Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo w celu zbadania dynamicznej niestabilności mikrotubul w raku piersi opornym na taksany

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55027

⸱

20 lutego 2017

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisujemy protokół opisujący metodę in vivo do pomiaru dynamicznej niestabilności mikrotubul w komórkach raka piersi opornych na docetaksel (MCF-7TXT). W tej metodzie stosuje się system obrazowania mikroskopii dekonwolucyjnej do wykrywania ekspresji tubuliny GFP w komórkach docelowych.

Streszczenie

Taksany takie jak docetaksel należą do grupy środków ukierunkowanych na mikrotubule (MTA), które są powszechnie stosowane w leczeniu raka. Jednak oporność na taksany w komórkach nowotworowych drastycznie zmniejsza skuteczność długotrwałego stosowania leków. Zgromadzone dowody sugerują, że mechanizmy leżące u podstaw oporności na taksany obejmują zarówno mechanizmy ogólne, takie jak rozwój oporności wielolekowej z powodu nadekspresji białek wypływu leku, jak i mechanizmy specyficzne dla taksanów, takie jak te, które obejmują dynamikę mikrotubul.

Ponieważ taksany celują w mikrotubule komórek, pomiar dynamicznej niestabilności mikrotubul jest ważnym krokiem w określaniu mechanizmów oporności na taksany i dostarcza wglądu w to, jak pokonać ten opór. W eksperymencie zastosowano metodę in vivo do pomiaru niestabilności dynamicznej mikrotubul. Tubulina α znakowana GFP uległa ekspresji i została włączona do mikrotubul w komórkach MCF-7, co pozwoliło na zarejestrowanie dynamiki mikrotubul w trybie poklatkowym za pomocą czułej kamery. Wyniki wykazały, że w przeciwieństwie do nieopornych rodzicielskich komórekCC MCF-7, dynamika mikrotubul komórekTXT MCF-7 opornych na docetaksel jest niewrażliwa na leczenie docetakselem, co powoduje oporność na zatrzymanie mitotyczne i apoptozę wywołane docetakselem. W niniejszym artykule przedstawiono tę metodę pomiaru niestabilności dynamicznej mikrotubul in vivo.

Wprowadzenie

Główną przyczyną śmiertelności z powodu raka piersi są przerzuty1,2. Taksany, takie jak docetaksel i paklitaksel, są obecnie stosowane jako schematy pierwszego rzutu w leczeniu przerzutowego raka piersi2,3,4,5,6. Należą one do grupy czynników ukierunkowanych na mikrotubule (MTA), które zaburzają dynamikę mikrotubul. Jednak jednym z największych wyzwań związanych ze stosowaniem taksanów w terapii leczniczej jest rozwój oporności na taksany w komórkach nowotworowych, co prowadzi do nawrotu choroby7. Oporność na leki odpowiada za ponad 90% wszystkich zgonów wśród pacjentów z przerzutowym rakiem piersi7.

Mikrotubule powstają w wyniku polimeryzacji heterodimerów α- i β-tubulinowych8,9. Precyzyjna regulacja dynamiki mikrotubul jest ważna dla wielu funkcji komórkowych, w tym polaryzacji komórek, progresji cyklu komórkowego, transportu wewnątrzkomórkowego i sygnalizacji komórkowej. Rozregulowanie mikrotubul i ich dynamiki zakłóci funkcjonowanie komórki i spowoduje śmierć komórki10,11. W zależności od tego, w jaki sposób powodują to rozregulowanie, leki MTA można sklasyfikować jako środki stabilizujące mikrotubule (tj. taksany) lub środki destabilizujące mikrotubule (tj. alkaloidy barwinka lub środki wiążące miejsce kolchicyny)20. Pomimo ich przeciwnego wpływu na masę mikrotubul, przy wystarczającej dawce, obie klasy mogą zabijać komórki rakowe poprzez swój wpływ na dynamikę mikrotubul21.

Taksany funkcjonują głównie poprzez stabilizację wrzeciona mikrotubul12, co prowadzi do niewspółosiowości chromosomów. Następująca po sobie ciągła aktywacja punktu kontrolnego montażu wrzeciona (SAC) zatrzymuje komórkę w mitozie. Przedłużone zatrzymanie mitotyczne powoduje apoptozę13,14. Taksan oddziałuje z mikrotubulami poprzez miejsce wiązania taksanu na β-tubulinie8,15, który występuje tylko w zmontowanej tubulinie16.

Zaproponowano wiele mechanizmów odporności na taksany9,17. Mechanizmy te obejmują zarówno ogólną oporność wielolekową spowodowaną nadekspresją białek wypływu leku, jak i oporność specyficzną dla taksanów5,9,18,19. Na przykład komórki nowotworowe oporne na taksany mogą mieć zmienioną ekspresję i funkcję niektórych izotypów β-tubuliny5,9,19,20,21,22,23. Stosując metodę in vivo do pomiaru dynamicznej niestabilności mikrotubul, pokazujemy, że w porównaniu z nieopornymi, rodzicielskimi komórkamiCC MCF-717, dynamika mikrotubul komórekTXT MCF-7 opornych na docetaksel jest niewrażliwa na leczenie docetakselem.

Aby lepiej zrozumieć funkcję MTA i dokładny mechanizm oporności na taksany w komórkach nowotworowych, konieczne jest zmierzenie dynamiki mikrotubul. Tutaj przedstawiamy metodę in vivo, aby to zrobić. Stosując obrazowanie na żywo w połączeniu z ekspresją tubuliny znakowanej GFP w komórkach, możemy zmierzyć dynamikę mikrotubul komórekMCF-7 TXT i MCF-7CC z leczeniem docetakselem i bez niego. Wyniki mogą pomóc nam w projektowaniu skuteczniejszych leków, które mogą przezwyciężyć oporność na taksany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek do obrazowania na żywo

  1. Hodowla i wysiew komórek
    1. Użyć komórek raka piersi MCF-7 wyselekcjonowanych pod kątem oporności na docetaksel (MCF-7Proszę wprowadzić tekst źródłowy do przetłumaczenia.) oraz ich niewrażliwej linii komórkowej macierzystej (MCF-7CC). Szczegółowy proces selekcji oraz charakterystyka wybranych linii komórkowych zostały opisane we wcześniejszych publikacjach24.
    2. Hodować wszystkie komórki w naczyniach hodowlanych o średnicy 10 cm w 37 °C w medium składającym się w 90% z modyfikowanej pożywki Eagle'a z dodatkiem Dulbecco (DMEM) oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), uzupełnionej o aminokwasy nieistotne. Pożywkę należy utrzymywać w 5% CO22 atmosfery. Hodowla MCF-7Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. komórki w obecności 5 nM docetakselu.
    3. Wysiewanie komórek na szkiełkach nakrywkowych do obrazowania na żywo. Sterylizuj szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 24 mm, powlekane poli-L-lizyną, płucząc je 70% alkoholem, a następnie naświetlając promieniami UV przez noc. Umieść szkiełka nakrywkowe w 6-dołkowej płytce hodowlanej o średnicy 35 mm. W każdym dołku umieść jedno szkiełko nakrywkowe.
    4. Usunąć medium z 10-centymetrowej płytki hodowlanej i przemyć komórki roztworem PBS. Do płytki dodać 0,5 ml trypsyny z EDTA, aby odkleić komórki od ścianek naczynia. Po odklejeniu komórek dodać do płytki 5 ml medium hodowlanego w celu neutralizacji trypsyny.
    5. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić liczbę komórek w jednostce objętości.
    6. Dodać około 105 komórki do każdego dołka w oparciu o liczbę komórek na jednostkę objętości. Po delikatnym potrząśnięciu należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić przytwierdzenie się komórek do szkiełek cover-slip.
  2. Ekspresja α-tubuliny z oznakownikiem GFP
    1. Aby zbadać dynamikę mikrotubul, należy przetransformować komórki $\alpha$-tubuliną znakowaną GFP wraz z komercyjną kontrolą transdukcji GFP (np. BacMam) zgodnie z protokołem producenta.
    2. hoduj komórki w dołku przez 36 h w 37 °C inkubator do hodowli komórkowych w celu zapewnienia pełnej adhezji i 60% konfluencji.
    3. Oblicz odpowiednią objętość α-tubuliny znakowanej GFP, którą należy dodać do każdej studzienki, zgodnie z poniższym równaniem:
      Wzór na obliczenie objętości dla stężenia cząsteczek GFP-tubuliny w schemacie analizy komórkowej.
      Liczba komórek to szacowana całkowita liczba komórek w dołku w momencie znakowania, a pożądane PPC to liczba cząsteczek na komórkę.
      UWAGA: Po wysianiu komórek MCF-7 liczba komórek powinna wzrosnąć dwukrotnie z 105 do 2 x 105 przy pożądanym PPC równym 20, objętość potrzebna dla każdego szkiełka nakrywkowego wynosi zatem 40 µLW przypadku różnych typów komórek objętość obliczona na podstawie powyższego wzoru może nie być optymalna. Dokładną objętość należy dostosować do rzeczywistego poziomu ekspresji GFP-tubuliny.
    4. Kilkukrotnie wymieszaj $\alpha$-tubulinę znakowaną GFP poprzez odwracanie probówki, aby uzyskać jednorodny roztwór. Nie używaj wortexa.
      UWAGA: W przypadku kontroli odczynnik Null (kontrolny) nie zawiera żadnych ssaczych elementów genetycznych i może być wykorzystany do pomocy w określeniu potencjalnych efektów pośredniczonych przez bakulowirusy oraz fluorescencji tła. Można również zastosować kontrolę transdukcji GFP bez celu, która spowoduje rozświetlenie całej komórki.
    5. Wymień pożywkę na świeżą. Dodaj 2 mL nowej pożywki i 40 µL $\alpha$-tubuliny znakowanej GFP do każdej dołki.
    6. Delikatnie potrząśnij płytką, aby zapewnić całkowite wymieszanie $\alpha$-tubuliny znakowanej GFP z pożywką hodowlaną. Przenieś płytkę z powrotem do inkubatora i inkubuj przez 24 h, aby umożliwić ekspresję tubuliny-GFP.
  3. Poddać komórki działaniu docetakselu
    UWAGA: Niniejszy eksperyment służy do zbadania wpływu docetakselu na dynamiczną niestabilność mikrotubul. W związku z tym komórki są traktowane docetakselem o pożądanym stężeniu.
    1. Przygotuj pożywkę składającą się w 90% z DMEM i 10% z FBS, uzupełnioną o nieessentialne aminokwasy. Należy użyć DMEM bez czerwieni fenolowej, ponieważ czerwień fenolowa może wpływać na fluorescencję GFP-tubuliny. Dodaj docetaksel w pożądanym stężeniu (w zakresie od 10 nM do 10 µM). Roztwór zapasowy docetakselu ma stężenie 10 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Podgrzej wcześniej pożywkę zawierającą docetaksel do 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    3. Należy zastąpić zwykłą pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą docetaksel i inkubować przez 30 min w inkubatorze do hodowli tkankowych. Na każdą koncentrację docetakselu powinno przypadać co najmniej 3 szkiełka nakrywowe na studzienkę.

2. Obrazowanie na żywo w celu zbadania niestabilności dynamicznej mikrotubul

  1. Konfiguracja systemu
    1. Przeprowadzać eksperymenty w komorze utrzymywanej w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Obrazy fluorescencyjne należy pozyskiwać metodą time-lapse za pomocą systemu mikroskopowego wyposażonego w obiektyw olejowy 60X, 1.42 NA w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym oraz kamery CCD.
    2. Przygotować komórki do obrazowania na żywo. Podgrzać uprzednio zarówno uchwyt na próbkę, jak i medium do 37 °C. Wybrać szkiełko cover slip do badania. Zamontować wybrane szkiełko w uchwycie na próbkę i inkubować je z 1 mL medium zawierającego docetaxel, przygotowanego w kroku 1.3.1.
  2. Obrazowanie na żywo dynamicznej niestabilności mikrotubul
    1. Zidentyfikować komórki, które zostaną wykorzystane do obrazowania. Powinny być one płaskie, wykazywać wysoką intensywność fluorescencji ekspresyjnej GFP-tubuliny oraz posiadać wyraźne struktury mikrotubul.
    2. Z grupy komórek zidentyfikowanych w kroku 2.2.1 wybrać jedną komórkę do pierwszego badania. Ustawić ostrość na obszarze peryferyjnym wybranej komórki. Skonfigurować program pod kątem czasu ekspozycji oraz częstotliwości akwizycji obrazów. Ponieważ czas ekspozycji wynosi zazwyczaj 0.5 s, obrazy będą pozyskiwane co dwie s.
    3. Przewidzieć dodatkowe 20 min na wykonanie kroków od 1.3 do 2.2.3. W ten sposób, dokładnie 50 min po dodaniu docetaxelu, zgodnie z opisem w kroku 1.3.3, rozpocząć obrazowanie (w celu standaryzacji).
    4. Rejestrować dynamikę mikrotubul przez 2 min, wykonując zdjęcie co 2 s. W sumie pozyskać 60 obrazów dla zidentyfikowanej komórki.
    5. Przejść do kolejnej zidentyfikowanej komórki i powtórzyć kroki 2.2.2 do 2.2.4. Powtarzać procedurę, aż do obrazowania 5 komórek. Jest to niezbędne do wykonania przed upływem 70 min od dodania docetaxelu, zgodnie z opisem w kroku 1.3.3.
    6. Dla każdego warunku traktowania powtórzyć kroki 2.2.1 do 2.2.5 dla 3 różnych szkiełek cover slip. W sumie obrazować 15 komórek, co stanowi wystarczającą ilość danych do pomiaru dynamicznej niestabilności mikrotubul.

3. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

  1. Dekonwolucja obrazów
    1. Przeprowadź dekonwolucję nabytych obrazów w celu uzyskania wysokiej jakości. Uruchom program do dekonwolucji dołączony do systemu mikroskopowego.
    2. Kliknij „Process” i wybierz „Deconvolve”. Przeciągnij plik obrazu do okna „Input” i kliknij „Do”. Plik obrazu zostanie poddany dekonwolucji, a wynikowy plik zostanie automatycznie zapisany jako nowy plik.
  2. Generowanie filmów
    1. Kliknij plik obrazu po dekonwolucji, aby otworzyć go w odpowiednim oprogramowaniu.
    2. Kliknij „File” i wybierz „Save as movie”. Wybierz format filmu („Movie format”) jako „AV” oraz styl animacji („Animation style”) jako „Forward”. Ustaw jakość kompresji („Compression quality”) na „10%” oraz częstotliwość klatek („Frame rate”) na „5/second”.
    3. Zaznacz pole „Animate through time” i kliknij „Do it”. Film zostanie wygenerowany.
  3. Pomiar tempa skracania i wzrostu mikrotubul
    1. Zidentyfikuj mikrotubule, które zostaną wykorzystane do pomiaru. W każdej komórce tylko kilka mikrotubul będzie nadawało się do wyraźnego i pełnego śledzenia procesu skracania lub wzrostu.
    2. Przeanalizuj każdą klatkę filmu, aby zidentyfikować klatkę pokazującą długość początkową mikrotubuli oraz klatkę z mikrotubulą o maksymalnym wydłużeniu lub skróceniu. Zmierz zmianę długości między tymi dwoma stanami mikrotubuli oraz czas, który upłynął między dwiema klatkami.
    3. Oblicz tempo wzrostu lub skracania, dzieląc zmianę długości przez czas (jednostka: µm/s). Dla każdego warunku badawczego przeanalizuj co najmniej 10 komórek i zmierz co najmniej 20 mikrotubul.
    4. Oblicz średnią oraz błąd standardowy dla każdego warunku badawczego. Przeanalizuj różnice statystyczne między warunkami za pomocą testu Studenta. Przedstaw dane w tabeli i/lub na wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując przedstawiony tutaj protokół, zbadaliśmy wpływ docetakselu na dynamikę mikrotubul w prawidłowych (MCF-7CC) oraz opornych na docetaksel (MCF-7TXT) komórkach raka piersi. Dwa zestawy obrazów przedstawiają wpływ docetakselu (0,5 µM) na wzrost i skracanie się mikrotubul w komórkach MCF-7CC oraz MCF-7TXT (Rycina 1A).

Obliczyliśmy również szybkość wzrostu lub s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieją dwie główne metody pomiaru dynamicznej niestabilności mikrotubul: in vitro i in vivo. W metodzie in vitro oczyszczona tubulina jest używana do pomiaru dynamicznej niestabilności mikrotubul za pomocą wspomaganej komputerowo poklatkowej różnicowej mikroskopii interferencyjnej z kontrastem. W metodzie in vivo mikrowstrzykiwana tubulina fluorescencyjna lub tubulina GFP ulega ekspresji w mikrotubulach. Dynamika (wzrost i skracanie) mikrotubul jest następnie rejestrowana w trybie po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Te badania są wspierane przez finansowanie z CBCF (do ZW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Aminokwasy endogenneLife Technologies, Invitrogen11140-050
FBSGibco, Invitrogen12483
Anti-Anti (100x)Life Technologies, Invitrogen15240-062
docetaxelSigma-Aldrich01885-5mg-F
DMEM fenol bez czerwieniGibco, Invitrogen21063
Odczynnik CellLight * BacMam 2.0 * GFP-tubulinaThermoFisher ScientificC10613Kluczowy odczynnik do ekspresji tubuliny GFP w komórkach
Odczynnik CellLight *BacMam 2.0* GFPThermoFisher ScientificB10383Control
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich+B9:AA9472301do usuwania decetakselu
22-milimetrowy szklany coveslipFisher Scientifics12-545-101
6-dołkowa płytka hodowlanaGreiner Bio-One International6-dołkowa płytka hodowlana Celi Systemy
obrazowania mikroskopowego DeltaVisionGE HealthTen system jest wyposażony w stację pogodową do kontrolowania temperatury i CO2. Jest również wyposażony w oprogramowanie Worx do dekonwolucji i kontroli poklatkowej.
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific
Bright-Line, Hausser ScientificHausser Scientific, dystrybuowany przez VWRNr dostawcy: 1492 Nr VWR: 15170-172
Zestaw hemacytometru 25200056

Bibliografia

  1. Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
  2. Yardley, D. A. Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes. Int J Breast Cancer. 2013, 137414(2013).
  3. Jassem, J., et al. Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial. J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).
  4. Nabholtz, J. M., et al. Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial. J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).
  5. Zelnak, A. Overcoming taxane and anthracycline resistance. Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).
  6. Rivera, E. Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options. Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).
  7. Longley, D. B., Johnston, P. G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).
  8. Downing, K. H., Nogales, E. Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding. Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).
  9. McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).
  10. Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. Determination of microtubule dynamic instability in living cells. Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).
  11. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).
  12. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  13. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).
  14. Kavallaris, M. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).
  15. Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics. J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).
  16. Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).
  17. Wang, H., et al. Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (37), (2014).
  18. Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review. Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).
  19. Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies. Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).
  20. Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability. J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).
  21. Banerjee, A. Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).
  22. Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation. Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).
  23. Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins. Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).
  24. Hembruff, S. L., et al. Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance. BMC.Cancer. 8, 318(2008).
  25. Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev. Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).
  26. Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).
  27. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  28. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  29. Walczak, C. E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki oporne na docetakselalfa tubulina z etykiet GFPobrazowanie poklatkowemikroskopia fluorescencyjnawzrost mikrotubulskracanie mikrotubulmetoda in vivokom rki raka piersileczenie farmakologiczne

Powiązane artykuły