Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

29.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55031

⸱

3 lutego 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biodiversity and Conservation Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 2Research Support Unit, Real Jardín Botánico, CSIC, 3Mycology Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 4Division of Glycoscience, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH)

W tym artykule

Podsumowanie

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Streszczenie

Częste problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) obejmują zapadanie się komórek, obróbkę próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Na przykładzie młodych tkanek kwiatowych, cyst lęgniowców i zarodników grzybów (Agaricales) opisano tutaj konkretne protokoły przetwarzania delikatnych próbek, które przezwyciężają niektóre z głównych wyzwań związanych z obróbką próbek w celu przechwytywania obrazu w ramach SEM.

Merystemy kwiatowe utrwalone za pomocą FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) i przetworzone za pomocą Suszarki Punktu Krytycznego (CPD) nie wykazywały zapadniętych ścian komórkowych ani zniekształconych organów. Wyniki te mają kluczowe znaczenie dla rekonstrukcji rozwoju kwiatów. Podobne traktowanie oparte na CPD próbek z wilgotnych mikrośrodowisk, takich jak torbiele lęgniowców utrwalonych aldehydem glutarowym, jest optymalne do testowania zróżnicowanego wzrostu cech diagnostycznych (np. kolców torbieli) na różnych typach substratów. Uniknięto zniszczenia komórek pielęgniarskich przyczepionych do zarodników grzybów po ponownym nawodnieniu, odwodnieniu i leczeniu CPD, co jest ważnym krokiem dla dalszych badań funkcjonalnych tych komórek.

Opisane tutaj protokoły stanowią tanią i szybką alternatywę dla pozyskiwania obrazów dobrej jakości w celu rekonstrukcji procesów wzrostu i badania cech diagnostycznych.

Wprowadzenie

W biologii zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) zostało rozszerzone na badania ewolucji strukturalnej, morfologii porównawczej, rozwoju organów oraz charakterystykę populacji lub gatunków1. Dzięki dwuwymiarowemu obrazowaniu struktur mikroskopowych, dziedziny takie jak mikromorfologia i systematyka zyskały na postępach w technice SEM od drugiej połowy 20th wieku. Na przykład wprowadzenie metody napylania w latach 70. umożliwiło obserwacje delikatnych materiałów, takich jak wierzchołki pędów i kwiaty, co usprawniło obrazowanie tkanek nieprzewodzących2,3. SEM wykorzystuje elektrony emitowane z powierzchni preparatu do odwzorowania topografii w środowisku wysokiej próżni4.

Badania z wykorzystaniem SEM koncentrują się zarówno na wnioskowaniu o cechach strukturalnych, jak i na rekonstrukcji procesów wzrostu. Dzięki obserwacjom SEM odkryto nowe cechy strukturalne istotne dla taksonomii i systematyki szerokiego zakresu organizmów. Na przykład cechy roślin wykorzystywane do diagnozy gatunkowej lub klasyfikacji nadrzędnych, takie jak jamki oklejone w drewnie5, zróżnicowanie znamięk6, morfologia nektarników i kwiatów7,8, szczegóły trichomów9 oraz ziarna pyłku10,11, nie mogą być właściwie zobrazowane bez użycia SEM. Pomyślne obserwacje z wykorzystaniem konwencjonalnego SEM przeprowadzono również w przypadku organizmów utrwalonych w formalinie przez długi czas12 oraz okazów roślin z zielników13.

Z drugiej strony badania nad rekonstrukcją procesów wzrostu z wykorzystaniem SEM obejmują szeroki zakres zagadnień, takich jak rozwój organów14, infekcje indukowane przez bakterie15, fizjologia korzeni roślin16, mechanizmy przyczepiania się pasożytów do żywiciela17,18, wpływ leków na pasożyty19, mikopasożytnictwo i antybioza20,21, wady wzrostu22, porównawczy rozwój osobników dzikich i mutantów23 oraz całe cykle życiowe24. Choć środowiskowe skaningowe mikroskopy elektronowe (ESEM)25 mogą oferować istotne zalety w obserwacji mokrych próbek biologicznych w procesach wzrostu, delikatny materiał może zostać uszkodzony nawet w warunkach niskiej próżni ESEM, dlatego wymaga on odpowiedniego przygotowania, aby uniknąć utraty cennych obserwacji morfologicznych.

W niniejszej pracy przedstawiono przegląd specyficznych protokołów obserwacji SEM dla trzech różnych rodzajów próbek: merystemów kwiatowych, oomycetów (Saprolegnia) oraz materiału grzybowego. Protokoły te stanowią kompilację doświadczeń z naszych poprzednich badań opartych na SEM26,27,28,29,30,31,32,33, w których zidentyfikowano konkretne trudności i znaleziono alternatywne rozwiązania. W przypadku porównawczych badań rozwojowych i strukturalnych roślin, zastosowanie SEM rozpoczęło się w latach 70. XX wieku34,35, a od tego czasu badacze odkryli, że niektóre cechy kwiatów są bardziej zmienne, niż wcześniej sądzono36. Rekonstrukcja rozwoju kwiatu wymaga uchwycenia wszystkich etapów pomiędzy młodymi merystemami kwiatowymi a anthezą. Aby osiągnąć ten cel, niezbędne jest, aby topografia próbki oraz integralność ścian komórkowych nie zostały naruszone po utrwaleniu i późniejszym odwodnieniu. Młode merystemy kwiatowe są szczególnie podatne na zapadanie się ścian komórkowych (Ryciny 1a, 1b). Podobnie delikatne struktury, takie jak nektarniki, płatki, znaki i sporangia, wymagają skutecznych i nieinwazyjnych protokołów. Niniejszy przegląd podsumowuje optymalny protokół pozwalający zachować nienaruszone młode i delikatne tkanki do obrazowania SEM.

W przypadku oomycetes (Stramenopiles) – jednej z najbardziej zróżnicowanych i rozpowszechnionych grup pasożytów, których gospodarze obejmują mikroby, rośliny, bezkręgowce i kręgowce37 – istnieją zarodniki, które rosną i rozwijają się w wilgotnym środowisku. Warunek ten stanowi wyzwanie dla obserwacji za pomocą SEM, ponieważ zarodniki wymagają odpowiedniego podłoża, które nie jest zgodne ze standardowymi protokołami SEM. Wśród oomycetes gatunki rodzaju Saprolegnia budzą szczególne zainteresowanie, ponieważ mogą powodować znaczne straty w akwakulturze, rybołówstwie i populacjach płazów38. Wykazano, że cechy mikromorfologiczne, takie jak haczykowate kolce cyst, są użyteczne w identyfikacji gatunków Saprolegnia, co jest kluczowe dla ustanowienia kontroli infekcji i potencjalnych metod leczenia39. Niniejszy protokół eksperymentalny służy do porównania wzorców wzrostu kolców cyst na różnych podłożach oraz do przygotowania próbki do suszenia w punkcie krytycznym (CPD) i późniejszej obserwacji SEM.

W trzecim przypadku pojawiły się interesujące spostrzeżenia po inspekcji zarodników grzybów Phellorinia herculanea f. stellata f. nova (Agaricales)31. Wraz z zarodnikami, przy użyciu SEM, zidentyfikowano grupę nieoczekiwanych komórek pielęgnacyjnych. Przy zastosowaniu poprzednich tradycyjnych protokołów i nieobrobionego materiału, komórki pielęgnacyjne były całkowicie zapadnięte (Rycina 1c). Dalsze wnioski dotyczące konkretnych tkanek powiązanych z zarodnikami można sformułować dzięki prostym, lecz kluczowym modyfikacjom standardowych podejść opisanych w niniejszym opracowaniu (Rycina 1d).

W niniejszym przeglądzie przedstawiono szczegółowe protokoły SEM, które mogą być wykorzystane do rozwiązania różnych problemów związanych z obserwacjami SEM u okrytonasiennych, oomycetes oraz Agaricales, takich jak odpowiednio: zapadanie się komórek i kurczenie się tkanki merystematycznej, nieoptymalny wzrost kolców cyst oraz niszczenie tkanek efemerycznych.

Mikrografie SEM ziaren pyłku o zróżnicowanej teksturze powierzchni do analizy morfologicznej.
Rycina 1: Porównanie próbek traktowanych bez (a, c) oraz z zastosowaniem (b, d) protokołu FAA-etanol-CPD. (a-b) Pąki kwiatowe Anacyclus clavatus, w połowie rozwoju. Pąk traktowany czwartotlenkiem osmu46 (a) oraz pąk traktowany protokołem FAA-CPD (b). (c-d) Komórki pielęgnacyjne z zarodnikami Phellorinia herculanea f. stellata. Próbki suszone bez żadnej obróbki (c) oraz z zastosowaniem opisanego tutaj protokołu dla Agaricales (d). Zarodniki zaznaczono na pomarańczowo. Skala: (a-b) 100 µm, (c-d) 50 µm. Zdjęcia wykonane przez Y. Ruiz-León. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Protokół ten składa się z sześciu głównych sekcji, z czego trzy są poświęcone konkretnym organizmom (sekcje 1-3), a trzy opisują procedury wspólne dla wszystkich (4-6). Gwiazdki (*) oznaczają kroki zmodyfikowane przez eksperymentatorów.

1. Badania rozwijających się i w pełni uformowanych struktur roślinnych

  1. Zbieranie i utrwalanie
    1. Jeśli materiał roślinny jest zbierany w miejscu bez dostępu do dygestorium, należy go umieścić i zanurzyć w 70% etanolu w probówkach wirówkowych. Idealnie jest zanurzyć materiał w FAA (kroki 1.1.1-1.1.3) po 48 h, aby uniknąć nadmiernego odwodnienia w etanolu. Jeśli dygestorium jest dostępne w miejscu pobierania materiału roślinnego, należy pominąć ten krok i przejść do punktu 1.1.1.
    2. Przygotować utrwalacz FAA (formalin-kwas octowy-alkohol) w dygestorium wyposażonym w filtr aldehydowy. Dodać 85 części 70% denaturowanego etanolu, 10 części 60% roztworu formaldehydu i 5 części lodowatego kwasu octowego. FAA należy przygotować bezpośrednio przed utrwalaniem materiału, ponieważ jego długotrwałe przechowywanie nie jest zalecane40.
    3. W dygestorium przelać zapas FAA do oddzielnych plastikowych butelek z szerokim wlewkiem i szczelnym zamknięciem. Użyć tylu butelek, ile jest dostępnych próbek, i przygotować etykiety do ich identyfikacji.
    4. Wybrać do utrwalenia merystemy kwiatowe lub wegetatywne, upewniając się, że nie są one uszkodzone przez owady, grzyby lub ekstremalne warunki pogodowe. Odciąć gałązki, usuwając niepotrzebny materiał, i natychmiast umieścić próbkę w roztworze FAA.
    5. Po 72-96 h przelać FAA do plastikowego pojemnika na odpady chemiczne. Następnie natychmiast przemyć próbki trzykrotnie świeżym 70% etanolem, aby usunąć pozostałości FAA. Utrwalony materiał można przechowywać w nieskończoność w 70% etanolu.
  2. Disekcja i odwadnianie
    1. Przeprowadzić disekcję utrwalonego materiału w 70% etanolu pod stereomikroskopem, używając ultraprecyzyjnych pęset, igieł, kleszczyków, pędzelków i mikroskalpeli (maksymalny rozmiar tkanki powinien wynosić około 1 cm3 lub 2 cm w przypadku materiału płaskiego). Disekcję próbek należy wykonywać w szalce Petriego pokrytej etanolem, aby zapobiec wysychaniu tkanek. Należy użyć szalki Petriego z dnem pokrytym suchym, czarnym silikonem, aby lepiej widzieć kontrastujące białe tkanki.
    2. Umieścić zdisekowany materiał w pojemnikach na próbki do suszarki w punkcie krytycznym (CPD, Rysunek 2a). Na tym etapie zanurzyć pojemniki w szalce Petriego z 70% etanolem i dołączyć etykiety identyfikacyjne próbek (wykonane z papieru i ołówka). Aby uzyskać bardziej efektywne suszenie z myślą o dalszych manipulacjach, należy unikać mieszania młodych i dojrzałych próbek w jednym pojemniku.*
    3. Zakręcić pojemniki i umieścić je w plastikowych probówkach wirówkowych z dużą ilością 70% etanolu. Jeśli materiał nie jest przetwarzany natychmiast, przechowywać probówki przez noc.
    4. Przenieść zdisekowany materiał przez następującą serię etanolu w szczelnych słoikach lub probówkach wirówkowych: 70%, 90%, 100% i 100%. Pozostawić próbki w każdym roztworze przez co najmniej 1 h. Próbki przechowywać przez noc w 100% roztworze etanolu.
    5. Przenieść pojemniki z materiałem do CPD (sekcja 4).
  3. Montowanie i przygotowanie tkanek roślinnych do obserwacji SEM
    1. Zanotować numer identyfikacyjny próbki pod uchwytami do próbek SEM (tj. aluminiowymi stubami). Wierzch stubów pokryć taśmą dwustronną. Umieścić stuby w uchwycie na próbki (Rysunek 2b).
    2. Pod stereomikroskopem ostrożnie otworzyć pojemniki z młodymi i delikatnymi próbkami, które zostały już wysuszone w CPD. Należy pamiętać, że po obróbce w CPD próbki stają się lżejsze i wrażliwe na elektrostatykę. Zamknąć pojemniki po wyjęciu próbek, aby uniknąć dostania się kurzu lub zanieczyszczeń.
    3. Umieścić próbki na lepkej powierzchni stubów, wcześniej planując pożądaną pozycję (po zetknięciu próbki z powierzchnią bardzo trudno jest ją przesunąć). Na tym etapie nie należy przeprowadzać rozległej disekcji; należy jedynie usunąć niepotrzebne fragmenty tkanki, które łatwo usunąć. W badaniach palynologicznych należy zdisekować pylniki i otworzyć je, aby odsłonić pyłek na stubach.
    4. Długie próbki (np. o długości 2 cm), takie jak kwiatostany, ułożyć w pozycji poziomej. Jeśli to możliwe, zorientować próbki tej samej struktury w widoku polarnym, bocznym i dolnym. Pozostawić wystarczający odstęp między próbkami na stubie.
    5. Jeśli próbki nie mogą być przetworzone natychmiast, przechowywać je przez noc w szczelnym pojemniku z żelem krzemionkowym, aby zapobiec rehydratacji (Rysunek 2c)*. Pokryć próbki za pomocą napylacza i przenieść je do SEM (sekcje 5 i 6).

Spiekanie ceramiki eksperymentalnej; schemat sprzętu, uchwyt mikroskopowy, piec, wskaźnik zagęszczenia.
Rysunek 2: Narzędzia do manipulowania i przetwarzania próbek przed obserwacją w SEM. (a) Stalowy pojemnik na próbki z perforowanymi ściankami do wymiany etanolu/CO2 w komorze CPD. (b) Stalowe stuby w plastikowym uchwycie na próbki. (c) Szklany pojemnik służący do ochrony próbek przed wilgocią i kurzem. U podstawy znajduje się przegroda na żel krzemionkowy. (d) Suszarka do punktu krytycznego (CPD). Z przodu znajdują się (od lewej do prawej): manometr, włącznik zasilania, system kontroli temperatury oraz wyświetlacz temperatury. Typowe ciśnienie robocze dla wymiany CO2-etanol wynosi 60 bars (800 psi). Na górze znajdują się cztery zawory (sterowanie wlotem, spustem, wentylacją i wydechem) flankujące centralną komorę na próbki. Zdjęcia wykonali Y. Ruiz-León i M.A. Bello. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Badanie zachowania cyst Saprolegnia (Oomycetes) na różnych powierzchniach

  1. Hodowla i utrwalanie cyst
    1. Przygotować pożywkę peptonowo-glukozową (PG-l)41, używając D-(+)-glukozy (6 g) i peptonu mycologicznego (3 g)*. Dopełnić do 900 mL wodą z kranu i autoklawować przez 40 min w 121 °C. Dodać 50 mL wcześniej autoklawowanego roztworu A (NaH2PO4, 0.13 M) oraz 50 mL roztworu B (Na2HPO4, 0.13 M).
    2. Z kultur szczepów Saprolegnia parasitica utrzymywanych na pożywce peptonowo-glukozowo-agarowej (PGA, przygotowywanej jak PG-l, lecz z dodatkiem 10 g europejskiego agaru bakteriologicznego do glukozy i peptonu przed autoklawowaniem), wyhodować kolonie grzybni w kropelkach 0,5 mL pożywki PG-l przez 24-48 h w 20 °C w szalkach Petriego. Indukować sporulację poprzez trzykrotne przemycie grzybni autoklawowaną wodą z kranu i inkubację przez 15 h w 20 °C42,43.
    3. Zebrać uwolnione wtórne zoospory, delikatnie pipetując górną część zawiesiny, i połączyć je w porcjach 1 mL. Intensywnie wymieszać zoospory przez 30 s za pomocą vortexa, aby doprowadzić do powstania wtórnych cyst44.
    4. Aby przetestować różnicowy wzrost kolców cyst, na oddzielnych szalkach Petriego (p60) nanieść 0,5 mL zawiesiny wtórnych cyst na różne powierzchnie (t.j. węglowe, złote i miedziane siatki TEM; łuski łososia iy hake (wcześniej wybielone); oraz szkiełka nakrywkowe)*. Inkubować cysty w 20 °C przez 70 min, co sprzyja przyleganiu cyst do powierzchni.
    5. Usunąć ciecz i dodać 0,5 mL 2% glutaraldehydu do każdej powierzchni w celu utrwalenia cyst. Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej w dygestorium przez 1 h.
    6. Usunąć glutaraldehyd i odwadniać próbkę w serii etanolu (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% i 100%), dodając po 5 mL każdego roztworu etanolu na 15 min. Po przeniesieniu do ostatniego roztworu 100% etanolu próbkę można przechowywać do miesiąca w szczelnej szalce Petriego. Na tym etapie próbki są gotowe do suszenia w CPD.
    7. Ostrożnie przenieść siatki i łuski z szalki Petriego do uchwytu odpowiedniego dla CPD (Sekcja 4). W tym kroku należy użyć uchwytu do siatek CPD lub kasetowego uchwytu na próbki, które utrzymują próbki oddzielnie od siebie. Przenosić siatki i łuski pęsetą, pamiętając, że cysty na siatkach powinny być przez cały czas skierowane ku górze.*
  2. Montaż i przygotowanie próbek cyst do obserwacji SEM
    1. Zamocować siatki i łuski na aluminiowych stubach, które zostały wcześniej pokryte dwustronną taśmą węglową i opisane od spodu.
    2. Przenieść próbki do napylacza (sekcja 5).
    3. Obserwować próbki pod SEM (sekcja 6).

3. Badanie zarodników grzybów z herbarium Phellorinia herculanea pod SEM

  1. Rehydratacja i dehydratacja zarodników
    1. Każdą próbkę należy ostrożnie owinąć papierem filtrowanym, tworząc koperty o powierzchni ~0,5-1 cm2 z opisami wykonanymi ołówkiem, uważając, aby ich nie zmiażdżyć. Papier filtrowany należy zabezpieczyć spinaczami biurowymi. Spakowane próbki przenieść do szalki Petriego i zanurzyć w 10 mL wody, aby rehydratować tkanki wokół zarodników.
    2. Próbki należy natychmiast umieścić w kuchence mikrofalowej (600 W przez około 20 s). Materiał należy wyjąć w momencie, gdy woda zacznie odparowywać, i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.
    3. Próbki należy przeprowadzić przez następującą serię etanolu: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% oraz 100%. W zależności od liczby próbek, na tym etapie należy użyć zlewki lub probówek do wirowania. Próbki pozostawić w każdym roztworze na 15 min.
    4. Próbki należy przekazać do punktu CPD (sekcja 4).
  2. Montaż i przygotowanie zarodników do obserwacji SEM
    1. Otworzyć koperty. Zarodniki należy wysypać na wcześniej przygotowany stub z dwustronną taśmą klejącą. Alternatywnie można zebrać zarodniki lepką powierzchnią stubów, uważając, aby ich nie zmiażdżyć*.
    2. Jeśli próbki zawierają mało zarodników, oprócz poprzedniego kroku, należy wyciąć mały fragment koperty (~1 mm2) i umieścić go na nowym stubie*.
    3. Tkanki należy umieścić w napylaczu (sekcja 5).
    4. Obserwować pod SEM (sekcja 6).

4. Suszenie materiału przy użyciu suszarki w punkcie krytycznym (CPD, Rysunek 2d)

  1. Używaj urządzenia CPD w wentylowanym pomieszczeniu i upewnij się, że wszystkie zawory maszyny są zamknięte. Sprawdź, czy komora na próbki jest pusta i czysta.
  2. Włącz urządzenie i zweryfikuj, czy test systemu kontroli temperatury odbywa się automatycznie. Jeśli CPD posiada zewnętrzny system łaźni chłodzącej, sprawdź poziom wody przed jego włączeniem.
  3. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta konkretnego modelu CPD w celu wymiany etanolu na CO2 . Ze względów bezpieczeństwa wykonaj ten krok pod nadzorem osoby przeszkolonej w obsłudze urządzenia. Pamiętaj, że jest ono narażone na gwałtowne zmiany ciśnienia, co może doprowadzić do jego gwałtownego wyrzutu.
  4. Wyjmij próbki i przejdź do kroku 1.3 w przypadku pracy z tkankami roślinnymi, do kroku 2.2 w przypadku cyst oomycetes oraz do kroku 3.2 w przypadku zarodników grzybów.

5. Napylanie złota na próbki za pomocą napylacza (Rycina 3a)

  1. Sprawdzić napylacz. Zweryfikować, czy złota tarcza katody jest w dobrym stanie. W razie potrzeby oczyścić ścianki komory próżniowej oraz pokrywę komory za pomocą ściereczki bezpyłowej nasączonej 90% etanolem.
  2. Oznaczyć uchwyt do napylania numerami obok każdego otworu na stuby, aby umożliwić późniejszą identyfikację próbek pod mikroskopem. Ostrożnie umieścić stuby z załadowanymi próbkami i zabezpieczyć je. Aby zapewnić równomierną powłokę na próbkach o nieregularnych powierzchniach, należy zastosować obrotowy stołik planetarny do preparatów.
  3. Zgodnie z instrukcjami producenta ustawić parametry, takie jak odległość robocza (np. 30 mm), ciśnienie gazu roboczego (np. 5 x 10-1 - 7 x 10-1 mbar), czas napylania (np. 50 s), grubość warstwy złota (np. 12 nm), natężenie prądu (np. 15 mA) oraz napięcie zasilania (np. 600 V)45.
  4. Wyjąć stuby i przenieść je do SEM (sekcja 6). Alternatywnie można umieścić stuby w szczelnym pojemniku z żelem krzemionkowym (Rysunek 2c).

Aparat do kriopreparacji (a) oraz zestaw mikroskopu elektronowego (b) do analizy próbek.
Rycina 3: Napylacz (a) i skaningowy mikroskop elektronowy (b). (a) Widok z przodu komory próżniowej (po lewej), zaworu gazowego, timera oraz regulatorów próżni i prądu. (b) Widok z boku głównych komponentów SEM (od lewej do prawej): kolumny próżniowej z komorą na próbkę, ekranu komputera z panelami sterowania oraz monitora komory. Zdjęcia wykonał Y. Ruiz-León. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Obserwacja pod skaningowym mikroskopem elektronowym (SEM, Rycina 3b)

  1. Uruchamianie SEM
    1. Zgodnie z instrukcjami producenta uruchomić i skonfigurować SEM, dostosowując wysokość próbki, średnicę apertury obiektywu (np. 2 µm dla roślin oraz 4 µm dla grzybów i oomycetes) oraz napięcie pracy (np. 15 kV).
    2. Sprawdzić prawidłowe wyrównanie systemu wiązki elektronowej, a następnie ustawić wyrównanie osiowe i stygmatory zgodnie ze wskazówkami producenta. Dostosować odległość roboczą w celu uzyskania odpowiedniej głębi ostrości.
  2. Przechwytywanie obrazu
    1. Uzyskać ostry obraz próbki i potraktować go jako punkt wyjścia. Zwiększyć powiększenie niemal do poziomu maksymalnego i ponownie ustawić ostrość obrazu. Wybrać obszary z nieregularnościami powierzchni, takimi jak otwory. Skorygować astygmatyzm oraz dostosować optymalny kontrast i jasność.
    2. Przechwytać obraz SEM w wysokiej rozdzielczości. W przypadku stwierdzenia na obrazie naładowania próbek zastosować detektor BSE. W przeciwnym razie ustawić detektor SE. Zmieniać detektory zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rozwój kwiatowy i utrwalanie rozwijających się i uformowanych struktur roślinnych

Dzięki protokołowi FAA-CPD opisanemu w tym artykule, młode i dojrzałe tkanki roślinne są optymalnie utrwalane i odwadniane w celu obrazowania w SEM. Procesy takie jak rozwój kwiatów mogą być rekonstruowane, ponieważ topografia i kształt pąków nie są zniekształcone przez kurczenie się komórek (Figury 1b, 1d, 4a-f). Struktury o złożony...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W odniesieniu do standardowych protokołów SEM, przedstawione tutaj procedury obejmują stosunkowo szybkie, łatwe do naśladowania i tanie metodologie. W zależności od ilości próbek i łatwości przetwarzania, uzyskanie dobrej jakości obrazów zajmuje od czterech do pięciu dni. Łącznie z odpowiednimi środkami ostrożności dotyczącymi operacji CPD i SEM, procedury są łatwe w obsłudze. Szczególną ostrożność należy zachować w przypadku formaliny i aldehydu glutarowego (patrz kroki 1.1.1 do 1.1.3 i 2.1.5 protokołu). Istnieją pewne ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 634429. Niniejsza publikacja odzwierciedla jedynie poglądy autora, a Komisja Europejska nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie zawartych w niej informacji. Doceniamy również wkład finansowy wniesiony przez Real Jardín Botánico, CSIC. SR jest wdzięczna Unii Europejskiej [ITN-SAPRO-238550] za wsparcie jej badań w Saprolegni. Pragniemy również podziękować Francisco Calonge za uprzejme dostarczenie zdjęć Phellorinia herculanea oraz B. Pueyo za przetworzenie próbek (ryc. 5). Wszystkie zdjęcia zostały wykonane przez serwis SEM w Real Jardín Botánico-CSIC w Madrycie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyBrak konkretnego dostawcyPodrażnienie skóry, działanie drażniące na oczy
aluminiowe króćceTed Pella, Inc.16221www.tedpella.com
Probówki wirówkoweBrak konkretnego dostawcy
Suszarka punktu krytycznegoPolaron Quatum TechnologiesCPD7501
D-(+)-GlukozaMerck1 083 421 000
Dwustronna taśma do oznaczaniaBrak konkretnego dostawcy
Absolutny etanolBrak konkretnego dostawcyŁatwopalny
europejski agar bakteriologicznyConda1800.00www.condalab.com
Bibuła filtracyjnaBrak konkretnego dostawcy
KleszczeBrak konkretnego dostawcy
Formalina 4%Brak konkretnego dostawcySzkodliwy, toksyczność ostra, działanie uczulające na skórę, rakotwórcze. Szkiełka nakrywkowe łatwopalne
Brak konkretnego dostawcy
Szklany pojemnik hermetyczny Brak konkretnego dostawcy
Aldehyd glutarowy 25% DC 253857.1611  Panie przewodniczący, panie i panowie!Dismadel S.L.3336www.dismadel.com
Pepton mykologicznyConda1922.00
IgłyBrak konkretnego dostawcy
Szalki PetriegoBrak konkretnego dostawcy
Pojemniki plastikoweBrak konkretnego dostawcy
Uchwyt na próbkę z pokrywką  do suszarki w punkcie krytycznym Ted Pella, Inc.4591www.tedpella.com
skalpeleBrak konkretnego dostawcy
Skaningowy mikroskop elektronowyHitachiS3000N
Oprogramowanie do SEM
Rozwiązanie A: NaH2PO4
Rozwiązanie B: Na2HPO4
Uchwyty na próbkiBrak konkretnego dostawcy
Napylarka do napylaniaBalzersSCD 004
Mikroskop stereoskopowyBrak konkretnego dostawcy
Siatki transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)Mikroskopia elektronowa NaukiG200 (siatka kwadratowa)www.emsdiassum.com
PęsetaBrak konkretnego dostawcy
www.condalab.com

Bibliografia

  1. Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
  2. Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
  3. Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
  4. Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
  5. Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
  6. Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
  7. Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
  8. Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
  9. Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
  10. Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
  11. Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
  12. Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
  13. Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
  14. García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
  15. Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
  16. Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
  17. Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
  18. Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
  19. Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
  20. Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
  21. Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
  22. Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
  23. Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
  24. Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
  25. Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
  26. Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
  27. Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
  28. Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
  29. Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
  30. Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
  31. Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
  32. Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
  33. Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
  34. Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
  35. Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
  36. Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
  37. Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
  38. Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
  39. van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
  40. Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
  41. Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
  42. Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
  43. Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
  44. Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
  45. Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
  46. Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
  47. Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

suszarka punktu krytycznegoutrwalacz FAAseria etanolowaprzygotowanie próbekcysty oomycetezarodniki grzybówmerystemy kwiatoweutrwalanie glutaraldehydemnapylanie złotem
Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.