Artykuł metodologiczny

Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - Plazma sprzężona indukcyjnie - Spektrometria mas (LA-ICP-MS)

23.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55042

⸱

22 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Elemental Bio-imaging Facility, University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne, 3Department of Pathology, The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences, The University of Melbourne, 5Research School, Ruhr University, 6Department of Physiology, Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

W tym artykule

Podsumowanie

Ilościowe mapowanie metali w tkance za pomocą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS) to czuła technika analityczna, która może dostarczyć nowego wglądu w to, jak metale uczestniczą w normalnych funkcjach i procesach chorobowych. W tym miejscu opisujemy protokół ilościowego obrazowania metali w cienkich odcinkach tkanki neurologicznej myszy.

Streszczenie

Metale są powszechnie spotykane w organizmie, a ich biologiczna rola jest podyktowana zarówno ich reaktywnością chemiczną, jak i obfitością w określonym regionie anatomicznym. W mózgu metale mają wysoce podzieloną dystrybucję, w zależności od podstawowej funkcji, jaką pełnią w ośrodkowym układzie nerwowym. Obrazowanie przestrzennego rozmieszczenia metali dostarczyło unikalnego wglądu w architekturę biochemiczną mózgu, umożliwiając bezpośrednią korelację między regionami neuroanatomicznymi a ich znaną funkcją w odniesieniu do procesów zależnych od metali. Ponadto kilka zaburzeń neurologicznych związanych z wiekiem charakteryzuje się zaburzoną homeostazą metali, która często ogranicza się do małych obszarów mózgu, które w przeciwnym razie są trudne do analizy. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodę ilościowego obrazowania metali w mózgu myszy, wykorzystującą ablację laserową - plazmę sprzężoną indukcyjnie - spektrometrię mas (LA-ICP-MS) oraz specjalnie zaprojektowane oprogramowanie do przetwarzania obrazu. Koncentrując się na żelazie, miedzi i, które są trzema najliczniejszymi i najważniejszymi metalami istotnymi dla chorób w mózgu, opisujemy podstawowe etapy przygotowania próbek, analizy, pomiarów ilościowych i przetwarzania obrazu w celu stworzenia map rozmieszczenia metali w zakresie rozdzielczości o niskiej rozdzielczości mikrometrowej. Technika ta, mająca zastosowanie do każdego przekroju tkanki, jest w stanie wykazać bardzo zmienny rozkład metali w narządzie lub układzie i może być wykorzystana do identyfikacji zmian w homeostazie metali i poziomach bezwzględnych w drobnych strukturach anatomicznych.

Wprowadzenie

Unikalna chemia redoks metali ułatwia szereg funkcji neurologicznych, w tym transdukcję sygnału, produkcję energii i syntezę neuroprzekaźników. W wielu głównych chorobach neurodegeneracyjnych dyshomeostaza tych metali została zarówno zaangażowana w patogenezę choroby, jak i zidentyfikowana jako potencjalne nowe cele interwencji terapeutycznej1. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób metale są zaangażowane w stany takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona (odpowiednio AD i PD), konieczne jest zmierzenie, jak zmienia się rozmieszczenie i poziomy metali w regionach, na które niekorzystnie wpływa proces chorobowy. Zmiany te często wskazują na subtelne zmiany w reakcjach biochemicznych, które mogą być ściśle związane z procesami inicjującymi śmierć komórki, takimi jak nasz niedawno zaproponowany mechanizm neurotoksyczności żelaza i dopaminy w PD2.

Tradycyjnie, poziomy metali w określonych obszarach anatomicznych zostały osiągnięte poprzez staranne wycięcie, trawienie i analizę przy użyciu szeregu technik analitycznych3. Jednak takie podejście powoduje utratę informacji przestrzennej, która może mieć kluczowe znaczenie, gdy badane stany chorobowe obejmują małe, dobrze zdefiniowane regiony lub określone typy komórek. Dostępnych jest wiele metod analitycznych do wizualizacji metali w układach biologicznych, od nienaruszonych próbek po skrawki tkanek oraz w dwóch i trzech wymiarach, przy użyciu spektroskopii emisyjnej, sond fluorescencyjnych i spektrometrii mas4. Każda technika ma zalety i wady dotyczące czułości, selektywności związków chemicznych i rozdzielczości przestrzennej, którą można osiągnąć. Aby uzyskać pełny przegląd zakresu dostępnych technik, zobacz przegląd autorstwa Hare i wsp.5.

Metody oparte na spektrometrii mas (MS) są najbardziej czułą z tych technik, zdolną do pomiaru najbardziej istotnych biologicznie metali w ich natywnym stężeniu6. Obrazowanie ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS) wykorzystuje skupioną wiązkę lasera ultrafioletowego o średnicy od 1 do >100 μm (lub szerokości, gdy używany jest kształt wiązki czworobocznej), pod którą przechodzi próbka7. Informacje ilościowe można uzyskać poprzez reprezentatywną ablację standardowych materiałów referencyjnych, które mogą być wytwarzane przy użyciu różnych podejść8, z których każde ma inny stopień trudności technicznej i praktyczności analitycznej. Najpowszechniejsze podejście wykorzystuje dopasowywanie matrycy, w którym wzorzec o dominującym składzie chemicznym porównywalnym do składu próbki jest przygotowywany przez wzbogacanie docelowym analitem i dokładnie oceniany pod kątem jednorodności i bezwzględnego stężenia metalu za pomocą niezależnych metod analitycznych9,10. Ablacja przygotowanych wzorców może być następnie wykorzystana do celów kalibracji zewnętrznej, co pozwala na wyodrębnienie danych o stężeniu z wynikowego obrazu próbki na piksel.

Rozdzielczość obrazu zależy zarówno od wielkości wiązki, jak i prędkości, z jaką próbka jest skanowana. Standardowy ICP-MS o konstrukcji kwadrupolowej (który stanowi ponad 90% wszystkich zainstalowanych systemów ICP-MS na całym świecie11) jest sekwencyjnym analizatorem masy, w którym detektor masy przechodzi przez wszystkie wybrane proporcje masy do ładunku (m/z), zamiast zbierać dane jednocześnie. W związku z tym czas akwizycji dla każdego cyklu mas musi być równy czasowi potrzebnemu na pokonanie przez próbkę jednej szerokości wiązki laserowej, aby zapewnić uzyskanie piksela reprezentatywnego dla pożądanej rozdzielczości12. Wybór wielkości wiązki laserowej jest kluczowym parametrem, który ma znaczący wpływ zarówno na czułość, jak i całkowity czas analizy. Ponieważ ablacja laserowa fizycznie usuwa materiał, który jest zmiatany do ICP-MS przez gaz nośny argonu, ilość materii, która może być fizycznie wykryta przez analizator masy, jest zgodna z prawem odwrotności kwadratu. Na przykład zmniejszenie średnicy wiązki laserowej z 50 - 25 μm powoduje czterokrotne zmniejszenie ablowanego materiału. Dodatkowo, jako metoda skanowania, mniejsze średnice wiązki wydłużają całkowity czas potrzebny na ablację wybranego obszaru. W związku z tym projekt eksperymentalny jest niezbędny, aby zrównoważyć niezbędną rozdzielczość przestrzenną z potrzebami w zakresie czułości i ograniczeniami czasowymi.

Obrazowanie za pomocą LA-ICP-MS zostało zastosowane do szeregu próbek, matryc i stanów chorobowych, w tym do zwierzęcych modeli zaburzeń neurologicznych13,14, urazowe uszkodzenie mózgu15, dystrybucja leków przeciwnowotworowych zawierających metale16, narażenie na toksyny w łożysku17 i rozkład metali w zębach jako biomarker diety we wczesnym okresie życia Przejścia. 18 W tym protokole opisujemy ogólną metodę obrazowania żelaza, miedzi i w mózgu myszy WT w rozdzielczości 30 μm, choć można ją łatwo dostosować do różnych typów próbek i wyników eksperymentów, w zależności od potrzeb analityka.

Protokół

Procedury opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Howarda Floreya i są zgodne ze standardami opieki nad zwierzętami Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych.

1. Przygotowanie próbki do analizy

UWAGA: Ten krok różni się w zależności od próbki do analizy.

  1. Przygotowanie i podział na sekcje próbek
    UWAGA: Utrwalanie przy użyciu 4% paraformaldehydu (PFA) i krioprotekcja w 30% sacharozy w 0,1 M PBS spowoduje różne ilości wypłukiwania metali z tkanki. Zobacz Hare et al19, aby uzyskać szczegółowe informacje. Upewnij się, że wszystkie próbki przeszły identyczne etapy utrwalania i krioochrony.
    1. Przezsercową perfuzję zwierzęcia poddanego eutanazji lodowato zimnym 0,1 M PBS, pH 7,4 (patrz sekcja Metody w Dodt i wsp.20 po szczegóły) i usuń mózg.
    2. Umieść mózg w 4% PFA O/N, aby utrwalić tkankę.
    3. Krioprotekcjonalna mózg umieszczając go w 30% sacharozie w 0,1 M PBS przez 24 godziny, a następnie zmień na świeżą 30% sacharozę na kolejne 24 godziny.19
    4. Zamrozić mózg w kriosacie w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
    5. Zamontuj mózg na uchwycie za pomocą odpowiedniego medium montażowego.
    6. Przekrój mózg na kriostat za pomocą jednorazowego ostrza bez metalu (np. noże pokryte politetrafluoroetylenem [PTFE]) i zamontuj na standardowym szkiełku mikroskopowym. Optymalna grubość przekroju powinna wynosić około 30 μm.
  2. W przypadku stosowania próbek zatopionych w parafinie, należy je przeciąć na żądaną grubość, przenieść wstęgę na ciepłą kąpiel wodną i zamontować na standardowych szkiełkach mikroskopowych.
    UWAGA: Dokładne efekty długotrwałego utrwalania i zatapiania parafiny w próbkach biologicznych nie są znane. Jak opisano w ppkt 1.1, należy upewnić się, że wszystkie próbki zostały poddane identycznym procedurom przygotowania próbek, jeżeli planowana jest analiza porównawcza.
    1. Odwoskować próbki zatopione w parafinie, zanurzając szkiełko w 3 przemianach ksylenu, po 1 zmianie każda: 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i co najmniej 3 przemianach w ISO 3696 lub równoważnej wodzie oczyszczonej (zwanej dalej "wodą"; patrz Hare i wsp.21 dla metody szczegółowej).
  3. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu przez około 1 godzinę w środowisku wolnym od kurzu, takim jak pudełko na szkiełka, w którym próbki są umieszczone pionowo w stojakach, a pokrywka pozostaje uchylona.

2. Przygotowanie wzorców dopasowanych do matrycy

UWAGA: Poniżej znajduje się wcześniej opublikowany protokół podsumowujący9. Prosimy o zapoznanie się z oryginalnym artykułem, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania wzorców tkanek dopasowanych do matrycy.

  1. Zdobądź komercyjne mózgi jagnięce (lub podobne) i spłucz w wodzie, usuwając całą krew i tkankę łączną.
  2. Za pomocą skalpela ostrożnie wypreparuj około 50 g tkanki korowej i częściowo homogenizuj za pomocą ręcznego homogenizatora tkanek z jednorazową sondą z poliwęglanu o małej mocy. Podzielić na porcje po 5 g, których liczba zależy od zakresu kalibracji i liczby żądanych punktów kalibracji.
  3. Przygotuj roztwory metali, aby zwiększyć każdy wzorzec, rozpuszczając rozpuszczalną sól każdego analitu (np. FeSO4·H2O) w 1% kwasie azotowym w celu wytworzenia 0,1, 1 i 100 mg metalu mL-1.
  4. Dodać wstępnie obliczoną objętość roztworu podstawowego do porcjowanej tkanki o masie 5 g (np. 5 μl 10 mg mL-1 dla przybliżonego końcowego stężenia 10 μg g-1 mokrej tkanki), aby uzyskać zakres poziomów wzbogaconych metali w każdym wzorcu.
    1. W zależności od pożądanego stężenia końcowego każdego wzorca, należy użyć kombinacji każdego roztworu podstawowego metalu, aby zapewnić dodanie minimalnej ilości roztworów do wzorca. Dodaj ostatni skok wody do każdego wzorca, aby upewnić się, że w każdym wzorcu znajdują się równoważne objętości dodanego płynu.
    2. Homogenizować wzory z kolcami na małej mocy przez około 30 s. Jeśli nie mają być użyte natychmiast, przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C w zakorkowanych probówkach polipropylenowych uszczelnionych Parafilmem.
  5. Określić dokładne stężenie i jednorodność każdego wzorca, stosując jedną z następujących procedur:
    1. Roztwarzanie w kuchence mikrofalowej
      1. Umieścić 6 dokładnie zważonych (około 50 mg) podwielokrotności wzorca w umytym naczyniu do wytrawiania PTFE i dodać 4 ml stężonego (65%) kwasu azotowego i 1 ml 30% nadtlenku wodoru. Uszczelnić i wytrawić w temperaturze 500 W przez 30 minut.
      2. Po schłodzeniu naczynia do wytrawiania otworzyć wyciąg i przenieść ilościowo strawiony roztwór do przemytej kwasem probówki o pojemności 50 ml przy użyciu 10 ml podwielokrotności wody. Uzupełnić do około 50 ml i dokładnie zważyć masę końcowego roztworu.
      3. Powtórz kroki od 2.5.1.1 do 2.5.1.2 dla każdej normy.
    2. Jeśli sprzęt do mineralizacji mikrofalowej nie jest dostępny, należy zastosować następującą procedurę:
      1. Umieścić sześć dokładnie odmierzonych (między 25 - 200 mg) podwielokrotnościami wzorca w probówce polipropylenowej mytej kwasem/bez metalu i liofilizować O/N.
      2. Dodać 40 μl stężonego kwasu azotowego i podgrzewać, bez nakrętki, na bloku grzewczym do temperatury 70 °C przez 5 minut, a następnie dodać 10 μl 30% nadtlenku wodoru. Podgrzewać przez kolejne 5 minut, a następnie dokładnie uzupełnić do 1 ml całkowitej objętości za pomocą 950 μl 1% kwasu azotowego.
        UWAGA: Zaleca się trawienie certyfikowanego materiału referencyjnego przy użyciu wybranej metody, aby zapewnić dokładność procedur trawienia.
  6. Oznaczyć stężenie metalu w każdym roztworze mineralizowanym przez nebulizację roztworu ICP-MS przy użyciu standardowego protokołu. Oceń jednorodność każdego wzorca, określając względne odchylenie standardowe (%RSD) między każdą podwielokrotnością. Upewnij się, że wszystkie %RSD mieszczą się w granicach 15%. Korzystając ze zmierzonej masy każdej podwielokrotności, obliczyć dokładne stężenie metalu w każdym homogenizowanym wzorcu tkankowym.
  7. Wracając do standardu homogenizowanej tkanki, zapakuj plastikową jednorazową formę histologiczną o wymiarach 5 x 5 mm i zamroź w izopentanie schłodzonym ciekłym azotem. Wyjąć zamrożony blok tkanki wzorcowej z formy i podzielić na kriostat o tej samej grubości co próbka.
    Uwaga: Zaleca się przygotowanie kilku sekcji o różnej grubości do przyszłych eksperymentów. Wzorce suszone na powietrzu można przechowywać przez czas nieokreślony w szczelnym i wolnym od kurzu pojemniku.

3. Przygotowanie LA-ICP-MS do analizy

  1. Umieścić wzorce i próbkę w komorze ablacyjnej, upewniając się, że mieszczą się w głębi ostrości kamery CCD zamontowanej w jednostce LA. Jeśli konieczne jest strojenie instrumentu, dołącz odpowiedni materiał referencyjny (np. NIST 612 Trace Elements in Glass). Dokręć palcami dwie na drzwiach komory, aby uszczelnić komorę ablacyjną.
  2. W oprogramowaniu ICP-MS wybierz opcję otwórz zawór argonu w panelu "Konserwacja" lub podobnym i ustaw przepływ gazu nośnego na 1,2 l min-1 w odpowiednim oknie dialogowym.
    UWAGA: W tym protokole jako gaz nośny stosuje się argon. W kilku przykładach jako gaz nośny wykorzystuje się hel lub mieszaninę helu i argonu. Zobacz Günther and Heinrich22, aby uzyskać szczegółowe informacje techniczne dotyczące stosowania mieszanin helu i argonu jako gazów nośnych w aerozolu.
  3. W oprogramowaniu LA kliknij przycisk "usuń", aby przepłukać ogniwo argonem przez co najmniej 30 minut.
    UWAGA: Czas czyszczenia można zmienić, klikając przycisk "czas czyszczenia" lub podobny. W przypadku korzystania z systemu ablacyjnego z dwuobjętościową komorą ablacyjną, należy okresowo przesuwać stolik do każdego rogu i przechodzić po przekątnej komórki, aby upewnić się, że jak najwięcej powietrza resztkowego zostało usunięte z komórki. Można to osiągnąć, wybierając "home stages" lub równoważną funkcję.
  4. Włącz ICP-MS, klikając "plazma włączona" i pozwól mu się rozgrzać przez dwie godziny, podczas których można wykonać kroki 3.5 - 4.4. Ustawienia przyrządów różnią się w zależności od producenta, chociaż przykład odpowiednich warunków pracy LA-ICP-MS można znaleźć w Hare i wsp.10.
  5. Reprezentatywna ablacja wzorców tkanek
    1. Wybierz narzędzie do tworzenia linii i narysuj pojedynczą linię ablacji o długości około 3 mm na powierzchni tkanki.
    2. Ustaw parametry w następujący sposób, klikając prawym przyciskiem myszy linię ablacji na liście eksperymentów i zmieniając następujące: średnicę wiązki (wybraną odpowiednio przez użytkownika; używana jest tutaj wiązka kwadratowa 30 μm), prędkość skanowania (4-krotność średnicy wiązki na sekundę; 120 μm s-1) i fluencję energii (0,3 -0,5 J cm-2 dla tkanek miękkich; zoptymalizuj w razie potrzeby dla twardszych matryc). Przy grubości tkanki 30 μm wiązka lasera nie przenika przez całą grubość tej tkanki, eliminując wszelkie potencjalne zanieczyszczenia ze podłoża mikroskopu. Normalizacja do carbon23 może być użyta do skorygowania różnic w ilości tkanki, która została poddana ablacji. Ustaw te parametry jako domyślne dla każdego kolejnego wiersza, wybierając przycisk radiowy "domyślne".
    3. Zduplikuj ten wiersz sześć razy, wybierając początkową linię, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając "zduplikowane skany". Upewnij się, że linie są przesunięte na osi x lub y przez średnicę belki. Daje to w sumie siedem linii na standard, rozmieszczonych w odstępach zgodnie ze średnicą belki.
    4. Powtórz kroki 3.5.1 - 3.5.3 dla każdego wzorca, upewniając się, że linia ma identyczną długość.
  6. Aby narysować obszar ablacji nad próbką, postępuj zgodnie z jedną z dwóch następujących metod:
    UWAGA: Upewnij się, że te same parametry skanowania (średnica wiązki, prędkość skanowania, fluencja energii) są używane dla linii próbkowania.
    1. Jeżeli system LA jest wyposażony w szerokie pole widzenia, wybrać narzędzie do tworzenia linii i narysować linię od lewego górnego rogu próbki wystarczająco długą, aby pokryć próbkę w jej najszerszym punkcie, używając tych samych parametrów lasera, które przedstawiono w ppkt 3.5. Powtórzyć ten skan w sposób opisany w ppkt 3.5.3 z liniami rozmieszczonymi zgodnie ze średnicą wiązki tyle razy, ile jest to konieczne, aby zapewnić pełne pokrycie próbki.
    2. Jeżeli widok szerokiego pola widzenia nie jest dostępny, należy określić i zapisać współrzędne x i y (zwykle wyświetlane na ekranie głównym jako "pozycja stołu montażowego" lub podobne) odpowiadające narożnikom prostokąta pokrywającego całą próbkę. Współrzędne te służą do wyznaczenia równoległych linii ablacji obejmujących cały obszar próbki, jak opisano w ppkt 3.7.1.
    3. Narysować linie do przerywanego skanowania wzorców najpóźniej po ~20 godzinach skanowania próbki, powtarzając proces opisany w ppkt 3.5. W zależności od czasu skanowania próbki może to być wymagane wielokrotnie. Zakończ eksperyment dodatkowym skanem standardów.
      UWAGA: Podczas określania współrzędnych x i y podczas czyszczenia komórki, wybór pozycji początkowych i związana z tym kalibracja osi zmieni wcześniej uzyskane szczegółowe współrzędne x i y, podczas gdy różnica (tj. długość linii) pozostanie niezmieniona.

4. Ustawianie metod pozyskiwania danych dla ICP-MS

  1. W przypadku standardowej linii ablacji należy podzielić długość linii przez prędkość skanowania laserowego, aby określić całkowity czas analizy dla pojedynczej linii. Powtórz tę czynność dla linii próbkowania.
  2. W oprogramowaniu ICP-MS utwórz nową metodę (pokazaną tutaj jako "wsad") i upewnij się, że wybrano opcję "analiza czasowo-rozdzielcza" lub jej odpowiednik. Wybierz wartości m/z, które mają zostać wykryte, a następnie dostosuj czas całkowania dla każdego m/z tak, aby całkowity czas całkowania dla jednego cyklu wynosił 0,25 s. Kliknij "Zapisz partię jako" i nazwij odpowiednio (np. Std1).
    UWAGA: Ponieważ próbka będzie przechodzić przez wiązkę laserową z prędkością czterokrotnie większą od średnicy wiązki, zapewnia to rejestrację punktu danych dla każdej masy odpowiadającego średnicy wiązki12. Na przykład, przy użyciu rozmiaru plamki 100 μm, prędkość skanowania 400 μm s-1 z czasem integracji 0,25 s pozwoli uzyskać obrazy o rzeczywistych rozmiarach pikseli. Czas integracji można dostosować w celu poprawy czułości; Przy zwiększaniu czasu integracji do 0,33 s prędkość skanowania powinna zostać zmniejszona do trzykrotności średnicy wiązki.
  3. W przypadku norm wprowadź czas analizy dla każdej linii skanowania w odpowiednim polu oraz dodatkowe 15 sekund, aby uwzględnić czas nagrzewania i wymywania lasera. Wprowadź przykładową listę przebiegów (tj. kolejność, w jakiej są uruchamiane skanowania) z taką samą liczbą przejęć (zwykle ponumerowanych sekwencyjnie; tj. 001, 002 itd.) jako łączna liczba linii standardowych.
  4. W przypadku próbki zduplikuj metodę używaną dla wzorców, zapisując bieżącą metodę lub partię z alternatywną nazwą pliku, a następnie dostosuj całkowity czas akwizycji (w tym dodatkowe 15 s) i łączną liczbę akwizycji, aby dopasować liczbę linii, które będą ablować próbkę.
    UWAGA: Ponieważ większość systemów LA-ICP-MS wykorzystuje wyzwalacz jednokierunkowy (LA wyzwala ICP-MS), ważne jest, aby oprogramowanie ICP-MS oczekiwało na wyzwolenie z LA przed rozpoczęciem kolejnej linii ablacji. W oknie akwizycji ICP-MS pojawi się komunikat "oczekiwanie na start".

5. Przeprowadzanie eksperymentu

  1. Uruchom kolejkę ICP-MS, dodając pierwszą metodę lub partię do kolejki i upewnij się, że oprogramowanie oczekuje na wyzwalacz z systemu LA.
  2. W oprogramowaniu LA włącz zasilanie lasera, klikając "emisja", kliknij "uruchom" i ustaw czas nagrzewania lasera na 10 s i czas wymywania na 20 s w odpowiednich skrzynkach.
    Uwaga: To przekroczenie zapewni, że ICP-MS będzie gotowy do rozpoczęcia pozyskiwania nowych danych, gdy laser rozpocznie każdą kolejną linię ablacji.
  3. Rozpocznij sekwencję laserową, klikając "start". Jeśli używasz kuwety o dwóch objętościach, upewnij się, że kubek na próbkę jest na swoim miejscu.

6. Obliczanie wzorców ilościowych

UWAGA: Istnieje wiele wariantów konwersji danych ICP-MS na obrazy. Obejmują one korzystanie z domowych narzędzi programowych napisanych w językach open source17,24,25, komercyjne makra26 oraz oprogramowanie do analizy danych. 7 Tutaj użyj ostatnio opracowanej wtyczki oprogramowania (opisanej w Paul et al.27), na podstawie specjalistycznego zestawu do analizy danych LA-ICP-MS28.

  1. Przenieś wszystkie foldery wsadowe zawierające dane uruchomienia (001.d, 002.d itd.) na oddzielny komputer z zainstalowanym oprogramowaniem analitycznym. Wyodrębnij pliki danych *.csv dla każdego wiersza partii do osobnego folderu.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się użycie skryptu do automatycznego przesyłania plików *.csv do nowego folderu. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz załączony kod języka Python. Ten skrypt został napisany tak, aby pasował do Agilent 7700 lub 8800 Series ICP-MS, ale może być edytowany tak, aby pasował do pliku wyjściowego innych producentów.
  2. Otwórz platformę oprogramowania i postępuj zgodnie z zakładkami sekwencyjnie, aby zaimportować i przeanalizować standardy w celu uzyskania obrazów ilościowych, jak opisano poniżej.
  3. Aby zaimportować dane z pierwszej standardowej partii, wybierz "Agilent .csv" jako "Typ pliku", "Cały folder" jako "Typ importu" i sprawdź, czy "Format daty" jest identyczny z formatem komputerowym. Kliknij "Importuj", wybierz folder zawierający pliki .csv dla pierwszego zestawu standardów i przejdź do zakładki "Linie bazowe".
  4. Odejmowanie linii bazowej
    1. Skorzystaj z zakładki "Wybór automatyczny" (polecenie 2) z głównego menu rozwijanego aplikacji na pasku narzędzi, wybierz "Informacje z importu" i kliknij "Kontynuuj".
    2. Kliknij "Zaznacz wszystko" i wybierz "Baseline_1" do integracji.
    3. Aby wybrać pierwsze 10 s każdej linii skanowania (odpowiadające czasowi nagrzewania lasera), przytnij dane, wprowadzając drugie wartości "0" i "(czas trwania linii - 10 s)" i kliknij "Dodaj integracje" (np. dla linii skanowania 35 s wprowadź wartości "0" i "25").
  5. Aby wybrać przykładowe dane, użyj zakładki "Automatyczne wybory" zgodnie z opisem w 6.4, ale wybierz "Output_1" jako integrację. Przytnij dane od początku i końca każdej standardowej linii, aby wykluczyć sygnał tła (np. dla linii skanowania trwającej 35 sekund wprowadź wartości "13" i "4").
  6. Aby wykluczyć spadki sygnału spowodowane ewentualnymi w standardach, w zakładce 'Samples' kliknij 'Channels' w lewym górnym rogu obszaru wykresu, aby wybrać kanał o wysokim stosunku sygnału do szumu (np. C13 lub P31). Zanotuj wszelkie gwałtowne spadki sygnału i wybierz wartość CPS na tyle niską, która jest poniżej normalnej zmienności w próbkach, ale wystarczająco wysoką, aby wychwycić ostre spadki sygnału.
  7. Kliknij zakładkę "DRS" i wybierz "Baseline_Subtract" dla "Aktualnego schematu redukcji danych". Wybierz kanał od 6.6 dla "Index Channel" i wartość CPS dla "Threshold do użycia podczas maskowania słabych sygnałów". Wstaw wartość <0,5 s dla opcji "Sekundy do trymowania przed/po słabych sygnałach", aby uwzględnić opóźnienie w przesyłaniu sygnału z lasera do ICP-MS.
  8. Aby potwierdzić odpowiednie maskowanie obszarów o niskim sygnale, kliknij z powrotem na zakładkę 'Samples' i wybierz przetworzony (np. Fe56_CPS) ślad kanału. W razie potrzeby powtórzyć i doprecyzować wartości CPS i "Sekundy do przycięcia przed/po niskich sygnałach", jak w ppkt 6.7.
  9. Kliknij zakładkę "Wyniki" i wybierz "Eksportuj dane" z głównego menu rozwijanego aplikacji. Wprowadź nazwę pliku, aby wygenerować plik danych arkusza kalkulacyjnego z wynikami (np. obliczenia Std1, Std2...).
  10. Otwórz plik danych w odpowiednim programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i oblicz wartości CPS dla każdego kanału, który ma zostać określony ilościowo. Użyj wstępnie określonych stężeń metali z nebulizacji roztworu ICP-MS, aby obliczyć współczynnik konwersji z wartości CPS na ppm (μg g-1) dla każdego pierwiastka mierzalnego.
  11. Powtórz kroki od 6.3 do 6.10 dla wszystkich zestawów standardów w przebiegu.

7. Konstruowanie obrazów ilościowych

  1. Pisać "Biolite()" w wierszu polecenia, aby otworzyć oprogramowanie.
  2. Zaimportuj przykładowe dane, klikając "Załaduj obrazy" i wybierając folder zawierający pliki .csv dla przykładowego obrazu.
  3. Korekcja tła
    1. Kliknij kartę "Linie bazowe", aby zastosować korekcję tła dla próbki. Na obrazie fosforu (P31) wyświetlanym na ekranie zaznacz obszary tła za pomocą narzędzia do rysowania prostokąta. Wybranie tak wielu obszarów, jak to możliwe, tworzy mapę dryfu sygnału/plazmy obejmującą cały obraz, aby zapewnić odpowiednią kompensację tych czynników zakłócających.
    2. Aby sygnał tła był bardziej widoczny, wybierz narzędzie do edycji wykresu (lewy górny róg wyświetlanego obrazu) i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Wybierz opcję "Modyfikuj wygląd obrazu" i zmień "Pierwszy kolor przy Z=" na dużą wartość ujemną (np. -100 000). Kontynuuj, klikając "Gotowe".
  4. Kliknij zakładkę "Standardy", aby wyświetlić tabelę współczynników korekcyjnych CPS/ppm. Wprowadź wartości obliczone na podstawie norm w kroku 6.10 dla każdego z elementów. Ten krok pomoże skorygować odchylenie czułości w ICP-MS. Kliknij przycisk "Idź!".
  5. Otwórz "Przeglądarkę danych" z zakładki "Dane", która zawiera obrazy dla każdego elementu i każdego kroku.
  6. Aby sfinalizować obraz do eksportu, wybierz żądany obraz w folderze "StdCorrImages", kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę obrazu (*_ppm) i kliknij "Nowy obraz". Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, aby otworzyć "Modyfikuj wygląd obrazu", aby wybrać żądaną tabelę kolorów i skalę kolorów. Dodaj skalę kolorów do obrazu, klikając obraz prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję "Dodaj adnotację". Wybierz "ColorScale" z menu rozwijanego w lewym górnym rogu i użyj zakładek, aby zmodyfikować żądaną skalę kolorów.
  7. Aby wyeksportować obraz, upewnij się, że dany obraz jest zaznaczony i przejdź do zakładki "Plik" i kliknij "Zapisz grafikę...". Wybierz żądany format i zapisz obraz. Alternatywnie wybrany obraz można przesłać za pomocą narzędzi do kopiowania i wklejania.
  8. Powtórz kroki 7.6 i 7.7 dla wszystkich interesujących obrazów.
  9. Kwantyfikacja regionów dyskretnych
    1. Aby aktywować narzędzia ROI, przejdź do zakładki "Analiza", "Pakiety" i wybierz "Przetwarzanie obrazu".
    2. Wybierz żądany obraz i przejdź do zakładki "Obraz" i kliknij "ROI...". Kliknij "Rozpocznij rysowanie ROI" i użyj narzędzia do rysowania, aby wybrać interesujący Cię obszar w próbce. Aby zakończyć rysowanie, kliknij "Zakończ ROI".
    3. Aby uzyskać statystyki dla wybranego ROI, przejdź do zakładki "Obraz" i kliknij "Statystyki...".
    4. Skopiuj wyniki i wklej je do osobnego arkusza kalkulacyjnego. Powtórz wybór ROI (7.9.2) dla wszystkich regionów i elementów będących przedmiotem zainteresowania.

Wyniki

Aby zademonstrować możliwości tej metody obrazowania LA-ICP-MS, przedstawiono prosty eksperyment z wykorzystaniem pojedynczego przekroju mózgu myszy WT C57BL/6, przedzielonego w obrębie społoadczewkowego ciała modzelowatego i wycięcia w płaszczyźnie czołowej. Opisano również schemat analizy danych przy użyciu programu Biolite (Rysunek 1), zgodnie z opisem w sekcjach 6 i 7, a także sposób uzyskania reprezentacyjnego obrazu rozkładu metali w analizowanym przekroju (Rysunek 2).

Jak widać, rozkład metali w mózgu myszy jest zróżnicowany w zależności od regionu anatomicznego. Można to przypisać różnym rolom, jakie metale, a ściślej białka, z którymi są one związane, pełnią w każdym regionie mózgu27. Na przykład żelazo wykazuje tendencję do wyższych stężeń w śródmózgowiu oraz wzdłuż zakrętu zębatego, podczas gdy cynk występuje najobficiej w obszarach korowych. Węgiel, powszechnie stosowany jako standard wewnętrzny8, jest rozmieszczony jednorodnie. Mapy pierwiastkowe (Rycina 2) mogą być szczególnie użyteczne w połączeniu z istniejącymi atlasami anatomicznymi i funkcjonalnymi29, gdzie informacje o kolokalizacji metali oraz ekspresji specyficznych białek wiążących metale mogą dostarczyć wiedzy na temat funkcji metali w obrębie regionu mózgu lub zmian poziomów metali w korelacji z zidentyfikowaną biomolekułą związaną z chorobą. Zastosowanie opisanego podejścia, zoptymalizowanego dla szerszego zakresu analitów, wiąże się z ograniczeniem czułości dla pierwiastków występujących w niskich ilościach, takich jak mangan; metody te można jednak dostosować tak, aby skupić się głównie na tym analitycie, zwiększając czasy przebywania kosztem innych pomierzanych mas.

Główną zaletą wykorzystania obrazowania metodą LA-ICP-MS jest możliwość obserwacji względnych różnic w stężeniu i rozmieszczeniu metali pomiędzy grupami eksperymentalnymi. Wcześniej wykorzystaliśmy tę technikę do wykazania wzrostu poziomu żelaza po podaniu neurotoksyny imitującej PD2,10 oraz zmian w poziomie żelaza w korze mózgowej w tkance ludzkiej z chorobą Alzheimera21. Opisany tutaj protokół można łatwo zaadaptować do dowolnego innego rodzaju tkanki, wprowadzając minimalne poprawki do wymienionych metod.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przetwarzania obrazów. Schemat uzupełniający sekcje 6 i 7, przedstawiający konwersję surowych danych rozdzielczych w czasie z ICP-MS na ilościowe obrazy rozkładu metali w mózgu myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Typowy rozkład pierwiastkowy biometali w mózgu myszy. Reprezentatywne mapy pierwiastków z koronalnego przekroju półkuli mózgu jednej myszy o grubości 30 µm, analizowanego za pomocą LA-ICP-MS. Obrazy dla węgla-13 (C13), magnezu-24 (Mg24) i fosforu-31 (P31) przedstawione w złotych skalach kolorystycznych (liczba zliczeń na sekundę; CPS) (górny rząd). Obrazy ilościowe (dolny rząd) dla manganu-55 (Mn55), miedzi-63 (Cu63), żelaza-56 (Fe56) i cynku-66 (Zn66) przedstawione w odpowiadających im skalach kolorystycznych BlueHot (µg g-1). Całkowity czas analizy przekroju mózgu wynosił około 5 h. Pasek skali = 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Uzupełniający plik kodu 1. Kod Python o otwartym kodzie źródłowym opisany w sekcji 6.1, który można modyfikować za pomocą odpowiedniego edytora Python w zależności od metody eksportu danych producenta ICP-MS. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Obrazowanie metali w tkance neurologicznej to tylko jeden z przykładów tego, jak ten protokół może dostarczyć użytecznych informacji na temat rozmieszczenia i ilości metali w dowolnej matrycy biologicznej. Chociaż przygotowanie standardowych materiałów referencyjnych może być żmudne, jest to eksperyment, który można przeprowadzić jednorazowo i zarchiwizować do późniejszego wykorzystania.

LA-ICP-MS ma pewne zalety w porównaniu z alternatywnymi metodami, takimi jak synchrotronowa mikroskopia fluorescencyjna rentgenowska, głównie pod względem dostępności i czułości. Istnieją jednak pewne wady, które należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania eksperymentu z użyciem LA-ICP-MS, i jako taka jest często przydatną techniką uzupełniającą do obrazowania chemicznego, która obejmuje alternatywne techniki analizy metali, a także histochemię porównawczą5.

Zgodność ze znanymi cechami anatomicznymi mózgu myszy może dostarczyć użytecznych informacji na temat możliwego związku funkcjonalnego między poziomami metalu a rozmieszczeniem przestrzennym. Wcześniej korzystaliśmy z internetowego zasobu Allen Brain Atlas, który jest ogólnodostępnym repozytorium danych anatomicznych i ekspresji genów w mózgu myszy C57BL/6 w celu zbadania korelacji przestrzennej zarówno ekspresji enzymów zależnych odmetalu14, jak i neuroanatomii27,30. Dostępne są również inne zasoby, takie jak Rodent Brain WorkBench31, które pomagają w rejestracji i ustawianiu obrazów metali, aby pomóc w prawidłowej identyfikacji rozmieszczenia metalu w często małych obszarach anatomicznych.

Zastosowania tej techniki są przydatne w ocenie, jak zmieniają się poziomy i dystrybucja metali w mikroskali zarówno podczas normalnych zdarzeń życiowych (np. starzenie się), jak i w stanach chorobowych; a także badanie wpływu zarówno związków zawierających metale, jak i leków zaprojektowanych do celowania w metabolizm metali. Obecnie głównymi ograniczeniami LA-ICP-MS jako techniki obrazowania do przestrzennej oceny rozkładu metali są przepustowość i czułość. Istnieje kompromis między szybkością analizy a rozdzielczością przestrzenną 5,12, przy czym obrazy o wyższej rozdzielczości wymagają dłuższego czasu analizy. Technika ta jest dobrze dostosowana do pierwiastków biologicznych w wyższych stężeniach, chociaż pierwiastki takie jak mangan, kobalt i selen są ograniczone ze względu na ich niską obfitość w normalnych tkankach i/lub ograniczenia w ich wykrywaniu przez konwencjonalny ICP-MS. Nowe osiągnięcia w technologii ICP-MS, takie jak wprowadzenie analizatorów masy z potrójnym kwadrupolem, pozwalają na ukierunkowane wykrywanie trudnych analitów, takich jak selen32 przy wyższych czułościach33. Postęp zarówno w projektowaniu spektrometrii laserowej, jak i spektrometrii mas będzie polegał na dalszym rozwoju tej techniki obrazowania, zwiększając szybkość analizy i czułość34.

Oświadczenia

RWH i COC są opłacanymi pracownikami ESI Ltd., FF i TPH są opłacanymi pracownikami Agilent Technologies Australia.

Podziękowania

DJH i PAD są wspierane przez Australian Research Council Linkage Project (LP120200081) z Agilent Technologies i ESI Ltd. Wkład BK został wsparty przez Szkołę Badawczą Uniwersytetu Ruhry PLUS, finansowaną przez niemiecką Inicjatywę Doskonałości [DFG GSC 98/3]. DJH był częściowo wspierany przez Fundację Ramaciottiego. KK jest wspierany przez Fundację Sigrid Juselius.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka mikroskopowe ze szkła sodowegonieTypowe szkiełka są odpowiednie do wszystkich eksperymentów
Ostrza mikrotomowe pokryte PTFEC.L. StuckeyDT315R50Rozmiar ostrza zależy od uchwytu ostrza kriostatu. Sprawdź przed złożeniem zamówienia.
Parafomaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich16005Dowolny dostawca odpowiedni
SacharozaniedotyczyNie dotyczy Odpowiedni jest biały cukier klasy handlowej
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma-AldrichP5368Wymienione wstępnie zmieszane saszetki, które można przygotować zgodnie z normalnymi protokołami laboratoryjnymi
KsylenSigma-Aldrich247624Dowolny dostawca odpowiedni
EtanolSigma-AldrichE7023Dowolny dostawca odpowiedni
Mózg jagnięcyniedotyczyDostępny u większości lokalnych rzeźników
Sole metaliniedotyczydotyczy Używaj rozpuszczalnych w wodzie soli metali zawierających pożądane anality
Homogenizator tkankowy Omni THOmni IncTHP115Odpowiednie są alternatywne homogenizatory
Sondy homgenizatora z poliwęglanuOmni IncTH115-PCRH
Mikrofalowe urządzenie do wytrawianianie dotyczyOpcjonalnie. Patrz rozdział 2
Probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 mlTechnoPlasP4010Rurki polipropylenowe bez metalu. Odpowiednie są również probówki myte kwasem
65% kwas azotowyMerk Millipore100441Klasa do analizy śladowej
30% nadtlenek wodoruSigma-Aldrich95321analizy śladowej
10 x 10 mmTed Pella27181
IzopentanSigma-Aldrich76871
Ciekły azotnie dotyczynie dotyczyZastosowanie lokalny dostawca
NWR213 System ablacji laserowejESI Ltdn/aUżywany w tych eksperymentach. Inni producenci odpowiedni, mogą wymagać modyfikacji protokołu
Agilent 8800 Series ICP-MSAgilent Technologiesn/aUżywany w tych eksperymentach. Inni producenci odpowiedni, mogą wymagać modyfikacji protokołu
IoliteIolite Softwaren/aDostępne od http://iolite-software.com/. Dostępne są inne metody, patrz protokół
ExcelMicrosoftn/a
IGOR ProWave Metricsn/aDostępne od https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm
dotyczy Jednorazowe krioformy do

Bibliografia

  1. Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
  2. Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
  3. Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
  4. New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
  5. Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
  6. Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
  7. Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912(2005).
  8. Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
  9. Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
  10. Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53(2009).
  11. Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690(2008).
  12. Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159(2012).
  13. Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
  14. Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
  15. Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
  16. Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
  17. Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
  18. Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
  19. Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
  20. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
  21. Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
  22. Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
  23. Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
  24. Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
  25. Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
  26. Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
  27. Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
  28. Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508(2011).
  29. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  30. Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
  31. Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4(2007).
  32. Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
  33. Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
  34. Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

LA ICP MSobrazowanie metali w tkance m zgowejilo ciowa analiza metalianaliza przekroj w tkankowychmapowanie rozk adu metalidetekcja elaza miedzi i cynkuprotok przygotowania pr bekoprogramowanie do przetwarzania danychmetoda analizy ROIbadania nad chorobami neurodegeneracyjnymi

Powiązane artykuły