Method Article

Szybka, skalowalna metoda izolacji, badania funkcjonalnego i analizy macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek

DOI:

10.3791/55051

⸱

January 4th, 2017

 ,  , 
1School of Biochemistry, University of Bristol

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz zewnątrzkomórkowa odgrywa główną rolę w definiowaniu mikrośrodowiska komórek oraz w modulowaniu ich zachowania i fenotypu. Opisujemy szybką metodę izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórki, którą można dostosować do różnych skal do badań mikroskopowych, biochemicznych, proteomicznych lub funkcjonalnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest rozpoznawana jako różnorodne, dynamiczne i złożone środowisko, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych komórek. Jednak izolacja ECM z tkanek lub hodowli komórkowych jest skomplikowana ze względu na nierozpuszczalny i usieciowany charakter złożonego ECM oraz potencjalne zanieczyszczenie ekstraktów ECM powierzchnią komórki i białkami wewnątrzkomórkowymi. W tym miejscu opisujemy metodę do stosowania z hodowanymi komórkami, która jest szybka i niezawodnie usuwa komórki w celu wyizolowania ECM pochodzącego z komórki do dalszych eksperymentów.

Dzięki zastosowaniu tej metody, wyizolowany ECM i jego komponenty mogą być wizualizowane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej in situ. Dynamikę określonych białek ECM można śledzić, śledząc osadzanie się znakowanego białka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zarówno przed, jak i po usunięciu komórek. Alternatywnie, wyizolowany ECM można wyekstrahować do analizy biochemicznej, takiej jak elektroforeza w żelu dodecylosiarczanowym sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) i immunoblotting. W większych skalach można przeprowadzić pełną analizę proteomiczną izolowanego ECM za pomocą spektrometrii mas. Przeprowadzając izolację ECM w sterylnych warunkach, można uzyskać sterylne warstwy ECM do badań funkcjonalnych lub fenotypowych na dowolnej komórce będącej przedmiotem zainteresowania. Metoda może być stosowana do każdego typu komórek przylegających, jest stosunkowo łatwa do wykonania i może być powiązana z szerokim repertuarem projektów eksperymentalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad, macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) stała się rozpoznawalna jako różnorodne, dynamiczne i złożone środowisko, które bierze udział w wielu komórkowych procesach fizjologicznych i patologicznych. Na poziomie tkankowym ECM wpływa na sygnalizację komórkową, ruchliwość, różnicowanie, angiogenezę, biologię komórek macierzystych, nowotworzenie i zwłóknienie itp.1,2. Badania nad organizacją ECM i procesami zależnymi od ECM mają zatem szerokie implikacje dla biologii komórki i fizjologii tkanek. Aby osiągnąć mechanistyczne zrozumienie składu, organizacji i właściwości funkcjonalnych ECM, potrzebne są metody dokładnej izolacji ECM. Podczas gdy najwcześniejsza identyfikacja białek ECM opierała się na izolacji z tkanek3, obecnie coraz powszechniejsze staje się przygotowywanie ECM z hodowanych komórek.

Izolacja i analiza ECM pochodzącego z komórek jest skomplikowana z dwóch głównych powodów. Po pierwsze, obecność komórek i ich obfitych białek wewnątrzkomórkowych może utrudniać wyizolowanie ECM jako dyskretnej struktury zewnątrzkomórkowej. Rzeczywiście, niektóre białka ECM pełnią rolę zarówno wewnątrz komórki, jak i w ECM4; w związku z tym skuteczne usuwanie białek wewnątrzkomórkowych z ECM pochodzącego z komórki jest niezbędne, jeśli badanie białek w ECM nie ma być mylone z ich rolami wewnątrz komórki. Po drugie, ECM pochodzenia komórkowego składa się z wielu dużych, oligomerycznych białek, które często są kowalencyjnie sieciowane podczas składania ECM i dlatego są nierozpuszczalne w standardowych detergentach. Właściwości te mogą komplikować ekstrakcję i dalszą analizę ECM. Aby rozwiązać te problemy, potrzebna jest metoda, która umożliwia skuteczne oddzielenie białek ECM od składników komórkowych.

W literaturze opisano kilka metod izolacji ECM z hodowli komórkowych lub ekstraktów tkankowych. Wiele z tych metod ma na celu ekstrakcję obfitego białka ECM, kolagenu, z tkanek i obejmuje użycie neutralnych soli3, warunków kwaśnych5,6 lub pepsyny7. Izolacja całkowitego ECM z ekstraktów tkankowych często obejmuje decelularyzację tkanki przed izolacją ECM. Na przykład opisano metodę ekstrakcji sekwencyjnej, która izoluje ECM z ludzkiej tkanki serca8. Najpierw luźno związane białka ECM ekstrahowano 0,5 M NaCl, a następnie użyto dodecylosiarczanu sodu (SDS) do usunięcia komórek. Na koniec pozostałe białka ECM wyekstrahowano przy użyciu 4 M guanidyny8. ECM można również rozpuszczać z próbek bezkomórkowych przy użyciu 8 M mocznika9. Inne techniki wykorzystują detergenty, takie jak kwas dezoksycholowy10, do ekstrakcji zarówno komórek, jak i ECM przed oddzieleniem nierozpuszczalnych białek ECM od rozpuszczalnego lizatu komórkowego przez odwirowanie.

Metoda izolacji i analizy ECM pochodzącego z komórek opisana w tym raporcie zapewnia powtarzalną metodę usuwania materiału komórkowego, pozostawiając ECM pochodzenia komórkowego, który może być analizowany metodą immunofluorescencji in situ lub ekstrahowany do dalszej analizy biochemicznej. Metoda ta może być dostosowana do dowolnego typu komórek przylegających i może być skalowana w górę do dalszych procedur, takich jak immunoblotting lub spektrometria mas, lub do wykorzystania izolowanego ECM w badaniach funkcjonalnych. Metoda ta może być również stosowana w połączeniu z mikroskopią konfokalną żywych komórek w celu śledzenia odkładania się ECM znakowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania w czasie rzeczywistym. Osiąga się to dzięki zastosowaniu naczynia z kratką i szklanym dnem. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to zapewnia dokładną izolację ECM pochodzącego z komórek, a także umożliwia identyfikację i monitorowanie depozycji i dynamiki poszczególnych białek ECM.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Usuwanie komórek roztworem wodorotlenku amonu

  1. Przygotować przylegające komórki, posiewając je z odpowiednią gęstością.
    UWAGA: Komórki mogą być dowolnym typem komórek przylegających, które wytwarzają wystarczającą ilość ECM do analizy. Tutaj opisujemy zastosowanie komórek COS-7, linii komórkowej podobnej do fibroblastów nerki afrykańskiej zielonej małpy, która zawiera sekwencje DNA wirusa SV-40; RCS, linia komórkowa chrzęstniakomięsaka szczura; lub normalne szczepy ludzkich fibroblastów skórnych (HDF) z młodocianego napletka. HDF stosuje się tylko od przejścia 1 do przejścia 8.
    1. Umieścić komórki na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania żywych komórek i ECM, do badań mikroskopii fluorescencyjnej stałego ECM lub do przygotowania ECM pochodzącego z komórek do testów funkcjonalnych na małą skalę. Umieść komórki na szalkach do hodowli komórkowych w celu analizy SDS-PAGE, immunoblot lub badań proteomicznych.
      UWAGA: Warunki hodowli komórkowej (liczba komórek na płytce i pożywka hodowlana) będą zależeć od typu komórki. Liczba komórek do tabliczki będzie musiała zostać ustalona empirycznie dla konkretnej linii komórkowej lub szczepu komórkowego.
    2. Odczekaj odpowiedni czas, aby komórki zdeponowały ECM, zwykle >16 godzin. UWAGA: Okres czasu będzie zależał od typu ogniwa i będzie musiał zostać określony empirycznie. W przypadku przeprowadzania ekspresji ektopowej należy przeznaczyć odpowiedni czas na ekspresję transfekowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania oraz na zdeponowanie ECM.
  2. W okapie kuchennym przygotować 20 mM wodorotlenku amonu w odpowiednim naczyniu, rozcieńczając roztwór podstawowy 1:14 dejonizowanymH2O.
    1. Wyjmij komórki z inkubatora i delikatnie usuń pożywkę hodowlaną. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez Ca2+/Mg2+, delikatnie wylewając na ścianki naczynia. Dwukrotnie obróć naczynie i usuń płyn plastikową pipetą transferową. Powtórz jeszcze dwa razy.
  3. W okapie wyciągowym przechyl każde naczynie i wyjmij PBS z kroku 1.2 za pomocą plastikowej pipety transferowej. Dodać 3 ml wodorotlenku amonu na 100-milimetrowe naczynie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Podczas 5-minutowego okresu inkubacji delikatnie mieszaj naczynie co minutę, aby zapewnić lizę wszystkich komórek. Kroki 1.4-1.7 zostaną również wykonane w okapie kuchennym.
    UWAGA: Alternatywne odczynniki do usuwania komórek obejmują mocznik 2 M lub 8 M, który inkubuje się z komórkami przez 10 minut.
  4. Dodać duże ilości dejonizowanego H2O do każdej potrawy, co najmniej 20 ml na 100 mm naczynia, z kołysaniem. Zutylizować materiał rozpuszczony w wodorotlenku amonu, który składa się z wodorotlenku amonu, komórek zlizowanych i zdejonizowanegoH2O, przez aspirację za pomocą pipety transferowej. Przenieść ten roztwór odpadowy do pojemnika na odpady płynne.
  5. Przemyć nierozpuszczalną warstwę ECM w dużej ilości zdejonizowanego H2O jeszcze cztery razy, aby zapewnić całkowite usunięcie całego materiału rozpuszczonego w wodorotlenku amonu.
  6. W celu zbadania ECM metodą immunofluorescencji, utrwalić ECM dodając 2% paraformaldehydu (PFA; 3 ml na 100 mm szalki) w temperaturze pokojowej przez 10 min.
    Ostrzeżenie: PFA jest bardzo niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami, a poważne nadmierne narażenie może spowodować uszkodzenie płuc, zadławienie, utratę przytomności lub śmierć. Należy się z nim obchodzić wyłącznie w okapie kuchennym i należy nosić środki ochrony osobistej.
  7. Przemyć każdą utrwaloną próbkę dwukrotnie PBS, jak w kroku 1.2, i wyrzucić roztwór PFA do odpowiedniego pojemnika na odpady płynne. W razie potrzeby należy przechowywać próbki ECM w PBS w temperaturze 4 °C przed przygotowaniem ich do mikroskopii fluorescencyjnej.

2. Śledzenie osadzania się białka ECM za pomocą obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Policz komórki pod hemocytometrem. W przypadku komórek COS-7 umieść 250 000 komórek na naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm w celu transfekcji.
    UWAGA: W przypadku obrazowania żywych komórek, komórki muszą być transfekowane wektorem kodującym interesujące nas białko ECM, połączone w ramce z genetycznie kodowanym znacznikiem fluorescencyjnym. Ma to umożliwić identyfikację białka ECM będącego przedmiotem zainteresowania podczas obrazowania żywych komórek.
  2. Po odpowiednim czasie do ekspresji białka (np. 16 godzin) usuń komórki z naczynia roztworem trypsyny-EDTA, policz je w hemocytometrze i umieść ~ 150 000 komórek na 35-milimetrowym naczyniu ze szklanym dnem w celu obrazowania. Odczekaj 2 godziny, aż komórki ponownie się przyczepią i rozpoczną osadzanie ECM (okres ten zależy od typu komórki i musi być ustalony empirycznie).
    UWAGA: Użyj podłoża komórkowego, które nie zawiera czerwieni fenolowej, ponieważ może to spowodować czerwony odcień, który wpływa na jakość obrazu.
  3. W ciągu powyższych 2 godzin należy ustawić mikroskop konfokalny z komorą inkubatora o temperaturze 37 °C i dopływem CO2 . Przed przystąpieniem do obrazowania należy pozwolić, aby temperatura w komorze i w naczyniu ustabilizowała się do 37 °C; Może to potrwać do 1 godziny.
  4. Inkubować komórki posiażone na naczyniu z kratką o średnicy 35 mm z fluorescencyjnym markerem komórkowym przez 30 minut. Następnie przed obrazowaniem należy dwukrotnie umyć komórki w pożywce hodowlanej wolnej od czerwieni fenolowej.
    UWAGA: Cytoplazmatyczny marker fluorescencyjny może być użyty do wizualizacji objętości komórek lub marker wprowadzający błonę może być użyty do wizualizacji krawędzi komórek.
  5. Korzystając z obiektywu 20X i kontrastu fazowego w mikroskopie konfokalnym, zidentyfikuj odpowiedni kwadrat siatki, który zawiera liczbę (>3) przylegających, zdrowych komórek. Potwierdź ekspresję wybranego białka docelowego w komórkach w wybranym kwadracie siatki za pomocą obiektywów 63X lub 100X i odpowiednich długości fal pod mikroskopią fluorescencyjną.
  6. Skonfiguruj obrazowanie poklatkowe fluorescencyjne i poklatkowe z kontrastem fazowym za pomocą oprogramowania z-stack. Ustaw stos "Początek" tak, aby znajdował się tuż pod warstwą ECM, a stos "Koniec" tuż nad treścią komórki. Ustaw rozmiar kroku z na 0,3 μm, a objętość z na łączną głębokość od 5 do 10 μm, w zależności od typu ogniwa. Da to od 15 do 30 przekrojów z na punkt czasowy.
  7. Rejestruj obrazy fluorescencyjne (dla białka czerwonej fluorescencji (RFP), wzbudzenie = 555 nm i emisja = 584 nm) oraz obrazy kontrastu fazowego okresowo w określonym przedziale czasu. Na przykład użyj oprogramowania poklatkowego, aby ustawić przedział czasu na 2 minuty, a czas trwania na 2 godziny. Wybierz przycisk "start", aby rozpocząć przechwytywanie obrazów przekroju z w zdefiniowanym okresie czasu.
  8. Pod koniec tego okresu należy usunąć komórki z naczynia, jak opisano w krokach 1.1-1.5, aby potwierdzić lokalizację markerowanego fluorescencyjnie białka będącego przedmiotem zainteresowania w ECM.
  9. Użyj obrazowania z kontrastem fazowym i obiektywu 20X, aby przesunąć odpowiedni kwadrat siatki.
  10. Przełącz się na obiektyw 63X i zidentyfikuj warstwę ECM pod mikroskopią fluorescencyjną. Porównaj ten obraz z obrazem przed ekstrakcją

3. Sterylne przygotowanie ECM pochodzącego z komórki do testów funkcjonalnych komórek

  1. Hodować jedną populację komórek (komórki "producenta matrycy") na szkiełkach nakrywkowych, a drugą populację ("komórki "testowe") w kulturze standardowej w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm przez co najmniej 24 godziny
    UWAGA: Mogą to być dowolne dwa różne typy komórek przylegających, a projekt eksperymentalny może obejmować transfekcję jednej lub obu populacji komórek w celu ekspresji znakowanego fluorescencyjnie białka ECM.
  2. W okapie z przepływem laminarnym, używanym do hodowli komórek, przygotować sterylne roztwory PBS bez Ca2+/Mg2+, 20 mM wodorotlenku amonu (patrz krok 1.3) i zdejonizowanegoH2O, przepuszczając je przez sterylny filtr 0,2 μm do odpowiedniego sterylnego pojemnika.
  3. Zachowując sterylną technikę, delikatnie przemyć komórki "producenta matrycy" na szkiełkach nakrywkowych trzykrotnie sterylnym PBS (patrz krok 1.2).
  4. Wyjąć PBS przez aspirację sterylną pipetą i wyrzucić go do odpowiedniego pojemnika na odpady płynne. Dodać 20 mM sterylnego wodorotlenku amonu (szalka 3 ml/100 mm) i inkubować przez 5 minut, kołysząc w odstępach czasu.
  5. Dodać duże ilości sterylnego zdejonizowanegoH2Odo naczynia "producent matrycy", co najmniej 20 ml na 100 mm szalki, z kołysaniem i wylać lizat komórkowy do odpowiedniego pojemnika na odpady.
  6. Powtórz krok 3.5 jeszcze cztery razy, aby zapewnić całkowite usunięcie materiału rozpuszczonego w wodorotlenku amonu.
    UWAGA: ECM osadzony przez komórki "producenta matrycy" na szkiełkach nakrywkowych zapewnia następnie sterylny ECM do testów funkcjonalnych z dowolnymi komórkami testowymi będącymi przedmiotem zainteresowania.
  7. Inkubować komórki testowe z naczynia podstawowego z 1,5 ml roztworu trypsyny-EDTA na 100 mm szalki (0,05% w/v trypsyny i 0,02% w/v EDTA w zrównoważonym roztworze soli Hanka), aż komórki testowe zostaną odłączone od naczynia. Dodać pożywkę komórkową, odwirować komórki testowe przy sile 400 x g przez 5 minut i usunąć ciecz sklarowaną nad osadem.
  8. Ponownie zawiesić badane komórki w świeżym, sterylnym podłożu i policzyć je w hemocytometrze. Umieścić odpowiednią liczbę tych komórek testowych na sterylnym, izolowanym ECM na szkiełkach nakrywkowych. Hodować je w odpowiedniej pożywce komórkowej przez 2-3 godziny lub przez okres wymagany do zaprojektowania doświadczenia.
  9. Aby zbadać organizację cytoszkieletu aktynowego, utrwal komórki testowe w 2% PFA i wybarwić je izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)-falloidyną (wzbudzenie = 490 nm i emisja = 525 nm) w celu wizualizacji F-aktyny i 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI; wzbudzenie = 358 nm i emisja = 461 nm) w celu wizualizacji jąder11,
    UWAGA: Porównaj morfologię i organizację aktyny w komórkach testowych posianych na heterologicznym ECM pochodzącym z komórek z komórkami testowymi podanymi na ich własnym ECM.

4. Izolacja ECM dla SDS-PAGE, analizy immunoblot lub proteomiki

  1. Hoduj przylegające komórki będące przedmiotem zainteresowania na 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych (5 do 10 szalek w przypadku proteomiki lub 1-2 szalki w przypadku immunoblottingu) przez 24-96 godzin, w zależności od typu komórki, aby umożliwić wydzielanie i odkładanie ECM.
  2. Usuń komórki zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.5.
  3. Przechyl każdą płytkę pod kątem, aby odsączyć resztkiH2Ona dno naczynia i ostrożnie usuń pozostałąH2Oza pomocą pipety p200, aż płyta całkowicie wyschnie.
  4. Równolegle podgrzej bufor próbki SDS-PAGE zawierający 100 mM ditiotreitolu (DTT) do 95 °C przez 2 minuty za pomocą bloku grzewczego, a następnie dodaj go do płytki. 200 μl buforu próbki na płytkę 100 mm jest odpowiednie dla próbek, które mają być badane za pomocą immunoblot.
    1. Aby przeanalizować ECM za pomocą spektrometrii mas, należy uzyskać bardziej skoncentrowaną próbkę, pobierając bufor próbki SDS-PAGE z naczynia (jak opisano w krokach 4.5 i 4.6 poniżej), ponownie podgrzewając go do 95 °C i używając tej samej podwielokrotności na 2-3 dodatkowych płytkach.
  5. Użyj skrobaka do komórek, aby dokładnie zeskrobać ECM z naczynia, upewniając się, że wszystkie obszary naczynia zostały zeskrobane.
  6. Za pomocą skrobaka do komórek zebrać próbkę z jednej strony naczynia i wyjąć ją za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl do probówki.
  7. Przenieś resztkowy ekstrakt bufora próbki SDS-PAGE z końcówki skrobaka do komórek do probówki, aby zminimalizować straty materiału ECM. W przypadku próbki zagęszczonej należy ponownie podgrzać tę samą porcję bufora próbki SDS-PAGE do temperatury 95 °C i ponownie użyć jej na 2-3 dodatkowych płytkach.
  8. Rozmieść białka ECM za pomocą SDS-PAGE12, używając żeli poliakrylamidowych o gradiacji 7% lub 4-7%.
    UWAGA: Wygodne jest stosowanie wstępnie wybarwionych markerów białkowych.
  9. Aby zwiększyć rozdzielczość białek ECM o dużej masie cząsteczkowej, należy wydłużyć czas działania żelu tak, aby marker masy cząsteczkowej 37 kDa przebiegał blisko dna żelu, a markery masy cząsteczkowej <37 kDa spłynęły z żelu.
  10. W celu analizy proteomicznej białek ECM należy wybarwić żel barwnikiem białkowym i uchwycić obraz. Wytnij interesujące pasma z żelu, strawij je trypsyną i przeanalizuj za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI)13.
  11. Alternatywnie, w celu bardziej kompleksowej analizy ekstraktu ECM i przeanalizowania całej próbki, należy pokroić pas żelu na sekcje, wytrawić je trypsyną i przeprowadzić chromatografię cieczową ze spektrometrią mas (LC-MS)14.
  12. Alternatywnie, w przypadku immunoblottingu15, przenieść białka z żelu SDS-PAGE na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) pod napięciem 15 V przez co najmniej 1 godzinę i 10 minut (metoda półsucha), aby zapewnić transfer białek ECM o dużej masie cząsteczkowej. Wizualizuj całkowite białko przeniesione do błony za pomocą barwienia Pąs.
  13. Po kroku 4.11 należy użyć przeciwciał w celu ustalenia obecności i/lub przeprowadzenia półilościowej analizy poszczególnych białek ECM15.
    1. Zablokować błonę 2% (m/v) mlekiem w TBS-Tween 20 (bufor blokujący) przez noc w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć specyficzne przeciwciała przeciwko białkom ECM w buforze blokującym i inkubować z błoną przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (przeciwciało przeciwko fibronektynie rozcieńczone 1/600 i przeciwciało przeciwko trombospondynie-1 rozcieńczone 1/150; Tabela uzupełniająca 1).
    2. Zbadaj jakość izolacji ECM, ponownie sondując tę samą plamę przeciwciałami przeciwko licznym białkom wewnątrzkomórkowym, takim jak aktyna lub tubulina (antyaktyna rozcieńczona 1/10 000 i antytubulina rozcieńczona 1/5 000).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w krokach 1.1-1.5 działa w celu usunięcia komórek i pozostawienia ECM pochodzącego z komórki. Protokół przeprowadzono na komórkach COS-7 hodowanych przez 96 godzin na szklanych szkiełkach nakrywkowych, a ECM pochodzące z komórek analizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Leczenie wodorotlenkiem amonu skutecznie usunęło komórki, jak ustalono na podstawie utraty jąder komórkowych i cytoszkieletu aktynowego, zgodnie odpowiednio z barwieniem DAPI i falloidyną (ryc. 1). Ekstrakcja komórek za pomocą 2 M mocznika nie była tak skuteczna jak wodorotlenku amonu; po leczeniu wykryto ślady barwienia DAPI i falloidyny. 8 M mocznik miał podobny efekt do wodorotlenku amonu (ryc. 1). Następnie uwidoczniono ECM pochodzenia komórkowego przed i po leczeniu wodorotlenkiem amonu (kroki 2.1-2.11). Komórki COS-7 transfekowano monomerycznym trimerem C-końcowym trombospondyny-1 znakowanym białkiem czerwonej fluorescencji (mRFP) (mRFPovTSP1C)11 i hodowano na 35-milimetrowej szalce z siatkowaną szklaną podstawą.

Dwie godziny po posiewie, pod mikroskopem konfokalnym uwidoczniono odpowiedni kwadrat siatki, który zawierał wiele zdrowych komórek wyrażających mRFPovTSP1C. Wykonano obraz kontrastowy fazy referencyjnej tego obszaru, a następnie przeprowadzono fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe co 1 minutę przez 2 godziny (ryc. 2A). Komórki zostały następnie usunięte za pomocą wodorotlenku amonu, a ten sam kwadrat siatki na szalce został przeniesiony pod wpływem kontrastu fazowego, a następnie ponownie przeanalizowany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki nie były już obecne w kwadracie siatki, ale mRFPovTSP1C pozostał w ECM, wykryty przez mikroskopię fluorescencyjną jako charakterystyczna puncta (Figura 2A). Każdy mRFPovTSP1C zdeponowany w ECM przed usunięciem komórki zidentyfikowano poprzez porównanie wzorca fluorescencji przed i po usunięciu komórek. Zakłada się, że punkt fluorescencyjny zidentyfikowany na obu obrazach (rysunek 2A, przykład ze strzałką) jest powiązany z ECM.

Leczenie wodorotlenkiem amonu zostało następnie użyte do wyizolowania natywnego ECM z hodowanych, przylegających komórek. Ludzkie fibroblasty skórne (HDF) hodowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych przez 96 godzin. Komórki usunięto za pomocą wodorotlenku amonu, a ECM badano przeciwciałem anty-kolagenowym I, które wykazało charakterystyczny wzór barwienia fibrylarnego i siatkowego16 (Figura 2B). Wzorzec fibronektyny badano wokół stałych, nieprzepuszczalnych komórek chrzęstniakomięsaka szczura (RCS) oraz w ECM po usunięciu komórek RCS (Figura 2C). Izolację ECM wodorotlenkiem amonu przeprowadzono również w sterylnych warunkach, tak aby komórki "testowe" mogły zostać ponownie posiane na ECM w celu przeprowadzenia badań fenotypowych lub funkcjonalnych. Na przykład, "testowe" komórki COS-7 były siane przez 2 godziny na sterylnym ECM wytwarzanym przez komórki RCS, a następnie zostały utrwalone, permeabilizowane i analizowane pod kątem organizacji F-aktyny przez barwienie FITC-falloidyną, w porównaniu z komórkami COS-7 wytwarzającymi własny ECM (kroki 3.1-3.9) (Figura 3).

Na większą skalę, metoda ta została wykorzystana do izolacji ECM do procedur biochemicznych. Na przykład komórki RCS hodowano na dwóch 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych przez 7 dni, a następnie postępowano zgodnie z procedurami opisanymi w krokach 4.1-4.7. Białka w ECM pochodzącym z komórki zebrano poprzez zeskrobanie ich do gorącego bufora próbki SDS-PAGE i oddzielono za pomocą SDS-PAGE na 7% żelu poliakrylowym w warunkach redukcyjnych. Żel wybarwiono na białko, a cztery główne prążki wyizolowano i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas (ryc. 4A). Zidentyfikowano szereg białek ECM, w tym fibronektynę, trombospondynę 1 (TSP1), trombospondynę 5 / białko macierzy oligomerycznej chrząstki (TSP5 / COMP) i matrylinę-1 (Figura 4B).

Alternatywnie, preparaty ECM na mniejszą skalę mogą być oceniane za pomocą immunoblots. Na przykład ECM pochodzący z komórek COS-7 wykazujących ektopową ekspresję mRFPovTSP1C oddzielono za pomocą SDS-PAGE, przeniesiono do membrany PVDF i sondowano pod kątem RFP za pomocą przeciwciała anty-RFP (Figura 4C). Ta technika jest wystarczająco czuła, aby wykryć różnice w osadzaniu między natywnym trimerem TSP1 (mRFPovTSP1C) a zaprojektowanym pentamerem regionu C-końcowego TSP1 (mRFP-TSP-5-1C)17 (Figura 4C). Aby zbadać endogenny ECM HDF, zbadano obecność specyficznych białek w lizacie komórkowym lub wyizolowanym ECM za pomocą immunoblottingu. Charakterystyczne białka ECM fibronektyna i trombospondyna-1 zostały wykryte w ECM, podczas gdy obfite białka wewnątrzkomórkowe α-tubulina i β-aktyna były nieobecne w izolowanym ECM (Figura 4D).

figure-results-1
Rysunek 1: Porównanie metod usuwania komórek. Komórki COS-7 hodowano w wysokiej gęstości przez 96 godzin na szkiełkach nakrywkowych, utrwalano w 2% PFA i przepuszczalno w 0,5% Triton X100 lub traktowano zgodnie ze wskazaniami do usunięcia komórek. Szkiełka nakrywkowe zostały następnie wybarwione falloidyną FITC, aby uwidocznić F-aktynę i DAPI, aby uwidocznić jądra. Podziałka = 25 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie oryginalnej publikacji w Journal of Cell Science11. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Identyfikacja białek ECM w izolowanym ECM. (A) Obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji komórek COS-7 eksprymujących mRFPovTSP1C i hodowanych na 35 mm szalce ze szklanym dnem, siatkowaną podstawą przez 2 godziny. Obrazy są wyświetlane przed i po usunięciu komórek za pomocą wodorotlenku amonu. Krawędź litery siatki jest oznaczona na obrazach kontrastu fazowego linią przerywaną. Białe strzałki wskazują przykłady fluorescencyjnych punkci, które były obecne przed i po usunięciu komórek. (B) Wykrywanie kolagenu I w HDF ECM metodą immunofluorescencji pośredniej. HDF uprawiano przez 96 godzin i usunięto wodorotlenkiem amonu, a ECM wybarwiono pod kątem ludzkiego kolagenu fibrylarnego I. ECM był również barwiony samym sprzężonym z FITC przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi. (C) Lokalizacja fibronektyny wokół komórek RCS lub w izolowanym RCS ECM, wykryta przez immunofluorescencję pośrednią. Komórki RCS hodowano przez 48 godzin, utrwalano w 2% PFA i barwiono na obecność fibronektyny i DAPI. W równoległych szalkach komórki usunięto za pomocą wodorotlenku amonu o stężeniu 20 mM, a ECM wybarwiono pod kątem fibronektyny i DAPI. Komórki barwiono również samym przeciwciałem anty-mysim IgG sprzężonym z FITC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Zastosowanie sterylnego ECM w badaniach funkcjonalnych. Komórki RCS "producenta matrycy" hodowano przez 48 godzin na szklanych szkiełkach nakrywkowych, a następnie traktowano 20 mM wodorotlenkiem amonu w sterylnych warunkach w celu usunięcia komórek. Komórki "testowe" COS-7 posiewano na szkiełkach nakrywkowych z izolowanym RCS ECM lub bez niego przez 2 godziny, utrwalano w 2% PFA, permeabilizowano w 0,5% Triton X100 i barwiono falloidyną FITC w celu wizualizacji F-aktyny i DAPI w celu wizualizacji jąder. Ogniwa COS-7 platerowane na RCS ECM rozprzestrzeniały się szerzej i tworzyły duże wiązki mikrowłókien (na przykład ze strzałkami) i falbany krawędziowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Identyfikacja białek z izolowanego ECM za pomocą SDS-PAGE, spektrometrii mas lub immunoblottingu. (A) Komórki RCS hodowano przez 7 dni i usunięto za pomocą 20 mM wodorotlenku amonu; ECM został zeskrobany do gorącego bufora próbki SDS-PAGE zawierającego 100 mM DTT. Preparat ECM oddzielono za pomocą SDS-PAGE na 7% żelu poliakrylamidowym w warunkach redukujących. Cztery znaczące prążki (strzałki 1-4) zidentyfikowano za pomocą barwienia białek. (B) Białka z pasm RCS ECM 1-4 zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas MALDI. (C) Komórki COS-7 wykazujące ekspresję mRFPovTSP1C (trimer) lub mRFP-TSP-5-1C (pentamer) hodowano przez 48 godzin i usuwano za pomocą 20 mM wodorotlenku amonu, a następnie izolowano ECM do gorącego bufora próbki SDS-PAGE zawierającego 100 mM DTT. Preparat ECM rozdzielono za pomocą SDS-PAGE na 7% żelu poliakrylamidowym w warunkach redukcyjnych, przeniesiono do membrany PVDF i sondowano przeciwciałem anty-RFP. Ten panel został zmodyfikowany na podstawie oryginalnej publikacji w Bioscience Reports17. (D) HDF hodowano przez 96 godzin, a następnie traktowano 2% kwasem deoksycholowym w PBS (lizat komórkowy) lub 20 mM wodorotlenkiem amonu w celu usunięcia komórek. ECM został zeskrobany do gorącego bufora próbki SDS-PAGE. Obie frakcje oddzielono za pomocą SDS-PAGE na 10% żelu poliakrylamidowym w warunkach redukujących, przeniesiono do membrany PVDF i zbadano przeciwciałami, jak wskazano. W każdym panelu pozycje markerów masy cząsteczkowej są wskazane w kDa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Metoda składa się z kilku krytycznych kroków, które należy wykonać, aby zapewnić pomyślną izolację i analizę ECM. Na przykład wodorotlenek amonu jest używany do usuwania komórek i izolowania ECM do analizy. Chociaż wodorotlenek amonu jest stabilny w roztworach wodnych w ciemności i może być przechowywany w temperaturze pokojowej, butelki muszą być szczelnie zamykane między każdym użyciem. Ponieważ gaz może wyparować z roztworu, zmniejszając w ten sposób stężenie, zdecydowanie zalecamy rozpoczęcie nowej butelki co 6-8 tygodni. Ponadto roztwór roboczy powinien być przygotowywany świeżo do każdego eksperymentu. Istotne jest również, aby komórki zostały całkowicie usunięte za pomocą obfitych płukań w wodzie dejonizowanej. Jeśli te kroki nie zostaną wykonane prawidłowo, materiał komórkowy może pozostać na szalce i zanieczyścić dalsze analizy. Jeśli komórki były hodowane przez 10 dni lub dłużej, może być konieczne dodatkowe płukanie wodą. Ważne jest, aby pamiętać, że izolowana warstwa ECM jest zazwyczaj bardzo cienka w porównaniu z komórkami11, dlatego należy zachować ostrożność podczas identyfikacji ECM podczas obrazowania. W celu skutecznej ekstrakcji wyizolowanego ECM do buforu próbki SDS-PAGE konieczne jest, aby bufor próbki zawierał środek redukujący. W celu najskuteczniejszego usunięcia ECM należy użyć gorącego buforu do sporządzania próbek. W przypadku eksperymentów, w których próbki ECM będą rozdzielone za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w celu barwienia białek lub proteomiki, kluczowe znaczenie ma uzyskanie skoncentrowanej próbki poprzez zeskrobanie kilku płytek ECM do tej samej podwielokrotności bufora próbki.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Produkcja i wydzielanie białek ECM może się znacznie różnić w zależności od typu komórki, dlatego okresy wydzielania i odkładania ECM powinny być określone de novo dla każdego typu komórki. Ważne jest również, aby mieć świadomość, że skład ECM będzie się dynamicznie zmieniał w zależności od gęstości komórek i czasu w hodowli18. Czynnik ten powinien być brany pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów. Nie ulega wątpliwości, że wybór typu komórki do tej metody jest ważny, szczególnie w przypadku ekstrakcji ECM do analizy za pomocą spektrometrii mas, która może wymagać znacznej ilości całkowitego białka ECM.

Ograniczenia techniki

Komórki, które wydzielają bardzo niski poziom białek ECM, będą trudniejsze do wykorzystania tą metodą. Nieprzylegające komórki, hodowle komórkowe 3D lub testy inwazji komórek nie są obecnie odpowiednie do izolacji ECM tą metodą. Metoda jest najbardziej odpowiednia do stosowania ze standardowymi "dwuwymiarowymi" hodowlami komórkowymi. Ponieważ ekstrakcja wodorotlenkiem amonu całkowicie usuwa komórki, ECM związany z górnymi bokami komórek i wydzielany, ale nieusieciowany, białka ECM są również usuwane, pozostawiając na szalce cienką warstwę złożonego ECM od dołu i wokół podstaw komórek11,17. Trudno jest określić, ile ECM jest uwalniane przez ekstrakcję wodorotlenku amonu, ponieważ uwolniony materiał zawiera również białka ECM, które są wewnątrzkomórkowe przed wydzielaniem lub po wychwyceniu z powierzchni komórki.

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod

Możliwość przeprowadzania szerokiego zakresu eksperymentów z wyizolowanym ECM jest ważna w kontekście biologii komórki i fizjologii tkanek, a także ma implikacje dla dziedzin regeneracji tkanek i inżynierii tkankowej. Metoda ta ma przewagę nad żelami utworzonymi z oczyszczonych kolagenów lub innych oczyszczonych białek ECM, ponieważ komórki składają złożone struktury ECM w ich natywnej wielkości, z natywnymi mechanizmami sieciowania i z pojedynczymi białkami ECM obecnymi w proporcjach odpowiednich do typu komórki pochodzenia. Na przykład badanie proteomiczne RCS ECM wykazało obfitość matrylin i COMP / TSP5, zgodnie z oczekiwaniami dla chrzęstnego ECM19,20 (Figura 4). Ogólnie rzecz biorąc, analiza ECM pochodzącego z komórek jest utrudniona ze względu na jego charakter jako rozległej, wielobiałkowej sieci, która powoduje kowalencyjne sieciowanie i nierozpuszczalność wielu białek ECM, a także ze względu na potencjalne zanieczyszczenie ekstraktów ECM białkami wewnątrzkomórkowymi. Wieloetapowa procedura mająca na celu wyizolowanie frakcji ECM z tkanek w celu analizy proteomicznej pozwoliła uzyskać 8% białek ECM w całym zestawie zidentyfikowanych białek21. Jednak peptydy z białek ECM stanowiły 73% wszystkich zidentyfikowanych peptydów. Ta metoda izolacji i analizy ECM pochodzenia komórkowego szybko i niezawodnie usuwa materiał komórkowy, zachowując białka ECM. Metoda ta może być stosowana w wielu typach komórek i dalszych zastosowaniach oraz ułatwia analizę biologii ECM i interakcji komórka-ECM w hodowli komórkowej. Nasze protokoły szczegółowo opisują, w jaki sposób metoda może być stosowana w różnych skalach, aby odpowiedzieć na szeroki zakres pytań eksperymentalnych w odniesieniu do organizacji, dynamiki lub składu ECM oraz do funkcjonalnego wpływu izolowanego ECM na komórki.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki

Patrząc w przyszłość, metoda może zostać zaadaptowana do stosowania w hodowlach komórkowych 3D; Rozszerzyłoby to jego znaczenie fizjologiczne. Pozbawiona komórek tkanka natywna ma ogromny potencjał jako rusztowanie do regeneracji utraconych lub uszkodzonych tkanek oraz jako alternatywa dla przeszczepu, np. po niewydolności serca22. Ma ona potencjał, aby przezwyciężyć problemy związane z dostępnością dawców i odrzuceniem immunologicznym. Przyszłe zastosowania metody opisanej w niniejszym raporcie mogą obejmować badanie jej zastosowania w hodowlach komórkowych 3D lub decelularyzacji tkanek, co jeszcze bardziej zwiększyłoby zakres tego podejścia.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy bardzo wdzięczni dr Belindzie Willard, Laboratorium Proteomiki i Metabolomiki, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, za przeprowadzenie analizy proteomicznej RCS ECM. Dziękujemy za wsparcie finansowe udzielone JCA przez Brytyjską Radę ds. Badań Medycznych (Medical Research Council UK), grant numer K018043.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciało przeciwko COL1A1NovusNB600-408Królik poliklonalny. (W)wchodzi w reakcję z innymi kolagenami fibrylarnymi, a także z kolagenem I. JEŻELI: 1/200
Przeciwciało przeciwko fibronektynieSigmaF3648Królik poliklonalny. WB: 1/600 przez 1,5 h. JEŻELI: 1/200 Przeciwciało
przeciwko trombospondynie 1ThermoFisher MA5-13398Klon monoklonalny myszy A6.1. WB: 1/150 przez 1,5 h
Przeciwciało przeciwko RFPAbcamab62341Królik poliklonalny. WB: 1/2,000 przez 2 h
Przeciwciało przeciwko β-aktynieSigmaA1978Mysi klon monoklonalny AC-15. WB: 1/10 000 przez 1,5 h
Przeciwciało przeciwko &alfa-tubulinieSigmaT9026Mysi klon monoklonalny DM1A. WB: 1/5 000 dla 1,5 h
Cell Tracker GreenThermoFisher C2925Marker fluorescencyjny. Stosować przy 1 i mikro; M przez 30 min
Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC)-falloidynaSigmaP-5282Zapas = 50 mg / ml w DMSO. 1/50 przez 45 min
IgG IgG IgGF8771: 1/50 przez 1 h
królikom IgGF7512IF: 1/50 przez 1 h
Peroksydaza chrzanowa (HRP)-sprzężona z kozą anty-mysią IgGLI-COR926-80010WB: 1/50 000 przez 1 h
LI-COR926-80011kóz sprzężonych z HRP: 1/100 000 przez 1 h
Nośnik montażowy Vectorshield z DAPIVectorH-1200Przechowywać w temperaturze 4 ° C w ciemności
Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigmaD6429Ciepły przed użyciem
Pożywka wzrostowa fibroblastówPromoCellC-23010Ciepła przed użyciem, uzupełnić 50 &mikro; g/ml kwas askorbinowy
Fenol bez czerwieni DMEMThermoFisher 21063-029Ciepły przed użyciem
Roztwór trypsyny-EDTASigmaT3924Ciepły przed użyciem
Naczynie ze szklanym dnem w kratceMatTekP35G-2-14-C-GRID
NH4OH, roztwór 28-30%Sigma221228Rozcieńczyć do 20 mM w wodzie dejonizowanej. Po otwarciu przechowywać w ciemności, szczelnie zakręcone.
Paraformaldehyd, 16% roztwórAlfa Aesar43368Rozcieńczyć do 2% (v/v) w PBS
Kwas deoksycholowySigmaD2510Stosować przy 2% (v/v) stężeniu końcowym
Triton X-100SigmaT8787Rozcieńczyć do 0,5% (v/v) stężenia końcowego
Odczynnik do barwienia GelCode BlueThermoFisher 24590Barwnik białkowy do żeli SDS-PAGE Wzorce
białkowe Precision PlusBiorad161-0374Wzorce białkowe do żeli SDS-PAGE
Trans-Blot SD Semi Dry komórka transferowaBiorad1703940Wydajny transfer białek o wysokiej masie cząsteczkowej Membrana
transferowa PVDFMilliporeISEQ00010Immobilon-PSQ 
Bejca Pąsek SSigmaP7170Odwracalny barwnik białkowy do membrany PVDF
Podłoże WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL)LI-COR926-80200
Wysokowydajna folia chemiluminescencyjnaGE Healthcare28906837
Sterylne urządzenie filtracyjne, MILLEX-GVMilliporeML481051
SP8 Konfokalny skaning laserowy AOBS mikroskopLeicaKomora środowiskowa potrzebna do kontroli temperatury i CO2 (Life Imaging Services)
Klucz: IF, immunofluorescencja; WB, Western Blot (Zachodnia Blot
IgG Igg skojarzone z FITC IF IgG przeciw IgG PL dla WB)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).">Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
  2. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903(2012).">Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903(2012).
  3. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).">Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
  4. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).">Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
  5. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).">Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
  6. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).">Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
  7. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).">Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
  8. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).">Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
  9. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).">Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
  10. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).">Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
  11. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).">Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
  12. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).">Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  13. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).">Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
  14. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).">Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
  15. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).">Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
  16. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).">Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
  17. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).">Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
  18. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).">Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
  19. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).">Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
  20. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).">Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
  21. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647(2012).">Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647(2012).
  22. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).">Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix IsolationCell derived ECMAmmonium Hydroxide TreatmentSDS PAGE AnalysisImmunoblotting DetectionMass Spectrometry AnalysisImmunofluorescence MicroscopySterile ECM PreparationFunctional ECM StudiesECM Protein Extraction

Related Articles