Brzuszne naczynie grzbietowe pszczoły miodnej i innych owadów służy jako funkcjonalny odpowiednik serca ssaków i odgrywa ważną rolę w transporcie składników odżywczych, usuwaniu odpadów, funkcjonowaniu układu odpornościowego i innych. Tutaj opisujemy protokół wizualizacji i farmakologicznej manipulacji tętnem pszczół.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sekcja i obserwacja naczynia grzbietowego pszczoły miodnej w celu zbadania funkcji serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Europejska pszczoła miodna, Apis mellifera L., jest cennym zasobem rolniczym i komercyjnym, znanym z produkcji miodu i świadczenia usług zapylania upraw, a także ważnym modelowym owadem społecznym używanym do badania pamięci i uczenia się, starzenia się i innych. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół preparacji grzbietowej ściany brzusznej pszczoły w celu uwidocznienia jej naczynia grzbietowego, które pełni rolę serca u owada. Udana sekcja ujawni funkcjonalne serce, które w odpowiednich warunkach może utrzymać stałe bicie serca przez dłuższy czas. Dzięki temu badacz może manipulować tętnem poprzez zastosowanie związków kardiomodulujących do naczynia grzbietowego. Korzystając z mikroskopu cyfrowego lub mikroskopu wyposażonego w kamerę cyfrową, badacz może dokonać nagrań wideo naczynia grzbietowego przed i po leczeniu związkami testowymi. Filmy mogą być następnie oceniane w czasie dogodnym dla użytkownika w celu określenia zmian w tętnie, a także zmian we wzorcu bicia serca po leczeniu. Zaletą tego protokołu jest to, że jest stosunkowo niedrogi w konfiguracji, łatwy do nauczenia, wymaga niewiele miejsca lub sprzętu, a jego przeprowadzenie zajmuje bardzo mało czasu.
Wprowadzenie
Ogólnym celem tej metodologii jest umożliwienie badaczowi szybkiej i łatwej obserwacji oraz ilościowego określenia wpływu, jaki środek farmakologiczny wywiera na tętno pszczół miodnych. Pszczoły, podobnie jak inne owady, mają otwarty układ krążenia, który rozprowadza hemolimfę, owadzi odpowiednik krwi, w całej jamie ciała, znaną jako hemocoel. Krążenie hemolimfy jest niezbędne do transportu składników odżywczych, czynników odpornościowych, produktów przemiany materii, a także neurohormonów i innych cząsteczek sygnałowych1. Krążenie ułatwia naczynie grzbietowe, które rozciąga się wzdłuż grzbietowej linii środkowej owada, a także dodatkowe narządy pulsacyjne. Naczynie grzbietowe jest podzielone na dwie funkcjonalnie odrębne sekcje, oznaczone sercem w jamie brzusznej i aortą w klatce piersiowej i głowie. Rozchodzące się skurcze w sercu pompują hemolimfę w kierunku klatki piersiowej i głowy, podczas gdy dodatkowe narządy pulsacyjne zapewniają przepływ hemolimfy do kończyn.
Funkcję serca owada można obserwować za pomocą różnych metod, w zależności od wielkości, fizjologii lub etapu życia owada. Powszechnym podejściem do obserwacji częstości akcji serca u larw lub mniejszych owadów jest zastosowanie obrazowania przyżyciowego2. Ta metoda jest jednak mniej przydatna u dorosłych pszczół, ponieważ wyraźne widzenie naczynia grzbietowego przez ścianę brzucha może być trudne. Uznanym podejściem do rejestrowania tętna u różnych owadów, w tym pszczół, jest wykorzystanie termografii kontaktowej, która wykorzystuje termistory umieszczone na zewnątrz owada w celu wykrycia pulsacji serca3,4. Tętno u dorosłych pszczół zostało również zarejestrowane przy użyciu techniki elektrofizjologicznej do pomiaru sygnału impedancji elektrycznej4,5. Technika ta wymaga wprowadzenia elektrod do zwierzęcia obok serca i użycia konwertera impedancji do rejestrowania uderzeń serca4. Podobnie, elektrokardiogramy zostały wykorzystane do wykrywania sygnałów elektrycznych wytwarzanych przez serce i połączone z zapisem wideo pszczoły w celu zaobserwowania zmian w czynności serca6. Wyraźną zaletą tych podejść jest to, że tętno jest oceniane u nienaruszonej, żywej pszczoły, a nie u wypreparowanego egzemplarza, co pomaga zapewnić dostępność pełnego zakresu reakcji fizjologicznych u pacjenta. Wyzwania związane z tymi podejściami obejmują uwzględnienie unieruchomienia lub znieczulenia pacjenta, potrzebę ograniczenia zmiennych zewnętrznych i bodźców, które mogą zmieniać częstość akcji serca, a także określenie odpowiedniej metody dostarczania podczas testowania środków farmakologicznych.
Innym podejściem, które zostało użyte do badania aktywności serca pszczół, jest częściowe wypreparowanie owada w celu odsłonięcia serca, a następnie zmierzenie skurczów naczyń grzbietowych za pomocą przetwornika siłyprzemieszczenia 7. W tym protokole serce jest stale kąpane w działającej soli fizjologicznej, a badane związki mogą być rozpuszczone w tym roztworze w celu zastosowania u pacjenta7. Istotną różnicą między tą metodą a poprzednio opisanymi jest to, że brzuszny rdzeń nerwowy jest usuwany, eliminując rolę, jaką ośrodkowy układ nerwowy odgrywa w modulowaniu częstości akcji serca5. W rezultacie wyjściowe bicie serca, które zwykle jest dość nieregularne, stabilizuje się przy znacznie niższej częstotliwości i amplitudzie niż zwykle obserwuje się u żywego owada5,7. Wspólną cechą wszystkich tych metod jest to, że wymagają one wysoce specjalistycznego i często drogiego sprzętu, a także pewnego poziomu wiedzy specjalistycznej, aby mogły zostać przeprowadzone. Być może największą wadą jest to, że żadne z tych podejść nie nadaje się szczególnie dobrze do eksperymentów, które obejmują testowanie dużej liczby osób, takich jak badanie przesiewowe biblioteki potencjalnie kardiomodulujących związków.
Największą zaletą opisanego tutaj podejścia jest jego prostota. Protokół jest stosunkowo łatwy do opanowania, konfiguracja zajmuje niewiele miejsca i wymagany jest tylko minimalny wkład finansowy. Metoda wymaga niewiele więcej niż kilku pszczół, kilku narzędzi chirurgicznych, roztworu izotonicznego i mikroskopu cyfrowego lub tradycyjnego mikroskopu z kamerą cyfrową. Pszczoły są poddawane sekcji w celu uwidocznienia naczynia grzbietowego, a cyfrowe filmy wideo są wykorzystywane do rejestrowania tętna przed i po leczeniu środkami farmakologicznymi. Chociaż nagrywanie wideo nie jest w rzeczywistości konieczne do zaobserwowania zmian w tętnie, znacznie zwiększy przepustowość (tj. liczbę obiektów, które można przetworzyć w danym czasie). Badacz może zmaksymalizować wydajność, nagrywając dużą liczbę filmów jednocześnie, a następnie oceniając te filmy w bardziej dogodnym czasie. Kolejną zaletą tego podejścia jest to, że filmy pozwalają badaczowi zacząć od nowa, jeśli proces oceniania zostanie przerwany, i ułatwiają widzowi bycie ślepym na leczenie w celu zmniejszenia stronniczości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pobieranie i przygotowanie obiektów badawczych
- Zebrać odpowiednią liczbę pszczół z kolonii.
UWAGA: Wymagana liczba zależy nie tylko od wielkości i zakresu eksperymentu, ale także od umiejętności badacza. Na przykład, jeśli istnieją 2 grupy badawcze z pożądaną wielkością próby 10 pszczół na grupę, doświadczony badacz może zebrać co najmniej 30 pszczół, aby uwzględnić nieudane sekcje, co w efekcie pozwoli uzyskać 20 użytecznych filmów do oceny. - Zminimalizować czas, jaki upływa między zebraniem a sekcją.
UWAGA: Chociaż pszczoły mogą być przetrzymywane w laboratorium przez kilka dni przed sekcją, zaobserwowano, że wskaźnik sukcesu sekcji (i.e., prawdopodobieństwo utrzymania stabilnej częstotliwości uderzeń serca w wypreparowanym naczyniu grzbietowym) spada wraz z czasem przetrzymywania pszczół poza kolonią.- Zapewnić pszczołom źródło wody i pokarmu podczas przetrzymywania w laboratorium. Na przykład, w minimalnym zakresie, zapewnić dostęp do 50% (w/v) roztworu sacharozy w wodzie (jest to wystarczające na czas krótszy niż 6 hr). Na dłuższe okresy zapewnić pszczołom dostęp do miodu.
- Przetrzymywać pszczoły w laboratorium przez noc w temperaturze około 32 °C i wilgotności względnej 60-80%, aby zredukować stres i uniknąć odwodnienia.
- Przed sekcją krótko znieczulić pszczoły, aby ułatwić manipulację.
UWAGA: Może to obniżyć wskaźnik sukcesu sekcji i zmniejszyć przepustowość.- Schłodzić pszczoły, kładąc je na lodzie lub wkładając do lodówki tylko na czas wystarczający do ograniczenia ich ruchów, aby ułatwić manipulację.
- Alternatywnie, krótko poddać pszczoły działaniu CO2, aby ułatwić manipulację.
UWAGA: Długotrwała ekspozycja na zimno może obniżyć wskaźnik sukcesu sekcji. Długotrwała lub powtarzana ekspozycja na CO2 również może obniżyć wskaźnik sukcesu sekcji.
2. Disekcja grzbietowej ściany brzucha
UWAGA: Pszczoły powinny być żywe w momencie przeprowadzania sekcji.
- Używając pincety i/lub nożyczek do mikrodissekcji, usuń odnóża i skrzydła, aby ułatwić sekcję odwłoka. W pobliżu należy przygotować mały zlewka lub podobny pojemnik z wodą destylowaną w celu płukania narzędzi pomiędzy kolejnymi sekcjami.
- Unieruchamiając pszczołę pincetą, użyj nożyczek do mikrodissekcji, aby przeciąć bocznie grzbietową ścianę odwłoka pomiędzy pierwszym a drugim tergiem (patrz Rycina 1).
Rycina 1: Widok grzbietowy odwłoka pszczoły. Pierwsze nacięcie należy wykonać między pierwszym a drugim tergitem, zgodnie z zaznaczeniem czerwoną linią. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Lekko trzymając pęsetą tylną krawędź drugiego tergitu, wykonaj cięcie wzdłużne po obu stronach ciała pszczoły, od miejsca pierwszego nacięcia aż do żądła (patrz Rysunek 2). Podczas cięcia należy zachować ostrożność, aby nie przebić przewodu pokarmowego.
Rysunek 2: Widok boczny odwłoka pszczoły. Drugie i trzecie nacięcia należy wykonać wzdłuż obu stron odwłoka, zgodnie z zaznaczeniem czerwonej linii. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Zamień nożyczki na drugą parę precyzyjnych pęset i za ich pomocą ostrożnie oddziel grzbietową ścianę brzucha od pozostałej części jamy brzusznej. Delikatnie usuń żądło oraz wszelkie fragmenty przewodu pokarmowego, które pozostały przytwierdzone do grzbietowej ściany brzucha. Unikaj przerwania ciągłości jelit, ponieważ ich zawartość może oblepić ścianę brzucha i utrudnić widoczność naczynia grzbietowego.
Rycina 3: Widok naczynia grzbietowego. Po usunięciu przewodu pokarmowego i żądła naczynie grzbietowe jest widoczne wzdłuż linii środkowej rozciętej grzbietowej ściany brzusznej. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Ustaw grzbietową ścianę jamy brzusznej w pożądanej orientacji pod kamerą w taki sposób, aby naczynie grzbietowe było widoczne (patrz Rycina 3). Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji odetnij nadmiar ściany jamy brzusznej, który utrudnia wizualizację naczynia grzbietowego. Prawidłowo umieszczona grzbietowa ściana jamy brzusznej powinna przypominać płytką czarkę lub miseczkę.
- Ponieważ naczynie grzbietowe nie sięga ostatniego segmentu brzusznego pszczoły, usuń ostatni tergit, aby poprawić widoczność naczynia grzbietowego.
- Używając mikropipety z regulowanym объjętością, pokryj naczynie grzbietowe 10 µl roztworu izotonicznego, aby utrzymać warunki fizjologiczne i zapewnić stabilne tętno.
UWAGA: Zalecanym roztworem jest czterokrotnie rozcieńczony roztwór Ringera (0.120 g/L chlorku wapnia, 0.105 g/L chlorku potasu, 0.050 g/L wodorowęglanu sodu oraz 2.250 g/L chlorku sodu), który w badaniach okazał się sprzyjać stabilnemu i ciągłemu biciu serca.
3. Obserwacja i modulacja częstotliwości akcji serca
- Pozostaw naczynie grzbietowe w spokoju do momentu uzyskania stabilnego, ciągłego bicia serca (zazwyczaj w ciągu 300 sec).
UWAGA: Bicie serca objawia się jako rytmiczne skurcze naczynia grzbietowego. Początkowo może wydawać się, że serce nie bije, zwłaszcza jeśli pszczoła była znieczulona, ale zazwyczaj zaczyna ono ponownie bić po kilku minutach spoczynku w roztworze izotonicznym i może bić przez wiele godzin, pod warunkiem że pozostanie zanurzone w roztworze. - Zmierz częstotliwość akcji serca jako liczbę uderzeń na minutę (BPM).
- Zapisz liczbę skurczów zaobserwowanych w ciągu 60 sec. W celu ułatwienia tego procesu należy użyć ręcznego licznika i stoperze.
- Zmierz zmianę częstotliwości akcji serca, zapisując zaobserwowaną wartość BPM przed i po podaniu związku kardiomodulującego.
UWAGA: Chociaż czas potrzebny do zaobserwowania efektu wpływu na częstotliwość akcji serca może się różnić w zależności od testowanego związku, zmiany te są zazwyczaj widoczne w ciągu kilku minut.- Wyznacz bazową częstotliwość akcji serca bezpośrednio przed dodaniem jakiegokolwiek związku testowego.
UWAGA: Częstotliwość akcji serca po zastosowaniu preparatu można zazwyczaj wyznaczyć po 90 do 120 sec. - Przygotuj potencjalne kardiomodulatory (np. oktopaminę), rozpuszczając związek w tym samym roztworze izotonicznym, który służy do kąpieli naczynia grzbietowego.
- Dodaj związki testowe do roztworu otaczającego naczynie grzbietowe, korzystając z mikropipety.
- Wyznacz bazową częstotliwość akcji serca bezpośrednio przed dodaniem jakiegokolwiek związku testowego.
- W celu uzyskania większej dokładności i zwiększenia przepustowości, dokonaj nagrania wideo każdego obiektu testowego, a następnie wykorzystaj nagrania do oceny częstotliwości akcji serca w późniejszym czasie.
UWAGA: Pozwala to jednemu badaczowi na rozłożenie w czasie operacji sekcyjnych, co ułatwia niemal ciągłe tworzenie nagrań wideo. Podczas nagrywania zalecana minimalna długość filmu to około 240 sec, przy czym jakikolwiek związek testowy należy dodać w 60 sec nagrania. Zapewnia to badaczowi 60 sec okna czasowego na ocenę bazowej częstotliwości akcji serca, a następnie kolejne 60 sec okna czasowego na ocenę częstotliwości akcji serca po zastosowaniu preparatu, 120 sec po podaniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ponieważ wiele związków farmakologicznie aktywnych, które mogą być testowane przy użyciu tego protokołu, nie rozpuszcza się w wodzie, konieczne jest zastosowanie wiarygodnego rozpuszczalnika, który umożliwi podanie testowanych związków za pomocą roztworu izotonicznego używanego do kąpieli naczynia grzbietowego. Dimetylosulfoksyd (DMSO) jest rozpuszczalnikiem powszechnie stosowanym jako nośnik do podawania leków eksperymentalnych i innych związków u zwierząt8 i był z sukcesem wy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół zapewnia proste i skuteczne podejście do testowania związków farmakologicznych pod kątem ich wpływu na tętno pszczół miodnych. Jak zaobserwowano we wcześniejszych eksperymentach, w których albo przecina się brzuszny rdzeń nerwowy żywegoowada5 , albo wycina się brzuszny rdzeń nerwowy podczas odsłaniania naczyniagrzbietowego7, utrata regulacji ośrodkowego układu nerwowego skutkuje stabilnym biciem serca o niskiej częstotliwości. Niska częstotliwość uderzeń pozwala badaczow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują doktorom Jeffreyowi Bloomquistowi i Danielowi Swale za ich techniczne komentarze i sugestie. Projekt ten został częściowo sfinansowany przez Wydział Entomologii i Kolegium Rolnictwa i Nauk Przyrodniczych w Virginia Tech.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cyfrowy mikroskop USB Dino-Lite Edge | Dino-Lite | AM4815ZT | Wystarczy dowolny mikroskop cyfrowy lub podobna konfiguracja |
| Statyw do mikroskopu | Dino-Lite | RK-10 | Dowolny statyw odpowiedni do mikroskopu cyfrowego |
| Laptop lub komputer | Niezbędny do mikroskopu cyfrowego | ||
| Nożyczki do mikrodysekcji (Vannas, 8 cm, Proste, Ostrza 5 mm) | Świat Instrumenty precyzyjne | 14003 | Wystarczą wszelkie podobne nożyczki odpowiednie do mikrodysekcji Kleszcze |
| mikropreparacji, 10,2 cm, kątowe (2 pary) | World Precision Instruments | 504482 | Wystarczą wszelkie podobne kleszcze odpowiednie do mikrodysekcji |
| Roztwór Ringersa Tabletki o sile 1/4 | Sigma-Aldrich | 96724-100TAB | |
| Taca | Dowolna powierzchnia odpowiednia do mikrodysekcji | ||
| Pojedynczy kanał 10 i mikro; l pipeta | Dowolne urządzenie zdolne do dokładnego dostarczania 10 i mikro; l objętość | ||
| Końcówki | |||
| Mała zlewka lub pojemnik z wodą | Służy do płukania narzędzi między obiektami | ||
| Licznik ręczny | Office Depot | 295033 | Każdy podobny produkt wystarczy |
| Timer | Office Depot | 644219 | Każdy podobny produkt wystarczy |
| Woda | dejonizowanaPrzygotowanie roztworu Ringera i narzędzi do płukania |
Bibliografia
- Klowden, M. J. Circulatory Systems. Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 3rd, 365-413 (2013).
- League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae. J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).
- Wasserthal, L. T. Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements. J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).
- Wasserthal, L. T. Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects. Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).
- Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera. J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).
- Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees. Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).
- Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition. J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).
- Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620. Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).
- Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz. Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).
- Roeder, T. Octopamine in invertebrates. Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).
- Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
