Method Article

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

DOI:

10.3791/55031

⸱

February 3rd, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Biodiversity and Conservation Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 2Research Support Unit, Real Jardín Botánico, CSIC, 3Mycology Department, Real Jardín Botánico, CSIC, 4Division of Glycoscience, AlbaNova University Center, Royal Institute of Technology (KTH)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częste problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) obejmują zapadanie się komórek, obróbkę próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Na przykładzie młodych tkanek kwiatowych, cyst lęgniowców i zarodników grzybów (Agaricales) opisano tutaj konkretne protokoły przetwarzania delikatnych próbek, które przezwyciężają niektóre z głównych wyzwań związanych z obróbką próbek w celu przechwytywania obrazu w ramach SEM.

Merystemy kwiatowe utrwalone za pomocą FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) i przetworzone za pomocą Suszarki Punktu Krytycznego (CPD) nie wykazywały zapadniętych ścian komórkowych ani zniekształconych organów. Wyniki te mają kluczowe znaczenie dla rekonstrukcji rozwoju kwiatów. Podobne traktowanie oparte na CPD próbek z wilgotnych mikrośrodowisk, takich jak torbiele lęgniowców utrwalonych aldehydem glutarowym, jest optymalne do testowania zróżnicowanego wzrostu cech diagnostycznych (np. kolców torbieli) na różnych typach substratów. Uniknięto zniszczenia komórek pielęgniarskich przyczepionych do zarodników grzybów po ponownym nawodnieniu, odwodnieniu i leczeniu CPD, co jest ważnym krokiem dla dalszych badań funkcjonalnych tych komórek.

Opisane tutaj protokoły stanowią tanią i szybką alternatywę dla pozyskiwania obrazów dobrej jakości w celu rekonstrukcji procesów wzrostu i badania cech diagnostycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W biologii, zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) zostało rozszerzone na badania ewolucji strukturalnej, morfologii porównawczej, rozwoju organów i charakterystyki populacji lub gatunków1. Dzięki dwuwymiarowemu spojrzeniu na struktury mikroskopowe, dziedziny takie jak mikromorfologia i systematyka skorzystały z postępów techniki SEM od drugiej połowyXX wieku. Na przykład wprowadzenie metodologii powlekania napylaniem w latach siedemdziesiątych XX wieku umożliwiło obserwacje delikatnych materiałów, takich jak wierzchołki pędów i kwiaty, poprawiając obrazowanie tkanek nieprzewodzących2,3. SEM wykorzystuje elektrony wyrzucone z powierzchni próbki do odtworzenia topografii w środowisku wysokiej próżni4.

Badania z udziałem SEM koncentrują się zarówno na wnioskowaniu o cechach strukturalnych, jak i na rekonstrukcji procesów wzrostu. Na podstawie obserwacji SEM odkryto nowe cechy strukturalne istotne dla taksonomii i systematyki szerokiego zakresu organizmów. Na przykład cechy roślin używane do diagnozowania gatunków lub klasyfikacji ponadgatunkowych, takie jak zagłębione doły drewna5, stigma diversity6, nektarnik i morfologia kwiatów7,8, trichom details9 i ziarna pyłku10,11, nie mogą być prawidłowo zwizualizowane bez SEM. Udane obserwacje za pomocą konwencjonalnego SEM osiągnięto również dla organizmów o długim czasie utrwalanych w formalinie12 i roślinnych okazów zielnikowych13.

Z drugiej strony, badania nad rekonstrukcją procesów wzrostu za pomocą SEM obejmują szeroki zakres tematów, takich jak rozwój narządów14, infekcje wywołane przez bakterie15, fizjologia korzeni roślin16, mechanizmy przyczepiania pasożyta-gospodarza17,18, wpływ leków na pasożyty19, mykopasożytnictwo i antybioza20,21, wady rozwojowe22, porównawczy rozwój dzikich i zmutowanych osobników23, oraz całe cykle życia24. Chociaż środowiskowe skaningowe mikroskopy elektronowe (ESEM)25 mogą mieć istotne zalety w obserwacji mokrych próbek biologicznych w procesach wzrostu, delikatny materiał może być nadal zagrożony nawet w warunkach niskiej próżni ESEM) i muszą być odpowiednio przetwarzane, aby uniknąć utraty cennych obserwacji morfologicznych.

W tym artykule przedstawiono przegląd konkretnych protokołów obserwacji SEM trzech różnych typów próbek: merystemów kwiatowych, lęgniowców (Saprolegnia) i materiału grzybowego. Protokoły te kompilują doświadczenia z naszych poprzednich badań opartych na SEM26,27,28,29,30,31,32,33, w którym stwierdzono szczególne trudności i alternatywne rozwiązania. W przypadku porównawczych badań rozwojowych i strukturalnych roślin, stosowanie SEM rozpoczęło się w latach siedemdziesiątych XX wieku34,35, a od tego czasu naukowcy odkryli, że niektóre cechy kwiatowe są bardziej labilne niż wcześniej sądzono36. Rekonstrukcja rozwoju kwiatowego polega na uchwyceniu wszystkich etapów między młodymi merystemami kwiatowymi a antezą. Aby osiągnąć ten cel, ważne jest, aby topografia próbki i integralność ściany komórkowej nie zostały naruszone po utrwaleniu, a następnie odwodnieniu. Młode merystemy kwiatowe są szczególnie podatne na zapadanie się ściany komórkowej (ryc. 1a, 1b). Podobnie, delikatne struktury, takie jak nektarniki, płatki, znamiona i sporangia, wymagają skutecznych i nieuszkadzających protokołów. Niniejszy przegląd podsumowuje optymalny protokół utrzymywania młodych i delikatnych tkanek w stanie nienaruszonym do obrazowania SEM.

W przypadku lęgniowców (Stramenopiles) - jednej z najbardziej zróżnicowanych i rozpowszechnionych grup pasożytów, z żywicielami od mikrobów i roślin po bezkręgowce i kręgowce37- istnieją zarodniki, które rosną i rozwijają się w wilgotnym środowisku. Warunek ten stanowi wyzwanie dla obserwacji SEM, ponieważ zarodniki potrzebują odpowiedniego podłoża, które nie jest odpowiednie dla standardowych protokołów SEM. Wśród lęgniowców szczególnie interesujące są gatunki Saprolegnia, ponieważ mogą powodować poważne redukcje w akwakulturach, rybołówstwie i populacjach38. Cechy mikromorfologiczne, takie jak haczykowate kolce torbieli, okazały się przydatne do identyfikacji gatunków Saprolegnia, co ma fundamentalne znaczenie dla ustalenia kontroli infekcji i potencjalnych metod leczenia39. W tym przypadku istnieje protokół eksperymentalny do porównywania wzorców wzrostu torbieli kręgosłupa na różnych podłożach i manipulowania próbką w celu przygotowania do suszenia punktu krytycznego (CPD) i późniejszej obserwacji SEM.

W trzecim przypadku, interesujące wyniki uzyskano po zbadaniu zarodników grzybów Phellorinia herculanea f. stellata f. nova (Agaricales)31. Wraz z zarodnikami w ramach SEM zidentyfikowano grupę nieoczekiwanych komórek żłobkowych. Przy poprzednich tradycyjnych protokołach i nieleczonym materiale, komórki pielęgniarskie wyszły całkowicie zapadnięte (ryc. 1c). Dalsze wnioski na temat poszczególnych tkanek związanych z zarodnikami można wyciągnąć za pomocą prostych, ale kluczowych modyfikacji standardowych podejść opisanych tutaj (Figura 1d).

W tym przeglądzie znajdują się szczegółowe protokoły SEM, które mogą być używane do radzenia sobie z różnymi problemami związanymi z obserwacją SEM u roślin okrytozalążkowych, lęgniowców i agaricales, takich jak zapadanie się komórek i kurczenie się tkanki merystematycznej, nieoptymalny wzrost kolców torbieli i niszczenie efemerycznych tkanek.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Porównanie próbek poddanych działaniu bez (a, c) i z (b, d) protokołu FAA-etanol-CPD. lit. a-b) Pąki kwiatowe Anacyclus clavatus, w połowie rozwoju. Pączek potraktowany tetroksydkiem osmu46 (a) i pączek potraktowany protokołem FAA-CPD (b). (c-d) Komórki pielęgniarskie z zarodnikami Phellorinia herculanea f. stellata. Suszone próbki bez żadnej obróbki (c) i z protokołem opisanym tutaj dla Agaricales (d). Zarodniki w kolorze pomarańczowym. Skale: (a-b) 100 μm, (c-d) 50 μm. Autorem zdjęć jest Y. Ruiz-León. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół zawiera sześć głównych sekcji, trzy poświęcone konkretnym organizmom (sekcje 1-3) i trzy opisujące procedury wspólne dla wszystkich (4-6). Gwiazdki (*) wskazują kroki zmodyfikowane przez eksperymentatorów.

1. Badania rozwijających się i w pełni ukształtowanych struktur roślinnych

  1. Zbieranie i utrwalanie
    1. Jeśli materiał roślinny jest zbierany w miejscu bez dostępu do dygestoriów, należy wprowadzić i zanurzyć materiał w 70% etanolu w probówkach wirówkowych. Najlepiej zanurzyć materiał po 48 godzinach w FAA (kroki 1.1.1-1.1.3), aby uniknąć nadmiernego odwodnienia etanolu. Jeśli dygestorium jest dostępne dla materiału roślinnego, zignoruj ten krok i przejdź do 1.1.1.
    2. Przygotować utrwalacz formalina-alkohol octowy (FAA) w dygestorium wyposażonym w filtr aldehydowy. Dodaj 85 części 70% denaturowanego etanolu, 10 części 60% roztworu formaldehydu i 5 części lodowatego kwasu octowego. Przygotuj FAA tuż przed zamocowaniem materiału, ponieważ jego długotrwałe przechowywanie nie jest zalecane40.
    3. Pod dygestoriami wlej zapas FAA do pojedynczych plastikowych butelek z szerokim otworem i szczelnych. Użyj tylu butelek, ile jest dostępnych próbek, i utwórz etykiety do identyfikacji próbek.
    4. Wybierz merystemy kwiatowe lub wegetatywne do zamocowania, upewniając się, że nie zostaną uszkodzone przez owady, grzyby lub ekstremalne warunki pogodowe. Odetnij gałęzie, usuwając niechciany materiał, i natychmiast umieść próbkę w roztworze FAA.
    5. Po 72-96 godzinach wlej FAA do plastikowego pojemnika w celu utylizacji chemicznej. Natychmiast umyj próbki trzykrotnie świeżym 70% etanolem, aby usunąć wszelkie pozostałości FAA. Materiał stały może być przechowywany w nieskończoność w 70% etanolu.
  2. Rozwarstwienie i odwodnienie
    1. Wypreparuj utrwalony materiał w 70% etanolu pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą ultracienkiej pęsety, igieł, kleszczy, szczoteczek i mikroskalpeli (maksymalny rozmiar tkanki powinien wynosić około 1 cm3 lub 2 cm w przypadku płaskiego materiału). Rozciąć próbki na szalkę Petriego pokrytą etanolem, aby zapobiec wysuszeniu tkanek. Użyj szalki Petriego z podstawą pokrytą suchym czarnym silikonem, aby lepiej zobaczyć kontrastujące białe tkanki.
    2. Wypreparowany materiał należy umieścić w pojemnikach na próbki do suszarki w punkcie krytycznym (CPD, rysunek 2a). W tym momencie zanurz pojemniki w szalce Petriego z 70% etanolem i dołącz etykiety identyfikacyjne próbki (wykonane z papieru i ołówka). Aby uzyskać bardziej efektywne suszenie w celu dalszej manipulacji, należy unikać mieszania młodych i dojrzałych próbek w tym samym pojemniku.*
    3. Załóż pokrywki na pojemniki i umieść je w plastikowych probówkach wirówkowych z dużą ilością 70% etanolu. Przechowuj probówki przez noc, jeśli materiał nie zostanie natychmiast przetworzony.
    4. Przeprowadź wypreparowany materiał przez następujące serie etanolu w hermetycznych słoikach lub probówkach wirówkowych: 70%, 90%, 100% i 100%. Pozostawić próbki w każdym roztworze na co najmniej 1 godzinę. Próbki należy przechowywać przez noc w roztworze 100% etanolu.
    5. Przenieść pojemniki z materiałem do CPD (sekcja 4).
  3. Montaż i przygotowanie tkanek roślinnych do obserwacji SEM
    1. Wpisz numer identyfikacyjny próbki pod uchwytami na próbki SEM (tj. aluminiowymi króćcami). Przykryj górną część odcinków taśmą dwustronną. Umieść klocki w uchwycie na próbki (Rysunek 2b).
    2. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie otworzyć pojemniki z młodymi i delikatnymi próbkami już wysuszonymi w CPD. Należy pamiętać, że po zabiegu CPD próbki stają się lżejsze i wrażliwe na elektrostatykę. Po wyjęciu próbek należy zamknąć pojemniki, aby uniknąć kurzu lub zanieczyszczeń.
    3. Umieść próbki na lepkiej powierzchni kikutów, planując z wyprzedzeniem żądaną pozycję (gdy próbki dotkną powierzchni, bardzo trudno jest je usunąć). Nie próbuj w tym momencie przeprowadzać poważnej sekcji; Po prostu usuń niechcianą tkankę, którą łatwo jest zebrać. W przypadku badań palinologicznych należy wypreparować pylniki i otworzyć je, aby odsłonić pyłek na pniakach.
    4. Długie próbki (np. o długości 2 cm), takie jak kwiatostany, należy umieścić w pozycji poziomej. Jeśli to możliwe, zorientuj próbki o tej samej strukturze dla widoków biegunowych, bocznych i dolnych. Pozostaw wystarczająco dużo miejsca między próbkami na króćcu.
    5. Jeśli próbki nie mogą być natychmiast przetworzone, należy je chronić przez noc w hermetycznym pojemniku z żelem krzemionkowym, aby uniknąć ponownego uwodnienia (rysunek 2c)*. Próbki należy pokryć za pomocą powlekarki napylającej i przenieść je do SEM (sekcje 5 i 6).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Narzędzia do manipulacji i przetwarzania próbek przed obserwacją SEM. a) Wykonany ze stali pojemnik na próbki z otworami do wymiany etanolu/CO2 w komorze CPD. b) Stalowe króćce w plastikowym uchwycie na próbki. c) Szklany pojemnik używany do ochrony próbek przed wilgocią i kurzem. U podstawy znajduje się komora na żel krzemionkowy. (d) Suszarka z punktem krytycznym. Z przodu znajduje się (od lewej do prawej) manometr, wyłącznik zasilania, system kontroli temperatury i wyświetlacz temperatury. Zwykłe ciśnienie robocze dla wymiany CO2-etanolu wynosi 60 barów (800 psi). W górnej części znajdują się cztery zawory (wlotowy, spustowy, wentylacyjny i wywiewny) flankujące centralną komorę na próbki. Zdjęcia wykonali Y. Ruiz-León i M.A. Bello. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Badanie zachowania torbieli u saprolegni (lęgniowców) na różnych powierzchniach

  1. Uprawa i naprawianie torbieli
    1. Przygotuj pożywkę z peptonem i glukozą (PG-l)41 używając D-(+)-glukozy (6 g) i peptonu mykologicznego (3 g)*. Dodać do 900 ml wody z kranu i sterylizować w autoklawie przez 40 minut w temperaturze 121 °C. Wlać 50 ml uprzednio autoklawizowanego roztworu A (NaH2PO4, 0,13 M) i 50 ml roztworu B (Na2HPO4, 0,13 M).
    2. Z kultur podstawowych szczepów Saprolegnia parasitica utrzymywanych na peptonie, glukozie, pożywce agarowej (PGA, który jest przygotowywany jako PG-l, ale dodaje 10 g europejskiego agaru bakteriologicznego do glukozy i peptonu przed autoklawem), hoduj kolonie grzybni w 0,5 ml kropelek PG-l przez 24-48 godzin w temperaturze 20 °C na szalkach Petriego. Indukuj zarodnikowanie poprzez trzykrotne przemycie grzybni autoklawowaną wodą z kranu i inkubowanie ich przez 15 godzin w temperaturze 20 °C42,43.
    3. Zebrać uwolnione wtórne zoospory, delikatnie pipetując górną część zawiesiny i zebrać je w porcje o objętości 1 ml. Energicznie mieszaj zoospory przez 30 sekund przez wirowanie, aby wytworzyć wtórne torbiele44.
    4. Aby przetestować zróżnicowany wzrost kolców torbieli, na oddzielnych szalkach Petriego (p60) umieść 0,5 ml wtórnej zawiesiny torbieli na różnych powierzchniach (tj. węglowych, złotych i miedzianych siatkach TEM, łuskach łososia i morszczuka (wcześniej bielonych) i szklanych szkiełkach nakrywkowych)*. Inkubować cysty w temperaturze 20 °C przez 70 minut, co sprzyja przyczepianiu się cyst do powierzchni.
    5. Usuń płyn i dodaj 0,5 ml 2% aldehydu glutarowego do każdej powierzchni w celu utrwalenia torbieli. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej w dygestorium przez 1 godzinę.
    6. Usunąć aldehyd glutarowy i odwodnić próbkę za pomocą szeregu etanolu (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% i 100%), dodając 5 ml każdego roztworu etanolu przez 15 minut. Po umieszczeniu w ostatnim roztworze 100% etanolu próbka może być przechowywana przez okres do miesiąca na szczelnie zamkniętej szalce Petriego. Na tym etapie próbki są gotowe do wysuszenia w CPD.
    7. Ostrożnie przenieść kratki i łuski z szalki Petriego do uchwytu odpowiedniego dla CPD (sekcja 4). Na tym etapie należy użyć uchwytu siatki CPD lub uchwytu na próbki do układania w stosy, które utrzymują próbki oddzielnie od siebie. Weź siatki i łuski za pomocą pęsety, pamiętając, że torbiele powinny być cały czas skierowane do góry na siatkach.*
  2. Montaż i przygotowanie próbek torbieli do obserwacji SEM
    1. Zamontuj kratki i wagi na aluminiowych króćcach, które wcześniej były pokryte dwustronną taśmą węglową i oznaczone poniżej.
    2. Przenieść próbki do urządzenia do napylania (sekcja 5).
    3. Przestrzegać próbek w ramach SEM (sekcja 6).

3. Badanie zarodników grzybów zielnikowych Phellorinia herculanea w ramach SEM

  1. Rehydratacja i odwodnienie zarodników
    1. Każdą próbkę należy starannie owinąć bibułą filtracyjną, tworząc koperty oznaczone ołówkiem ~0,5-1 cm2, uważając, aby ich nie zgnieść. Uszczelnij bibułę filtracyjną spinaczami do papieru. Przenieś zapakowane próbki na szalkę Petriego i zanurz je w 10 ml wody w celu nawodnienia tkanek wokół zarodników.
    2. Natychmiast umieść próbki w kuchence mikrofalowej (600 W na około 20 s). Usuń materiał, gdy woda zacznie parować i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej.
    3. Przepuścić próbki przez następujące serie etanolu: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% i 100%. W zależności od ilości próbek do tego etapu należy użyć zlewki lub probówek wirówkowych. Pozostawić próbki na 15 minut w każdym roztworze.
    4. Umieścić próbki w CPD (sekcja 4).
  2. Montowanie i przygotowanie zarodników do obserwacji SEM
    1. Otwórz koperty. Zarodniki wylać na wcześniej przygotowany kikut za pomocą taśmy dwustronnej. Alternatywnie, zbierz zarodniki lepką powierzchnią kikutów, uważając, aby ich nie zmiażdżyć*.
    2. Jeśli próbki zawierają niewiele zarodników, oprócz poprzedniego etapu, odetnij mały kawałek koperty (~1 mm2) i umieść go na nowym kikutku*.
    3. Umieścić chusteczki w powlekarce napylającej (sekcja 5).
    4. Przestrzegać w SEM (sekcja 6).

4. Suszenie materiału za pomocą suszarki punktu krytycznego (CPD, rysunek 2d)

  1. Używaj CPD w wentylowanym miejscu i sprawdź, czy wszystkie zawory maszyny są zamknięte. Sprawdź, czy komora na próbkę jest pusta i czysta.
  2. Włącz maszynę i sprawdź, czy test systemu kontroli temperatury odbywa się automatycznie. Jeśli CPD jest wyposażony w zewnętrzny system kąpieli chłodniczej, przed włączeniem sprawdź poziom wody.
  3. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi konkretnego CPD używanego do wymiany etanolu i CO2 . Ze względów bezpieczeństwa wykonaj ten krok pod nadzorem osoby przeszkolonej w zakresie obsługi maszyny. Pamiętaj, że jest narażony na gwałtowne zmiany ciśnienia, może gwałtownie wybuchnąć.
  4. Wyjmij próbki i przejdź do kroku 1.3 w przypadku pracy z tkankami roślinnymi, kroku 2.2 w przypadku pracy z cystami lęgniowców i kroku 3.2 w przypadku pracy z zarodnikami grzybów.

5. Powlekanie próbek złotem za pomocą napylarki (Rysunek 3a)

  1. Sprawdź powlekarkę napylającą. Sprawdź, czy tarcza ze złotą katodą jest w dobrym stanie. Użyj niestrzępiącej się szmatki nasączonej 90% etanolem, aby wyczyścić ściany komory próżniowej i pokrywę komory, jeśli to konieczne.
  2. Oznacz uchwyt napylacza numerami obok każdego króćca w celu dalszej identyfikacji próbek pod mikroskopem. Ostrożnie umieść kikuty załadowane próbkami i zabezpiecz je. Użyj obrotowego stolika planetarnego na próbki, aby zapewnić jednolitą powłokę na próbkach o nieregularnych powierzchniach.
  3. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby dostosować ustawienia, takie jak odległość robocza (np. 30 mm), ciśnienie gazu roboczego (np. 5 x 10-1 - 7 x 10-1 mbar), czas rozpylania (np. 50 s), grubość warstwy złota (np. 12 nm), prąd (np. 15 mA) i napięcie zasilania (np. 600 V)45.
  4. Usuń kikuty i zanieś je do SEM (sekcja 6). Alternatywnie umieść kikuty w szczelnie zamkniętym pojemniku z żelem krzemionkowym (Rysunek 2c).

figure-protocol-2
Rysunek 3: Powlekarka napylająca (a) i skaningowy mikroskop elektronowy (b). (a) Widok z przodu komory próżniowej (po lewej), zawór gazowy, timer, podciśnienie i regulatory prądu. b) Widok z boku głównych elementów SEM (od lewej do prawej): kolumna próżniowa z komorą na próbkę, ekran komputera z elementami sterującymi i monitor komory. Autorem zdjęć jest Y. Ruiz-León. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Obserwacja pod skaningowym mikroskopem elektronowym (SEM, Rysunek 3b)

  1. Uruchamianie SEM
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uruchomić i ustawić SEM, dostosowując wysokość próbki, średnicę otworu obiektywu (np. dla roślin 2 μm, a dla grzybów i lęgniowców 4 μm), napięcie robocze (np. 15 kV).
    2. Sprawdź prawidłowe ustawienie układu wiązki elektronów i ustaw wyrównanie osiowe oraz stygmatory zgodnie ze wskazaniami producenta. Dostosuj odległość roboczą w celu uzyskania odpowiedniej głębi ostrości.
  2. Przechwytywanie obrazu
    1. Uzyskaj skoncentrowany obraz próbki i użyj go jako punktu wyjścia. Zwiększ powiększenie blisko maksymalnego poziomu i ponownie ustaw ostrość obrazu. Wybierz obszary z nierównościami powierzchni, takie jak otwory. Skoryguj astygmatyzm i dostosuj optymalny kontrast i jasność.
    2. Przechwyć obraz SEM w wysokiej rozdzielczości. Należy użyć detektora BSE, jeśli obraz pokazuje, że próbki są naładowane. W przeciwnym razie ustaw detektor SE. Wymień detektory zgodnie z instrukcjami producenta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój kwiatów i utrwalanie rozwijających się i w pełni ukształtowanych struktur roślinnych

Korzystając z opisanego tutaj protokołu FAA-CPD, młode i dojrzałe tkanki roślinne są optymalnie utrwalane i odwadniane do obrazowania SEM. Procesy takie jak rozwój kwiatów można zrekonstruować, ponieważ topografia i kształt pąków nie są zniekształcone przez kurczenie się komórek (ryc. 1b, 1d, 4a-f). Konstrukcje o skomplikow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W odniesieniu do standardowych protokołów SEM, przedstawione tutaj procedury obejmują stosunkowo szybkie, łatwe do naśladowania i tanie metodologie. W zależności od ilości próbek i łatwości przetwarzania, uzyskanie dobrej jakości obrazów zajmuje od czterech do pięciu dni. Łącznie z odpowiednimi środkami ostrożności dotyczącymi operacji CPD i SEM, procedury są łatwe w obsłudze. Szczególną ostrożność należy zachować w przypadku formaliny i aldehydu glutarowego (patrz kroki 1.1.1 do 1.1.3 i 2.1.5 protokołu). Istnieją pewne ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 634429. Niniejsza publikacja odzwierciedla jedynie poglądy autora, a Komisja Europejska nie ponosi odpowiedzialności za jakiekolwiek wykorzystanie zawartych w niej informacji. Doceniamy również wkład finansowy wniesiony przez Real Jardín Botánico, CSIC. SR jest wdzięczna Unii Europejskiej [ITN-SAPRO-238550] za wsparcie jej badań w Saprolegni. Pragniemy również podziękować Francisco Calonge za uprzejme dostarczenie zdjęć Phellorinia herculanea oraz B. Pueyo za przetworzenie próbek (ryc. 5). Wszystkie zdjęcia zostały wykonane przez serwis SEM w Real Jardín Botánico-CSIC w Madrycie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas octowyBrak konkretnego dostawcyPodrażnienie skóry, działanie drażniące na oczy
aluminiowe króćceTed Pella, Inc.16221www.tedpella.com
Probówki wirówkoweBrak konkretnego dostawcy
Suszarka punktu krytycznegoPolaron Quatum TechnologiesCPD7501
D-(+)-GlukozaMerck1 083 421 000
Dwustronna taśma do oznaczaniaBrak konkretnego dostawcy
Absolutny etanolBrak konkretnego dostawcyŁatwopalny
europejski agar bakteriologicznyConda1800.00www.condalab.com
Bibuła filtracyjnaBrak konkretnego dostawcy
KleszczeBrak konkretnego dostawcy
Formalina 4%Brak konkretnego dostawcySzkodliwy, toksyczność ostra, działanie uczulające na skórę, rakotwórcze. Szkiełka nakrywkowe łatwopalne
Brak konkretnego dostawcy
Szklany pojemnik hermetyczny Brak konkretnego dostawcy
Aldehyd glutarowy 25% DC 253857.1611  Panie przewodniczący, panie i panowie!Dismadel S.L.3336www.dismadel.com
Pepton mykologicznyConda1922.00
IgłyBrak konkretnego dostawcy
Szalki PetriegoBrak konkretnego dostawcy
Pojemniki plastikoweBrak konkretnego dostawcy
Uchwyt na próbkę z pokrywką  do suszarki w punkcie krytycznym Ted Pella, Inc.4591www.tedpella.com
skalpeleBrak konkretnego dostawcy
Skaningowy mikroskop elektronowyHitachiS3000N
Oprogramowanie do SEM
Rozwiązanie A: NaH2PO4
Rozwiązanie B: Na2HPO4
Uchwyty na próbkiBrak konkretnego dostawcy
Napylarka do napylaniaBalzersSCD 004
Mikroskop stereoskopowyBrak konkretnego dostawcy
Siatki transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)Mikroskopia elektronowa NaukiG200 (siatka kwadratowa)www.emsdiassum.com
PęsetaBrak konkretnego dostawcy
www.condalab.com

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
  2. Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
  3. Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
  4. Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
  5. Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
  6. Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
  7. Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
  8. Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
  9. Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
  10. Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
  11. Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
  12. Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
  13. Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
  14. García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
  15. Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
  16. Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
  17. Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
  18. Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
  19. Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
  20. Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
  21. Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
  22. Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
  23. Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
  24. Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
  25. Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
  26. Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
  27. Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
  28. Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
  29. Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
  30. Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
  31. Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
  32. Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
  33. Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
  34. Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
  35. Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
  36. Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
  37. Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
  38. Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
  39. van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
  40. Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
  41. Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
  42. Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
  43. Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
  44. Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
  45. Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
  46. Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
  47. Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Scanning Electron MicroscopyCritical Point DryerFAA FixativeEthanol SeriesSample PreparationOomycete CystsFungal SporesFloral MeristemsGlutaraldehyde FixationGold Coating

Related Articles