Artykuł metodologiczny

Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ

19.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55039

⸱

2 stycznia 2017

 , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

W tym artykule

Podsumowanie

Test monocytów (MMA) to test in vitro, który wykorzystuje izolowane pierwotne monocyty uzyskane z pełnej krwi obwodowej ssaków do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR).

Streszczenie

Chociaż pierwotnie opracowany do przewidywania wyników transfuzji krwi niezgodnej serologicznie, monochromatyczny test monocytowy (MMA) jest bardzo wszechstronnym testem in vitro, który może być modyfikowany w celu zbadania różnych aspektów fagocytozy za pośrednictwem przeciwciał i receptora Fcγ (FcγR) zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych. Test wykorzystuje przylegające monocyty z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej wyizolowanych z krwi pełnej ssaków. MMA zostało opisane do stosowania zarówno w badaniach na ludziach, jak i na myszach. Te monocyty wyrażają FcγR (np. FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB i FcγRIIIA), które są zaangażowane w odpowiedzi immunologiczne. MMA wykorzystuje mechanizm interakcji za pośrednictwem FcγR, w szczególności fagocytozy, w której uwrażliwione na przeciwciała czerwone krwinki (RBC) przylegają i / lub aktywują FcγR, a następnie są fagocytozowane przez monocyty. In vivo głównie makrofagi tkankowe znajdujące się w śledzionie i wątrobie przeprowadzają fagocytozę opsonizowanych przez przeciwciała krwinek czerwonych za pośrednictwem FcγR, powodując hemolizę pozanaczyniową. Oceniając poziom fagocytozy za pomocą MMA, można badać różne aspekty procesu in vivo, w którym pośredniczy FcγR. Niektóre zastosowania MMA obejmują przewidywanie znaczenia klinicznego allo- lub autoprzeciwciał w warunkach transfuzji, ocenę potencjalnych leków, które promują lub hamują fagocytozę, oraz łączenie testu z mikroskopią fluorescencyjną lub tradycyjnym zachodnim immunoblottingiem w celu zbadania dalszych efektów sygnalizacyjnych leków lub przeciwciał angażujących FcγR. Niektóre ograniczenia obejmują pracochłonność tej techniki, która zajmuje cały dzień od początku do końca, oraz wymóg zatwierdzenia etyki badawczej w celu pracy z krwią ssaków. Jednak przy zachowaniu staranności i odpowiedniego treningu wyniki MMA można uzyskać w ciągu 24 godzin.

Wprowadzenie

Test monocytów (MMA) jest testem in vitro, pierwotnie opracowanym w celu lepszego przewidywania wyników transfuzji krwi u pacjentów z auto- lub alloprzeciwciałami przeciwko czerwonym krwinkom (RBCs)1-5. Oceniając wpływ przeciwciał anty-RBC na fagocytozę za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR) za pomocą tego testu in vitro, można przewidzieć wynik kliniczny in vivo. Rzeczywiście, MMA jest z powodzeniem stosowany w celu uniknięcia immunologicznego zniszczenia erytrocytów związanych z przeciwciałami, pomimo transfuzji krwi niezgodnej serologicznie5. Typowa procedura przed transfuzją do testowania zgodności, zwana również dopasowaniem krzyżowym, obejmuje metody serologiczne, które obejmują typowanie krwi pacjenta na obecność antygenów ABO i Rh oraz badania przesiewowe na obecność przeciwciał anty-RBC u pacjenta6. Wybiera się krew dopasowaną pod kątem ABO/Rh, a jeśli obecne są przeciwciała, podejmuje się próbę ich identyfikacji, aby można było dalej selekcjonować krew do transfuzji w celu uniknięcia tych antygenów. Idealny wynik dopasowania krzyżowego występuje, gdy cała krew dawcy jest serologicznie zgodna z krwią pacjenta, co zmniejsza ryzyko hemolizy po transfuzji7. Jednak system ten jest niewystarczający dla niewielkiej grupy pacjentów, którzy zostali uodpornieni na alloimmunizację po wielokrotnej transfuzji lub ciąży. Pacjenci ci wytwarzają alloprzeciwciała przeciwko specyficznym antygenom RBC. Niektóre wytwarzają przeciwciała przeciwko antygenom o bardzo wysokiej częstotliwości w populacji ogólnej, a zatem stają się coraz trudniejsze do dopasowania krzyżowego8,9. Co więcej, nie wszystkie alloprzeciwciała są klinicznie istotne; Innymi słowy, wiązanie alloprzeciwciała z krwinkami czerwonymi wykrytymi za pomocą testu serologicznego niekoniecznie powoduje hemolizę, gdy przetacza się antygenowo-dodatnią, niezgodną krew. MMA został pierwotnie opracowany w celu oceny potencjalnego znaczenia klinicznego krwi niezgodnej serologicznie w warunkach transfuzji1-5.

Ponieważ wiadomo, że pozanaczyniowa hemoliza krwinek czerwonych związanych z przeciwciałami jest wywoływana przez jednojądrzasty system fagocytów, pierwotne monocyty/makrofagi są wykorzystywane w rozwoju testów diagnostycznych. Pierwszy test badający interakcję monocytów, erytrocytów i przeciwciał został opublikowany w 1975 roku, ale zastosowane nieoptymalne warunki doprowadziły jedynie do powstania rozety (wiązania erytrocytów z obrzeżem monocytu) i nie zaobserwowano fagocytozy10. Znaczące modyfikacje testu zostały wprowadzone przez kilka grup, co doprowadziło do testu, w którym poziom fagocytozy erytrocytów związanych z alloprzeciwciałami można było skorelować z wynikiem klinicznym hemolizy1-5. Niedawno zbadano optymalne warunki przechowywania próbek klinicznych i dalszą optymalizację warunków oznaczania w celu zwiększenia użyteczności klinicznego dopasowania krzyżowego MMA przy użyciu autologicznych próbek pacjentów11.

Trzy inne techniki diagnostyczne zostały zastosowane oprócz MMA do przewidywania wyników transfuzji: test uwalniania 51Cr, test rozetowy i test chemiluminescencji (CLT). W teście uwalniania 51Cr pacjentowi wstrzykuje się 51krwinek czerwonych znakowanych krwinkami krwinkowymi znakowanymi Cr, a okres półtrwania znakowanych krwinek czerwonych jest monitorowany i jest predyktorem przeżycia lub klirensu po transfuzji12,13. Ponieważ metoda ta wykorzystuje materiały radioaktywne, jest już rzadko wykonywana. Test rozetowy polega na mieszaniu i inkubacji monocytów z krwinkami czerwonymi oraz ilościowym określeniu poziomu tworzenia rozety (bez fagocytozy)14. Kliniczne znaczenie przeciwciał in vivo obejmuje aktywną fagocytozę przez makrofagi znajdujące się w śledzionie i/lub wątrobie; W związku z tym metoda ta nie zapewnia odpowiedniego odczytu fagocytozy. CLT wykorzystuje luminol do monitorowania wybuchu oksydacyjnego podczas fagocytozy monocytów RBC, ponieważ luminol fluoryzuje na niebiesko po utlenieniu w fagosomie15. Ta metoda jest dobra, ale zanieczyszczenie neutrofilami może zakłócić odczyt. Przeprowadzono równoległe porównania w celu oceny czułości, praktyczności i odtwarzalności czterech dostępnych metod, a zarówno CLT, jak i MMA zostały ocenione jako lepsze16. Jednak CLT jest głównie wykorzystywany do oceny choroby hemolitycznej płodu i noworodka (HDFN), a optymalne pH testu wynoszące 8,0 może zagrozić poziomowi fagocytozy11.

Oprócz swojej użyteczności diagnostycznej i klinicznej, MMA zostało zmodyfikowane do innych celów badawczych. Rzeczywiście, MMA może służyć nie tylko jako test funkcjonalny w celu rozwiązania rozbieżności między serologią a biologią, ale został również wykorzystany do retrospektywnego zbadania przyczyny hemolizy po dożylnej terapii immunoglobulinami (IVIG)17. Został również wykorzystany do zbadania struktury-funkcji chemicznych inhibitorów fagocytozy za pośrednictwem FcγR18-20 oraz do badania dalszej sygnalizacji fagocytozy za pośrednictwem FcγR21. W naszym laboratorium, oprócz wykorzystania ludzkiego MMA, opracowujemy mysi MMA przy użyciu pierwotnych mysich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i autologicznych krwinek czerwonych. Uzasadnieniem jest badanie przesiewowe przeciwciał, które mogą indukować fagocytozę za pośrednictwem FcγR jako produkt pośredni do rozwoju mysiego modelu autoimmunologicznej niedokrwistości hemolitycznej (AIHA) in vivo (dane niepublikowane). Różne modyfikacje koncentrują się na różnych aspektach interakcji przeciwciał IgG i FcγR, które indukują fagocytozę.

Protokół

Uzyskaj zgodę na wykorzystanie próbek ludzkich przez komisję etyki badań/instytucjonalną komisję rewizyjną i uzyskaj podpisaną zgodę od wszystkich ludzkich dawców. MMA można również przeprowadzić przy użyciu mysich PBMC w podobny sposób, jak test na ludziach, po zatwierdzeniu przez etykę stosowania na zwierzętach. MMA wykorzystuje techniki aseptycznych hodowli tkankowych.

UWAGA: Zobacz Rysunek 1.

UWAGA: Chociaż zalecamy użycie komory bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 podczas testu, aby utrzymać technikę aseptyczną, ponieważ metoda ta jest tylko "krótkoterminową" metodą hodowli, nie ma wystarczająco dużo czasu, aby bakterie mogły zanieczyścić test. W związku z tym, jeśli nie istnieje szafa biologiczna poziomu 2, zamiast kupować ją tylko do tego testu, test można przeprowadzić poza szafą bezpieczeństwa biologicznego, na otwartej ławce. Użycie inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 nie jest jednak możliwe i musi być stosowane w celu uzyskania optymalnych wyników.

1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

  1. Pozyskać ludzką krew pełną od zdrowego dawcy lub pacjenta przez nakłucie żyły za pomocą podgrzewaczy próżniowych zawierających antykoagulant kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowy (ACD) (probówki z żółtą górą).
    UWAGA: Krew pełną można przechowywać w ACD w temperaturze pokojowej (18-22 °C) do 36 godzin przed przejściem do następnego kroku11. Zwykle do testu wystarczają 1-2 probówki próżniowe o pojemności 10 ml z krwią pełną.
  2. Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1 v/v w ciepłym, kompletnym pożywce RPMI (RPMI-1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą, 20 mM HEPS i 0,01 mg/ml gentamycyny).
  3. Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) z rozcieńczonej krwi pełnej za pomocą wirowania w gradiencie gęstości, zgodnie z zaleceniami producenta (patrz wykaz materiałów). Rozcieńczoną krew należy bardzo powoli nakładać na gradient gęstości (podgrzanej do temperatury pokojowej, 18-22 °C).
    UWAGA: Zminimalizuj ilość mieszania na granicy faz, aby uzyskać optymalne oddzielenie krwi, ostrożnie układając mieszaninę krwi kroplami lub używając pipety.
    1. Pozwolić, aby mieszanina krwi powoli nakładała się na górną część gradientu gęstości, umieszczając końcówkę pipety blisko gradientu gęstości i pozwalając mieszaninie krwi spływać po boku probówki bardzo powoli.
    2. W zależności od skali eksperymentu, warstwę 10 ml mieszaniny krwi na 3 ml gradientu gęstości (w probówce 15 ml) lub warstwę 35 ml mieszaniny krwi na 15 ml gradientu gęstości (w probówce 50 ml). Zazwyczaj 10 ml krwi pełnej daje 10 milionów PBMC, z pewnymi różnicami między dawcami.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie dochodziło do mieszania mieszaniny krwi z gradientem gęstości. Mieszanina krwi powinna nakładać się na gradient gęstości i powoli rosnąć, aż cała krew znajdzie się na szczycie gradientu gęstości.
    3. Odwirować warstwową mieszaninę o sile 700 x g przez 30 minut bez hamulców. Odwirowana mieszanina powinna rozdzielić się na 5 warstw (od góry do dołu): osocze, kożuchowy płaszcz (zawierający PBMC), materiał gradientu gęstości, granulocyty i erytrocyty.
    4. Usuń i wyrzuć większość osocza, a następnie ostrożnie odzyskaj zawartość kożucha (PBMC) do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety Pasteura i bańki ssącej.
      UWAGA: Usuwanie warstwy kożucha odbywa się skutecznie poprzez zastosowanie ssania na pipecie Pasteura, wykonując jednocześnie ruchy okrężne wokół zewnętrznej strony warstwy, z końcówką pipety przylegającą do probówki.
  4. Przemyć wyizolowane PBMC trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7,3 (PBS) przez odwirowanie przy 350 x g przez 10 minut (z pełnymi hamulcami) pomiędzy płukaniami. Rozpuść osad PBMC w kompletnym podłożu RPMI. W zależności od wielkości granulki wystarczy 3-7 ml podłoża.
  5. Policz PBMC za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Policz tylko te komórki, które nie są zabarwione błękitem trypanowym. Rozpuść PBMC do 1 750 000 komórek/ml w pełnym pożywce RPMI.
  6. Wysiewaj 400 μl (700 000 komórek) do każdego dołka 8-komorowego szkiełka. Inkubować szkiełko w całkowicie nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C (uzupełnionym 5% CO2 ) przez 1 godzinę, aby umożliwić przyleganie monocytów/makrofagów.

2. Wstępne leczenie przylegających monocytów

UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy szukasz sposobów na zahamowanie lub wzmocnienie fagocytozy.

  1. Wstępnie potraktuj przylegające monocyty dowolnymi lekami lub związkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Rozpuścić lek(i) lub inny badany materiał do pożądanego stężenia przy użyciu kompletnego podłoża RPMI.
    UWAGA: Na przykład 200 μg / ml IVIG jest zwykle używane do uzyskania 95-100% zahamowania fagocytozy przy użyciu ludzkich monocytów.
  2. Odessać i odrzucić supernatant zawierający jakiekolwiek nieprzylegające komórki z 8-komorowego szkiełka po 1-godzinnej inkubacji (po kroku 1.6). Zastąpić go 400 μl leku lub innego środka leczniczego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    1. Podczas zasysania i wymiany roztworów w szkiełku 8-komorowym należy pamiętać o kontrolowaniu przepływu płynów, aby słabo przylegające komórki nie unosiły się. Pracuj również tylko z 2-3 pustymi studzienkami na raz i unikaj suszenia studzienek.
      UWAGA: Zazwyczaj każdy zabieg wykonywany jest w trzech egzemplarzach technicznych.

3. Opsonizacja czerwonych krwinek R2R2

UWAGA: Używane tutaj R2R2 są uzyskiwane z Centrum Pobierania Krwi (Kanadyjska Służba Krwi), ale są również dostępne na rynku. Opsonizowane R2R2 RBC są stosowane jako kontrola pozytywna dla fagocytozy za pośrednictwem FcγR. Naiwny R2R2 należy przechowywać w roztworze Alsever (w celu przedłużenia okresu przydatności do spożycia) w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. Roztwór firmy Alsever jest wytwarzany we własnym zakresie i składa się z 0,8% m/v cytrynianu trisodowego (dwuwodnego), 1,9% w/v dekstrozy, 0,42% w/v chlorku sodu i 0,05% w/v kwasu cytrynowego (jednowodnego). Jeśli komórki R2R2 nie są dostępne, można użyć innych komórek Rh-fenotypowanych, takich jak R1R2, R1R1, R1r lub R2r.

  1. Przemyć krwinki czerwone R2R2 (cDE/cDE) w PBS łącznie trzy razy, używając wirowania przy 350 x g przez 5 minut każda.
    UWAGA: Ilość potrzebnych erytrocytów zależy od wielkości eksperymentu i może być obliczona wstecznie. Zawsze należy przemyć nadmiar krwinek czerwonych, ponieważ są one tracone podczas każdego prania w wyniku lizy lub podczas usuwania supernatantu. Na przykład w eksperymencie z 5 zabiegami i 2 kontrolami, przeprowadzonymi w trzech próbach technicznych, jest w sumie 21 studzienek. 21 dołków z 400 μl / studzienka 1,25% mieszaniny RBC wskazuje, że potrzebne jest 105 μl upakowanych, opsonizowanych RBC. 200 μl RBC należy wstępnie przepłukać, a 150 μL opsonizować, aby upewnić się, że jest odpowiednia ilość RBC na etapie fagocytozy.
  2. Opsonizować przemyty osad R2R2 poliklonalnymi przeciwciałami anty-D 1:1 v/v z ludzkiej surowicy i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, z przerywanym mieszaniem.
    UWAGA: Jeśli poliklonalne przeciwciała anty-D nie są dostępne, możliwe jest użycie przeciwciał monoklonalnych anty-D, które są dostępne na rynku, lub przeciwciał anty-D, które są zwykle stosowane w profilaktyce immunologicznej Rh, które można uzyskać z banków krwi lub usług transfuzjologicznych. Testy optymalizacyjne należy przeprowadzić na początku, podczas ustawiania testu i za każdym razem, gdy zmienia się partię przeciwciał poliklonalnych bez tiezy lub przechodzi na przeciwciało monoklonalne. Ma to na celu określenie optymalnego stężenia lub objętości anty-D wymaganej do uzyskania wyniku testu antyglobulinowego (IAT) między 3+ a 4+ oraz wyniku fagocytozy między 70-90 fagocytozowanych erytrocytów na 100 zliczonych monocytów.
  3. Przemyć opsonizowane R2R2 łącznie trzy razy w PBS, używając wirowania przy 350 x g przez 5 minut każdy.
    UWAGA: Pomyślną opsonizację R2R2 można potwierdzić, wykonując pośrednie IAT. Krótko mówiąc, dodaje się drugorzędowe poliklonalne przeciwciała anty-ludzkie w celu związania pierwszorzędowych przeciwciał opsonizujących na powierzchniach RBC, a wzmocniony sygnał można zaobserwować w postaci hemaglutynacji. Szczegółowy protokół producenta znajduje się w pliku materiałów uzupełniających.
  4. Rozpuść przemyty granulat R2R2 do 1,25% v/v przy użyciu kompletnego podłoża RPMI.
    UWAGA: Nadmiar opsonizowanego R2R2 może być przechowywany w roztworze Alsevera w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.

4. Fagocytoza za pośrednictwem receptora Fc

  1. Odessać lek lub pożywkę supernatant z szkiełka 8-komorowego i dodać 400 μl mieszaniny 1,25% v/v R2R2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  2. Po 2 godzinach inkubacji wyjmij komory za pomocą adapterów producenta. Zetrzyj nadmiar R2R2 na ręczniku papierowym. Upewnij się, że szkiełko nie wysycha.
  3. Napełnij zlewkę o pojemności 100 ml PBS. Zanurz i umyj szkiełko, powoli przesuwając szkiełko do przodu i do tyłu (około 30-40 uderzeń), aby usunąć większość niefagocytozowanego R2R2.
  4. Wyjmij szkiełko z PBS. Zetrzyj nadmiar PBS za pomocą ręcznika papierowego lub chusteczki i wysusz szkiełko na powietrzu.
  5. Zamocuj wysuszoną na powietrzu szkiełko w 100% metanolu na 45 s. Następnie wysusz na powietrzu zamocowaną prowadnicę.
    UWAGA: Szkiełka można mocować za pomocą innej metody, która jest bardziej kompatybilna z późniejszym barwieniem, takiej jak bejca Grünwald-Giemsa21 lub bejca Wright-Giemsa22.
  6. Zamontuj szkiełko za pomocą własnego podłoża montażowego elvanol (lub innego dostępnego na rynku medium montażowego) i dodaj szkiełka nakrywkowe.
    UWAGA: Podłoże montażowe Elvanol składa się w 15% z żywicy polialkoholu winylowego i w 30% z gliceryny w PBS. Mieszaninę podgrzewa się, aż cała żywica się rozpuści, a gliceryna zostanie jednorodnie wymieszana. Można go zastąpić innym dostępnym na rynku medium montażowym.
  7. Pozostaw wierzchowiec do wyschnięcia na noc przed kwantyfikacją.

5. Kwantyfikacja fagocytozy

  1. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i soczewki obiektywowej 40X ręcznie określ ilościowo ilość zdarzeń fagocytarnych, licząc co najmniej 200 monocytów i liczbę fagocytozowanych R2R2 w tych monocytach. Trzymaj po jednym liczniku w każdej ręce, aby jednocześnie określić ilościowo liczbę monocytów i liczbę fagocytozowanychR2,R2.
  2. Uzyskaj średni indeks fagocytarny, dzieląc liczbę fagocytozowanychR2,R2 przez liczbę monocytów i mnożąc przez 100. Wyrazić dane jako średnią (średni indeks fagocytarny) ± błąd standardowy średniej (SEM).

Wyniki

Postępując zgodnie z kluczowymi etapami przedstawionymi na Rysunku 1 oraz opisaną powyżej procedurą, można w sposób powtarzalny przeprowadzić MMA. W celu zaprezentowania hamowania fagocytozy na Rysunku 2 wykorzystano IVIG. Znane jest, że IVIG wiąże i blokuje receptory Fc, hamując tym samym końcowy efekt fagocytozy. Poprzez miareczkowanie ilości użytego IVIG obserwuje się hamowanie zależne od dawki, w którym stężenia powyżej 200 µg/mL skutkowały niemal 100% hamowaniem, a stężenia poniżej 0.5 µg/mL nie wykazały żadnego działania hamującego (Rysunek 2A). Po przekształceniu i normalizacji indeksów fagocytarnych względem dodatniej kontroli R2R2 jako 0% hamowania, można wyznaczyć krzywą hamowania z wartością IC50 wynoszącą 3 µg/mL (Rysunek 2B).

Oprócz zapewnienia spójności w przeprowadzaniu testu, jego kwantyfikacja może być czasami trudna. Rycina 3 przedstawia zestaw obrazów z mikroskopii kontrastowej różnych preparatów MMA. Dzięki doświadczeniu w mikroskopii można odróżnić monocyt od zanieczyszczającego go erytrocyta (Rycina 3D) lub wakuolę od fagocytowanego erytrocyta (Rycina 3B). Podczas kwantyfikacji należy unikać gęstych skupisk komórek i/lub debris (Ryciny 3E i F). Należy również unikać nadmiernej opsonizacji erytrocytów R2R2, co prowadziłoby do nasilenia fagocytozy, nadmiernego wypełnienia wnętrza monocytu i utrudniłoby dokładną kwantyfikację (Rycina 3C).

Schemat metody izolacji monocytów z krwi i fagocytozy z gradientem gęstości i procesem PBMC.
Rycina 1. Schemat MMA. Przedstawienie krok po kroku kluczowych etapów MMA: izolacji PBMC z krwi pełnej, podawania opsonizowanych R2R2 do przylegających monocytów oraz mycia szkiełek komorowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe i liniowe przedstawiające wyniki analizy indeksu fagocytozy i inhibicji przez IVIG.
Rycina 2. Dożylne IgG (IVIG) hamuje fagocytozę in vitro z wykorzystaniem MMA. Wiadomo, że IVIG hamuje fagocytozę i jest stosowany jako kontrola inhibicji w ludzkim MMA. (A) Miareczkowanie IVIG doprowadziło do zależnej od dawki inhibicji fagocytozy w porównaniu z nieleczoną kontrolą R2R2. Wyniki przedstawiają średnią ± błąd standardowy średniej (SEM) dla n = 3 eksperymentów. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu t Studenta: ** P≤0.01 oraz *** P≤0.001. (B) Krzywa inhibicji IVIG z IC50 wynoszącym 3 µg/mL (linia przerywana). Wyniki przedstawiają dane znormalizowane względem nieleczonej R2R2 (0% inhibicji); średnią ± SEM dla n = 3 eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Agregacja komórek pod mikroskopem; wyniki eksperymentalne; analiza mikroskopowa; klastry komórkowe.
Rycina 3. Obrazy z mikroskopii kontrastowej preparatów przy powiększeniu 40X. (A) Idealny preparat, w którym monocyty fagocytowały średnio 1-2 R2R2 (czarne strzałki z charakterystycznym blaskiem halo), z bardzo niewielką liczbą zanieczyszczających, niefagocytowanych R2R2 w tle (białe strzałki). (B) Jak pokazano na tym preparacie, monocyty mają czasami powiększone wakuole (białe strzałki), które mogą zostać pomylone z fagocytowanymi R2R2. (C) W przypadku nadmiernej opsonizacji R2R2, obecność więcej niż 4-5 fagocytowanych R2R2 na monocyt (czarne strzałki) utrudnia dokładne liczenie, ponieważ R2R2 są stłoczone wewnątrz monocytu i nie można rozróżnić wyraźnych granic komórek. (D) Niewystarczające przemycie preparatu prowadzi do licznych zanieczyszczeń R2R2 (białe strzałki), które mogą zostać pomylone z przyklejonymi RBC. (E) Czasami monocyty i zanieczyszczające RBC mogą tworzyć klastry. Klastry wskazują również na zanieczyszczenie bakteryjne, czego należy unikać. (F) Monocyty mogą tworzyć większe agregaty, których należy unikać podczas kwantyfikacji. Przy zastosowaniu losowego wyboru pól widzenia, panel A przedstawia to, co zwykle obserwuje się po prawidłowym przeprowadzeniu MMA. Pasek skali wynosi 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

MMA to pracochłonna technika, która wymaga specjalistycznej wiedzy zarówno w zakresie hodowli tkankowej, jak i mikroskopii. Istnieje kilka krytycznych kroków, które zapewniają sukces: 1) generowanie monowarstwy monocytów; 2) opsonizacja erytrocytów i 3) ręczna kwantyfikacja. Monowarstwa monocytów nie przylega zbyt mocno do szkiełka komory, dlatego fizjologiczne pH musi być utrzymywane przez cały czas trwania testu11 i należy wysiać odpowiednią liczbę PBMC. Należy unikać intensywnego pipetowania, które mogłoby zakłócić przylegające komórki. Jednym ze sposobów jest zawsze usuwanie i dodawanie roztworów z tego samego rogu komory oraz upewnienie się, że ruch jest powolny i stabilny. Podobnie, podczas ostatniego etapu mycia w celu usunięcia nadmiaru erytrocytów, ruch powinien być powolny i równomierny. Zapewnia to minimalne zakłócenia w monowarstwie, jednocześnie usuwając większość niefagocytozowanych krwinek czerwonych. Nieodpowiednie mycie doprowadzi do wysokiego tła zanieczyszczenia krwinek czerwonych, co utrudnia ręczną ocenę ilościową. Po drugie, R2R2 RBC muszą być wystarczająco opsonizowane, aby uzyskać średni indeks fagocytarny 80-120 dla kontroli fagocytozy. Ten pożądany zakres fagocytarów zapewnia równowagę między łatwością liczenia (np. monocyty z więcej niż 5 fagocytozowanymi krwinkami czerwonymi są trudne do dokładnego określenia ilościowego) a utrzymaniem odpowiedniej ilości fagocytozy do analizy statystycznej. Stopień opsonizacji można potwierdzić za pomocą IAT i potrzebny jest odczyt od 3+ do 4+. R2R2 Erytrocyty należy wyrzucić, gdy występuje nadmierna liza podczas mycia, gdy supernatant zmienia kolor na ciemnoczerwony lub gdy w doświadczeniach obserwuje się znaczny spadek fagocytozy spowodowany starzeniem się komórek w magazynie. Wreszcie, ręczna kwantyfikacja za pomocą mikroskopu może być trudna, zwłaszcza podczas porównywania liczb między personelem laboratoryjnym i między eksperymentami. Badając to samo pole na każdym dołku lub po prostu licząc więcej komórek, można uzyskać bardziej spójne zliczenie. Zaleca się szkolenie równoległe z doświadczonym technikiem i korzystanie z wyznaczonego zestawu slajdów szkoleniowych.

Główną krytyką MMA jest subiektywność ręcznego etapu kwantyfikacji. Jednak przy odpowiednim szkoleniu można uzyskać spójność w różnych licznikach. Innym ograniczeniem są wewnętrzne różnice między dawcami w zdolnościach fagocytarnych monocytów i poziomach ekspresji antygenu powierzchniowego R2R 2, co jest źródłem zmienności danych w przypadku próbek ludzkich.

Dostępne są inne alternatywne techniki badania fagocytozy za pośrednictwem FcγR. Większość komercyjnych zestawów wykorzystuje moc fluorescencyjną do monitorowania fagocytozy (np. Biocząstki, białko fluorescencyjne wrażliwe na pH lub fluorescencyjne kulki lateksowe znakowane IgG). Wykorzystanie mocy fluorescencyjnej oferuje bardziej obiektywną ocenę ilościową, ale należy również wziąć pod uwagę dostępność, koszt i szkolenie związane z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego lub cytometru przepływowego, a także wynikającą z tego zależność od dostępnych na rynku zestawów.

Wreszcie, test ten może być modyfikowany w zależności od pytania badawczego. Na przykład, podczas testowania hamowania fagocytozy przez leki, monocyty mogą być wstępnie leczone lub współinkubowane zarówno z lekami, jak i opsonizowanymi krwinkami czerwonymi (tj. Test konkurencji). Można również testować dalszą sygnalizację przeciwciał różnych podtypów, przeciwciał chimerycznych lub konstruktów rekombinowanych. Dzięki niedawnym przełomom w rozwoju uniwersalnej krwi bez antygenu24, MMA można wykorzystać we wstępnych badaniach przesiewowych tych erytrocytów o zerowym poziomie antygenu z różnymi przeciwciałami, aby ocenić, czy rzeczywiście istnieje obniżona skuteczność w wyzwalaniu fagocytozy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Kanadyjskiej Służbie Krwi za przyznanie T.N.T. nagrody w ramach programu stypendialnego dla absolwentów. Badania te otrzymały wsparcie finansowe od Centrum Innowacji Kanadyjskiej Służby Krwi, finansowanego przez rząd federalny (Health Canada) oraz prowincjonalne i terytorialne ministerstwa zdrowia. Poglądy zawarte w niniejszym dokumencie nie odzwierciedlają poglądów władz federalnych, prowincjonalnych lub terytorialnych w Kanadzie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwory próżniowe dekstrozy kwaśnej cytrynianu (ACD)BDREF364606
RPMI 1640SigmaR8758
HEPESBioshopHEP003.100
Surowica bydlęcapłodu Multicell 080150
GentamycynaGibco15710-64
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-03https://www.gelifesciences.com/
Roztwory soli fizjologicznej buforowanej fosforanemSigmaD8537
Szkiełka 8-komoroweLab-Tek-ll154534
R2R2 (cDE/cDE) czerwone krwinkiKanadyjskie służbyDostępne na rynku (np. , http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Poliklonalny anty-D z ludzkiej surowicyGamma BiologicsDIN 02247724Może być zastąpiony dostępnym w handlu monoklonalnym anty-D lub immunoglobuliną Rh
100% metanolCaledon6700-1-42
Żywicaalkoholu poliwinylowegoSigmaP8136Może być zastąpiony dostępnym w handlu uchwytem
UltraPure glicerynaInvitrogen15514-011
Szkiełka nakrywkoweVWR48366 067
Novaclone anty-IgGImmucorgamma5461023Opcjonalnie dla IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)
krwi

Bibliografia

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Fagocytoza zależna od receptorów Fcfagocytoza opopropośrednia przez przeciwciałamononuklearne komórki krwi obwodowejopsonizacja erytrocytówmikroskopia fazowo-kontrastowamikroskopia fluorescencyjnawestern blottinghamowanie immunoglobulinami dożylnymitest w medycynie transfuzjologicznej
Zastosowanie jednowarstwowego testu monocytowego monocytów do oceny fagocytozy za pośrednictwem receptora Fcγ
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.