Tworzenie proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z nietransformowanych ludzkich fibroblastów

Podsumowanie

Chociaż proliferacyjne komórki poliploidalne są niezbędne do analizy niestabilności chromosomalnej komórek poliploidalnych, tworzenie takich komórek z nieprzekształconych komórek ludzkich nie jest łatwe. Niniejszy raport opisuje stosunkowo proste procedury tworzenia proliferacyjnych komórek tetraploidalnych wolnych od diploidalnej populacji z normalnych ludzkich fibroblastów.

Streszczenie

Komórki poliploidalne (głównie tetraploidalne) są często obserwowane w zmianach przednowotworowych tkanek ludzkich, a ich niestabilność chromosomalna jest uważana za odpowiedzialną za kancerogenezę w takich tkankach. Chociaż proliferacyjne komórki poliploidalne są niezbędne do analizy niestabilności chromosomalnej komórek poliploidalnych, tworzenie takich komórek z nieprzekształconych komórek ludzkich jest dość trudne. Indukcja tetraploidii przez czynniki chemiczne zwykle powoduje mieszaninę populacji diploidalnych i tetraploidalnych, a większość badań wykorzystywała sortowanie lub klonowanie komórek aktywowanych fluorescencją poprzez ograniczenie rozcieńczenia w celu oddzielenia komórek tetraploidalnych od diploidalnych. Procedury te są jednak czasochłonne i pracochłonne. Niniejszy raport opisuje stosunkowo prosty protokół indukcji proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z normalnych ludzkich fibroblastów przy minimalnym zanieczyszczeniu komórkami diploidalnymi. Krótko mówiąc, protokół składa się z następujących kroków: zatrzymanie komórek w mitozie przez demekolcynę (DC), zebranie komórek mitotycznych po otrząśnięciu, inkubacja pobranych komórek z prądem stałym przez dodatkowe 3 dni oraz inkubacja komórek w pożywce wolnej od leków (wznawiają proliferację jako komórki tetraploidalne w ciągu kilku dni). W zależności od typu komórki, zbieranie komórek mitotycznych przez strząsanie się może zostać pominięte. Protokół ten zapewnia prostą i wykonalną metodę tworzenia proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z normalnych ludzkich fibroblastów. Komórki tetraploidalne uzyskane tą metodą mogą być użytecznym modelem do badania niestabilności chromosomów i potencjału onkogennego poliploidalnych komórek ludzkich.

Wprowadzenie

Poliploidalność została zaobserwowana nie tylko w wyspecjalizowanych tkankach gatunków ssaków, ale także w różnych stanach patologicznych, takich jak rak i choroby zwyrodnieniowe. Komórki poliploidalne (głównie tetraploidalne) są często obserwowane w zmianach przednowotworowych tkanek ludzkich, takich jak przełyk Barretta ^1,2 lub płaskonabłonkowe zmiany śródnabłonkowe szyjki macicy ^3,4 i są uważane za źródło złośliwych komórek aneuploidalnych w tych tkankach ^5,6. Chociaż sugeruje się, że konwersja komórek tetraploidalnych do aneuploidalnych może być kluczowym wydarzeniem we wczesnych stadiach nowotworzenia, mechanizmy zaangażowane w te....

Protokół

1. Hodowla komórkowa

1. Uzyskaj komórki do indukcji tetraploidii. Do tej pory potwierdzono, że technika ta może być stosowana do ludzkich linii komórkowych fibroblastów TIG-1, BJ, IMR-90 i TIG-1 unieśmiertelnionych telomerazą (TIG-hT).
2. Hodować komórki w minimalnej ilości niezbędnej pożywki z modyfikacją α lub w dowolnym innym pożywce do hodowli komórkowej odpowiedniej dla badanego typu komórki, uzupełnionej 10% (v/v) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) przez inkubację w atmosferze 5% (v/v) CO₂ w temperaturze 37 °C. Komórki pasażowe co 3 lub 4 dni, aby nie przekroczyć gęstości poniżej zlewu.
   UWAGA: Poziom podwojeni....

Wyniki

W naszym doświadczeniu komórki TIG-1 można uczynić niemal całkowicie tetraploidalnymi poprzez prostą, ciągłą inkubację z 0,1 µg/mL DC przez 4 dni (Rysunek 2A). W przeciwieństwie do nich, inne linie fibroblastów, takie jak BJ lub IMR-90, a także komórki TIG-hT, po zastosowaniu tej samej procedury stały się mieszaniną populacji diploidalnych i tetraploidalnych, co wymaga izolacji komórek mitotycznych metodą odrywania (shake-off) w trakcie kuracji DC (zazwyczaj 16–18 h po ro.......

Dyskusja

Głównym problemem w indukcji tetraploidii z komórek diploidalnych przez czynniki chemiczne, zarówno przez inhibitory cytokinezy, jak i inhibitory wrzeciona, jest to, że komórki często stają się mieszaniną populacji diploidalnych i tetraploidalnych, a komórki tetraploidalne muszą być oddzielone od komórek diploidalnych. Najczęstsze podejścia do izolacji populacji tetraploidalnej wolnej od komórek diploidalnych wykorzystują FACS lub klonowanie poprzez ograniczenie rozcieńczenia. Jednak procedury te są pracochłonne i niełat.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MEM-α	Sigma-Aldrich	M8042-500ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML
Roztwór demekolcyny (10 μ g/ml w HBSS)	Sigma-Aldrich	D1925-10ML
BD CycleTES Plus Zestawy odczynników DNA	BD Biosciences	#340242	Do badania ploidalności DNA metodą cytometrii przepływowej
Wielokolorowa sonda FISH z chromosomem ludzkim 24XCyte	MetaSystems	#D-0125-060-DI	Niezbędny jest specjalistyczny zestaw filtrów i oprogramowanie do analizy mFISH
System obrazowania Isis z oprogramowaniem mFISH	Niezbędny jest specjalistyczny zestaw sond	MetaSystems