Kolekcja pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi myszy bez surowicy i karmy dla podejścia bezkomórkowego

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia metodę pobierania pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) pochodzących z surowicy (płodowej surowicy bydlęcej, FBS) i karmowiska (mysie fibroblasty embrionalne, MEFs) dla podejścia wolnego od komórek. Może mieć zastosowanie w leczeniu starzenia się i chorób związanych ze starzeniem się.

Streszczenie

Zdolność embrionalnych komórek macierzystych (ESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do generowania różnych typów komórek otworzyła nowe możliwości w dziedzinie medycyny regeneracyjnej. Jednak pomimo korzyści, jakie płyną przeciwko nim, potencjał rakotwórczy ESC i iPSC od dawna stanowi barierę dla zastosowań klinicznych. Co ciekawe, wykazano, że ESC wytwarzają kilka rozpuszczalnych czynników, które mogą promować regenerację tkanek i opóźniać starzenie się komórek, co sugeruje, że ESC i iPSC mogą być również wykorzystywane jako metoda interwencji bezkomórkowej. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na metodę pobierania pożywki kondycjonowanej mysimi embrionalnymi komórkami macierzystymi (mESC) przy minimalnym zanieczyszczeniu składników surowicy (płodowa surowica bydlęca, FBS) i komórek żywicielskich (mysie fibroblasty zarodkowe, MEF). W tym miejscu niniejsze badanie demonstruje zoptymalizowaną metodę zbierania mESC-CM w warunkach wolnych od surowicy i karmowicy oraz charakterystyki mESC-CM przy użyciu wielokrotnych odczytów związanych ze starzeniem. Protokół ten zapewni metodę zbierania czystych czynników wydzielniczych specyficznych dla mESC bez zanieczyszczenia surowicy i karmowicy.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest zebranie pożywki kondycjonowanej przez embrionalne komórki macierzyste myszy (mESC-CM) z hodowli wolnej od surowicy i karmy oraz scharakteryzowanie jej funkcji biologicznych.

Ogólnie rzecz biorąc, embrionalne komórki macierzyste (ESC) mają duży potencjał dla medycyny regeneracyjnej i terapii komórkowej ze względu na ich pluripotencję i zdolność do samoodnawiania^1-3. Jednak bezpośredni przeszczep komórek macierzystych ma kilka ograniczeń, takich jak odrzucenie immunologiczne i powstawanie guza^4,5. W związku z tym podejście bezkomórkowe może stanowić alternatywną strategię terapeutyczną dla medycyny regeneracyjnej i interwencji związanych ze starzeniem^{się 6,7}.

Starzenie się jest postrzegane jako komórkowy odpowiednik starzenia się tkanek i organów, charakteryzujący się ciągłym stanem zatrzymania wzrostu, zmienioną fizjologią komórki i zachowaniami. Starzenie się jest głównym czynnikiem ryzyka powszechnych chorób, w tym raka, chorób układu krążenia, cukrzycy typu 2 i neurodegeneracji⁸. Jedną z oczywistych cech starzenia się jest spadek potencjału regeneracyjnego tkanek, który jest spowodowany starzeniem się i wyczerpaniem komórek macierzystych⁹. Wiele znaczących badań wykazało, że cząsteczki farmakologiczne, takie jak rapamycyna⁹, resweratrol¹⁰ i metformina¹¹, oraz czynniki ogólnoustrojowe przenoszone przez krew, a mianowicie GDF11¹², mają zdolność konsekwentnego opóźniania starzenia się i wydłużania życia.

W obecnym badaniu, mESC-CM został pobrany bez warstwy surowicy (płodowa surowica bydlęca, FBS) i feedera (mysie fibroblasty embrionalne, MEF), aby wykluczyć zanieczyszczenie czynników surowicy i czynników wydzielniczych z MEF. Warunki te pozwoliły na uzyskanie CM wolnego od surowicy i karmy, co w konsekwencji umożliwiło dokładną identyfikację czynników wydzielniczych specyficznych dla mESC.

Ten proponowany protokół jest bardzo wydajny, stosunkowo opłacalny i łatwy w obsłudze. Technika ta zapewnia wgląd w charakterystykę rozpuszczalnych czynników pochodzących z mESC, które mogą pośredniczyć w efekcie przeciwstarzeniowym, co może być wykorzystane do opracowania bezpiecznego i potencjalnie korzystnego podejścia terapeutycznego bez komórek w kierunku interwencji w przypadku chorób związanych ze starzeniem się i innych zabiegów regeneracyjnych.

Protokół

UWAGA: Schemat protokołu pobierania CM bez surowicy i karmowicy pokazano na rysunku 1.

1. Materiały (Przygotowanie MEF-ów, Podłoża, Płytek i Roztworów)

1. Przygotować 500 ml pożywki do hodowli MEF. Uzupełnij zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM) w 10% FBS (jakość ESC), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 mg/ml streptomycyny.
2. Wyizolować MEF od zarodków zgodnie z ustalonym rutynowym protokołem¹³ i utrzymać je w pożywce MEF.
3. Przygotować 500 ml pożywki do hodowli mESC. DMEM jest uzupełniony o 15% FBS i 2 mM L-glutaminę, 100 μM aminokwasów endogennych (NEAA), 100 μM β-merkaptoetanol, 100 jednostek/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 50 jednostek/ml penicyliny i 50 mg/ml streptomycyny.
4. Przygotować zżelowane płytki (5 płytek żelatynizowanych/1 płytka mESC), pokrywając 10 cm szalki do hodowli komórkowych 5 ml 0,1% roztworu żelatyny. Inkubować przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przygotuj 500 ml zredukowanej pożywki surowicy, aby uzyskać stan wolny od surowicy. Uzupełnij zredukowaną pożywkę w surowicy 1,2 g wodorowęglanu sodu (pH 7,0). Przefiltruj przez filtr butelkowy 0,2 μm.
6. Przygotować roztwór barwiący β-galaktozydazę (SA β-gal) związany ze starzeniem się do wykrywania komórek starczych: 1 mg/ml X-gal (rozpuszczony w dimetyloformamidzie, DMF), 40 mM bufor kwasu cytrynowego/fosforanu sodu (pH 6,0), 5 mM żelazocyjanku potasu, 5 mM żelazocyjanku potasu, 150 mM NaCl i 2 mM MgCl₂¹⁴,
   UWAGA: (Niebezpieczne) DMF jest roztworem toksycznym i. Podczas pracy z roztworem należy nosić osobistą odzież ochronną (np. rękawice nitrylowe lub lateksowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). Użyj dygestorium.
7. Przygotować 500 ml pożywki do hodowli ludzkich fibroblastów skóry (HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast). Uzupełnij DMEM o 10% FBS i 100 jednostek/ml penicyliny oraz 100 mg/ml streptomycyny.

2. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (Rysunek 1A i 2A)

UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w biologicznym kapturze bezpieczeństwa do hodowli komórkowej.

1. Poddać MEF działaniu 20 ml pożywki MEF zawierającej 10 μg/ml mitomycyny C w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Zassać pożywkę z MEF-ów. Umyj komórki trzykrotnie PBS. Dodać 3 ml trypsyny-EDTA (TE, 1x) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po 3 minutach zneutralizować TE 6 ml pożywki MEF i odwirowywać przez 3 minuty przy 300 x g.
3. Zawiesić w 5 ml pożywki MEF. Określ liczbę komórek w powstałej zawiesinie komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru. Płytka inaktywowana MEF (podajnik) o gęstości 2 x 10⁶ komórek na 10-centymetrowe naczynie do hodowli komórkowej w pożywce MEF. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Wymień pożywkę MEF na pożywkę mESC 24 godziny po poszyciu podajnika (następnego dnia).
5. Płytkę mESC (G4 F1 hybrid ES cell) o gęstości 2 x 10⁶ komórek na pożywce mESC. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   UWAGA: Działanie przeciwstarzeniowe mESC-CM jest prawdopodobnie silniejsze, gdy stosuje się mESC o niższej liczbie pasaży^15-17. Zakupiono linię mESC G4 od dr Andrasa Nagya w Instytucie Badawczym Lunenfeld-Tanenbaum, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada.
6. Utrzymuj komórki w stosunkowo dużej gęstości i pasażu w stanie sub-konfluencji 70-80%. Codziennie zastępować pożywkę świeżą pożywką z mESC.

3. Zbiór pożywki kondycjonowanej bez surowicy i karmy (Rysunek 1B i 2B)

UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności w biologicznym kapturze bezpieczeństwa do hodowli komórkowej.

1. Przepłukać płytkę mESC 5 ml PBS. Dodać 1 ml TE (2,5x) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po 3 minutach zneutralizować TE za pomocą 2 ml pożywki mESC i odwirować przez 3 minuty przy 300 x g.
2. Zawiesić w 5 ml pożywki mESC i rozlać 1 ml do każdego naczynia hodowlanego pokrytego żelatyną (5 płytek żelatynizowanych/1 płytka mESC) w pożywce mESC. Hodowla w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 aż} do osiągnięcia 80-85% konfluencji.
3. Przemyć mESC wystarczającą ilością PBS, aby pokryć komórki (8 ml na płytkę o średnicy 10 cm) przez 10 minut na płukanie, w sumie trzy płukania. Inkubować w zredukowanym podłożu surowicy przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   UWAGA: Etap mycia jest ważny, aby zapobiec zanieczyszczeniu FBS. Ważne jest, aby przestrzegać czasu inkubacji^18,19.
4. Zebrać mESC-CM do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przez 20 minut przy 2 500 x g. Zebrać roztwór sklarowanego osadu (CM) po odwirowaniu. Przefiltruj przez filtr butelkowy 0,2 μm.

4. Efekty działania pożywki kondycjonowanej komórkami macierzystymi embrionalnymi myszy (mESC-CM)

UWAGA: Efekty mESC-CM zwalidowano kilkoma metodami, takimi jak test SA β-gal, analiza cyklu komórkowego i qRT-PCR.

1. Test SA β-gal (rysunek 3A)
   1. Wysiewaj HDF o gęstości 2 x 10⁴ komórki na basenie na płytkach 6-dołkowych w pożywce HDF. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Po całonocnej inkubacji należy wyrzucić połowę pożywki HDF i dodać mESC-CM oraz pożywkę kontrolną. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Pożywka kontrolna jest otrzymywana z pożywki wolnej od surowicy (Reduced Serum Media) w naczyniu pokrytym żelatyną w przypadku braku mESC.
   3. Przemyć komórki wystarczającą ilością PBS, aby przykryć komórki (2 ml na płytkę 6-dołkową) przez 30 sekund na pranie, w sumie dwa przemycia. Dodaj 3,7% paraformaldehydu (PFA) do utrwalenia. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: (Niebezpieczny) Paraformaldehyd jest roztworem toksycznym i. Podczas pracy z roztworem należy nosić osobistą odzież ochronną (np. rękawice nitrylowe lub lateksowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). Użyj dygestorium.
   4. Zassać roztwór utrwalający. Przemyć utrwalone komórki dwukrotnie PBS, jak opisano w kroku 4.1.3.
   5. Dodać roztwór barwiący SA β-gal (1-2 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej). Inkubować przez 17,5 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nie należy go inkubować w inkubatorze CO_{2 .}
   6. Zassać roztwór barwiący SA β-gal i dwukrotnie przemyć komórki PBS, jak opisano w kroku 4.1.3.
   7. Dodaj roztwór Eozyny do barwienia przeciwdziałającego. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyć komórki dwukrotnie PBS, jak opisano w kroku 4.1.3.
   8. Obrazuj komórki w 100-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu świetlnego i rejestruj obrazy za pomocą dołączonej kamery cyfrowej w celu późniejszej analizy.
      UWAGA: Całkowitą liczbę komórek można policzyć w sposób ślepy i można obliczyć procent dodatnich niebieskich komórek SA β-gal.
2. Analiza cyklu komórkowego (rysunek 3B)
   1. Wysiewać HDF o gęstości 8 x 10⁴ komórki na studzienkę w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 6 cm w pożywce HDF. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. Po całonocnej inkubacji należy wyrzucić połowę pożywki HDF i dodać mESC-CM oraz pożywkę kontrolną. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   3. Trypsynizować komórki, jak opisano krok w ppkt 3.1, i odwirowywać przez 5 minut przy 300 x g. Przemyć komórki zimnym roztworem PBS (PBS z 0,5 mM CaCl₂ i 2% FBS, 1 ml na probówkę 1,5 ml) dwa razy i wirować przez 3 minuty przy 2 500 x g. Zawiesić w 100 μl zimnego roztworu PBS.
   4. Napraw komórki, upuszczając 200 μl zimnego etanolu podczas wirowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę.
   5. Przemyć komórki dwukrotnie zimnym roztworem PBS, jak opisano w kroku 4.2.3.
   6. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu cytrynianu sodu (1,12%, pH 8,5) zawierającego 50 μg/ml RNazy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   7. Dodać 250 μl buforu cytrynianu sodu zawierającego 50 μg/ml jodku propidyny. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   8. Zmierz 10 000 komórek w każdej próbce za pomocą cytometrii przepływowej²⁰.
3. qRT-PCR (Figura 3C)
   1. Zastąp HDF i dodaj mESC-CM, jak opisano w krokach 4.1.1 i 4.1.2.
   2. Wyizoluj całkowite RNA z HDF za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z protokołem producenta. Określić ilościowo wyekstrahowany całkowity RNA za pomocą spektrofotometru²¹.
   3. Zsyntetyzować cDNA poprzez dodanie 1 μg całkowitego RNA do 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej startery oligo (dT) i odwrotną transkryptazę M-MLV, zgodnie z protokołem producenta²⁰.
   4. Zmierz amplifikację cDNA za pomocą maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, używając głównej mieszanki Green PCR i specyficznych starterów genów (tabela suplementu 1). Znormalizuj dane za pomocą wyrażenia GAPDH. Stosować następujący protokół PCR: wstępna denaturacja przez 10 minut w temperaturze 95 °C; 45 cykli przez 15 sekund w temperaturze 95 °C, 20 sekund w temperaturze 55 °C i 35 sekund w temperaturze 72 °C; i etap krzywej topnienia przez 15 sekund w temperaturze 95 °C, 1 minutę w temperaturze 60 °C, 30 sekund w temperaturze 95 °C i 5 sekund w temperaturze 60 °C¹⁵.

Wyniki

Pierwotnie, mESC są utrzymywane na pożywce MEF w pożywce mESC z FBS i innymi dodatkami (Rysunki 1A i 2A). CM pobrano z mESC w zredukowanej pożywce surowicy bez warstwy zasilającej, FBS lub innych suplementów (ryc. 1B i 2B). Ten warunek hodowli pozwala nam na pobranie kondycjonowanej pożywki specyficznej dla mESC bez potencjalnego zanieczyszczenia czynnikami z karmnika, FBS lub innych suplementów. Pożywkę kontrolną zebrano...

Dyskusja

W celu pomyślnego zebrania mESC-CM wolnego od surowicy i karmowiska, należy wziąć pod uwagę następujące sugestie. Najbardziej krytycznym czynnikiem jest wykorzystanie mESC wczesnego pasażu do zbierania mESC-CM. Wcześniej wykazano, że mESC-CM z wczesnym pasażem ma lepsze działanie przeciwstarzeniowe w porównaniu z mESC z późnym pasażem. Doniesiono, że liczba pasaży mESC wpływa na ich potencjał rozwojowy¹⁶ i pluripotencję¹⁷.

Chociaż potrzebne są dodatkowe badania w celu prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	#11960-044
FBS	Invitrogen	#30044333	20%, jakość komórek ES
Penicylina i streptomycyna	Invitrogen	#15140	50 jednostek/ml penicyliny i 50  mg/ml streptomycyna
L-glutamina	Invitrogen	#25030	2  mM
Aminokwasy endogenne (NEAA)	Invitrogen	#11140	100  &mikro; M
β-merkaptoetanol	Sigma	#M3148	100  &mikro;
M Czynnik hamujący białaczkę	Milipore	#ESG1107	100 jednostek/ml
OPTI-MEM	Invitrogen	#22600
X-gal	Sigma	#B4252	1 mg/ml
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	P6148	3,70%
Dimetyloformamid (DMF)	Sigma	#D4551
Żelazocyjanek potasu	Aldrich	#455946	5 mM
żelazocyjanek potasu	Aldrich	#455989	5 mM
NaCl	Sigma	#S7653	150 mM
MgCl2	Sigma	#M2393	2 mM
Mitomycyna C	Sigma	#M4287	10  &mikro; g/ml
jodku propidyny	Sigma	#P4170	50  &mikro; g/ml
TRIzol	Ambion	#15596018
M-MLV odwrotna transkrypcja	Promega	#M170B
Power SYBR Green PCR master mix	Biosystemy stosowane	#4367659
HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast	LONZA	#CC-2511
Filtr butelkowy	Corning	#430513	0,2 μ mln