In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Giovanna Muggiolu; Marina Simon; Nathanael Lampe; Guillaume Devès; Philippe Barberet; Claire Michelet; Marie-Hélène Delville; Hervé Seznec

doi:10.3791/55041

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55041

⸱

3 lutego 2018

Giovanna Muggiolu^*¹^,² , Marina Simon^*¹^,² , Nathanael Lampe¹^,² , Guillaume Devès¹^,² , Philippe Barberet¹^,² , Claire Michelet¹^,² , Marie-Hélène Delville³^,⁴ , Hervé Seznec¹^,²

¹Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), Université de Bordeaux, ²Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), CNRS, ³Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), CNRS, ⁴Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), Université de Bordeaux

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

Streszczenie

Techniki mikroanalityczne oparte na obrazowaniu pierwiastków chemicznych umożliwiają lokalizację i kwantyfikację składu chemicznego na poziomie komórkowym. Oferują one nowe możliwości charakterystyki żywych systemów i są szczególnie odpowiednie do wykrywania, lokalizacji i ilościowego określania obecności nanocząstek tlenków metali zarówno w próbkach biologicznych, jak i w środowisku. Rzeczywiście, wszystkie te techniki spełniają odpowiednie wymagania w zakresie (i) czułości (od 1 do 10 ^μg.g-1 suchej masy), (ii) rozdzielczości przestrzennej w zakresie mikrometrów oraz (iii) wykrywania wielopierwiastkowego. Biorąc pod uwagę te cechy, obrazowanie pierwiastków chemicznych mikrowiązką może stanowić doskonałe uzupełnienie rutynowych technik obrazowania, takich jak mikroskopia optyczna i fluorescencyjna. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić analizę mikrosondą jądrową na hodowanych komórkach (U2OS) wystawionych na działanie nanocząstek dwutlenku tytanu. Komórki muszą rosnąć i być wystawione bezpośrednio w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na próbkę używanym w mikroskopie optycznym i na etapach analizy mikrosondy jądrowej. Kriogeniczne utrwalanie próbek metodą wgłębnego zamrażania zachowuje zarówno organizację komórkową, jak i rozkład pierwiastków chemicznych. Jednoczesna analiza mikrosondy jądrowej (skaningowa transmisyjna mikroskopia jonowa, spektrometria wstecznego rozpraszania Rutherforda i emisja promieniowania rentgenowskiego indukowana cząstkami) wykonana na próbce dostarcza informacji o gęstości komórkowej, lokalnym rozmieszczeniu pierwiastków chemicznych, a także zawartości komórkowej nanocząstek. Istnieje rosnące zapotrzebowanie na takie narzędzia analityczne w biologii, zwłaszcza w rozwijającym się kontekście nanotoksykologii i nanomedycyny, w przypadku których konieczne jest pogłębienie naszego zrozumienia interakcji między nanocząstkami a próbkami biologicznymi. W szczególności, ponieważ analiza za pomocą mikrosondy jądrowej nie wymaga znakowania nanocząstek, obfitość nanocząstek jest mierzalna aż do poziomu pojedynczej komórki w populacji komórek, niezależnie od ich stanu powierzchniowego.

Wprowadzenie

Homeostaza komórkowa jest determinowana przez kontrolę wychwytu, asymilację i wewnątrzkomórkową lokalizację różnych pierwiastków śladowych (jonów, metali, egzogennych związków nieorganicznych). Składniki te często występują w postaci śladów, niemniej jednak mogą mieć znaczący wpływ na fizjologię układu. Tak więc badanie biochemii komórki zarówno w sytuacjach normalnych, jak i patologicznych/stresowych jest kluczowym krokiem w kierunku ogólnego zrozumienia komórkowych mechanizmów metabolicznych. W związku z tym konieczny staje się rozwój technik obrazowania i analiz umożliwiających badanie wewnątrzkomórkowych obfitości chemicznych, organizacji strukturalnej i związanyc....