². Do wizualizacji konstrukcji potrzebny jest program PyMOL²³ lub Chimera²⁴. Dane zebrane na długości fali odpowiadającej pikowi na krawędzi absorpcyjnej pierwiastka można wykorzystać do dyspersji anomalnej na jednej długości fali (SAD)²⁵ w celu uzyskania informacji o fazie, którą można rozszerzyć dla wszystkich atomów białka.

1. przetwarzanie danych
   1. Przetwarzaj dwa zestawy danych pików (normalny i odwrotny) za pomocą oprogramowania XDS (alternatywnie iMosflm lub HKL3000) w grupie kosmicznej P2₁2_{12 1 (}grupa kosmiczna 19) oddzielając wiązania Friedela (dane anomalne). Parametry komórki elementarnej powinny wynosić około a, b, c (A) = 43,17, 71,68, 117,70 i α=β=γ (°) = 90. Daje to dwa pliki HKL (pliki odbicia).
   2. Sprawdź plik POPRAWNIE. LP. Używaj danych do rozdzielczości, w której CC_1/2 wynosi co najmniej 50%. Skaluj razem oba zestawy danych/pliki odbicia (pliki HKL) przy użyciu narzędzia XSCALE. Sprawdź plik XSCALE. LP. Sprawdź, jak daleko rozciąga się sygnał anomalny (SigAno) i zwróć uwagę na rozdzielczość z anomalną korelacją (Anomal Corr) wynoszącą około 30%, co w przypadku użytych tu danych wynosi 2 A do 1,67 A. Jest to punkt odcięcia rozdzielczości dla anomalnego sygnału używanego w Phenix AutoSol.
   3. Przekonwertuj (skalowany) plik HKL na plik odbicia w formacie CCP4 (o nazwie na przykład peak_anom.mtz) za pomocą XDSCONV, tworząc podzbiór_wolny od języka R wynoszący 5% i zachowując nietypowe dane (FRIEDEL'S_LAW=FALSE). Sprawdź plik mtz pod kątem spójności z programem mtzdmp, sprawdzając parametry komórek elementarnych, grupę przestrzeni i istnienie_{podzbioru wolnego} R (etykieta FreeRflag) oraz dane anomalne (etykiety DANO/SIGDANO). Przygotuj również dodatkowy plik mtz za pomocą XDSCONV bez wyodrębniania nietypowych danych (FRIEDEL'S_LAW=TRUE; nazwanych na przykład peak_native.mtz) w celu doprecyzowania na późniejszym etapie.
2. Rozwiązanie podbudowy (określenie fazy)
   1. Uruchom Phenix AutoSol za pomocą pliku odbicia peak_anom.mtz. Wybierz pik SAD/MAD jako typ danych i wybierz 2 miejsca (ponieważ na jednostkę asymetryczną przypadają dwie cząsteczki). Wybierz albo dokładniejsze wartości eksperymentalne dla parametrów f'/f'' (wyznaczone w skanowaniu fluorescencyjnym na linii badawczej), albo wartości teotetyczne f' = -8,245 i f'' = 3,887. Załaduj również plik FASTA zawierający sekwencję aminokwasową skrystalizowanego białka.
   2. Ustaw limit rozdzielczości na rozdzielczość z anomalną korelacją (Anomal Corr) wynoszącą około 30% (wyznaczoną w 5.1.2), w tym przypadku 2 A i wybierz opcję "autobuild model". Korzystając z faz dwóch miejsc znalezionych przez Phenix HySS (część rurociągu Phenix AutoSol), można było wydedukować fazy dla całego białka, a model zbudować (za pomocą Phenix RESOLVE) w gęstości elektronów. Najlepszy model nazywa się "overall_best.pdb".
3. Budowanie, udoskonalanie i walidacja modeli
   1. Wybierz opcję "autobuild model", aby automatycznie zbudować większość modelu rPPEP-1. Sprawdź gęstość elektronów na poziomie konturu 1,0 σ za pomocą programu Coot (rysunek 6). Powinien być łączący i otaczający atomy modelu. Idealnie byłoby, gdyby w model wbudowano również cząsteczki wody (w rozdzielczości lepszej niż 2,5 A). Woda luzem (przestrzeń między cząsteczkami) nie powinna zawierać żadnej gęstości.
   2. Sprawdź, czy cały model jest kompletny (wszystkie aminokwasy wbudowane w gęstość elektronową). Jeśli nie, zbuduj je ręcznie, korzystając z narzędzi dostarczonych przez Coot. Udoskonal strukturę, uruchamiając iteracyjne rundy Phenix Refine z 5 rundami uściślania, z których każda używa pliku modelu overall_best.pdb, pliku odbicia peak_native.mtz i pliku sekwencji FASTA; i ręczne budowanie modeli w Coot.
   3. Sprawdź poprawność jakości modelu konstrukcyjnego za pomocą odpowiednich narzędzi w Coot.

Rysunek 6: Eksperymentalna mapa gęstości elektronów i model rPPEP-1 po uruchomieniu Phenix Autosol. Gęstość elektronów w kolorze niebieskim na poziomie konturu 1,0 σ wyświetlana w programie Coot. Na tej początkowej mapie gęstość elektronów jest ładnie rozdzielona, a model wbudowany w gęstość elektronów. Powiększenie pokazuje pozostałości His142 i Glu189, a także cząsteczkę wody. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Określanie struktury do wysokiej rozdzielczości poprzez wymianę molekularną

UWAGA: W celu uzyskania informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości na temat rPPEP-1 zbierany jest natywny zestaw danych. Następnie stosuje się procedurę molekularnej substytucji przy użyciu oprogramowania Phaser^26,27 (w pakiecie oprogramowania Phenix) przy użyciu struktury oznaczonej za pomocą-SAD jako modelu. Procedura ta może być również stosowana później przy rozwiązywaniu struktur rPPEP-1 skompleksowanych z małymi cząsteczkami.

1. Aby uzyskać strukturę krystaliczną o wyższej rozdzielczości (w tym przypadku do 1,4 A), należy przetworzyć natywny zbiór danych za pomocą oprogramowania XDS (alternatywnie iMosflm lub HKL3000) w grupie przestrzennej P2₁2_{12 1 (}grupa kosmiczna 19). Parametry komórki elementarnej powinny wynosić około a, b, c (A) = 43,17, 71,77, 117,80 i α=β=γ (°) = 90. Daje to jeden plik HKL (plik odbicia).
2. Sprawdź plik POPRAWNIE. LP. Używaj danych do rozdzielczości, w której CC_1/2 wynosi co najmniej 50%. Przekonwertuj plik HKL na plik odbicia w formacie CCP4 (o nazwie na przykład native.mtz) za pomocą XDSCONV, tworząc_{podzbiór wolny} od języka R o wartości 5%. Sprawdź plik mtz pod kątem spójności z programem mtzdmp, sprawdzając parametry komórki elementarnej, grupę przestrzeni i istnienie_{podzbioru wolnego} języka R (etykieta FreeRflag).
3. Przygotuj plik PDB zawierający model z overall_best.pdb wyznaczony wcześniej i usuń wszystkie cząsteczki wody oraz wszystkie ligandy (tj. atom). Załaduj również plik FASTA zawierający sekwencję aminokwasową skrystalizowanego białka. Uruchom Phaser w Phenix za pomocą pliku odbicia native.mtz. Szukaj dwóch cząsteczek na jednostkę asymetryczną.
4. Po pomyślnym rozwiązaniu struktury (wynik TFZ większy niż 8; tutaj 10.2) sprawdź model (nazwany native_phaser.1.pdb) i mapę gęstości elektronów w Coot. Zbuduj i udoskonal strukturę, uruchamiając iteracyjne rundy Phenix Refine z 5 rundami uściślania, z których każda używa pliku modelu native_phaser.1.pdb, pliku odbicia native.mtz i pliku sekwencji FAPSA; i ręczne budowanie modeli w Coot.
5. Sprawdź poprawność jakości modelu konstrukcyjnego za pomocą odpowiednich narzędzi w Coot.

Results

rPPEP-1 ulega nadekspresji w kilku szczepach E. coli, z najwyższą wydajnością w E. coli BL21 (DE3) Star (Rysunek 1C). Po pierwszym etapie chromatografii powinowactwa NiNTA znacznik 6xHhis można z powodzeniem odciąć od większości białka, a w drugim etapie NiNTA niestrawione białko można całkowicie oddzielić od białka trawionego trombiną (ryc. 1D). Na nieoznakowanej kolumnie S200 16/600 rPPEP-1 migruje jako monomer z okazjonalnym frontem, ...

Discussion

Krystalografia rentgenowska jest nadal najszybszą i najdokładniejszą metodą określania trójwymiarowych struktur białek o rozdzielczości zbliżonej do atomowej²⁸. Wymaga to jednak wzrostu dobrze uporządkowanych monokryształów. Są one często trudne do zdobycia, a stan krystaliczny jest sztuczny. Jednak porównanie struktur białkowych wyznaczonych za pomocą krystalografii rentgenowskiej z tymi wyznaczonymi innymi metodami, zwłaszcza NMR, wykazuje ogólnie bardzo dobrą zgodność. W przypadku PPEP-1, struktura NMR opub...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Geny / Wektory / szczepy komórek
pET28a wektor	Merck-Millipore	69864	Zakrzep rozszczepialny N-końcowy His-tag
E. coli szczep BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	niedoborem RNazy H
(dla E. coli) PPEP-1 (CD630_28300)	Geneart (Thermo Fisher Scientific)	niestandardowe	aminokwasy 27-220
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemicals
Ekstrakt drożdżowy	dowolny
Trypton	dowolny
Przeciwpieniący B	Sigma-Aldrich	A5757	wodno-silikonowa emulsja
Agar	z
Kanamycyną	według
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	Klasa buforu
NaCl	dowolna		klasa buforu
DNaseI	AppliChem	A3778
Imidazol	AppliChem	A1073	Klasa buforowa
Trombina	Sigma-Aldrich	T4648
Fosforan amonu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	215996
Glicerol 100%			najczystszy gatunek
Sacharoza	Sigma-Aldrich	84097
Płyn	dowolny		do przechowywania i kriochłodzenia kryształów
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Sprzęt (ogólny)
Inkubator z wytrząsaniem	o		temperaturze 20 ° C - 37 & C
Naczynia szklane	dowolne		kolby Erlenmeyera z przegrodami (50 ml - 2,8 l)
Wirówka do dużych objętości kultur	dowolna		wirówka do objętości przetwarzania do 12 l
Sonicator Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	lub dowolny inny sonikator / zakłócacz komórek
Ultrawirówka	Dowolna		wirówka zapewnia prędkość do 150 000 x g
Żywica NiNTA Superflow	Qiagen
Pusta szklana kolumna ekonomiczna	Bio-Rad	7371007	lub dowolna inna pusta szklana lub plastikowa
kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiar HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
System chromatograficzny i Auml; kta Purifier	GE Healthcare	28406264	lub dowolny inny system chromatograficzny
Rurki do dializy Spectra/Por 3	Spectrum Labs	132724
Zamknięcia węży do dializy	Spectrum Labs	132738
Jednostki ultrafiltracji (koncentratory) 10 000 NWCO	dowolny
spektrofotometr UV-Vis	dowolny
< strong>Nazwa	>Firma	Numer katalogowy	Uwagi
>Sprzęt (krystalografia)
Pipeta o małej objętości 0,1-10 i mikro; l	dowolna
pipeta wyporowa Microman M10	Gilson	F148501
Robot do krystalizacji	dowolna
96-dołkowa płytka krystalizacyjna TTP IQ z trzema dołkami białkowymi	TTP	4150-05810	lub dowolna inna 96-dołkowa płytka krystalizacyjna
24-dołkowa płytka CombiClover Junior Jena	Bioscience	EB-CJR
Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniająca	Hampton Research	HR3-511
Szkiełka osłonowe ze szkła silikonowanego	Hampton Research	HR3-225
Komercyjne ekrany krystalizacji: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal	Hampton Research	różnorodne
komercyjne ekrany krystalizacji: Czarodziej, PACT++, JCSG++Jena	Bioscience	diverse
JBS Koraliki do nasion	Jena Bioscience	CO-501
CrystalCap SPINE HT (nylonowe pętelki)	Hampton Research	różne	rozmiary pętli 0,025 mm - 0,5 mm
Fiolka CrystalCap	Hampton Research	HR4-904
Pianka kriogeniczna Dewar 800 ml	Hampton Research	HR4-673
Pianka kriogeniczna Dewar 2 L	Hampton Research	HR4-675
Zacisk do fiolek, prosty	Hampton Research	HR4-670
CrystalWand Magnetyczny, prosty	Hampton Research	HR4-729
CryoCane 6 Uchwyt na fiolki	Hampton Research	HR4-711
CryoSleeve	Hampton Research	HR4-708
CryoCane Koder kolorów - biały	Hampton Research	HR4-713
Skalpel	dowolny
Prosty mikrokleszcz	dowolny		do manipulacji taśmą uszczelniającą. etc.
Igła do akupunktury	dowolna		np. z apteki
Mikroskop stereoskopowy	dowolny		do inspekcji płytek krystalizacyjnych i montażu kryształowego, powiększenie do 160X