Artykuł metodologiczny

Analiza integralności bezkomórkowego DNA w próbkach moczu

DOI:

10.3791/55049

⸱

5 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Urology, Morgagni-Pierantoni Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zaproponowano metodę analizy integralności DNA w bezkomórkowej frakcji supernatantu próbek moczu. Metoda ta nadaje się do wczesnego wykrywania nowotworów urologicznych i okazała się skuteczna we wczesnej diagnostyce raka pęcherza moczowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż obecność krążącego bezkomórkowego DNA w osoczu lub surowicy została powszechnie uznana za odpowiednie źródło biomarkerów dla wielu typów raka, niewiele badań skupiało się na potencjalnym wykorzystaniu DNA bezkomórkowego w moczu (UCF). Wychodząc od hipotezy, że normalne komórki apoptotyczne wytwarzają wysoce rozdrobnione DNA i że komórki nowotworowe uwalniają dłuższe DNA, oceniono potencjalną rolę integralności DNA UCF jako wczesnego markera diagnostycznego zdolnego do rozróżnienia pacjentów z rakiem prostaty lub pęcherza moczowego od osób zdrowych.

Analiza integralności DNA UCF jest proponowana na podstawie czterech ilościowych PCR w czasie rzeczywistym czterech sekwencji dłuższych niż 250 pz: c-MYC, BCAS1, HER2 i AR. Do analizy wybrano sekwencje, które często mają zwiększoną liczbę kopii DNA w raku pęcherza moczowego i prostaty, ale metoda jest elastyczna i geny te można zastąpić innymi genami będącymi przedmiotem zainteresowania. Potencjalna użyteczność UCF DNA jako źródła biomarkerów została już wykazana w przypadku nowotworów urologicznych, torując w ten sposób drogę do dalszych badań nad charakterystyką DNA UCF. Test integralności DNA UCF ma tę zaletę, że jest nieinwazyjny, szybki i łatwy do wykonania, a do przeprowadzenia analizy potrzeba tylko kilku mililitrów moczu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezkomórkowe DNA można wykryć we krwi i moczu z powodu śmierci komórki w wyniku mechanizmów apoptotycznych lub nekrotycznych. Bezkomórkowe DNA we krwi jest szeroko badane w celach diagnostycznych i prognostycznych, w różnych chorobach, zwłaszcza w raku1. Jednak mniej wiadomo na temat roli DNA wolnego od komórek moczowych (UCF). DNA UCF może pochodzić z krwi przechodzącej przez system filtracji kłębuszkowej lub z komórek, które mają bezpośredni kontakt z tym płynem ustrojowym 2 (np. komórki urotelialne lub komórki gruczołu krokowego). Wykorzystanie DNA UCF jako źródła biomarkerów było badane głównie pod kątem wczesnej diagnozy raka nerki, pęcherza moczowego i prostaty ze względu na wysoki odsetek DNA UCF pochodzącego bezpośrednio z komórek dróg moczowych3,4.

Niewiele wiadomo o DNA UCF i najlepszych metodach jego izolowania i charakteryzowania. Biorąc pod uwagę hipotezę, że komórki nowotworowe uwalniają dłuższe fragmenty DNA niż normalne komórki, zbadano ocenę integralności DNA bez komórek w celu wyjaśnienia pochodzenia DNA w krążeniu krwi5. Niektóre badania wykazały, że bezkomórkowa integralność DNA we krwi stanowi dobry test diagnostyczny dla wielu rodzajów raka6 i ta sama hipoteza została zaproponowana w odniesieniu do moczu7-9.

Ten artykuł opisuje nową metodę analizy integralności DNA UCF z potencjalnym zastosowaniem do wykrywania raka pęcherza moczowego i prostaty. W szczególności integralność fragmentów DNA UCF dłuższych niż 250 pz badano w 4 regionach, o których wiadomo, że mają zwiększoną liczbę kopii DNA w guzach litych, w tym raku prostaty i pęcherza moczowego: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1), BCAS1 (20q13.2) i AR (Xq12)10-14. Wybrano konkretne onkogeny, a nie losowe sekwencje, aby zwiększyć prawdopodobieństwo ich znalezienia we frakcji bezkomórkowej pacjentów z rakiem. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że jest elastyczna i że inne regiony można również wybrać na podstawie rodzaju i cech guza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach IRST.

UWAGA: W tym protokole wyizolowaliśmy DNA z próbek moczu, aby przeprowadzić analizę integralności DNA UCF. Do skonstruowania wzorców wykorzystano linie komórkowe Lncap i MRC. Przeprowadzono takie techniki, jak ekstrakcja DNA, kwantyfikacja DNA (spektrofotometr i PCR w czasie rzeczywistym dla genu kontrolnego, STOX1) oraz PCR w czasie rzeczywistym dla określonych onkogenów (ryc. 1).

1. Zbieranie i przetwarzanie moczu

  1. Uzyskaj czystą próbkę moczu pierwszego ranka w czystym, suchym, plastikowym kubku. Zebrać co najmniej 50 ml próbki moczu.
  2. Utrzymać mocz w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 godziny i przesłać go do laboratorium w tej samej temperaturze.
  3. Wymieszać każdą próbkę, odwracając ją dwukrotnie natychmiast po przybyciu do laboratorium i przenieść do dwóch probówek polipropylenowych o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem.
  4. Odwirować probówki o masie 850 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej.
  5. Ostrożnie przenieść 10 ml górnej części supernatantu moczu do dwóch probówek o pojemności 5 ml, pozostawiając co najmniej 2 ml supernatantu nad osadem komórkowym.
    UWAGA: Przeniesienie górnej części supernatantu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia komórkami lub resztkami komórkowymi. Nie ma wyraźnego rozgraniczenia między górną a dolną częścią.
  6. Wyrzucić osad i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Izolacja DNA z supernatantu moczu i linii komórkowych

UWAGA: Wyizoluj DNA z linii komórkowej (np. Lncap dla raka prostaty lub MRC dla raka pęcherza moczowego) za pomocą zestawu komercyjnego i postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Izolację DNA z supernatantu moczu należy przeprowadzić przy użyciu protokołu handlowego, zmodyfikowanego w następujący sposób:

  1. Rozmrozić jedną porcję supernatantu moczu w temperaturze pokojowej.
  2. Odwirować i wymieszać próbkę moczu i przenieść 1 ml supernatantu moczu do przezroczystej probówki o pojemności 5 ml. Zamrozić resztki moczu w temperaturze -80 °C.
  3. Dodać 100 μl proteinazy k bezpośrednio do próbki.
  4. Dodać 1 ml buforu AL do próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
  5. Zamknąć probówki i inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 15 minut.
  6. Podczas inkubacji należy przygotować jedną kolumnę na każdą próbkę i przygotować płuczące AW1 i AW2 zgodnie z instrukcjami producenta (dodać wskazaną ilość 100% etanolu).
  7. Doprowadź próbki z powrotem do temperatury pokojowej i dodaj 1 ml absolutnego alkoholu etylowego. Całkowicie wymieszać przez pipetowanie.
  8. Dodać 650 μl mieszaniny otrzymanej w kroku 2.7 do kolumny i odwirować ją przy 6 000 x g przez 1 minutę.
  9. Wyrzucić probówkę zawierającą przepływowy i umieścić kolumnę na nowej, czystej probówce zbiorczej. Powtarzać kroki 2.8 i 2.9 aż do całkowitego zużycia mieszaniny próbki (5 razy).
  10. Dodać 500 μl buforu AW1 bez zwilżania krawędzi kolumny. Odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.
  11. Wyrzuć probówkę zawierającą przepływ i zastąp ją nową, czystą probówką zbiorczą.
  12. Dodać 500 μl buforu AW2 bez zwilżania krawędzi kolumny. Odwirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty.
  13. Wyrzuć probówkę zawierającą przepływ i zastąp ją nową, czystą probówką zbiorczą.
  14. Powtórz krok 2.12, aby usunąć resztki buforu myjącego.
  15. Umieść kolumnę w czystej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 50 μl buforu elucyjnego AE i odczekać 7 minut, aby upewnić się, że bufor zwilży kolumnę.
  16. Odwirować go przy 8 000 x g przez 1 minutę.
  17. Odpipetować eluent z kroku 2.15 do minikolumny i odwirować go z maksymalną prędkością przez 1 minutę, aby zapewnić maksymalne odzyskanie DNA.

3. Kwantyfikacja i rozcieńczanie DNA

  1. Za pomocą spektrofotometru przeprowadzić kwantyfikację DNA zarówno z linii komórkowej, jak i próbek supernatantu moczu. Użyj 2 μl próbki na spektrometrze laboratoryjnym, zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Rozcieńczyć próbki DNA UCF do uzyskania stężenia 1 ng/μl i przechowywać DNA w temperaturze -20 °C do czasu analizy integralności DNA.
    UWAGA: Jeśli ilość DNA nie jest wystarczająca do przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym (co najmniej 100 ng), wykonaj nowy proces izolacji DNA.
  3. Rozcieńczyć DNA z próbek linii komórkowych, aby uzyskać sześć wzorców o różnych stężeniach: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 i 2 ng/μl, każdy o objętości 100 μl (st1, st2, st3, st4, st5 i st6). Wzorce DNA linii komórkowej należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy integralności DNA.

4. Test integralności DNA — PCR

  1. Rozmrozić startery (stężenie zależy od rodzaju testu), zielony supermix, wzorce DNA linii komórkowej i próbki rozcieńczone DNA UCF na lodzie.
  2. Przygotować probówki paskowe w płytce dla 72-dołkowej tarczy wirnika. Podwielokrotność 10 μl w dwóch egzemplarzach dla każdej próbki wzorcowej i rozcieńczonej oraz 10 μl wody wolnej od RNaz dla kontroli ujemnej.
  3. Przygotować mieszaninę 1 μl każdego startera (stężenia podano w tabeli 1), 12,5 μl zielonego supermiksu i 6,5 μl wody wolnej od RNaz dla każdej próbki. Przygotowując mieszaninę, należy użyć następującej liczby próbek: 6 wzorców dla 2 kontrprób, liczba próbek dla 2 powtórzeń, kontrola ujemna dla 2 kontrprób i 2 dodatkowe próbki.
  4. Podatkować 15 μl mieszanki do każdego dołka. Nie pipetować ani nie obracać probówek.
  5. Rozpocznij protokół od warunków PCR wskazanych w tabeli 1.
    UWAGA: W przypadku wartości DNA UCF 29 próbek DNA przetworzono dla każdego eksperymentu w czasie rzeczywistym przy użyciu 72-dołkowej tarczy wirnika: 29 x 2 próbki + 6 x 2 wzorce + kontrola ujemna x 2 = 72 (wartość UCF DNA).
    UWAGA: Protokół analizy integralności DNA UCF można również wykonać przy użyciu innego przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym (w przypadku korzystania z innego urządzenia może być konieczne dodanie barwnika ROX).

5. Test integralności DNA — analiza i interpretacja danych

UWAGA: Wartość DNA UCF dla każdej próbki została uzyskana przez oprogramowanie systemu wykrywania w czasie rzeczywistym przy użyciu standardowej konstrukcji krzywej dla każdej indywidualnej oceny genu PCR i przy użyciu standardowej interpolacji krzywej, jak opisano wcześniej7-9 (Rysunek 2).

  1. Ocenić kontrpróby; próbki z różnicą ≥1 Ct muszą zostać odrzucone i ponownie ocenione w drugim doświadczeniu.
  2. Obliczyć medianę Ct dla każdej próbki i rozważyć próbki o wartości Ct ≤ 36.
  3. Oceń specyficzność produktów PCR za pomocą analizy topnienia.
  4. Ocenić stężenie każdego amplikonu przez interpolację z krzywą wzorcową; uzyskać wartość stężenia (ng/μl) dla każdego amplikonu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Całkowite stężenie wolnego DNA było mierzalne za pomocą spektrofotometrii dla wszystkich analizowanych próbek, wykazując zakres od 1,51 do 138 ng/μL. Do odtworzenia danych użyto pięciu próbek kontrolnych: przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty w czasie rzeczywistym dla c-MYC, HER2, BCAS1, AR i STOX1. Współczynniki zmienności (CV) zostały następnie obliczone dla każdego genu (Tabela 2), z dobrym stopniem odtwarzalności międz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza integralności DNA UCF jest nową, nieinwazyjną metodą oceny integralności DNA w moczu. Niedawno zaproponowano go do wczesnej diagnostyki raka pęcherza moczowego9 i raka prostaty7,8. Omówiono tutaj szereg zalet i wad testu integralności DNA UCF, wraz z perspektywami na przyszłość.

Główną zaletą tego podejścia jest to, że oferuje niedrogą, nieinwazyjną metodę i prosty protokół badania moczu jako potencjalnego źródła biomarkerów, wymagający jedynie podstawowej wiedzy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Gráinne Tierney i Silvii Bellissimo za pomoc redakcyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mini zestaw QIAamp DNA
 		Qiagen51304
iQ SYBR  Zielony Supermix, 100 x 50 &mikro; L rxns, 2,5 ml (2 x 1,25 mL)Biorad1708880
IDT niestandardowe oligonukleotydy DNA IDT Oczyszczanie HPLC, spektrofotometr 100nMole DNA oligo
NanoDrop 1000Thermo ScientificInne metody spektrofotometryczne mogą być również wykorzystane do ilościowego oznaczania DNA
Rotor-Gene 6000CorbettMożna również użyć innego instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym
wirówki
do probówek
inkubator-80
° C zamrażarka-20
° C zamrażarka
10 μ L pipeta
20 μ Pipeta
200 μ Pipeta
1,000 μ Końcówki do pipet
(10; 20; 200; 1,000)
Probówki 1,5 ml Probówki
50 ml Probówki
15 ml Rotor-Disc
72 RotorCorbett 9018899
Probówki paskowe i nakrętki, 0,1 ml (250)Qiagen981103
Probówki zbiorcze (2 ml)Qiagen19201
Bufor AL (264 ml)Qiagen19075
Proteinaza K (10 ml)Qiagen19133
, jednej o pojemności 50 mlLLL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
  2. Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
  3. Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
  4. Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
  5. Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
  6. Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
  7. Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120(2015).
  8. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).
  9. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
  10. Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
  11. Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
  12. Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
  13. Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
  14. Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wolnokr ce DNA z moczuPCR w czasie rzeczywistymsekwencje onkogen wrak p cherza moczowegorak prostatyoczyszczanie DNAwirowanieanaliza krzywych topnieniakrzywa standardowa

Powiązane artykuły