Artykuł metodologiczny

Tworzenie proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z nietransformowanych ludzkich fibroblastów

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55028

⸱

8 stycznia 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Chociaż proliferacyjne komórki poliploidalne są niezbędne do analizy niestabilności chromosomalnej komórek poliploidalnych, tworzenie takich komórek z nieprzekształconych komórek ludzkich nie jest łatwe. Niniejszy raport opisuje stosunkowo proste procedury tworzenia proliferacyjnych komórek tetraploidalnych wolnych od diploidalnej populacji z normalnych ludzkich fibroblastów.

Streszczenie

Komórki poliploidalne (głównie tetraploidalne) są często obserwowane w zmianach przednowotworowych tkanek ludzkich, a ich niestabilność chromosomalna jest uważana za odpowiedzialną za kancerogenezę w takich tkankach. Chociaż proliferacyjne komórki poliploidalne są niezbędne do analizy niestabilności chromosomalnej komórek poliploidalnych, tworzenie takich komórek z nieprzekształconych komórek ludzkich jest dość trudne. Indukcja tetraploidii przez czynniki chemiczne zwykle powoduje mieszaninę populacji diploidalnych i tetraploidalnych, a większość badań wykorzystywała sortowanie lub klonowanie komórek aktywowanych fluorescencją poprzez ograniczenie rozcieńczenia w celu oddzielenia komórek tetraploidalnych od diploidalnych. Procedury te są jednak czasochłonne i pracochłonne. Niniejszy raport opisuje stosunkowo prosty protokół indukcji proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z normalnych ludzkich fibroblastów przy minimalnym zanieczyszczeniu komórkami diploidalnymi. Krótko mówiąc, protokół składa się z następujących kroków: zatrzymanie komórek w mitozie przez demekolcynę (DC), zebranie komórek mitotycznych po otrząśnięciu, inkubacja pobranych komórek z prądem stałym przez dodatkowe 3 dni oraz inkubacja komórek w pożywce wolnej od leków (wznawiają proliferację jako komórki tetraploidalne w ciągu kilku dni). W zależności od typu komórki, zbieranie komórek mitotycznych przez strząsanie się może zostać pominięte. Protokół ten zapewnia prostą i wykonalną metodę tworzenia proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z normalnych ludzkich fibroblastów. Komórki tetraploidalne uzyskane tą metodą mogą być użytecznym modelem do badania niestabilności chromosomów i potencjału onkogennego poliploidalnych komórek ludzkich.

Wprowadzenie

Poliploidalność została zaobserwowana nie tylko w wyspecjalizowanych tkankach gatunków ssaków, ale także w różnych stanach patologicznych, takich jak rak i choroby zwyrodnieniowe. Komórki poliploidalne (głównie tetraploidalne) są często obserwowane w zmianach przednowotworowych tkanek ludzkich, takich jak przełyk Barretta 1,2 lub płaskonabłonkowe zmiany śródnabłonkowe szyjki macicy 3,4 i są uważane za źródło złośliwych komórek aneuploidalnych w tych tkankach 5,6. Chociaż sugeruje się, że konwersja komórek tetraploidalnych do aneuploidalnych może być kluczowym wydarzeniem we wczesnych stadiach nowotworzenia, mechanizmy zaangażowane w ten proces nie są w pełni poznane. Dzieje się tak częściowo dlatego, że nie jest dostępny żaden model in vitro, w którym mogą się rozmnażać nieprzekształcone poliploidalne komórki ludzkie.

Niektórzy badacze wywołali tetraploidię w nieprzekształconych ludzkich komórkach nabłonkowych poprzez generowanie komórek dwujądrowych poprzez hamowanie cytokinezy7-9. Jednakże w tej metodzie zbędne komórki diploidalne muszą zostać wyeliminowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) 7,8 lub klonowanie przez ograniczenie rozcieńczenia 9. Ponieważ procedury te są pracochłonne i niełatwe do wykonania, do badań w tej dziedzinie pożądane są prostsze metody tworzenia nietransformowanych komórek tetraploidalnych.

W niniejszym raporcie opisujemy protokół tworzenia proliferacyjnych komórek tetraploidalnych z normalnych ludzkich fibroblastów lub unieśmiertelnionych telomerazą ludzkich fibroblastów za pomocą stosunkowo prostych procedur. Procedury wykorzystują truciznę wrzeciona demekolcynę (DC) do zatrzymania komórek diploidalnych w mitozie, a komórki mitotyczne zebrane przez strząsanie są dalej traktowane DC. Diploidalne komórki mitotyczne traktowane prądem stałym przez dłuższy czas przekształcają się w tetraploidalne komórki G1, a komórki te namnażają się jako komórki tetraploidalne po zatrzymaniu wzrostu przez kilka dni po odstawieniu leku. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę tworzenia użytecznego modelu do badania związku między niestabilnością chromosomów a potencjałem onkogennym poliploidalnych komórek ludzkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

  1. Uzyskaj komórki do indukcji tetraploidii. Do tej pory potwierdzono, że technika ta może być stosowana do ludzkich linii komórkowych fibroblastów TIG-1, BJ, IMR-90 i TIG-1 unieśmiertelnionych telomerazą (TIG-hT).
  2. Hodować komórki w minimalnej ilości niezbędnej pożywki z modyfikacją α lub w dowolnym innym pożywce do hodowli komórkowej odpowiedniej dla badanego typu komórki, uzupełnionej 10% (v/v) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) przez inkubację w atmosferze 5% (v/v) CO2 w temperaturze 37 °C. Komórki pasażowe co 3 lub 4 dni, aby nie przekroczyć gęstości poniżej zlewu.
    UWAGA: Poziom podwojenia populacji (PDL) powinien być obliczany za każdym razem podczas pasażu, aby ocenić wzrost komórek i wiek komórek. PDL można obliczyć na podstawie liczby komórek wysianych w naczyniu (N1) i liczby komórek zebranych podczas następnego pasażowania (N2) przy użyciu następującego wzoru (X to początkowy PDL). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2

2. Indukcja i tworzenie komórek tetraploidalnych z fibroblastów diploidalnych

  1. Indukować tetraploidię bez wytrząsania.
    UWAGA: Niektóre szczepy komórkowe (np. TIG-1) mogą stać się prawie całkowicie tetraploidalne w wyniku ciągłego leczenia demekolcyną (DC) w następujący sposób.
    1. Przejście komórek do jednej lub dwóch 100-milimetrowych szalek w dniu poprzedzającym leczenie w celu wywołania tetraploidii. Zwykle przygotuj 5 x 105 do 1 x 106 komórek na naczynie do indukcji komórek tetraploidalnych.
    2. Traktuj wykładniczo rosnące komórki pożywką zawierającą 0,1 μg/ml prądu stałego przez 4 dni.
    3. Zastąp pożywkę zawierającą prąd stały pożywką wolną od leków i inkubuj komórki w atmosferze 5% (v/v) CO2 w temperaturze 37 °C. Komórki zwykle wznawiają proliferację w ciągu 1 tygodnia.
  2. Wywołaj tetraploidię za pomocą strząśnięcia.
    UWAGA: Większość komórek staje się mieszaniną populacji diploidalnych i tetraploidalnych w wyniku prostego leczenia prądem stałym opisanego powyżej (2.1). W związku z tym konieczne są pewne modyfikacje procedury w celu wyeliminowania populacji diploidalnej w następujący sposób (ryc. 1).
    1. Komórki pasażowe do kilku kolb T75 na dzień przed leczeniem w celu wywołania tetraploidii. Zwykle należy przygotować co najmniej 5 x 106 komórek (1 x 106 komórek na kolbę) do indukcji komórek tetraploidalnych.
    2. Traktuj wykładniczo rosnące komórki pożywką zawierającą 0,1 μg / ml DC przez 16 - 18 godzin, aby zatrzymać komórki w mitozie. Czas potrzebny do zatrzymania komórek w mitozie może zależeć od komórek docelowych i powinien być określony przez wstępne eksperymenty w celu uzyskania jak największej liczby komórek mitotycznych. Na przykład wolniej rosnące komórki powinny być traktowane prądem stałym przez dłuższy czas niż szybciej rosnące komórki.
      UWAGA: Jeśli komórki są traktowane zbyt długo na tym etapie, mogą ulec mitotycznemu poślizgowi i przylgnąć do powierzchni naczynia, uniemożliwiając zebranie komórek mitotycznych przez strząśnięcie w następnym kroku.
    3. Zebrać komórki mitotyczne zatrzymane w prądzie stałym metodą wytrząsania, w której luźno przylegające komórki mitotyczne zbiera się przez delikatne potrząsanie kolbami i przemywanie pożywką, a następnie odwirowanie (300 x g, 5 min). W tym kroku policz liczbę komórek za pomocą odpowiedniej metody.
    4. Ponownie zasiewaj komórki mitotyczne do naczyń hodowlanych o średnicy 60 mm i traktuj komórki 0,1 μg/ml prądu stałego przez dodatkowe 3 dni. Wysiewaj więcej niż 1 x 106 komórek mitotycznych na naczynie, ponieważ mniej niż 10% komórek może przetrwać ten zabieg.
    5. Zastąp pożywkę zawierającą prąd stały pożywką wolną od leków i poczekaj, aż komórki wznowią proliferację, co zwykle następuje w ciągu 1 tygodnia.
  3. Komórki pasażowe podobne do pierwotnych komórek diploidalnych.

3. Badanie ploidalności DNA

UWAGA: To jest dobrze znana procedura i należy zapoznać się z instrukcją techniczną, aby uzyskać szczegółowe procedury i wskazówki techniczne.

  1. Zebrać komórki (5 x 105 - 1 x 106) przez inkubację komórek z roztworem zawierającym 0,05% trypsyny i 0,02% EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C i zneutralizować trypsynę za pomocą pożywki zawierającej 10% FBS.
  2. Odwirować komórki w pożywce i umyć je przez ponowne zawieszenie w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie odwirować (300 x g, 5 min).
  3. Przygotować komórki do analizy DNA za pomocą jednej z następujących dwóch metod
    1. Metoda analizy komórek nieustalonych10
      UWAGA: Metodę tę można wykonać przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do analizy cyklu komórkowego. Próbki przygotowane tą metodą należy poddać analizie natychmiast, ponieważ komórki nie są utrwalone w procedurze, a wybarwione jądra z czasem ulegną uszkodzeniu.
      1. Przemyć komórki 40 mM buforem cytrynianowym zawierającym 250 mM sacharozy. Następnie potraktuj komórki 250 μl 0,1% (v/v) nonidetu P40 i 30 μg/ml trypsyny w 200 μl 40 mM buforu cytrynianowego zawierającego 250 mM sacharozy przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Dodaj 200 μl 0,5 μg/ml inhibitora trypsyny i 0,1 μg/ml RNazy A do 40 mM buforu cytrynianowego zawierającego 250 mM sacharozy i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Dodać 200 μl 0,4 mg/ml jodku propidyny (PI) do 40 mM buforu cytrynianowego zawierającego 250 mM sacharozy i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wybarwienia jąder komórkowych.
    2. Metoda analizy komórek stałych
      1. Utrwal komórki 80% etanolem, zawieszając komórki w 1 ml PBS, dodając kroplami 4 ml 100% EtOH, mieszając zawiesinę komórek i pozostawiając ją w temperaturze pokojowej na 30 minut. Komórki w tym utrwalaczu można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
      2. Umyć komórki, umieszczając je ponownie w 5 ml PBS, a następnie odwirować (300 x g, 5 min). Potraktuj komórki 0,5 mg/ml RNazy A i wybarwij je 50 μg/ml jodku propidyny (PI) (475 μl 0,5 mg/ml RNazy A i 25 μl 1 mg/ml PI) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Analizuj zawartość DNA w komórkach za pomocą cytometru przepływowego z laserem 488 nm i filtrem emisyjnym z kanałem czerwonym (długi > 610 nm). W tym samym czasie należy przeanalizować próbkę referencyjną przygotowaną z prawdziwych komórek diploidalnych, aby ocenić ploidalność komórek docelowych.
    1. Alternatywnie dodaj standardowe kulki fluorescencji, aby ocenić stosunek intensywności fluorescencji komórek diploidalnych do kulek. Użyj opcji "wysokość impulsu w stosunku do szerokości impulsu" cytometru przepływowego, aby odróżnić pojedyncze komórki tetraploidalne od skupisk komórek diploidalnych11.

4. Badanie liczby chromosomów i analiza kariotypu

UWAGA: To wszystko są dobrze ugruntowane procedury i należy zapoznać się z instrukcją techniczną lub protokołami producenta, aby uzyskać szczegółowe procedury i wskazówki techniczne.

  1. Traktuj wykładniczo rosnące komórki 0,1 μg / ml DC przez 4 godziny, aby zatrzymać komórki w metafazie.
  2. Przygotuj preparaty chromosomowe.
    1. Zebrać komórki (co najmniej 5 x 105 komórek) przez trypsynizację i zawiesić w pożywce zawierającej FBS.
    2. Odwirować komórki w pożywce (300 x g, 5 min) i traktować roztworem hipotonicznym (5 ml 0,075 M KCl) w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    3. Napraw i zawieś komórki w utrwalaczu Carnoya (metanol: kwas octowy = 3:1).
    4. Rozprowadzić komórki na szkiełku podstawowym, upuszczając niewielką objętość (25 - 35 μl) zawiesiny komórek. Dodatkowe kroki, takie jak wystawienie na działanie gorącej pary, mogą być konieczne, aby poprawić rozprzestrzenianie się chromosomów.
  3. Komórki barwione do liczenia chromosomów lub analizy kariotypu lub wielokolorowej fluorescencji hybrydyzacji in situ (mFISH).
    1. Liczba chromosomów.
      1. Komórki barwić 5% roztworem Giemsy (lub 5 μg/ml PI zawierającym 0,5 mg/ml RNazy A do mikroskopii fluorescencyjnej) przez 15 - 20 min.
      2. Sfotografuj cyfrowo co najmniej 50 komórek metafazy.
      3. Policz liczbę chromosomów na komórkę za pomocą oprogramowania do analizy obrazu po ręcznym oddzieleniu dotykających się i nakładających się chromosomów za pomocą oprogramowania do edycji zdjęć. Chociaż liczbę chromosomów można ocenić ręcznie, zalecana jest ocena komputerowa.
    2. Analiza kariotypu
      UWAGA: Ta analiza powinna być wykonana przez przeszkolonego technika lub profesjonalną firmę.
      1. Barwienie komórek zgodnie ze standardową techniką pasma G12.
      2. Analizuj chromosomy, aby uzyskać standardowe kariogramy12.
    3. mFISH
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i należy go wykonać w razie potrzeby.
      1. Barwienie komórek za pomocą wielokolorowych sond FISH dla chromosomów ludzkich zgodnie z protokołem producenta13.
      2. Analiza chromosomów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami i oprogramowaniem do analizy mFISH13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W naszym doświadczeniu komórki TIG-1 mogą stać się niemal całkowicie tetraploidalne poprzez prostą, ciągłą inkubację z 0,1 µg/mL DC przez 4 dni (Ryc. 2A). W przeciwieństwie do nich, inne linie fibroblastów, takie jak BJ lub IMR-90, a także komórki TIG-hT, po takim samym traktowaniu stały się mieszaniną populacji diploidalnych i tetraploidalnych, przez co podczas kuracji DC (zazwyczaj 16–18 h po rozpoczęciu traktowania) konieczna była izolacja komórek mitotycznych metodą s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym problemem w indukcji tetraploidii z komórek diploidalnych przez czynniki chemiczne, zarówno przez inhibitory cytokinezy, jak i inhibitory wrzeciona, jest to, że komórki często stają się mieszaniną populacji diploidalnych i tetraploidalnych, a komórki tetraploidalne muszą być oddzielone od komórek diploidalnych. Najczęstsze podejścia do izolacji populacji tetraploidalnej wolnej od komórek diploidalnych wykorzystują FACS lub klonowanie poprzez ograniczenie rozcieńczenia. Jednak procedury te są pracochłonne i niełat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

Dziękujemy Pani Matsumoto za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MEM-αSigma-AldrichM8042-500ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Roztwór demekolcyny (10 μ g/ml w HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus Zestawy odczynników DNABD Biosciences#340242Do badania ploidalności DNA metodą cytometrii przepływowej
Wielokolorowa sonda FISH z chromosomem ludzkim 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DINiezbędny jest specjalistyczny zestaw filtrów i oprogramowanie do analizy mFISH
System obrazowania Isis z oprogramowaniem mFISH Niezbędny jest specjalistyczny zestaw sondMetaSystems

Bibliografia

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67(2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198(2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Opracowanie demekolcynmetoda shake offzatrzymanie mitozyanaliza cytometrycznaliczenie chromosom wanaliza ploidii DNAprotok hodowli kom rkowejbadania nad kancerogenez

Powiązane artykuły