Model inwazji okołonerwowej w raku płaskonabłonkowym głowy i szyi

Podsumowanie

Inwazja okołonerwowa (PNI) jest powszechną cechą raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC), powodując niższe wskaźniki przeżycia. Jego mechanizmy są słabo poznane. Wykorzystując neuryty generowane z mysich zwojów korzenia grzbietowego ograniczonych do półstałej matrycy, można badać szlaki zaangażowane w PNI linii komórkowych HNSCC.

Streszczenie

Inwazja okołonerwowa (PNI) występuje w około 40% raków płaskonabłonkowych głowy i szyi (HNSCC). Pomimo leczenia multimodalnego z chirurgią, radioterapią i chemioterapią, nawroty lokoregionalne i przerzuty odległe występują częściej, a całkowite przeżycie jest zmniejszone o 40% w porównaniu z HNSCC bez PNI. Badania in vitro szlaków zaangażowanych w HNSCC PNI były historycznie trudne ze względu na brak spójnego, powtarzalnego testu. Opisano tutaj adaptację testu zwoju korzenia grzbietowego (DRG) do badania PNI w HNSCC. W tym modelu DRG są zbierane z kręgosłupa złożonej w ofierze nagiej myszy i umieszczane w półstałej matrycy. W ciągu kolejnych dni generowane są neuryty, które rosną promieniście z ciał komórkowych DRG. Linie komórkowe HNSCC są następnie umieszczane obwodowo wokół macierzy i atakują preferencyjnie wzdłuż neurytów w kierunku DRG. Metoda ta pozwala na szybką ocenę wielu schorzeń leczenia, przy bardzo wysokich wskaźnikach powodzenia testu i odtwarzalności.

Wprowadzenie

Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi (HNSCC) jest szóstym najczęściej występującym nowotworem w USA, z 10 000 zgonów rocznie w kraju i 300 000 zgonów rocznie na całym świecie¹. Ogólne rokowanie dla HNSCC pozostaje niezmienione na poziomie 50% od kilku dekad. Inwazja okołonerwowa (PNI) jest jedną z najbardziej widocznych cech patologicznych, które zwiastują złe rokowanie u pacjentów z HNSCC. Niestety, PNI jest częstym zjawiskiem w HNSCC i można go znaleźć nawet u 40% pacjentów z HNSCC^2,3.

PNI to proces, w którym złośliwe komórki podążają wzdłuż nerwów do sąsiednich tkanek, co pozwala na wyższe tempo lokalnego i dalekiego rozprzestrzeniania się. W związku z tym guzy HNSCC PNI-dodatnie mają wyższe wskaźniki nawrotów lokoregionalnych i przerzutów odległych, co skutkuje niższym całkowitym przeżyciem w porównaniu z pacjentami z HNSCC bez PNI^4-8.

Chociaż leczenie pacjentów z PNI jest zazwyczaj maksymalizowane poprzez zastosowanie chirurgii, radioterapii i chemioterapii, ogólne wskaźniki przeżycia tych pacjentów są nadal zmniejszone nawet o 40% w porównaniu do pacjentów bez PNI^9-11. W związku z tym jasne jest, że obecne metody leczenia HNSCC są nieskuteczne w poprawie niekorzystnego rokowania związanego z PNI. Opracowanie terapii celowanej przeciwko PNI w HNSCC było utrudnione ze względu na słabe zrozumienie czynników regulujących ten proces. Jest to po części konsekwencja braku spójnego modelu in vitro do badania PNI w HNSCC.

W ostatnich latach kilka grup wykorzystywało model in vitro do badania PNI w głównie rakach trzustki i prostaty^12-19. Model ten wykorzystuje neuryty generowane z grzbietowych zwojów korzeniowych wyizolowanych od myszy lub szczurów jako substytut inwazji dużych nerwów. Zwoje korzenia grzbietowego są umocowane w półstałej matrycy zubożonej w czynnik, która jest rozpuszczoną mieszaniną białek błony podstawnej wydzielaną przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm. Ta matryca pozwala na wzrost neurytów i śledzenie pojedynczych komórek rakowych wzdłuż tych neurytów. Opisano tutaj adaptację tego modelu do badania PNI w HNSCC.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża hodowlanego i potraw (10 min)

1. Dodaj 100 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
2. Wyjąć wstępnie porcjowaną fiolkę zawierającą około 100 μl półstałej matrycy z zamrażarki w temperaturze 20 °C i umieścić ją bezpośrednio na lodzie.
   UWAGA: Należy to zrobić przed zbiorem zwoju korzenia grzbietowego (DRG), ponieważ półstała matryca potrzebuje około 30 minut, aby osiągnąć stan ciekły na lodzie, który jest niezbędny do kolejnych etapów. Nieutrzymywanie półstałej matrycy na lodzie przez cały czas spowoduje niską jakość kropli matrycy.
3. Oznacz płytki kultur ze szklanym dnem trwałym atramentem, tworząc unikalne identyfikatory w każdym z czterech rogów na spodniej powierzchni płytki. Umieść talerze prawą stroną do góry na lodzie, aby schłodzić powierzchnię talerza.
   UWAGA: Każda mysz daje 32 - 40 DRG, więc oznacz je od 1 do 40. Nie ma potrzeby wstępnego schładzania końcówek pipet, ponieważ schłodzone końcówki nagrzewają się w trakcie umieszczania kropelek matrycy, co może powodować różnice w konsystencji matrycy.

2. Sekcja mysiego DRG (45 min)

1. Poddaj eutanazji nagą mysz zgodnie z określonymi protokołami laboratoryjnymi, takimi jak użycie komory CO₂ i torakotomii.
2. Ustaw obszar sekcji i mikroskop. Używaj czystego, wysterylizowanego i płaskiego spodu pojemników polistyrenowych do probówek stożkowych o pojemności 15 lub 50 ml.
   UWAGA: Dodatkowo nadają się do stosowania jako powierzchnia preparacyjna, ponieważ są niedrogie, jednorazowe i pozwalają na unieruchomienie kręgosłupa za pomocą szpilek lub igieł. Używaj wyłącznie wysterylizowanych narzędzi i igieł.
3. W naturalnym widzeniu wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż kręgosłupa od nasady ogona do głowy myszy za pomocą prostych lub zakrzywionych cienkich nożyczek.
4. Użyj tych samych nożyczek, aby podzielić poprzecznie poniżej kręgosłupa krzyżowego. Wypreparuj obie strony kręgosłupa aż do podstawy czaszki za pomocą nożyczek. W tym momencie upewnij się, że kręgosłup szyjny jest przecięty czaszką tak daleko, jak to możliwe, nożyczkami.
5. Obserwuj szyjny koniec kręgosłupa pod mikroskopem operacyjnym przy małej mocy. Biały rdzeń kręgowy jest widoczny w środku pierścienia kostnego, który jest otoczony zmienną ilością mięśni przykręgosłupowych i tkanek miękkich.
6. Podziel grzbietową lub górną część pierwszych 2-3 trzonów kręgów za pomocą mikroskopijnych nożyczek sprężynowych. Używając sprężynowego działania nożyczek, otwórz to początkowe cięcie kostne, aby upewnić się, że rozwarstwienie trzonu kręgu nastąpiło w linii środkowej. Kontynuuj małymi krokami w kierunku kręgosłupa krzyżowego, a następnie przetnij kręgosłup na pół, wykonując identyczne nacięcia na brzusznej lub dolnej stronie trzonów kręgów.
   UWAGA: Niezapewnienie rozwarstwienia linii środkowej kostnego kręgosłupa spowoduje niższą wydajność DRG.
7. W tym momencie kręgosłup jest podzielony na dwie połowy. Odłóż jeden kręgosłup połowiczny na bok, z rdzeniem kręgowym na miejscu i skierowany w dół na sterylnej płytce.
   UWAGA: Pozostawienie rdzenia kręgowego na miejscu zapobiegnie wysychaniu DRG, ponieważ DRG znajdują się głęboko w rdzeniu kręgowym.
8. Zabezpiecz oba końce drugiego grzbietu półgrzbietu dwiema igłami o rozmiarze 18 na polistyrenowej platformie sekcyjnej. Zaczynając od końca szyjnego (co jest widoczne, ponieważ kręgosłup jest węższy, DRG są bliżej siebie i są przyczepy żeber), delikatnie oderwij rdzeń kręgowy od około 4 poziomów kręgów.
9. Obserwuj nerwy czuciowe (zwykle dwa) łączące DRG. W obszarze, w którym nerwy wprowadzają się do DRG, delikatnie chwyć otaczającą powięź mikroskopijnymi kleszkami. Wypreparuj i przytnij tę powięź i inną tkankę nerwową za pomocą mikroskopijnych nożyczek sprężynowych, aby zwolnić DRG. Delikatne wycofanie spowoduje, że DRG przesunie się z jego pozycji w kostnym kręgosłupie.
   UWAGA: Zwiększenie mocy mikroskopu na tym etapie jest korzystne. Zmiażdżenie DRG znacznie ograniczy wzrost neurytów. Można tego uniknąć, nigdy nie chwytając DRG bezpośrednio, ale raczej chwytając otaczającą powięź.
10. Przetnij nerw obwodowy (DRG ma na ogół jeden nerw obwodowy, który jest głęboki w stosunku do widoku preparacyjnego) mikroskopijnymi nożyczkami sprężynowymi, aby uwolnić DRG.
    UWAGA: Najłatwiej jest ustalić, gdzie kończy się nerw, a zaczyna DRG podczas napięcia, więc idealnie jest wykonać to cięcie jak najbliżej DRG w tym momencie. Po przecięciu tej dystalnej gałęzi przycinane są również gałęzie proksymalne.
11. Przytnij DRG z wszelkich zabłąkanych włókien nerwowych lub przyczepów powięziowych za pomocą mikroskopijnych nożyczek sprężynowych. Po odpowiedniej izolacji umieścić DRG w podłożu o temperaturze pokojowej w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V.
    UWAGA: Umieszczenie ciemnego tła pod płytą ułatwia wizualizację białych DRG poniżej mm. Umieść tylko jeden DRG w każdej studzience; W ten sposób można je łatwiej rozliczyć w kolejnych krokach.
12. Powtórz ten proces aż do jednego grzbietu połowicznego, a następnie do drugiego. Każda strona daje 16 - 20 DRG, co daje w sumie 32 - 40,
    UWAGA: Jeśli DRG jest mniej niż ten, sekcja kręgosłupa musi być przeprowadzona dalej głowo, i/lub doogonowo. DRG stają się coraz mniej zdefiniowane w miarę postępu doogonowego.

3. Przygotowanie półstałych kropelek matrycy (< 1 min na płytkę)

1. Wyjmij jedną szklaną płytkę dna studzienki z lodu i umieść ją na bloku lodu pod mikroskopem operacyjnym. Upewnij się, że podwielokrotność matrycy pozostaje przez cały czas na lodzie.
2. Umieścić kroplę matrycy o pojemności 1,5 μl w każdym z czterech rogów płytki ze szklanym dnem za pomocą mikropipetera o pojemności 2 μl lub 10 μl, pozostawiając odległość co najmniej równą samej kropli od krawędzi szklanej studzienki.
   1. Umieść końcówkę pipety bezpośrednio na szkle pod kątem 45 stopni. Powoli pipetować matrycę. Powoli odsuń się od szklanego dna po zaciśnięciu matrycy na płycie.
      UWAGA: Napięcie powierzchniowe między matrycą a szkłem powinno za każdym razem tworzyć idealną półkulę.
   2. Należy przerwać pipetowanie tuż przed opróżnieniem końcówki, ponieważ przypadkowe wstrzyknięcie powietrza do kropli matrycy powoduje znacznie większą średnicę kropli matrycy i jest trudne do usunięcia.
      UWAGA: Użycie drugiej wskazówki do ustabilizowania wskazówki pipetującej ułatwia dokładniejsze umieszczenie.

4. Wprowadzanie DRG do półstałych kropel matrycy (< 2 min na płytkę)

1. Płytkę z kropelkami matrycy pozostawić na krótko w temperaturze pokojowej (~ 1 min). To nieznacznie usztywnia matrycę, ułatwiając precyzyjne umieszczenie DRG.
2. Delikatnie zgarnij (nie chwytaj) DRG za pomocą zamkniętych mikroskopijnych kleszczy w lewej ręce. Ponownie ciemne tło na małym, białym DRG ułatwia wizualizację. Przenieś DRG na końcówkę igły o rozmiarze 21 w prawej ręce. Ten transfer pozostawi resztki pożywki na kleszczach.
3. Delikatnie wprowadzić DRG do środka kropli matrycy za pomocą igły o rozmiarze 21 (Rysunek 1). W większości przypadków DRG łatwo uwalnia się do matrycy, a następnie można go ustawić centralnie za pomocą igły.
   1. Jeśli DRG przyklei się do igły, użyj mikroskopijnych kleszczyków, aby zepchnąć DRG z igły do kropli matrycy. Usuń nadmiar pożywki z mikroskopijnych kleszczyków za pomocą chusteczki laboratoryjnej.
      UWAGA: Wprowadzenie pożywki do matrycy zmieni średnicę, objętość i konsystencję testu. Blok lodu z kolorowym lub kolorowym napisem zapewnia kontrast tła, co ułatwia wizualizację tego delikatnego procesu.
4. Po tym, jak płytka ma wszystkie cztery DRG, przeprowadź końcową kontrolę, aby upewnić się, że DRG znajduje się w środku kropli matrycy. Dokonaj regulacji w razie potrzeby za pomocą igły 21-gwarowej.
5. Przenieść gotową płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Spowoduje to zestalenie półstałej matrycy i utrwalenie DRG na miejscu.
6. Powtórzyć ten proces dla wszystkich DRG. Umieścić puste kropelki matrycy bez DRG jako kontrolę ujemną.
7. Dodać 4 ml DMEM z 10% pożywką FBS do każdej płytki ze szklanym dnem po wypełnieniu wszystkich płytek i wystawieniu ich na działanie inkubatora w temperaturze 37 °C przez co najmniej 3 minuty. Umieścić płytkę pod niewielkim kątem i powoli dodawać pożywkę, tak aby stopniowo stykała się z jednostkami matrycy-DRG.
   UWAGA: Jeśli pożywka zostanie dodana zbyt szybko lub energicznie, matryca i/lub DRG mogą ulec przemieszczeniu.
8. Przechowywać testy w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez następne 48 - 72 h.
   UWAGA: Okresowe badanie testów wykaże obwodowy rozrost neurytów w kierunku krawędzi macierzy (ryc. 2). Gdy neuryty znajdują się na więcej niż trzech czwartych drogi do macierzy, właściwe jest płytki komórek.

5. Przygotowanie komórek raka głowy i szyi

UWAGA: Linie komórkowe inne niż komórki raka płaskonabłonkowego głowy i szyi mogą być użyte w tym eksperymentalnym projekcie.

1. Utrzymuj linie komórkowe raka płaskonabłonkowego w DMEM z 10% FBS w preferowanych kolbach lub szalkach hodowlanych w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Aby przygotować komórki do eksperymentów, należy odessać całą pożywkę z kolby hodowlanej lub naczynia i umyć je dwukrotnie PBS. Zawieś komórki, dodając odpowiednią ilość 0,025% trypsyny na 5 minut, a następnie DMEM z 10% FBS. Odpipetować 4 ml mieszaniny komórek i pożywki do 6 ml szalek hodowlanych.
   UWAGA: Płytka hodowlana o pojemności 6 ml zapewnia więcej niż wystarczającą ilość komórek, nawet jeśli zlewa się mniej niż 50%.
2. Wystaw linie komórkowe HNSCC na różne warunki 24 godziny przed barwieniem i posiewem w teście DRG. Ponownie dozuj warunek po posianiu komórek, aby utrzymać spójne środowisko.
   UWAGA: Dodaj przeciwciała, czynniki wzrostu, cytokiny lub inne cząsteczki do szalek z kulturą komórkową 1 - 2 dni po rosekcji myszy i wszczepieniu DRG do matrycy.
3. Dodać fluorescencyjne barwienie komórek na 1 godzinę przed posiewem komórek (2 - 3 dni po pobraniu DRG i implantacji do matrycy).
   UWAGA: Poszczególne zastosowane tutaj barwniki swobodnie przechodzą przez błonę komórkową; Jednak po reakcji z wewnątrzkomórkowymi grupami tiolowymi barwnik pozostaje w komórce i jest przekazywany do komórek potomnych. Barwienie znacznie ułatwia wizualizację w testach. Te tymczasowe plamy są idealne do tych testów, ponieważ fluorescencja jest obecna przez 2-3 dni, co jest ramą czasową tych eksperymentów. Pozwala również na użycie wielu różnych kolorów i eliminuje potrzebę tworzenia linii komórkowych transfekowanych białkami fluorescencyjnymi.
   1. Przygotuj 10 μM roztworu barwnika, mieszając 2 μL 10 mM barwników komórek podstawowych w 2 ml DMEM bez surowicy dla każdego stanu komórek. Podgrzej go do 37 °C przed dodaniem do komórek.
   2. Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki o pojemności 6 ml, pozostawiając przylegające komórki HNSCC na płytce. Dodać 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i usunąć 2 ml barwnika 10 μM komórek/DMEM bez surowicy dodanego do każdej płytki
   3. Umieścić 6 ml płytki hodowlanej z barwnikiem komórkowym do inkubatora o temperaturze 37 °C na 40 minut.
   4. Po 40 minutach odessać pożywkę. Dodaj 2 ml PBS, a następnie odessać. Dodać 1 ml 0,025% trypsyny do każdej płytki i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
   5. Po 3 - 5 minutach dodaj 2 ml DMEM z 10% FBS i przenieś zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zakręć komórki i ponownie zawiesij je w 1 ml DMEM z 10% FBS.
   6. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, a następnie dodaj DMEM z 10% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 300 000 komórek na ml.

6. Posiewanie komórek rakowych głowy i szyi

1. Wyjąć z inkubatora płytki ze szklanym dnem z testami matrycowymi-DRG.
   UWAGA: Ponownie, są one odpowiednie, gdy neuryty znajdują się co najmniej 75% drogi do krawędzi macierzy, co zwykle następuje po 2-3 dniach. Najlepiej widać to przy użyciu obiektywu o powiększeniu co najmniej 10x.
2. Zassać pożywkę do płytki ze szklanym dnem. Całkowicie zassać pożywkę w szklanej studzience bez wyjmowania jednostek matrycy-DRG.
3. Pobrać 200 μl z 300 000 komórek/ml pożywki za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Umieść dwie krople komórek na każdym teście matrycowym-DRG. Wykonaj ten krok dla każdej kropli matrycy, tworząc cztery powtórzenia każdego warunku komórki na jednej płytce.
   UWAGA: Półkulisty kształt matrycy pozwala komórkom osiąść w pierścieniu wzdłuż obwodu testu (Rysunek 3a, Rysunek 3b). Znalezienie pipety z płynnie działającym spustem znacznie ułatwia umieszczanie jednolitych kropli.
4. Potwierdź podobną liczbę komórek i rozkład różnych warunków komórkowych pod mikroskopią 4X.
5. Umieścić płytki ze szklanym dnem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na około 60 minut. UWAGA: Chociaż jest tylko niewielka objętość komórek i pożywki (~ 150 μL), testy nie wysychają, dopóki nie upłynie kilka godzin czasu inkubatora.
6. Po 60 minutach delikatnie dodaj 4 ml DMEM z 10% FBS wzdłuż bocznej ścianki szklanej płytki.
   UWAGA: Z biegiem czasu komórki częściowo przylegają do dna płytki, a sposób dodawania pożywki nie narusza komórek. Różne typy ogniw sprawiają, że potrzeba mniej lub więcej czasu, aby zacząć przylegać do płytki ze szklanym dnem.
7. W tym czasie należy wymienić wszelkie leki egzogenne lub czynniki wzrostu, aby utrzymać poprzednie poziomy stężenia.
8. Umieścić próbki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, z wyjątkiem sytuacji, gdy są one badane pod mikroskopem. Określ ilościowo wyniki tego testu za pomocą obrazowania mikroskopowego. Pokrótce policz pasma inwazji okołonerwowej w czterech kwadrantach, korzystając z 4-krotnego obrazu mikroskopowego.
   UWAGA: Mikroskop z obiektywem 4X i możliwościami fluorescencji jest wystarczający do fotograficznego dokumentowania testów. Rozmiar testów dobrze mieści się w polu obiektywu 4X, który jest wystarczająco szczegółowy, aby uchwycić poszczególne obszary inwazji okołonerwowej. Inwazja okołonerwowa staje się widoczna w ciągu 24 godzin, ale po 48 godzinach integralność testów zaczyna słabnąć, ponieważ komórki nowotworowe dzielą się wzdłuż obwodu macierzy i atakują. Po upływie 48 godzin dochodzi również do znacznego wypływu fibroblastów z DRG, co zasłania wizualizację za pomocą mikroskopii jasnego pola. Dlatego zaleca się fotodokumentowanie wyników za pomocą mikroskopu 4X co najmniej dwa razy w tym oknie (np. po 24 i 48 godzinach od posiewu komórek nowotworowych). Należy pamiętać, że są to testy trójwymiarowe i trudno jest w pełni zobrazować cały test. Większość inwazji okołonerwowej zachodzi w płaszczyźnie od dołu płytki, gdzie komórki są osadzone w macierzy nieco powyżej dna płytki. Ponieważ płaszczyzna ta jest zbliżona do poziomej, zdecydowana większość neurytów z komórkami nowotworowymi jest rejestrowana na jednopoziomowym obrazie przy 4X.

Wyniki

Po rozebraniu DRG i umieszczeniu w kropli matrycy, wygląd testu powinien przypominać rysunek 1. Zauważ, że DRG nie jest idealnie okrągły, ale jest wyśrodkowany w kropli matrycy. Pozwala to na rozrost neurytów w zakresie 360 stopni, co częściowo pokazano na rysunku 2. Należy pamiętać, że niektóre części DRG wysyłają neuryty szybciej i w większej liczbie niż inne, zwykle odpowiadając miejscu, w którym gałęzie nerwowe odprowadzające i doprowadzające wchodził...

Dyskusja

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Najważniejszymi krokami w ramach tego protokołu są precyzyjne wypreparowanie i ekstrakcja zwojów korzenia grzbietowego. Właściwa transsekcja kręgosłupa i podział linii środkowej i podłużnej na dwa półkolce mają kluczowe znaczenie dla uzyskania dużej liczby DRG. Podczas preparacji poszczególnych DRG nigdy nie należy dotykać zwoju bezpośrednio, ale raczej należy chwycić otaczającą go powięź za pomocą mikroskopijnych kleszczy. Niezastosowanie się...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F-12 50/50 Mieszanka z L-glutaminą i 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Płodowa surowica bydlęca	Atlanta biologiczna	S11150	Flowery Branch, GA
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, Nowy Jork
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Napromieniowane gamma 35 mm szklane płytki hodowlane	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Mikroskop operacyjny	Carl Zeiss	Microimaging 495015-0021-000	Thornwood, Nowy Jork
Źródło światła Schott ACE I	Schott	A20500	Niemcy
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD Igła PrecisionGlide 18 G i 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Pęseta do mikropreparacji premium	Aparat Harvard	60-3851	Holliston, MA
Standardowe nożyczki do precyzyjnej obsługi premium	Aparat Harvard	52-2789	Holliston, MA
Nożyczki sprężynowe premium	Harvard Aparatura	60-3923	Holliston, MA
Kleszcze opatrunkowe	Aparatura Harvardu	72-8949	Holliston, MA
Atymiczne nagie myszy (002019)	Laboratorium Jacksona	002019	Bar Harbor, ME