Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu

Podsumowanie

Zaproponowano metodę analizy integralności DNA w bezkomórkowej frakcji supernatantu próbek moczu. Metoda ta nadaje się do wczesnego wykrywania nowotworów urologicznych i okazała się skuteczna we wczesnej diagnostyce raka pęcherza moczowego.

Streszczenie

Chociaż obecność krążącego bezkomórkowego DNA w osoczu lub surowicy została powszechnie uznana za odpowiednie źródło biomarkerów dla wielu typów raka, niewiele badań skupiało się na potencjalnym wykorzystaniu DNA bezkomórkowego w moczu (UCF). Wychodząc od hipotezy, że normalne komórki apoptotyczne wytwarzają wysoce rozdrobnione DNA i że komórki nowotworowe uwalniają dłuższe DNA, oceniono potencjalną rolę integralności DNA UCF jako wczesnego markera diagnostycznego zdolnego do rozróżnienia pacjentów z rakiem prostaty lub pęcherza moczowego od osób zdrowych.

Analiza integralności DNA UCF jest proponowana na podstawie czterech ilościowych PCR w czasie rzeczywistym czterech sekwencji dłuższych niż 250 pz: c-MYC, BCAS1, HER2 i AR. Do analizy wybrano sekwencje, które często mają zwiększoną liczbę kopii DNA w raku pęcherza moczowego i prostaty, ale metoda jest elastyczna i geny te można zastąpić innymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania. Potencjalna użyteczność UCF DNA jako źródła biomarkerów została już wykazana w przypadku nowotworów urologicznych, torując w ten sposób drogę do dalszych badań nad charakterystyką DNA UCF. Test integralności DNA UCF ma tę zaletę, że jest nieinwazyjny, szybki i łatwy do wykonania, a do przeprowadzenia analizy potrzeba tylko kilku mililitrów moczu.

Wprowadzenie

Bezkomórkowe DNA można wykryć we krwi i moczu z powodu śmierci komórki w wyniku mechanizmów apoptotycznych lub nekrotycznych. Bezkomórkowe DNA we krwi jest szeroko badane w celach diagnostycznych i prognostycznych, w różnych chorobach, zwłaszcza w raku¹. Jednak mniej wiadomo na temat roli DNA wolnego od komórek moczowych (UCF). DNA UCF może pochodzić z krwi przechodzącej przez system filtracji kłębuszkowej lub z komórek, które mają bezpośredni kontakt z tym płynem ustrojowym ² (np. komórki urotelialne lub komórki gruczołu krokowego). Wykorzystanie DNA UCF jako źródła biomarkerów było badane głównie pod kątem wczesnej diagnozy raka nerki, pęcherza moczowego i prostaty ze względu na wysoki odsetek DNA UCF pochodzącego bezpośrednio z komórek dróg moczowych^3,4.

Niewiele wiadomo o DNA UCF i najlepszych metodach jego izolowania i charakteryzowania. Biorąc pod uwagę hipotezę, że komórki nowotworowe uwalniają dłuższe fragmenty DNA niż normalne komórki, zbadano ocenę integralności DNA bez komórek w celu wyjaśnienia pochodzenia DNA w krążeniu krwi5^. Niektóre badania wykazały, że bezkomórkowa integralność DNA we krwi stanowi dobry test diagnostyczny dla wielu rodzajów raka⁶ i ta sama hipoteza została zaproponowana w odniesieniu do moczu^7-9.

Ten artykuł opisuje nową metodę analizy integralności DNA UCF z potencjalnym zastosowaniem do wykrywania raka pęcherza moczowego i prostaty. W szczególności integralność fragmentów DNA UCF dłuższych niż 250 pz badano w 4 regionach, o których wiadomo, że mają zwiększoną liczbę kopii DNA w guzach litych, w tym raku prostaty i pęcherza moczowego: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1), BCAS1 (20q13.2) i AR (Xq12)^10-14. Wybrano konkretne onkogeny, a nie losowe sekwencje, aby zwiększyć prawdopodobieństwo ich znalezienia we frakcji bezkomórkowej pacjentów z rakiem. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że jest elastyczna i że inne regiony można również wybrać na podstawie rodzaju i cech guza.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach IRST.

UWAGA: W tym protokole wyizolowaliśmy DNA z próbek moczu, aby przeprowadzić analizę integralności DNA UCF. Do skonstruowania wzorców wykorzystano linie komórkowe Lncap i MRC. Przeprowadzono takie techniki, jak ekstrakcja DNA, kwantyfikacja DNA (spektrofotometr i PCR w czasie rzeczywistym dla genu kontrolnego, STOX1) oraz PCR w czasie rzeczywistym dla określonych onkogenów (ryc. 1).

1. Zbieranie i przetwarzanie moczu

1. Uzyskaj czystą próbkę moczu pierwszego ranka w czystym, suchym, plastikowym kubku. Zebrać co najmniej 50 ml próbki moczu.
2. Utrzymać mocz w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 godziny i przesłać go do laboratorium w tej samej temperaturze.
3. Wymieszać każdą próbkę, odwracając ją dwukrotnie natychmiast po przybyciu do laboratorium i przenieść do dwóch probówek polipropylenowych o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem.
4. Odwirować probówki o masie 850 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej.
5. Ostrożnie przenieść 10 ml górnej części supernatantu moczu do dwóch probówek o pojemności 5 ml, pozostawiając co najmniej 2 ml supernatantu nad osadem komórkowym.
   UWAGA: Przeniesienie górnej części supernatantu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia komórkami lub resztkami komórkowymi. Nie ma wyraźnego rozgraniczenia między górną a dolną częścią.
6. Wyrzucić osad i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Izolacja DNA z supernatantu moczu i linii komórkowych

UWAGA: Wyizoluj DNA z linii komórkowej (np. Lncap dla raka prostaty lub MRC dla raka pęcherza moczowego) za pomocą zestawu komercyjnego i postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Izolację DNA z supernatantu moczu należy przeprowadzić przy użyciu protokołu handlowego, zmodyfikowanego w następujący sposób:

1. Rozmrozić jedną porcję supernatantu moczu w temperaturze pokojowej.
2. Odwirować i wymieszać próbkę moczu i przenieść 1 ml supernatantu moczu do przezroczystej probówki o pojemności 5 ml. Zamrozić resztki moczu w temperaturze -80 °C.
3. Dodać 100 μl proteinazy k bezpośrednio do próbki.
4. Dodać 1 ml buforu AL do próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
5. Zamknąć probówki i inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 15 minut.
6. Podczas inkubacji należy przygotować jedną kolumnę na każdą próbkę i przygotować płuczące AW1 i AW2 zgodnie z instrukcjami producenta (dodać wskazaną ilość 100% etanolu).
7. Doprowadź próbki z powrotem do temperatury pokojowej i dodaj 1 ml absolutnego alkoholu etylowego. Całkowicie wymieszać przez pipetowanie.
8. Dodać 650 μl mieszaniny otrzymanej w kroku 2.7 do kolumny i odwirować ją przy 6 000 x g przez 1 minutę.
9. Wyrzucić probówkę zawierającą przepływowy i umieścić kolumnę na nowej, czystej probówce zbiorczej. Powtarzać kroki 2.8 i 2.9 aż do całkowitego zużycia mieszaniny próbki (5 razy).
10. Dodać 500 μl buforu AW1 bez zwilżania krawędzi kolumny. Odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.
11. Wyrzuć probówkę zawierającą przepływ i zastąp ją nową, czystą probówką zbiorczą.
12. Dodać 500 μl buforu AW2 bez zwilżania krawędzi kolumny. Odwirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty.
13. Wyrzuć probówkę zawierającą przepływ i zastąp ją nową, czystą probówką zbiorczą.
14. Powtórz krok 2.12, aby usunąć resztki buforu myjącego.
15. Umieść kolumnę w czystej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 50 μl buforu elucyjnego AE i odczekać 7 minut, aby upewnić się, że bufor zwilży kolumnę.
16. Odwirować go przy 8 000 x g przez 1 minutę.
17. Odpipetować eluent z kroku 2.15 do minikolumny i odwirować go z maksymalną prędkością przez 1 minutę, aby zapewnić maksymalne odzyskanie DNA.

3. Kwantyfikacja i rozcieńczanie DNA

1. Za pomocą spektrofotometru przeprowadzić kwantyfikację DNA zarówno z linii komórkowej, jak i próbek supernatantu moczu. Użyj 2 μl próbki na spektrometrze laboratoryjnym, zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Rozcieńczyć próbki DNA UCF do uzyskania stężenia 1 ng/μl i przechowywać DNA w temperaturze -20 °C do czasu analizy integralności DNA.
   UWAGA: Jeśli ilość DNA nie jest wystarczająca do przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym (co najmniej 100 ng), wykonaj nowy proces izolacji DNA.
3. Rozcieńczyć DNA z próbek linii komórkowych, aby uzyskać sześć wzorców o różnych stężeniach: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 i 2 ng/μl, każdy o objętości 100 μl (st1, st2, st3, st4, st5 i st6). Wzorce DNA linii komórkowej należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy integralności DNA.

4. Test integralności DNA — PCR

1. Rozmrozić startery (stężenie zależy od rodzaju testu), zielony supermix, wzorce DNA linii komórkowej i próbki rozcieńczone DNA UCF na lodzie.
2. Przygotować probówki paskowe w płytce dla 72-dołkowej tarczy wirnika. Podwielokrotność 10 μl w dwóch egzemplarzach dla każdej próbki wzorcowej i rozcieńczonej oraz 10 μl wody wolnej od RNaz dla kontroli ujemnej.
3. Przygotować mieszaninę 1 μl każdego startera (stężenia podano w tabeli 1), 12,5 μl zielonego supermiksu i 6,5 μl wody wolnej od RNaz dla każdej próbki. Przygotowując mieszaninę, należy użyć następującej liczby próbek: 6 wzorców dla 2 kontrprób, liczba próbek dla 2 powtórzeń, kontrola ujemna dla 2 kontrprób i 2 dodatkowe próbki.
4. Podatkować 15 μl mieszanki do każdego dołka. Nie pipetować ani nie obracać probówek.
5. Rozpocznij protokół od warunków PCR wskazanych w tabeli 1.
   UWAGA: W przypadku wartości DNA UCF 29 próbek DNA przetworzono dla każdego eksperymentu w czasie rzeczywistym przy użyciu 72-dołkowej tarczy wirnika: 29 x 2 próbki + 6 x 2 wzorce + kontrola ujemna x 2 = 72 (wartość UCF DNA).
   UWAGA: Protokół analizy integralności DNA UCF można również wykonać przy użyciu innego przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym (w przypadku korzystania z innego urządzenia może być konieczne dodanie barwnika ROX).

5. Test integralności DNA — analiza i interpretacja danych

UWAGA: Wartość DNA UCF dla każdej próbki została uzyskana przez oprogramowanie systemu wykrywania w czasie rzeczywistym przy użyciu standardowej konstrukcji krzywej dla każdej indywidualnej oceny genu PCR i przy użyciu standardowej interpolacji krzywej, jak opisano wcześniej^7-9 (Rysunek 2).

1. Ocenić kontrpróby; próbki z różnicą ≥1 Ct muszą zostać odrzucone i ponownie ocenione w drugim doświadczeniu.
2. Obliczyć medianę Ct dla każdej próbki i rozważyć próbki o wartości Ct ≤ 36.
3. Oceń specyficzność produktów PCR za pomocą analizy topnienia.
4. Ocenić stężenie każdego amplikonu przez interpolację z krzywą wzorcową; uzyskać wartość stężenia (ng/μl) dla każdego amplikonu.

Wyniki

Całkowite stężenie wolnego DNA było mierzalne spektrofotometrycznie dla wszystkich analizowanych próbek i mieściło się w zakresie od 1,51 do 138 ng/µL. W celu zapewnienia powtarzalności danych wykorzystano pięć próbek kontrolnych: przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty w czasie rzeczywistym dla c-MYC, HER2, BCAS1, AR oraz STOX1. Następnie obliczono współczynniki zmienności (CV) dla każdego genu (Tabela 2), stwierdzając dobr...

Dyskusja

Analiza integralności DNA UCF jest nową, nieinwazyjną metodą oceny integralności DNA w moczu. Niedawno zaproponowano go do wczesnej diagnostyki raka pęcherza moczowego⁹ i raka prostaty^7,8. Omówiono tutaj szereg zalet i wad testu integralności DNA UCF, wraz z perspektywami na przyszłość.

Główną zaletą tego podejścia jest to, że oferuje niedrogą, nieinwazyjną metodę i prosty protokół badania moczu jako potencjalnego źródła biomarkerów, wymagający jedynie podstawowej wiedzy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mini zestaw QIAamp DNA	Qiagen	51304
iQ SYBR  Zielony Supermix, 100 x 50 &mikro; L rxns, 2,5 ml (2 x 1,25 mL)	Biorad	1708880
IDT niestandardowe oligonukleotydy DNA	IDT		Oczyszczanie HPLC, spektrofotometr 100nMole DNA oligo
NanoDrop 1000	Thermo Scientific		Inne metody spektrofotometryczne mogą być również wykorzystane do ilościowego oznaczania DNA
Rotor-Gene 6000	Corbett		Można również użyć innego instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym
wirówki
do probówek
inkubator-80
° C zamrażarka-20
° C zamrażarka
10 μ L pipeta
20 μ Pipeta
200 μ Pipeta
1,000 μ Końcówki do pipet
(10; 20; 200; 1,000)
Probówki 1,5 ml Probówki
50 ml Probówki
15 ml Rotor-Disc
72 Rotor		Corbett 9018899
Probówki paskowe i nakrętki, 0,1 ml (250)	Qiagen	981103
Probówki zbiorcze (2 ml)	Qiagen	19201
Bufor AL (264 ml)	Qiagen	19075
Proteinaza K (10 ml)	Qiagen	19133

, jednej o pojemności 50 mlLLL