Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Summary

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Abstract

Częste problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) obejmują zapadanie się komórek, obróbkę próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Na przykładzie młodych tkanek kwiatowych, cyst lęgniowców i zarodników grzybów (Agaricales) opisano tutaj konkretne protokoły przetwarzania delikatnych próbek, które przezwyciężają niektóre z głównych wyzwań związanych z obróbką próbek w celu przechwytywania obrazu w ramach SEM.

Merystemy kwiatowe utrwalone za pomocą FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) i przetworzone za pomocą Suszarki Punktu Krytycznego (CPD) nie wykazywały zapadniętych ścian komórkowych ani zniekształconych organów. Wyniki te mają kluczowe znaczenie dla rekonstrukcji rozwoju kwiatów. Podobne traktowanie oparte na CPD próbek z wilgotnych mikrośrodowisk, takich jak torbiele lęgniowców utrwalonych aldehydem glutarowym, jest optymalne do testowania zróżnicowanego wzrostu cech diagnostycznych (np. kolców torbieli) na różnych typach substratów. Uniknięto zniszczenia komórek pielęgniarskich przyczepionych do zarodników grzybów po ponownym nawodnieniu, odwodnieniu i leczeniu CPD, co jest ważnym krokiem dla dalszych badań funkcjonalnych tych komórek.

Opisane tutaj protokoły stanowią tanią i szybką alternatywę dla pozyskiwania obrazów dobrej jakości w celu rekonstrukcji procesów wzrostu i badania cech diagnostycznych.

Introduction

W biologii, zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) zostało rozszerzone na badania ewolucji strukturalnej, morfologii porównawczej, rozwoju organów i charakterystyki populacji lub gatunków¹. Dzięki dwuwymiarowemu spojrzeniu na struktury mikroskopowe, dziedziny takie jak mikromorfologia i systematyka skorzystały z postępów techniki SEM od drugiej połowy^{XX wieku.} Na przykład wprowadzenie metodologii powlekania napylaniem w latach siedemdziesiątych XX wieku umożliwiło obserwacje delikatnych materiałów, takich jak wierzchołki pędów i kwiaty, poprawiając obrazowanie tkanek nieprzewodzących^2,

Protocol

UWAGA: Ten protokół zawiera sześć głównych sekcji, trzy poświęcone konkretnym organizmom (sekcje 1-3) i trzy opisujące procedury wspólne dla wszystkich (4-6). Gwiazdki (*) wskazują kroki zmodyfikowane przez eksperymentatorów.

1. Badania rozwijających się i w pełni ukształtowanych struktur roślinnych

1. Zbieranie i utrwalanie
   1. Jeśli materiał roślinny jest zbierany w miejscu bez dostępu do dygestoriów, należy wprowadzić i zanurzyć materiał w 70% etanolu w probówkach wirówkowych. Najlepiej zanurzyć materiał po 48 godzinach w FAA (kroki 1.1.1-1.1.3), aby uniknąć nadmiernego odwodnienia etanolu. Jeśli dygesto....

Results

Rozwój kwiatów i utrwalanie rozwijających się i w pełni ukształtowanych struktur roślinnych

Korzystając z opisanego tutaj protokołu FAA-CPD, młode i dojrzałe tkanki roślinne są optymalnie utrwalane i odwadniane do obrazowania SEM. Procesy takie jak rozwój kwiatów można zrekonstruować, ponieważ topografia i kształt pąków nie są zniekształcone przez kurczenie się komórek (ryc. 1b, 1d, 4a-f). Konstrukcje o skomplikow.......

Discussion

W odniesieniu do standardowych protokołów SEM, przedstawione tutaj procedury obejmują stosunkowo szybkie, łatwe do naśladowania i tanie metodologie. W zależności od ilości próbek i łatwości przetwarzania, uzyskanie dobrej jakości obrazów zajmuje od czterech do pięciu dni. Łącznie z odpowiednimi środkami ostrożności dotyczącymi operacji CPD i SEM, procedury są łatwe w obsłudze. Szczególną ostrożność należy zachować w przypadku formaliny i aldehydu glutarowego (patrz kroki 1.1.1 do 1.1.3 i 2.1.5 protokołu). Istnieją pewne .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kwas octowy	Brak konkretnego dostawcy		Podrażnienie skóry, działanie drażniące na oczy
aluminiowe króćce	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Probówki wirówkowe	Brak konkretnego dostawcy
Suszarka punktu krytycznego	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D-(+)-Glukoza	Merck	1 083 421 000
Dwustronna taśma do oznaczania	Brak konkretnego dostawcy
Absolutny etanol	Brak konkretnego dostawcy		Łatwopalny
europejski agar bakteriologiczny	Conda	1800.00	www.condalab.com
Bibuła filtracyjna	Brak konkretnego dostawcy
Kleszcze	Brak konkretnego dostawcy
Formalina 4%	Brak konkretnego dostawcy		Szkodliwy, toksyczność ostra, działanie uczulające na skórę, rakotwórcze. Szkiełka nakrywkowe łatwopalne
	Brak konkretnego dostawcy
Szklany pojemnik hermetyczny	Brak konkretnego dostawcy
Aldehyd glutarowy 25% DC 253857.1611  Panie przewodniczący, panie i panowie!	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Pepton mykologiczny	Conda	1922.00
Igły	Brak konkretnego dostawcy
Szalki Petriego	Brak konkretnego dostawcy
Pojemniki plastikowe	Brak konkretnego dostawcy
Uchwyt na próbkę z pokrywką  do suszarki w punkcie krytycznym	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
skalpele	Brak konkretnego dostawcy
Skaningowy mikroskop elektronowy	Hitachi	S3000N
Oprogramowanie do SEM
Rozwiązanie A: NaH2PO4
Rozwiązanie B: Na2HPO4
Uchwyty na próbki	Brak konkretnego dostawcy
Napylarka do napylania	Balzers	SCD 004
Mikroskop stereoskopowy	Brak konkretnego dostawcy
Siatki transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)	Mikroskopia elektronowa Nauki	G200 (siatka kwadratowa)	www.emsdiassum.com
Pęseta	Brak konkretnego dostawcy