Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

DOI:

10.3791/55038

⸱

6 lutego 2017

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ odpornościowy błony śluzowej żeńskiego układu rozrodczego (FRT) służy jako pierwsza linia obrony. Lepsza wiedza na temat błony śluzowej narządów płciowych jest zatem niezbędna do zrozumienia patogenności różnych patogenów, w tym HIV. Limfocyty T gamma delta (GD) są prototypem "niekonwencjonalnych" limfocytów T i reprezentują stosunkowo niewielki podzbiór limfocytów T zdefiniowany przez ekspresję heterodimerycznych receptorów limfocytów T (TCR) złożonych z łańcuchów gamma i delta. To odróżnia je od klasycznych i znacznie lepiej znanych limfocytów T pomocniczych CD4 + i cytotoksycznych limfocytów T CD8 +, które są definiowane przez TCR alfa-beta. Limfocyty T GD często wykazują lokalizację specyficzną dla tkanki i są wzbogacone w nabłonek. Limfocyty T GD koordynują odpowiedzi immunologiczne w stanach zapalnych, nadzorze nad nowotworami, chorobach zakaźnych i autoimmunizacji.

Tutaj prezentujemy metodę powtarzalnego izolowania i analizy ludzkich śródnabłonkowych limfocytów T GD w obrębie szyjki macicy. Użyliśmy próbek cytoszczoteczki do szyjki macicy od kobiet biorących udział w Women's Interagency HIV Infection Study (WIHS). Wiedza na temat interakcji limfocytów T GD w stanach, w których dochodzi do uszkodzenia błony śluzowej pochwy, może być zastosowana w każdym badaniu klinicznym, w którym zajęto się wrażliwością błony śluzowej, w tym rozwojem mikrobicydów pochwy. Ponadto wiedza na temat odpowiedzi komórek T GD w błonie śluzowej ma potencjał do zastosowania terapii immunologicznej opartej na limfocytach T GD w leczeniu chorób zakaźnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy metodologię wykorzystania próbek szczoteczek endoszyjkowych do oceny śródnabłonkowych komórek T GD. Kanał szyjki macicy jest wyłożony pojedynczą warstwą nabłonka walcowatego. Limfocyty śródnabłonkowe reprezentują limfocyty pierwszej linii znajdujące się w warstwie nabłonka, które mogą szybko zainicjować odpowiedź immunologiczną w przypadku napotkania drobnoustrojów chorobotwórczych7,8. Zrozumienie zdarzeń immunologicznych wewnątrznabłonkowego przedziału szyjki macicy jest ważne dla opracowania skutecznych strategii zapobiegania zakażeniom, w tym HIV.

Nasza metoda może być stosowana do świeżo pobranych próbek ludzkich szyjek macicy, jak również zamrożonych komórek szyjki macicy, aby dalej badać rolę śródnabłonkowych limfocytów T GD u kobiet z zakażeniem HIV lub zagrożonych zakażeniem wirusem HIV. Głównym celem tego protokołu jest odkrycie nowych zdarzeń immunologicznych w śródnabłonkowym przedziale śródnabłonkowym szyjki macicy oraz ocena odpowiedzi komórek T GD jako markera wrażliwości błony śluzowej u kobiet z zakażeniem wirusem HIV.

Znaczne luki w wiedzy na temat odporności na FGT wynikają częściowo z trudności w pomyślnym pobraniu i przetworzeniu próbek błony śluzowej. Co więcej, złożona heterogeniczność komórek odpornościowych błony śluzowej i ich wzajemne powiązania są głównymi wyzwaniami w identyfikacji klinicznie istotnych pomiarów, które odzwierciedlają stan i możliwości układu odpornościowego. Opracowaliśmy metodę otrzymywania wysoce oczyszczonych śródnabłonkowych limfocytów T GD, które można dalej analizować przy użyciu wysoce multipleksowanych technologii jednokomórkowych, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw odporności FRT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zajęcia badawcze odbyły się w Jednostce Badawczej HIV Uniwersytetu w Miami we współpracy z Miami Women's HIV Interagency Study (WIHS) i Miami Center for AIDS Research (CFAR). Zgoda Institutional Review Board (University of Miami Miller School of Medicine) została uzyskana przed rekrutacją i wszelkimi procedurami związanymi z oceną lub badaniem.

1. Pobieranie próbek szczoteczki do szyjki macicy

UWAGA: Uczestniczki przeszły badanie pochwy wykonane przez przeszkolonego lekarza lub ginekologa, a pobranie limfocytów śródnabłonkowych zostało przeprowadzone pod kątem wziernika poprzez wprowadzenie cytoszczotki.

  1. Charakterystyka uczestników
    1. Rekrutacja uczestniczek w wieku od 18 do 45 lat, aktywnych seksualnie, niebędących w ciąży i nieprzyjmujących leków antykoncepcyjnych lub z wkładką wewnątrzmaciczną.
    2. Przed badaniem dopochwowym poproś uczestniczki o pobranie 10 ml krwi w zielonych górnych wakutainerach heparyny do izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Służy jako kontrola do śródnabłonkowej analizy śródnabłonkowej szyjki macicy9.
  2. Pobieranie próbek z szyjki macicy
    1. Włóż sterylny wziernik o odpowiedniej wielkości do pochwy bez smarowania. Użyj ciepłej wody, aby ułatwić wprowadzenie wziernika i sterylnej gazy, aby oczyścić śluz. Położenie wziernika pozwala na pełną wizualizację szyjki macicy i szyjki macicy.
    2. Włóż szczoteczkę do szyjki macicy do kanału szyjki macicy, aż widoczne będą tylko włosie znajdujące się najbliżej dłoni. Obróć szczotkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 360°. Przenieś pędzel do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki IMDM.
    3. Natychmiast po pobraniu umieść probówkę zawierającą cytobrush na lodzie. Aby uzyskać wysoką żywotność pobranych komórek śródnabłonkowych, należy dostarczyć cytoszczotę do laboratorium i przetworzyć w ciągu 1 godziny.

2. Przetwarzanie próbek cytoszczotek do szyjki macicy

  1. Rurka wirowa zawierająca cytoszczarkę do szyjki macicy, wykonując 4 krótkie (10 sekund) pociągnięcia.
  2. Odwirować probówkę zawierającą cytoszczotę przez 10 minut przy 250 x g.
  3. Ostrożnie wyjmij cytoszczotę z probówki (nie naruszaj osadu na dnie probówki) i dodaj 1 ml pożywki IMDM i umieść probówkę na lodzie.
  4. Umieść cytoszczotę na sitku o średnicy 100 mm na górze probówki o pojemności 50 ml.
  5. Umyj cytoszczoteczkę 20 ml IMDM.
  6. Probówka wirówkowa przez 10 minut przy 250 x g.
  7. Zdekantować supernatant i granulowane komórki ponownie zawiesić w 1 ml IMDM i połączyć z już ponownie zawieszonym osadem opisanym w ppkt 2.3.
  8. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek10 lub policz komórki za pomocą hemocytometru, łącząc 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl barwnika błękitu trypanowego. Delikatnie pipetuj w górę i w dół dziesięć razy, aby wymieszać komórki i barwnik. Załadować 10 μl mieszaniny do otworu jednej z dwóch komór hemocytometru. Policz wszystkie komórki w pięciu obszarach siatki. Prowadź oddzielną liczbę komórek zdolnych do życia i niezdolnych do życia. Określ żywotność komórki, korzystając z następującego wzoru: % komórek żywotnych = komórki niezdolne do życia x 100/całkowita liczba komórek komórek.
    Określ kolejne stężenie komórek na ml (i całkowitą liczbę komórek), korzystając z następujących obliczeń. Całkowita liczba komórek na ml = całkowita liczba zliczonych komórek x (współczynnik rozcieńczenia/ liczba zliczonych kwadratów) x 10 000 komórek/ml.
  9. Zamrażać izolowane komórki szyjki macicy za pomocą pożywki zamrażającej zawierającej 10% DMSO i 90% FBS.

3. Cytometria przepływowa

  1. Ponownie zawiesić 1-3 x 105 komórek szyjki macicy w 100 μl buforze FACS (PBS zawierający 1% albuminy surowicy bydlęcej
  2. Dodać 1 μL/106 LIVE/DEAD Zestaw do barwienia żółtych martwych komórek i przeciwciała dla markerów powierzchniowych w stężeniach opisanych w tabeli 1.
  3. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze +4 °C, chronić przed światłem.
  4. Dodać 1 ml buforu FACS oraz komórki i probówki wirówkowe przez 5 minut przy 350 x g
  5. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 μl 1% paraformaldehydu.
  6. Przygotować kontrole kompensacyjne przy użyciu kulek i przeciwciał używanych do barwienia, dodając 100 μl buforu FACS i jedną kroplę kulek oraz takie samo stężenie przeciwciał użytych do barwienia próbki.
  7. Pobieraj barwione kulki i próbki na cytometrze przepływowym, wyposażonym w lasery o długości fali 405 nm, 488 nm i 635 nm.

4. Izolacja komórek T Gamma delta szyjki macicy

  1. Izolacja magnetyczna
    1. Zawiesić ponownie osad komórek szyjki macicy (≤107 komórek ogółem), opisany w ppkt 2.6, w 40 μl buforu zawartego w zestawie mikrokulek gamma delta TCR, o którym mowa w Tabeli materiałów i odczynników.
    2. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu dotyczącymi dwuetapowego protokołu barwienia: po pierwsze, za pomocą przeciwciała anty-TCR gamma delta Hapten-Antibody, a po drugie, za pomocą mikrokulek anty-haptenowych-FITC
    3. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze 4-8 °C, przemyć komórki, dodając 1 ml buforu i odwirować przy 300 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant przez odwrócenie probówki i stuknąć do sucha za pomocą kartki papieru.
    4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl dostarczonego buforu i przygotować kolumnę magnetyczną, umieszczając ją w odpowiednim separatorze magnetycznym zgodnie z protokołem dostawcy.
    5. Nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę i zebrać nieznakowane komórki, które przez nią przechodzą, a następnie przemyć kolumnę 3x odpowiednią ilością buforu (500 μL). Wykonaj kroki mycia, dodając bufor trzy razy, za każdym razem po opróżnieniu zbiornika kolumny. Zebrać ścieki całkowite. Jest to nieznakowana, ujemna frakcja komórkowa
    6. Wyjąć kolumnę z separatora magnetycznego i odpipetować 1 ml buforu na kolumnę i natychmiast wypłukać frakcję z magnetycznie znakowanymi komórkami, mocno naciskając tłok dostarczony z kolumną.
      UWAGA: Izolowane limfocyty T gamma delta są już barwione fluorescencyjnie do analizy cytometrycznej przepływowej, ponieważ znakowane magnetycznie mikrogranulki anty-haptenowe są sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym FITC.
  2. Sortowanie komórek
    1. W celu sortowania komórek oznacz komórki szyjki macicy matrycą żywotności i panelem przeciwciał, jak opisano w sekcji 3.
    2. Ustaw bramki elektroniczne na żywych, CD45+, CD3+ i komórkach gamma delta-dodatnich i wykonaj sortowanie komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio analizowaliśmy śródnabłonkowe limfocyty T GD w obrębie szyjki macicy i byliśmy pierwszymi, którzy poinformowali o utracie wewnątrzszyjkowych limfocytów T gamma delta u kobiet zakażonych wirusem HIV9,11. Tutaj opisujemy protokół izolacji i analizy podzbioru komórek T gamma delta szyjki macicy. Jak pokazano na rycinie 1, limfocyty T GD można łatwo wykryć w próbkach ludzkich komórek szyjki macicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena wrażliwości błony śluzowej dolnych dróg rodnych kobiet jest istotnym elementem badań klinicznych dotyczących ryzyka nabycia i przenoszenia wirusa HIV. Zazwyczaj podatność FGT na zakażenie wirusem HIV ocenia się poprzez pomiar rozpuszczalnych modulatorów immunologicznych w wydzielinie narządów płciowych (cytokiny, chemokiny i peptydy przeciwdrobnoustrojowe)12,13. Jednak te biomarkery wskazują jedynie na stan zapalny pochwy, wpływają na nie zdarzenia fizjolog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają powiązań komercyjnych ani innych, które mogłyby powodować konflikt interesów (np. posiadanie akcji farmaceutycznych, doradztwo, członkostwo w radzie doradczej, odpowiednie patenty lub finansowanie badań).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy uczestnikom badania WIHS w Miami za chęć udziału w tej pracy. Dane zawarte w tym manuskrypcie zostały zebrane przez Miami Women's Interagency HIV Study (WIHS). Wyłączną odpowiedzialność za treść tej publikacji ponoszą autorzy i nie reprezentują one oficjalnych poglądów National Institutes of Health (NIH). Prace te były wspierane przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases oraz Women's Interagency HIV Infection Study (WIHS) [numer grantu U01 AI103397], National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health [numer grantu P30AI073961], National Center for Advancing Translational Sciences oraz National Institute on Minority Health and Health Disparities, National Institute of Health [numer grantu UL1TR000460 i 1KL2TR000461], oraz National Institute of Child Health and Human Development, National Institute of Health [ grant nr K23HD074489].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cytobrush Plus GT (CareFusion, San Diego, Kalifornia, USA
IMDM, zmodyfikowany Dulbecco's Medium firmy Iscove ThermoFisher Scientific12440061
Automatyczny licznik komórek Beckman Coulter (Analizator żywotności komórek serii Vi-CELLBeckman Coulter496178
DMSO, Dimetylosulfotlenek Sigma Aldrich D2650
FBS, Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen, Gibco26140-079
PBSInvitrogen, Gibco10010023
BSASigmaAldrich A-9647
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy żółtych martwych komórek LifeTechnologies,L349S9
1% paraformaldehydSigma Aldrich D6148
Cytometr przepływowy Fortessa Becton Dickinson
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
ArC Aminowe reaktywne koraliki kompensacyjne (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)Life TechnologiesA10346
anty-TCR gamma/delta MicroBead Kit Milteny Miltenyi Biotec Inc.130-050-701
Kolumna103-042-201
Separator4124
MS MACS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
  2. Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
  3. Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
  4. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
  5. Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
  6. Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687(2014).
  7. Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
  8. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
  9. Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
  10. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
  11. Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045(2016).
  12. Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
  13. Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
  14. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
  15. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675(2014).
  16. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pr bka z szczoteczki endocervikalnejizolacja za pomoc kulek magnetycznychsortowanie kom rek aktywowane fluorescencjTCR gamma deltakom rki CD45 dodatniekom rki CD3 dodatnieekspresja barwnika ywotno ciwykres rozrzutu Forward Side Scatterplot

Powiązane artykuły