Artykuł metodologiczny

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

DOI:

10.3791/55041

⸱

3 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), Université de Bordeaux, 2Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), CNRS, 3Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), CNRS, 4Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), Université de Bordeaux

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki mikroanalityczne oparte na obrazowaniu pierwiastków chemicznych umożliwiają lokalizację i kwantyfikację składu chemicznego na poziomie komórkowym. Oferują one nowe możliwości charakterystyki żywych systemów i są szczególnie odpowiednie do wykrywania, lokalizacji i ilościowego określania obecności nanocząstek tlenków metali zarówno w próbkach biologicznych, jak i w środowisku. Rzeczywiście, wszystkie te techniki spełniają odpowiednie wymagania w zakresie (i) czułości (od 1 do 10 μg.g-1 suchej masy), (ii) rozdzielczości przestrzennej w zakresie mikrometrów oraz (iii) wykrywania wielopierwiastkowego. Biorąc pod uwagę te cechy, obrazowanie pierwiastków chemicznych mikrowiązką może stanowić doskonałe uzupełnienie rutynowych technik obrazowania, takich jak mikroskopia optyczna i fluorescencyjna. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić analizę mikrosondą jądrową na hodowanych komórkach (U2OS) wystawionych na działanie nanocząstek dwutlenku tytanu. Komórki muszą rosnąć i być wystawione bezpośrednio w specjalnie zaprojektowanym uchwycie na próbkę używanym w mikroskopie optycznym i na etapach analizy mikrosondy jądrowej. Kriogeniczne utrwalanie próbek metodą wgłębnego zamrażania zachowuje zarówno organizację komórkową, jak i rozkład pierwiastków chemicznych. Jednoczesna analiza mikrosondy jądrowej (skaningowa transmisyjna mikroskopia jonowa, spektrometria wstecznego rozpraszania Rutherforda i emisja promieniowania rentgenowskiego indukowana cząstkami) wykonana na próbce dostarcza informacji o gęstości komórkowej, lokalnym rozmieszczeniu pierwiastków chemicznych, a także zawartości komórkowej nanocząstek. Istnieje rosnące zapotrzebowanie na takie narzędzia analityczne w biologii, zwłaszcza w rozwijającym się kontekście nanotoksykologii i nanomedycyny, w przypadku których konieczne jest pogłębienie naszego zrozumienia interakcji między nanocząstkami a próbkami biologicznymi. W szczególności, ponieważ analiza za pomocą mikrosondy jądrowej nie wymaga znakowania nanocząstek, obfitość nanocząstek jest mierzalna aż do poziomu pojedynczej komórki w populacji komórek, niezależnie od ich stanu powierzchniowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Homeostaza komórkowa jest determinowana przez kontrolę wychwytu, asymilację i wewnątrzkomórkową lokalizację różnych pierwiastków śladowych (jonów, metali, egzogennych związków nieorganicznych). Składniki te często występują w postaci śladów, niemniej jednak mogą mieć znaczący wpływ na fizjologię układu. Tak więc badanie biochemii komórki zarówno w sytuacjach normalnych, jak i patologicznych/stresowych jest kluczowym krokiem w kierunku ogólnego zrozumienia komórkowych mechanizmów metabolicznych. W związku z tym konieczny staje się rozwój technik obrazowania i analiz umożliwiających badanie wewnątrzkomórkowych obfitości chemicznych, organizacji strukturalnej i związanych z nimi funkcji metabolicznych. Bardzo niewiele metod jest w stanie dostarczyć ilościowych informacji in situ dotyczących ogólnego charakteru chemicznego danej próbki. Oprócz metod analizujących próbki w postaci masowej, analizy in situ uwzględniają próbki biologiczne pod względem ich integralności bez utraty informacji o masie i strukturze, zachowując w ten sposób ich składowe substancje chemiczne (pierwiastki śladowe i jony) oraz białka. Ponadto, wraz z dalszym rozwojem nanonauk, konieczne będzie udoskonalenie metod obrazowania i analiz do monitorowania środowiska na skali komórkowej w celu obserwacji i ilościowego określenia zachowań i interakcji nanoobiektów. 1

Nanocząstki (NPs) zostały zdefiniowane jako obiekty wykazujące co najmniej jeden wymiar twarzy w zakresie od 1 do 100 nm. 2 Ze względu na swoje szczególne właściwości fizykochemiczne, NP są szeroko stosowane w przemyśle. Nanocząsteczki są wykorzystywane w zastosowaniach biologicznych i w nanomedycynie. 3,4 Pomimo licznych właściwości fizykochemicznych nanocząsteczek, mogą one generować pewne ryzyko negatywnego wpływu na zdrowie ludzi i środowisko. Ryzyko to może być wywołane zarówno długotrwałym, jak i powtarzającym się narażeniem na różne poziomy stężeń, co nie zostało jeszcze jednoznacznie ustalone. 5,6,7,8 W szczególności los nanocząsteczek wewnątrz komórek i związane z nimi reakcje komórkowe nie są do tej pory w pełni opisane. Wynika to częściowo z niedoboru metod, które pozwalają na wykrywanie i kwantyfikację zinternalizowanych nanocząsteczek w pojedynczej komórce. 9

Klasycznymi narzędziami analitycznymi używanymi do szacowania dawki komórkowej nanocząstek są mikroskopy, spektrometria mas (MS), plazma indukcyjnie sprzężona MS (ICP-MS)10,11 i chromatografia cieczowa MS (LC-MS), ale dostarczają one tylko użytecznych informacji w skali makroskopowej. Żaden z nich nie jest w stanie zapewnić precyzyjnej oceny zawartości subkomórkowych nanocząsteczek ani rozmieszczenia nanocząsteczek bez zastosowania metod frakcjonowania. Systematyczna ocena dawka-odpowiedź jest zatem niemożliwa przy użyciu tych metod, w przeciwieństwie do metod opartych na spektroskopii atomowej, takich jak analiza mikrosondy jądrowej12,13, synchrotronowa mikroskopia fluorescencji rentgenowskiej14 i spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS). 15,16 Metody te są szczególnie interesujące, ponieważ uzupełniają obserwacje wykonane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zwłaszcza gdy NP nie mogą być znakowane cząsteczkami fluorescencyjnymi i dlatego są badane w swoim stanie naturalnym. Do pewnego stopnia, nawet gdy nanocząsteczki są szczepione fluoroforami, (i) kwantyfikacja pozostaje trudna, ponieważ poziom znakowania na NP jest nieznany oraz (ii) chemiczna modyfikacja powierzchni NP może modyfikować jej rozmieszczenie komórkowe.

W tym artykule skupiamy się na metodzie opartej na kombinacji technik mikrosond jądrowych, której celem jest zobrazowanie morfologii i składu pierwiastkowego próbek biologicznych w stężeniach głównych, mniejszych i śladowych.

Analiza mikrosondy jądrowej okazuje się szczególnie odpowiednia do pomiaru śladowych ilości pierwiastków chemicznych w tkankach biologicznych. Zarówno rozdzielczość poprzeczna wiązki (od 0,3 do 1 μm), jak i czułość w detekcji pierwiastków chemicznych (od 1 do 10 μg.g-1 s.m.) doskonale nadają się do badań na poziomie komórkowym. Techniki mikrosond jądrowych opierają się na wykrywaniu cząstek (fotonów, elektronów, jonów) emitowanych po tym, jak wiązka jonów (zwykle działająca z energią MeV) wchodzi w interakcję z atomami obecnymi w próbce. Oddziaływania zachodzące w komórkach to głównie: 1) wzbudzenie/jonizacja atomów, po której następuje emisja fotonów po powrocie atomów do stanu podstawowego; oraz 2) dyfuzja nadlatujących cząstek prowadząca do zmiany ich energii i kierunku. Pomiar energii emitowanych cząstek pozwala na identyfikację atomów biorących udział w oddziaływaniu. Aby wykonać mapowanie pierwiastków, mikrowiązka jonów jest wielokrotnie skanowana po powierzchni próbki, często na obszarze około 100 na 100μm2 zawierającym kilka komórek. Emitowane cząstki są wykrywane, a ich energia jest rejestrowana dla każdej pozycji wiązki. Sortowanie cząstek ze względu na położenie wiązki, a tym samym identyfikacja struktury odpowiedzialnej za emisję takich cząstek, jest celem przetwarzania danych. W tym miejscu dokładnie opisujemy podejście oparte na mikroskopii fluorescencyjnej i analizie mikrosondy jądrowej w celu wykrycia i ilościowego określenia egzogennych nanocząsteczek w skali komórkowej i subkomórkowej, w celu zbadania konsekwencji interakcji NP z żywymi organizmami. W szczególności skupimy się na możliwościach, jakie daje ta metoda w zakresie kwantyfikacji in situ agregatów nanocząstek dwutlenku tytanu (TiO2 NPs) na poziomie subkomórkowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie uchwytu na próbkę

  1. Projekt i przygotowanie uchwytu na próbkę
    1. Wykonaj uchwyt na próbkę, wiercąc kwadrat o wymiarach 5 mm x 5 mm w ramie z PEEK o grubości 1 mm.
    2. Czyścić przez spłukanie etanolem 70% (v/v) i przechowywać w sterylnych płytkach do momentu użycia.
      Nuta. Wymagany jest uchwyt na próbkę odpowiedni do hodowli komórkowej i obchodzenia się z komórkami. Musi być zaprojektowany do hodowli komórek, obserwacji in vitro za pomocą mikroskopii optycznej oraz analizy i obrazowania za pomocą mikrosondy jądrowej. Ten uchwyt jest wykonany z ramki PEEK13.
  2. Przygotowanie uchwytu na próbkę
    1. Przygotować roztwór Formvaru, rozpuszczając 1 mg proszku Formvar w 100 ml chloroformu.
    2. Rozciągnij folię poliwęglanową na metalowej ramie, aby nie przedstawiała fałd
      3. .
    3. Za pomocą sterylnej końcówki rozprowadzić roztwór Formvar wokół otworu uchwytu na próbkę.
    4. Delikatnie połóż uchwyt na próbkę z klejem na rozciągniętej folii poliwęglanowej (kwadrat o wymiarach 5 mm x 5 mm).
    5. Powtórz poprzednią sekwencję, aby przygotować jeden uchwyt na próbkę dla każdej kontrpróby.
      Nuta. Folia poliwęglanowa (PC) jest biokompatybilna, wystarczająco gruba i odporna na różne protokoły i ograniczenia analityczne.
      Uwaga- Chloroform jest toksyczny. Unikać wdychania, połknięcia lub kontaktu ze skórą. Zawsze używaj prawidłowo działającego dygestorium chemicznego i odpowiednich filtrów.
  3. Sterylizacja uchwytu na próbkę
    1. Umieścić zamontowany uchwyt na próbkę w stożkowej kolbie z 50 ml etanolu o stężeniu 70% (v/v) pod mieszaniem przy 180 obr./min i temperaturze +37 °C przez noc, używając inkubatora/mieszadła.
    2. Opłucz uchwyt kilka razy w sterylnej wodzie destylowanej.
    3. Wysuszyć je na powietrzu w sterylnych warunkach i wystawić na działanie światła ultrafioletowego (lampa bakteriobójcza z ławki Biosafety, klasa II) przez 30 minut z każdej strony.
    4. Próbki należy przechowywać w sterylnych płytkach 12-dołkowych (po jednym uchwycie na próbkę na studzienkę) do momentu użycia.
      nuta: Wiele uchwytów na próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej na sterylnych i suchych płytkach 12-dołkowych zamkniętych parafilmem przez kilka dni.

2. Wzrost komórek w odpowiednim uchwycie na próbkę.

Uwaga: Protokół musi być przeprowadzony na stanowisku bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym (klasa II), aby wykluczyć skażające mikroorganizmy. Z antybiotykami (np. penicyliną, streptomycyną) należy obchodzić się w rękawiczkach. Przestrzegaj najlepszych praktyk podczas obchodzenia się z materiałami biologicznymi (linie komórkowe, genetycznie zmodyfikowane komórki ludzkie).

Krytyczne: Użyte linie komórkowe powinny być sprawdzone, aby upewnić się, że nie są zainfekowane Mykoplazmą.

  1. Transfekcyjna linia komórkowa U2OS z łożyskiem plazmidowym Matrix-roGFP 17,18,19 przy użyciu metody transfekcji zgodnie z protokołem ustalonym przez producenta.
  2. Aby potwierdzić transfekcję za pomocą biosensora przenoszącego plazmid i zapobiec utracie plazmidu, należy wybrać i utrzymywać transfekowane komórki na odpowiedniej pożywce hodowlanej.
  3. Wizualizacja transfekowanych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby upewnić się, że transfekcja nastąpiła i potwierdzić ekspresję fluorescencji oraz wyświetlanie siatkowatej i rurkowej sieci mitochondrialnej19.
    Punkt pauzy: Komórki można zamrażać w ciekłym azocie przez kilka lat.
  4. Wykorzystać transfekowaną populację komórek, hodując komórki w odpowiednim podłożu w celu uzyskania subkonfluentnych populacji komórek. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% (v/v) CO2 w nasyconej atmosferze wody.
  5. Komórki nasienne w stężeniu, takim jak 80% zbieganie się w dniu utrwalenia. Zazwyczaj można zastosować stężenie 500 komórek na μl. Zebrać komórki za pomocą 400 μl Trypsin-EDTA 0,25% (v/v) i przechowywać przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać działanie trypsyny za pomocą 1 ml pożywki hodowlanej. Osadzać komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 230 x g i temperaturze +4 °C, następnie usunąć supernatant i dodać żądaną objętość świeżej pożywki hodowlanej.
    nuta.Protokół ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, a liczba zasiewanych komórek zależy od wielkości komórki i czasu podwojenia komórki.
    ostrożność: Unikaj poddawania trypsyny, antybiotyków i surowicy powtarzającym się cyklom zamrażania i rozmrażania. Utrzymuj je w sterylności. Podzielić roztwór podstawowy na podwielokrotności i zamrozić je w temperaturze -20 °C. Przechowywać podwielokrotności do daty ważności. Ostrożnie wypłucz osad komórkowy, aby całkowicie usunąć trypsynę. Ślady resztkowej trypsyny opóźnią i zmniejszą wydajność powlekania.
  6. Policzyć komórki i przeprowadzić rozcieńczenie świeżą, kompletną pożywką hodowlaną utrzymywaną w temperaturze 37 °C w celu uzyskania zawiesiny komórek zawierającej 500 komórek na μl.
    nuta: Stężenie zawiesiny komórek musi być dostosowane w zależności od typu komórki, aby uzyskać kroplę o pojemności 40 μl.
  7. Umieść kroplę o pojemności 40 μl na środku folii poliwęglanowej. Ostrożnie umieścić próbkę na 2 godziny w temperaturze +37 °C, 5% (v/v) CO2 w nasyconej atmosferze wodnej.
    Krytyczne: Po umieszczeniu próbki w inkubatorze należy w jak największym stopniu ograniczyć ruchy mechaniczne, aby sprzyjać szybkiemu przyczepianiu komórek. W zależności od typu ogniwa może być konieczna inkubacja komórek dłuższa niż 2 godziny w celu uzyskania optymalnej wydajności posiewu. Sprawdź, czy atmosfera inkubatora jest dobrze nasycona, aby zapobiec parowaniu kropli.
  8. Sprawdź, czy komórki są dobrze przymocowane do folii poliwęglanowej za pomocą mikroskopu optycznego. Delikatnie dodaj 2 ml świeżej, kompletnej pożywki i przechowuj przez 24 godziny.

3. Przygotowanie i ekspozycja nanocząstek

UWAGA: Modyfikowane barwnikiem fluorescencyjnym TiO2 NPs zostały zaprojektowane, zsyntetyzowane i chemicznie zmodyfikowane izotiocyjanianem tetrametylu rodaminy (TRITC). 20,21 Ta modyfikacja powierzchni umożliwia wykrywanie, śledzenie i lokalizację nanocząstek in situ i w celulolo, zarówno w żywych, jak i stałych komórkach lub w organizmach wielokomórkowych. 12,13,18

Uwaga: Z nanomateriałami i nanocząstkami należy obchodzić się ostrożnie. Unikać wdychania, połknięcia lub kontaktu ze skórą. Aby zapobiec rozprzestrzenianiu się w powietrzu, nanocząstki są utrzymywane w roztworze (woda ultraczysta).

  1. Przygotować zawiesinę 1 mg.mL−1 nanocząsteczekTiO2 w ultraczystej wodzie. Rozproszyć nanocząsteczki TiO2 za pomocą intensywnych 1-minutowych impulsów sonicznych o częstotliwości RT (750 W, 20 kHz, amplituda: 30%) za pomocą generatora ultradźwięków i dedykowanej stożkowej mikrosondy.
  2. Rozcieńczyć TiO2 NPs w żądanym stężeniu w pożywce hodowlanej w celu uzyskania zawiesiny ekspozycyjnej 4 μ g.cm-2 (stężenie końcowe). Zastąp pożywkę odpowiednią objętością pożywki zawierającej nanocząsteczki na komórkach i delikatnie wymieszaj w celu uzyskania jednorodnego rozprowadzenia nanocząsteczek TiO2. Przygotuj komórki kontrolne w podobny sposób bez dodatku nanocząsteczek TiO2.
  3. Inkubować populacje komórek przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% (v/v) CO2 i w nasyconej atmosferze wodnej.

4. Utrwalanie paraformaldehydu i mikroskopia fluorescencyjna.

  1. Przygotować świeży roztwór roztworu paraformaldehydu (PFA, 4% w/v) buforowany w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS, pH 7,4).
    1. Rozpuścić 4 g proszku PFA w 100 ml PBS. Podgrzać roztwór do temperatury 65 °C, mieszając za pomocą magnesu i mieszadła magnetycznego w dygestorium. Zwiększ pH, dodając 1 M NaOH po jednej kropli na raz, aż roztwór się klaruje. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i dostosować pH do 7,4. Świeżo przygotowany roztwór należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze +4 °C i chronić przed światłem.
      nuta: Można użyć gotowych roztworów PFA, jednak doraźne przygotowanie PFA gwarantuje lepszą jakość wiązania i długotrwałą konserwację utrwalonych próbek.
      ostrożność: PFA jest toksyczny; Unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą. Zawsze używaj prawidłowo działającego dygestorium chemicznego i odpowiednich filtrów.
  2. Po upływie czasu inkubacji usunąć pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą TiO2 NPs. Przepłukać populacje komórek raz świeżą pożywką hodowlaną, a raz PBS (2 ml). Usunąć PBS, szybko spłukać porcją świeżego i zimnego PFA (4% w/v, +4 °C).
    1. Dodać PFA (2 ml, 4% m/v, +4 °C). Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć PFA, przepłukać komórki PBS (2 ml, 3 razy, 5 min) pod mieszaniem.
      Punkt pauzy: Te chemicznie utrwalone próbki mogą być używane do procedury "wgłębnego zamrażania" po obrazowaniu fluorescencyjnym (przejdź do kroku 5) lub tylko do obrazowania fluorescencyjnego (przejdź do kroku 4.3).
  3. Wybarwić jądro za pomocą Hoechst33342, inkubując komórki przez 10 minut w PBS. Hoescht33342 stosuje się w końcowym stężeniu 500 nM. Po inkubacji usunąć roztwór i spłukać PBS.
    ostrożność: Hoechst33342 jest przepuszczalny dla komórek i może być toksyczny. Unikaj bezpośredniego kontaktu i używaj rękawiczek podczas przygotowywania i używania Hoechst33342.
    Krytyczne: Upewnij się, że roztwór barwiący Hoechst33342 jest świeżo przygotowany i przechowywany w sterylnych warunkach.
  4. Przetwarzaj utrwalone próbki do obrazowania in situ i pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 1).

5. "Zamrażanie wgłębne" Fiksacja i odwodnienie

  1. Przygotuj aluminiową płytę transferową, schładzając ją w ciekłym azocie. Przechowuj płytkę w pudełku wypełnionym ciekłym azotem i utrzymuj powierzchnię płytki nad cieczą w zimnej parze azotu.
    nuta: Płyta transferowa może być wykonana z dowolnej metalowej płyty (tutaj użyliśmy aluminium), która może być schłodzona do temperatury ciekłego azotu i która może wejść do komory próbki liofilizatora.
    Krytyczne: Pudełko powinno być zamknięte tak bardzo, jak to możliwe, aby zapobiec osadzaniu się pary wodnej na zimnej powierzchni płyty. Próbka przechowywana na płytce podczas przygotowywania nie powinna być pokryta ciekłym azotem.
  2. Opłucz komórki raz w pożywce hodowlanej, a następnie jeszcze dwa razy, krótko, w sterylnej i ultraczystej wodzie, aby pozbyć się wszelkich śladów pozostałych soli zewnątrzkomórkowych.
    Krytyczne: Upewnij się, że podłoża są świeżo przygotowane i przechowywane w sterylnych warunkach. Podgrzej wszystkie media w temperaturze 37 °C przed użyciem. Płukanie musi być bardzo krótkie (kilka sekund), a nadmiar płynu z próbek usunięty tak szybko, jak to możliwe.
  3. Zamrozić komórki w temperaturze -150 °C w 2-metylobutanie chłodzonym ciekłym azotem przez 30 s i umieścić je na aluminiowej płycie transferowej. Próbki należy przechowywać w tym miejscu podczas przygotowywania wszystkich innych próbek. Gdy wszystkie próbki są już kriofiksowane, przenieś je wszystkie naraz, umieszczając płytkę transferową w liofilizatorze.
    Krytyczne: Cały proces kriofiksacji nie powinien trwać dłużej niż 20 minut, aby zapobiec pojawieniu się zmian strukturalnych w próbkach tymczasowo przechowywanych w skrzynce rozdzielczej.
  4. Próbki należy liofilizować w celu liofilizacji, stosując następujące sekwencje: 1) przeprowadzić wstępne suszenie przez 12–24 godzin (-99 °C, 10–3 mbar) pod niskim ciśnieniem i w niskiej temperaturze, następnie 2) przeprowadzić wtórną fazę suszenia przez co najmniej 24 godziny, zwiększając temperaturę płytki do +40 °C, utrzymując ciśnienie na niskim poziomie (+40 °C, 10-3 mbar).
    ostrożność: Ciekły azot jest bardzo zimny i może spowodować poważne odmrożenia lub uszkodzenie oczu w kontakcie. Do transportu należy używać dostosowanych kontenerów stołowych i nosić sprzęt ochronny (rękawice kriogeniczne, ochrona oczu i twarzy).
    Uwaga: 2-metylobutan jest skrajnie łatwopalny. Do szkodliwego zanieczyszczenia powietrza można dojść dość szybko po odparowaniu tej substancji w temperaturze +20 °C. Unikać wdychania, spożycia lub kontaktu ze skórą. Stosować ochronę dróg oddechowych i oczu oraz rękawice ochronne. Zawsze używaj prawidłowo działającego okapu wyciągowego z chemikaliów. Może być przechowywany w temperaturze +4 °C.
    Krytyczne: Użyj odpowiedniego termometru (-150 °C) do monitorowania temperatury 2-metylobutanu podczas sesji "Zamrażania wgłębnego". 2-metylobutan musi być przechowywany w chłodnym stanie w fazie ciekłej. Przenoszenie próbek kriofiksowanych do atmosfery otoczenia może spowodować uszkodzenie komórek z powodu wzrostu temperatury lub kondensacji pary wodnej na powierzchni próbki. W związku z tym przelew powinien zostać wykonany tak szybko, jak to możliwe (30 s)
    Punkt pauzy: Po kriofiksacji próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni w sterylnych i suchych warunkach (chronionych przed kurzem i wilgocią). Ostrożnie obchodzić się z próbkami za pomocą cienkich kleszczyków i umieścić je na sterylnej 12-dołkowej płytce uszczelnionej parafilmem. Środek osuszający może być używany do osuszania atmosfery.

6. Analiza mikrosondy jądrowej

UWAGA: Analiza mikrosondy jądrowej została przeprowadzona na linii mikrowiązek AIFIRA (Applications Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine) przy użyciu uzupełniających technik analitycznych wiązki jonów Emisja promieniowania rentgenowskiego indukowana cząstkami (μ-PIXE) oraz skaningowa transmisyjna mikroskopia jonowa (μ-STIM). Obiekt oparty jest na akceleratorze cząstek o mocy 3,5 MV dostarczającym wiązki jonów świetlnych w zakresie energii MeV. 22,23

Punkt pauzy: AIFIRA to urządzenie wykorzystujące wiązkę jonów prowadzone przez Uniwersytet w Bordeaux, które oferuje dostęp do krajowych i międzynarodowych zespołów po naukowej ocenie proponowanego eksperymentu.

  1. Zamontuj uchwyty na próbki PEEK na płytce z otworem za pomocą taśmy dwustronnej.
  2. Umieścić płytkę podtrzymującą próbkę w płaszczyźnie pionowej prostopadłej do kierunku wiązki.
  3. Zamknąć komorę analityczną i odkurzyć komorę analizy.
  4. Skaningowa transmisyjna mikroskopia jonowa (μ-STIM)
    UWAGA: STIM służy do zapisu map gęstości powierzchniowej komórek po przeliczeniu strat energii na masę komórkową, wykorzystując fakt, że strata energii jest proporcjonalna do gęstości powierzchniowej próbki (wyrażonej w μ g.cm-2).
    1. Użyj mikrowiązki helu (He+) o energii 2 MeV (He+) jako sondy o średnicy około 300 nm w płaszczyźnie ogniskowej i niskiej płynności (2000 jonów.s-1). Zmierz energię przesyłanych jonów za pomocą płaskiego detektora krzemowego (detektor PIPS, 25 mm2, rozdzielczość energii 11 keV @ 5,4 MeV), umieszczonego za próbką w osi wiązki.
  5. Emisja promieniowania rentgenowskiego indukowana cząstkami (μ-PIXE) i spektrometria rozpraszania wstecznego Rutherforda (μ-RBS).
    UWAGA: Analizy μ-Pixe i μ-RBS zapewniają przestrzenny rozkład i kwantyfikację pierwiastków chemicznych z rozdzielczością submikrometrową.
    1. Użyj mikrowiązki protonów (H+) o energii 1,5 MeV (50-150 pA), skupionej do średnicy 1 μm i zeskanuj te same interesujące nas komórki dostrzeżone przez STIM od 4 do 8 godzin i około 100 x 100μm2.
    2. Zbieraj indukowane fotony promieniowania rentgenowskiego emitowane z atomów obecnych w próbce (cięższych niż Na) za pomocą detektora półprzewodnikowego Si(Li) o wysokiej rozdzielczości (rozdzielczość energii 145 eV, @Mn-Kα) umieszczonego pod kątem 45° od osi wiązki przychodzącej. Wykorzystaj wykrytą energię fotonów do określenia charakteru emiterów (np. Z pierwiastka) i intensywności promieniowania rentgenowskiego, aby określić stężenie pierwiastka.
    3. Jednoczesne zbieranie wstecznie rozproszonych protonów pod kątem -135° za pomocą detektora krzemowego (detektor częściowo zubożony, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) w celu zmierzenia całkowitej liczby nadlatujących cząstek i normalizacji intensywności promieniowania rentgenowskiego.
      Krytyczne: W celu kalibracji odpowiedzi detektora promieniowania rentgenowskiego wykorzystuje się zbiór certyfikowanych wzorców kalibracyjnych do oznaczania ilościowego stężenia atomowego. Materiały referencyjne to zbiór cienkich warstw atomowych osadzonych na foliach Mylar o grubości 6,3 μm. Emitowane energie promieniowania rentgenowskiego mieszczą się w zakresie od 0,6 (linia Li, K) do 20,2 keV (linia Rh, K).

7. Analiza danych

  1. Zrekonstruuj mapy pierwiastków chemicznych za pomocą wtyczki IBA-J do ImageJ. 24
    UWAGA: Dedykowane oprogramowanie w postaci wtyczki do ImageJ zostało opracowane do przetwarzania surowych danych z analizy mikrosondy jądrowej. Surowe dane odpowiadają liście zdarzeń wynikających z interakcji wiązki cząstek z komórkami, które są rejestrowane wraz z położeniem wiązki jako sekwencja chronologiczna.
    1. Użyj wtyczki IBA-J, aby posortować zdarzenia według ich typu: energia jonów przesyłanych (STIM), energia jonów rozpraszanych wstecznie (RBS) lub energia fotonów promieniowania rentgenowskiego (PIXE). Następnie przetwarzaj oddzielnie każdy typ danych.
    2. Obliczać Mapa gęstości obszaru STIM
    3. Oblicz średnie widma energii fotonów promieniowania rentgenowskiego i zdefiniuj dla każdego pierwiastka chemicznego będącego przedmiotem zainteresowania okno energetyczne, aby uzyskać rozkład przestrzenny pierwiastka.
    4. Zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) (np. pojedyncze komórki, gęsta struktura, agregaty itp.) i oblicz odpowiednie widma promieniowania rentgenowskiego.
  2. Przeanalizuj odpowiednie widma RBS, aby obliczyć całkowitą liczbę padających cząstek25.
  3. Dopasuj widma rentgenowskie za pomocą oprogramowania Gupix26 w celu określenia stężenia pierwiastka dla każdego ROI.
    UWAGA: Typowa granica wykrywalności (LOD) dla metody mieści się w zakresie od 1 do 10 μg.g-1 w suchej masie w zależności od liczby atomowej pierwiastków (LOD maleje wraz z Z).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórkowa i obrazowanie fluorescencyjne fluorescencyjnie znakowanych NP TiO2

Zaprojektowaliśmy uchwyt na próbki przystosowany do hodowli komórek, obsługi komórek, a także do analizy multimodalnej. W szczególności ważne było, aby posiadacz umożliwiał rutynową mikroskopię optyczną, a także analizę i obrazowanie za pomocą mikrosondy jądrowej. Ten uchwyt na próbk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę dostarczającą użytecznych informacji wykraczających poza to, co jest możliwe w przypadku innych technik obrazowania, zwłaszcza na poziomie subkomórkowym. Oprócz możliwości obrazowania, analiza mikrosondą jądrową oferuje również możliwości ilościowego oznaczania pierwiastków chemicznych wchodzących w skład próbki biologicznej. W niniejszej pracy badaliśmy populacje komórek ludzkich i skupiliśmy się na analizie wybranego regionu zainteresowania na podstawie pojedynczej komórki wystawionej na działanie nano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Serge'owi Borderesowi za reżyserię i montaż filmu. Francuska Narodowa Agencja Badawcza wspiera program badawczy TITANIUMS (ANR CES 2010, nr CESA 009 01). CNRS i Wspólnota Europejska jako działalność integrująca zapewniły "Wsparcie badań publicznych i przemysłowych z wykorzystaniem technologii wiązki jonowej (SPIRIT)" w ramach umowy WE nr 227012. Prace te były wspierane przez działania Marie Curie - Sieci Szkolenia Początkowego (ITN) jako "Działanie integrujące badania podyplomowe ze stażami w przemyśle i doskonałością szkoleniową" (SPRITE, D1.3) w ramach umowy WE nr 317169. C'NANO Grand Sud Ouest i Region Akwitanii wspierają program badawczy TOX-NANO (nr 20111201003) oraz program badawczy POPRA (nr 14006636-034).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hodowla komórkowa
U2OSATCC, STANDARDY LGCATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A bez L-glutaminyDominique DUTSCHERL0211-500
FBS 500 mLDominique DUTSCHER500105U
Penicylina/Streptomycyna ThermoFisher Scientific11548876
  L-Glutamina 200 mM, 100 mL Invitrogen25030024
Geneticin,  20 mlThermoFisher Scientific10092772
Trypsin-EDTA 0,25% (v/v)  500 mLThermoFisher Scientific11570626
Viromer RedLipocalyxVR-01LB-01
Plazmid Matrix-roGFPAddGene#49437
Hoechst 33342ThermoFisher ScientificH3570Ostrożnie
się obchodzićNPs przygotowanie
TiO2 P25 AEROXIDEDegussa/Evonik
Izotiocyjanian tetrametylorodaminy (TRITC)SIGMA-ALDRICHT3163Modyfikacja powierzchni NPs
Przygotowanie próbki
Folia poliwęglanowaGoodfellowCT301020
Polieteroeter Keton (PEEK)MatechplastA-239-4047
Etanol, Absolut ACSSIGMA-ALDRICH02860-6x1L
Chlorform, Bezwodny, 99%SIGMA-ALDRICH372978-1L Uwaga: toksyczny
Formvar 100 gAgar ScientificAGR1201Szkodliwy. Stosować w stężeniu 10 &mikro; g na ml chloroformu
NaOHSIGMA-ALDRICHS5881-500G
Utrwalanie próbki
proszek, 95% ParaformaldehydSIGMA-ALDRICH158127-500GUwaga toksyczny. Stosować jako 4% roztwór w PBS
PBS (pH 7,4, bez Ca2+ i Mg2+)ThermoFisher Scientific11503387
Prolong Gold Odczynnik przeciw blaknięciuThermoFisher ScientificP36934
Triton X-100SIGMA-ALDRICH93443Szkodliwy
Kriofiksacja próbki
Ciekły azotw powietrzu Szkodliwy
metylobutan >=99%SIGMA-ALDRICH  M32631-1LUwaga toksyczny
Aluminiowa płyta transferowaDomowej roboty
Woda destylowana i dejonizowanaDomowej robotyWyprodukowano w laboratorium przy użyciu systemu Barnstead Smart2Pure
ParafilmVWR52858-000
Equipment
Barnstead Smart2PureThermoFisher Stanowisko bezpieczeństwa biologicznego Scientific50129870
, klasa IIThermoFisher ScientificMSC-Advantage
TC20 automatyczny licznik komórekBiorad145-0102SP
Szkiełka zliczające 2 dołkiDetektor Biorad1450016
PIPS, 25 mm2, rozdzielczość energetyczna 12 keV @5,5 MeVCanberra PD25-12-100AM
Detektor półprzewodnikowy Si (Li) o wysokiej rozdzielczości, rozdzielczość 145-eVenergy, @Mn-Kαtypu Everhart-Thornley firmy Oxford Instruments
 Orsay Physics1-SED
Wzorzec kalibracji XRF sód lub chlor jako mikromateria NaCl34381
Wzorzec kalibracji XRF Magnez jakomikromateria34382
Standard kalibracji XRF Aluminium jakomikromateria34383
Wzorzec kalibracji XRF Krzem jakomikromateria34384
Wzorzec kalibracji XRF Siarka jako CuSxMicromatter34385
Standard kalibracji XRF Wapń jako CaF2Micromatter34387
Standard kalibracji XRF Tytan jako metal TiMikromateria34388
XRF Kalibracja Iron as Fe metalMicromatter34389
Sonicator 750WSonics Materials11743619
Mikrosonda 3MMBioblock scientific220-05
Liofilizator w próżniElexienceEK3147
Mikroskop optyczny Zeiss AxioObserver Z1Carl Zeiss MicroImaging, GmbH431006-9901
Zmotoryzowany stolik xyCarl Zeiss MicroImaging, GmbH432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0,50 Ph2 M27 obiektywCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Obiektyw Ph3M27Carl Zeiss MicroImaging, GmbH420781-9910
Zestaw filtrów Zeiss 02Carl Zeiss MicroImaging, GmbH488002-9901
Zestaw filtrów Zeiss 38HECarl Zeiss MicroImaging, GmbH489038-9901
Zestaw filtrów Zeiss 31Carl Zeiss MicroImaging, GmbH000000-1031-350
Wyciąg chemicznyErlabCaptair SD321
Akcelerator cząstekHVEEsingletron
Software
ImageJ oprogramowanieNational Institutes of health, USAImageJ 1.51
Oprogramowanie SimNRAMax-Planck-Institut fü r Plasmaphysik, NiemcySIMNRA 6.06
Oprogramowanie GupixUniwersytet Guelph, KanadaGUPIXWIN 2.2.4
Detektor elektronów wtórnych (SED) MgF2 metalu SiO

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , Elsevier Ltd. (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135(2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanocz steczki dwutlenku tytanutransmisyjna mikroskopia jonowa z szybkim skanowaniememisja promieni rentgenowskich indukowana cz stkamispektroskopia Rutherforda wstecznego rozpraszaniautrwalanie kriogenicznemikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie pierwiastk w chemicznychuchwyt do hodowli kom rkowych

Powiązane artykuły