Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie konstruktu TMEM184A znakowanego GFP w celu potwierdzenia tożsamości receptora heparyny

DOI:

10.3791/55053

⸱

17 lutego 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Lehigh University, 2Department of Natural Science, DeSales University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstrukt kodujący TMEM184A ze znacznikiem GFP na końcu karboksylowym, przeznaczony do ekspresji eukariotycznej, został wykorzystany w testach mających na celu potwierdzenie identyfikacji TMEM184A jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy nowe białka są identyfikowane poprzez izolację opartą na powinowactwie i analizę bioinformatyczną, często są one w dużej mierze niescharakteryzowane. Przeciwciała przeciwko określonym peptydom w przewidywanej sekwencji pozwalają na pewne eksperymenty lokalizacyjne. Jednak często nie można wykluczyć innych możliwych interakcji z przeciwciałami. Sytuacja ta stała się okazją do opracowania zestawu testów zależnych od sekwencji białka. W szczególności uzyskano konstrukt zawierający sekwencję genu sprzężoną z sekwencją kodującą GFP na C-końcowym końcu białka i wykorzystano go do tych celów. Eksperymenty mające na celu scharakteryzowanie lokalizacji, powinowactwa ligandów i wzmocnienia funkcji zostały pierwotnie zaprojektowane i przeprowadzone w celu potwierdzenia identyfikacji TMEM184A jako receptora heparyny1. Ponadto konstrukt ten może być wykorzystany do badań nad kwestiami topologii błony i szczegółowymi interakcjami białko-ligand. W niniejszym raporcie przedstawiono szereg protokołów eksperymentalnych opartych na konstrukcie GFP-TMEM184A ulegającym ekspresji w komórkach naczyniowych, które można łatwo zaadaptować do innych nowych białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja białek kandydujących do nowych funkcji często zależy od protokołów izolacji opartych na powinowactwie, po których następuje częściowe określenie sekwencji. Ostatnie przykłady nowo zidentyfikowanych białek obejmują białko transbłonowe 184A (TMEM184A), receptor heparyny zidentyfikowany po interakcjach powinowactwa heparyny1, oraz TgPH1, białko domeny homologii pleckstriny, które wiąże fosfoinozytyd PI(3,5)P22. Inna nowatorska identyfikacja białek obejmuje bezpośrednią analizę sekwencji peptydów, taką jak ta przeprowadzona przez Vit i wsp., którzy wykorzystali peptydy transbłonowe do identyfikacji produktów białkowych z wcześniej niescharakteryzowanych genów3. Podobnie, identyfikacja nowych sekwencji białek może być dokonana za pomocą bioinformatycznego przeszukiwania wcześniej scharakteryzowanych rodzin białek, takich jak identyfikacja nowych białek 4TM 4. Badanie sekwencji genów rodziny akwaporyn przyniosło również identyfikację nowych członków o nowych funkcjach5. Po zidentyfikowaniu, analiza funkcji białka jest zazwyczaj kolejnym krokiem, który czasami można zbadać przy użyciu specyficznego testu funkcji białka, takiego jak w przypadku akwaporyny.

Jeśli to możliwe, funkcja nowo zidentyfikowanego białka może być badana za pomocą specyficznych enzymatycznych lub podobnych testów funkcji in vitro. Ponieważ wiele funkcji nowych białek zależy od złożonych interakcji, które zachodzą tylko w nienaruszonych komórkach lub organizmach, testy in vitro nie zawsze są skuteczne. Testy in vivo muszą być jednak zaprojektowane w taki sposób, aby zależały od sekwencji genu. W hodowlach komórkowych i/lub prostych organizmach modelowych, knockdown może dostarczyć dowodów potwierdzających identyfikację białka/funkcji6. W przypadku nowych białek zidentyfikowanych zgodnie z powyższym, często nie wystarczy po prostu strącić białko w celu potwierdzenia funkcji, a projektowanie testów funkcjonalnych in vivo, które zależą od sekwencji genów, staje się ważne dla charakterystyki nowych białek.

Niedawna identyfikacja TMEM184A jako receptora heparyny (modulującego proliferację w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych i reakcje zapalne w komórkach śródbłonka) przy użyciu chromatografii powinowactwa i MALDI MS1,7 dała możliwość opracowania zbioru testów po tym, jak knockdown dał wyniki zgodne z identyfikacją. Niedawny przegląd potwierdził, że heparyna oddziałuje specyficznie z wieloma czynnikami wzrostu, ich receptorami, składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, receptorami adhezji komórek i innymi białkami8. W układzie naczyniowym heparyna i proteoglikany siarczanu heparanu (zawierające łańcuchy siarczanu heparanu o budowie zbliżonej do heparyny) oddziałują z kilkuset białkami9. Aby funkcjonalnie potwierdzić, że TMEM184A jest zaangażowana w wychwyt i wiązanie heparyny, opracowano techniki wykorzystujące konstrukt genu dla TMEM184A. Niniejszy raport zawiera zbiór testów opartych na konstrukcie GFP-TMEM184A do wykorzystania w celu potwierdzenia tożsamości TMEM184A jako receptora heparyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt konstruktu białka GFP

  1. Zakup lub zaprojektowanie i zbudowanie konstruktu oznaczonego GFP na podstawie danego białka.
    UWAGA: W przypadku zakupionego konstruktu w laboratoriach komercyjnych dostępne są standardowe wektory, które zawierają niektóre lub wszystkie z następujących sugestii: W przypadku białka błonowego wybierz C-końcową lokalizację GFP, ponieważ jest mniej prawdopodobne, że będzie ona zakłócać transport białek błonowych. Rozważ rozszerzenie między genem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP, jeśli istnieje powód, aby sądzić, że C-koniec danego białka jest zwartie złożony w domenę białka. Wybierz konstrukt dla ogólnej ekspresji komórek eukariotycznych, ale zezwól na produkcję konstruktu w systemach bakteryjnych. Uwzględnij miejsce rozszczepienia (takie jak w przypadku proteazy TEV), za pomocą którego GFP może zostać usunięty w razie potrzeby w przypadku niektórych eksperymentów, w których GFP może zakłócać aktywność białka. Dodaj inne wstawki, takie jak dodatkowy tag do lokalizacji lub interakcji powinowactwa (np. His6). Nie było to konieczne w przypadku testów opisanych w niniejszym dokumencie, ale mogło ułatwić inne testy lub być użyteczne bezpośrednio w sąsiedztwie genu, przed GFP, jeśli pożądane jest usunięcie GFP.

2. Ekspresja GFP-TMEM184A w komórkach naczyniowych

  1. Hodowla komórek śródbłonka lub naczyń krwionośnych mięśni gładkich na 0,2% pokrytych żelatyną naczyniach do hodowli tkankowych, jak opisano wcześniej1,6,7.
  2. Dodaj 5 ml roztworu trypsyny do hodowli komórkowych (0,5% w/v) do wypłukanego 100 mm lub większego, zlewającego się naczynia komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C do momentu, gdy komórki zostaną uwolnione z płytki, a następnie przenieść komórki do sterylnej probówki wirówkowej z polipropylenu.
  3. Dodać inhibitor trypsyny (np. równą objętość zwykłej pożywki hodowlanej), tak jak jest on stosowany w rutynowej hodowli, do roztworu komórka/trypsyna, aby ograniczyć aktywność trypsyny. Osadzać komórki przez 5 minut w temperaturze około 600 x g (lub odpowiednią prędkość i czas, aby po prostu otulić komórki do standardowej hodowli tkankowej). Odessać supernatant.
  4. Zawieś komórki w 1 ml buforu elektroporacyjnego HeBS (Hepes-buffered Saline), ograniczając czas przebywania komórek w osadzie lub zawiesinie. Umieścić zawiesinę komórkową na lodzie i wykonać pozostałe kroki na lodzie.
    UWAGA: Osad można przemyć jednorazowo za pomocą HeBS przed ponownym zawieszeniem.
  5. Dodać do komórek wystarczającą objętość plazmidu TMEM184A znakowanego GFP, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 μg/ml DNA. Użyj identycznego protokołu dla konstrukcji GFP.
  6. Umieścić około 0,4 ml roztworu komórek w HeBS w kuwecie do elektroporacji. Wstępnie schłodzić kuwety przed użyciem.
  7. Elektroporuj ogniwa w następujących warunkach: Rozpad wykładniczy, 500 μF, ∞ omów i 170 V.
    UWAGA: Napięcie dla danego typu ogniwa powinno być zoptymalizowane. Wstępne badania nad typami komórek śródbłonka i mięśni gładkich przeprowadzono za pomocą konstruktu GFP-winkulina w celu określenia optymalnej wartości napięcia podanej tutaj, np. 10.
    1. Aby zoptymalizować elektroporację, zacznij od zaleceń producenta sprzętu (które obejmują warunki dla niektórych standardowych typów ogniw). Użyj pożądanego konstruktu lub kontrolnego konstruktu białka fluorescencyjnego podobnego pod względem wielkości i charakterystyki fluorescencyjnej do pożądanego konstruktu.
      UWAGA: Małe kwasy nukleinowe wydają się wnikać do komórek łatwiej niż większe konstrukty, więc konstrukt zawierający tylko białko fluorescencyjne może być łatwiejszy do ekspresji niż większy.
    2. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić żywotność komórek, procent komórek, w których konstrukt fluorescencyjny ulega ekspresji po 24 i 48 godzinach oraz intensywność ekspresji.
      UWAGA: Zmniejsz nieznacznie napięcie i/lub czas, jeśli przeżywalność jest niska. Staraj się dążyć do jak najkrótszego czasu między uwolnieniem komórek z powierzchni hodowli a powrotem komórek do hodowli, aby zwiększyć przeżywalność. Niewielkie wydłużenie czasu lub drugi impuls może poprawić wychwyt konstruktu, jeśli przeżywalność jest wysoka, a ekspresja niska. Optymalne warunki i ekspresja będą się różnić w zależności od typu komórek. Jeśli odsetek komórek wykazujących ekspresję konstruktu jest wysoki, ale intensywność jest niska, zwiększenie stężenia DNA i monitorowanie transfekowanych komórek w czasie w celu uzyskania optymalnej intensywności, która będzie się różnić w zależności od okresu półtrwania białka, a także ekspresji, może poprawić intensywność. Intensywność barwienia można zwiększyć w przypadku niektórych testów, jeśli to konieczne, przez barwienie immunofluorescencyjne GFP przeciwciałami anty-GFP
  8. Po elektroporacji wysiewać komórki do sześciu 30-milimetrowych dołków do hodowli tkankowych ze szkiełkami nakrywkowymi do obrazowania lub do szalek do hodowli tkankowych. Hoduj komórki przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowych.
  9. Opcjonalnie: Wymień pożywkę hodowlaną po 24 godzinach, aby usunąć bufor do elektroporacji HeBS.

3. Wizualizacja lokalizacji GFP-TMEM184A

  1. Przepłukać komórki PBS i delikatnie wstrząsnąć po hodowli przez co najmniej 24 godziny. Ogranicz ekspozycję na jasne światło, aby uniknąć blaknięcia GFP.
  2. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Unikaj używania odczynników zawierających metanol, które mogą przenikać do komórek. Utrwalanie metanolem może być stosowane, jeśli nie jest konieczne do oceny oddziaływań ligandów.
    Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Używaj ostrożnie w dygestorium i odpowiednio wyrzuć.
  3. Spłucz PBS jak wyżej. W przypadku barwienia na podstawie przeciwciał, patrz 3.6 poniżej.
  4. Zamontuj szkiełka nakrywkowe do szkiełek za pomocą Mowiolu lub innego odpowiedniego medium montażowego.
  5. Preparaty obrazowe przy użyciu mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego z odpowiednimi zestawami filtrów do wzbudzenia GFP i widm emisyjnych. Mikroskopia konfokalna jest preferowana ze względu na możliwość oddzielenia próbek w płaszczyźnie z. Zapisuj obrazy w skali szarości w celu oceny ilościowej w formacie TIF (oprócz pełnokolorowych obrazów do ilustracji).
  6. W celu porównania z TMEM184A WT ulegającym ekspresji przez komórki, przygotuj inne komórki do immunofluorescencji za pomocą pierwszorzędowych przeciwciał przygotowanych dla peptydu (peptydów) z sekwencji TMEM184A, np. 1. Identyfikacja GFP-TEMEM184A może być również przeprowadzona za pomocą przeciwciał przeciwko GFP. Oceń obie próbki komórek za pomocą identycznych technik mikroskopowych.

4. Wiązanie i kolokalizacja rodaminy-heparyny z komórkami transfekowanymi GFP-TMEM184A

  1. Komórki wykazujące ekspresję GFP-TMEM184A należy traktować 100 μg/ml heparyny rodaminy dodanej do pożywki hodowlanej i pozwolić komórkom na inkubację przez określony czas, zwykle krótszy niż 10 minut w przypadku komórek A7r5. Spłukać i utrwalić jak w 3.1 i 3.2.
    UWAGA: Optymalny czas i stężenie liganda zależą od odpowiedzi komórki, intensywności fluorescencji liganda i uzyskanej intensywności obrazu. To stężenie heparyny zostało zastosowane, ponieważ powoduje ponad 50% odpowiedzi w innych testach11. Stężenie to można było zobrazować za pomocą standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej, więc nie było konieczności jego zwiększania. Rozcieńczenie rodaminy-heparyny nieznakowaną heparyną powoduje niższą fluorescencję w komórkach, a zatem jest trudniejsze do zobrazowania i ilościowego określenia.
  2. Aby określić ilościowo wiązanie rodaminy i heparyny w wyniku transfekcji GFP-TMEM184A, należy przygotować identyczne komórki bez transfekowanej GFP-TMEM184A.
  3. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi wartościami wzbudzenia i emisji GFP (488 nm) i rodaminy (543 nm) (500 - 530 nm dla GFP i więcej niż 560 nm dla rodaminy) w celu określenia kolokalizacji. Uzyskaj obrazy co najmniej 50 komórek z co najmniej trzech oddzielnych eksperymentów, aby uzyskać statystyki. Utrzymuj identyczne ustawienia w eksperymentach i stosuj próbkę kontrolną (np. transfekowane komórki bez leczenia), które można wykorzystać do standaryzacji danych do analizy wielu eksperymentów.
  4. Zbadaj obrazy za pomocą programu komputerowego, aby określić względne wiązanie/wychwyt rodaminy w każdej komórce w celu ilościowego określenia wiązania.
    UWAGA: Należy stosować obrazy TIF, ponieważ są one wygodne do analizy i mogą być konwertowane do skali szarości w wielu programach komputerowych, jeśli nie zostały początkowo zapisane w tym formacie. W niniejszej analizie zastosowano obraz J (freeware), który umożliwia pomiar obszaru i intensywności pikseli dla dowolnego zdefiniowanego przez użytkownika obszaru obrazu.
    1. Użyj narzędzia odręcznego, aby zakreślić komórkę na obrazie fluorescencyjnym i użyj narzędzia do mierzenia, aby określić intensywność w tej przestrzeni.
      UWAGA: Pomiary te dostarczają informacji potrzebnych do obliczenia całkowitej intensywności dla obszaru zdefiniowanego przez użytkownika (cała komórka, jądro itp.), umożliwiając porównanie różnych komórek o różnych geometriach. Można podać średnie natężenie na danym obszarze tła, co ułatwia zbieranie danych o intensywności tła do analizy.
    2. Eksportuj do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć obszar pomnożony przez intensywność i odjąć tło dla tej samej wielkości obszaru. Uśrednij fluorescencję/komórkę dla wystarczającej liczby komórek/eksperymentu, aby uzyskać istotność statystyczną.

5. Transfer energii rezonansu fluorescencyjnego z GFP-TMEM184A do rodaminy-heparyny

  1. Przygotować transfekowane komórki i inkubować z ligandem znakowanym rodaminą o stężeniu 200 μg/ml, jak w ppkt 3.1. Należy pamiętać, że czas inkubacji z ligandem fluorescencyjnym jest zależny od typu komórki. Napraw tylko za pomocą PFA i zamontuj slajdy do obrazowania.
  2. Najpierw wzbudzić przy 405 nm i obrazować pod kątem emisji rodaminy (566 - 685 nm; FRET). Po drugie, wzbudzić w 488 dla GFP (obraz w 493 - 530), a po trzecie, wzbudzić w 561 dla rodaminy (obraz w 566 - 685). Kontrole bez GFP-TMEM184A lub bez rodaminy-heparyny mają kluczowe znaczenie.

6. Obrazowanie żywych komórek wychwytu rodaminy i heparyny

  1. Komórki transfekowane za pomocą GFP-TMEM184A należy umieścić w indywidualnych szalkach przeznaczonych do obrazowania żywych komórek i traktować jak w protokole 3.
    UWAGA: Wymagana liczba komórek zależy od typu komórki i pożądanej gęstości. Aby zminimalizować czas, przez jaki komórki są w zawieszeniu, nie należy liczyć komórek. Komórki nasienne z 100-milimetrowej zlewającej się płytki do sześciu 35-milimetrowych naczyń do obrazowania na żywo w celu uzyskania komórek w pobliżu konfluencji w ciągu 48 godzin.
  2. Po 48 godzinach zastąpić pożywkę pożywką hodowlaną bez czerwieni fenolowej.
  3. Przenieś miskę z komórkami do mikroskopu konfokalnego ze stopniem rozgrzewania, aby utrzymać temperaturę, i ustaw ostrość mikroskopu.
  4. Odpipetować 100 μg/ml heparyny rodaminy do naczynia i delikatnie wymieszać.
  5. Natychmiast rozpocznij nagrywanie obrazu na żywo. Jeśli w widocznym obszarze nie występuje wychwyt heparyny przez komórki, należy lekko przesunąć szalkę, aby zidentyfikować komórki z co najmniej jednym zielonym pęcherzykiem zawierającym etykietę rodaminy.
    UWAGA: Specyfika obrazowania, wzbudzenia i emisji jest taka sama, jak w przypadku protokołu wychwytu heparyny (punkt 5). Odstęp czasu między obrazami wynosił około 16 s. Warunki eksperymentu i mikroskopu zazwyczaj określają prędkość, z jaką można uzyskać obrazy.

7. Izolacja GFP-TMEM184A i GFP z hodowanych komórek

  1. Po usunięciu pożywki hodowlanej i przepłukaniu PBS, dodać 2 ml 0,2% (w/v) CHAPS 1x PBS roztwór z inhibitorami proteazy do 150 mm płytki z komórkami wykazującymi ekspresję GFP-TMEM184A lub GFP (do kontrolnych testów wiązania). Zeskrob komórki z naczynia, umieść komórki/roztwór CHAPS w 15 ml probówce polipropylenowej na lodzie i dobrze wymieszaj, stukając. Wykonaj wszystkie kroki w jasnym świetle, aby upewnić się, że znacznik GFP jest wybielony do poniższego testu wiązania.
  2. Aby specyficznie związać GFP-TMEM184A (lub odpowiednią kontrolę GFP), dodać 2 μg/ml biotynylowanego przeciwciała anty-GFP do roztworu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z kołysaniem.
  3. Dodać 500 μl kulek streptawidyny-agarozy do co najmniej 5 ml 0,2% CHAPS/PBS i odwirować przy około 600 x g przez 3 do 5 minut. Usunąć supernatant. Powtórz jeszcze dwa razy z nowymi CHAPS/PBS za każdym razem. Dodać kulki do roztworu przeciwciała i roztworu komórkowego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z kołysaniem, aby umożliwić kulkom związanie się z biotynylowanym przeciwciałem anty-GFP związanym z GFP lub GFP-TMEM184A.
  4. Granulki obrać przez odwirowanie (jak w ppkt 7.3) i usunąć niezwiązany materiał. Dodaj co najmniej 5 ml 0,2% inhibitorów CHAPS/PBS/proteazy do przemycia. Powtórz mycie i odwirowanie co najmniej 3 razy, aby skutecznie usunąć wszelkie niezwiązane białka.
  5. Po usunięciu ostatniego płukania inkubować kulki z 1 ml 0,2 M glicyny/0,2% CHAPS w PBS (pH do 2,0 przy użyciu HCl) na lodzie przez 3 minuty, aby zdysocjować wiązanie przeciwciało-GFP (w wyniku czego powstaje wolny GFP-TMEM184A lub wolny GFP). Mieszaj delikatnie, stukając co 30 sekund.
  6. Odwirować przy około 600 x g i przenieść supernatant zawierający oczyszczone białko do nowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie natychmiast zneutralizować 5 ml 1 M wodorowęglanu sodu (doprowadzić pH do 7).
  7. Zagęścić próbkę za pomocą koncentratora odśrodkowego o masie cząsteczkowej 10 000 daltonów (należy zastosować prędkość wirowania zalecaną przez dostawcę). Gdy objętość osiągnie około 0,5 ml, dodaj 0,2% CHAPS/PBS. Kontynuuj zagęszczanie i dodawanie większej ilości 0,2% CHAPS/PBS, aż zostanie dodanych co najmniej dziesięć objętości (razy początkowa objętość próbki) 0,2% CHAPS/PBS.
  8. Aby określić szacunkową ilość wyizolowanego białka GFP lub białka znakowanego GFP, należy uzyskać odczyt absorbancji przy 280 nm i porównać go z krzywą wzorcową przygotowaną z albuminy surowicy bydlęcej lub innego białka kontrolnego w tym samym buforze.
    UWAGA: Ze względu na różnice w współczynnikach ekstynkcji, stężenie to jest szacunkowe, ale może zapewnić przybliżone stężenie białka, aby ułatwić dalszą analizę bez marnowania próbki. Dokładne stężenie białka można określić za pomocą testu białkowego mikro-Lowry'ego, upewniając się, że standardowe białko jest przygotowane w tym samym buforze co próbka. Dalsza analiza wyizolowanego białka może być przeprowadzona przez western blot wyizolowanego białka (przy użyciu wykrywania przeciwciał dla GFP) i porównanie z przewidywaną masą cząsteczkową. Alternatywnie, zastosowanie przeciwciał TMEM184A powinno skutkować uzyskaniem prążka o przewidywanej wielkości konstruktu, ale może również skutkować prążkiem WT TMEM184A, jeśli dimery (lub oligomery wyższego rzędu) są obecne w próbce. Oszacowanie czystości można uzyskać przez barwienie blot na białko całkowite z wyizolowanej próbki w stosunku do białka całkowitego z podwielokrotności materiału wyjściowego.

8. Test wiązania heparyny in vitro

  1. Przygotować czarną 96-dołkową płytkę pokrytą awidyną, przemywając ją 200 μl 0,2% CHAPS/PBS trzykrotnie przez 5 minut, wstrząsając. Przygotować identyczną czarną, niepowlekaną płytkę 96-dołkową, stosując tę samą procedurę mycia. Przygotować układ próbek doświadczalnych (w trzech egzemplarzach), który będzie obserwowany podczas testu. Dołączyć studzienki dla standardowych stężeń heparyny, kontrole buforowe oraz studzienki z próbkami GFP bez heparyny w celu potwierdzenia bielenia GFP.
    UWAGA: Jeśli zoptymalizowane izolacji lub interakcji ligandów są różne dla danego białka, wszystkie przygotowania płytki i płukanie należy wykonać za pomocą optymalnego systemu buforowego.
  2. Dodać 100 μl 60 pmol/studzienkę biotynylowanego anty-GFP do wszystkich studzienek na płytce pokrytej awidyną, w której pożądane jest wiązanie GFP. Ilość przeciwciała jest wystarczająca, aby nasycić awidynę o wysokim powinowactwie w studzienkach.
    1. Należy dodać bufor tylko do wszystkich studzienek używanych do celów kontrolnych (nie jest pożądane wiązanie GFP lub GFP-TMEM184A). Uszczelnij studzienki pokrywą płyty, aby zapobiec parowaniu. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, wytrząsając.
      UWAGA: Objętości dodawane do studzienek i czasy inkubacji są oparte na zaleceniach dostawcy.
  3. Umyj wszystkie studzienki trzy razy przez 5 minut 200 μl 0,2% CHAPS/PBS.
  4. Dodać 100 μl 5 nmol/basenik GFP-TMEM184A lub GFP do odpowiednich studzienek na płytce pokrytej amidyną i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Umyć ponownie, jak w 8.3.
    UWAGA: Takie stężenie białka zostało wybrane tak, aby zapewnić, że wszystkie miejsca są nasycone nadmiarem GFP lub GFP-TMEM184A. Jest to ważne, aby upewnić się, że taka sama ilość białka jest związana z każdym dołkiem. Mniejsze ilości białka mogą również nasycać miejsca, co można zbadać, oceniając niezwiązane białko pozostałe po inkubacji kilku koncentracji białka z płytką i porównując testy wiązania niezwiązanego białka i liganda.
  5. Przygotować różne stężenia heparyny znakowanej fluoresceiną, np. 10, 25, 50, 75, 100, 200 μg/ml, w 0,2% CHAPS/PBS. Zrób to i całą pozostałą pracę w ciemności.
    UWAGA: Przed przygotowaniem stężeń należy określić specyficzne stężenia dla innych ligandów dla danego białka. Najniższe stężenie powinno być wykrywalne w czytniku płytek. Dlatego ważne jest, aby najpierw określić zakres, który można dokładnie wykryć w zastosowanym systemie buforowym. Następnie określ zakres potrzebny do uzyskania mierzalnego wiązania. Stężenia heparyny fluoresceinowej poniżej 10 μg/ml nie były konsekwentnie rejestrowane w czytniku płytek w zastosowanych warunkach buforowych. Podobnie, podczas gdy rodamina-heparyna, taka jak stosowana w innych testach, mogła być wizualizowana w czytniku płytkowym, w warunkach buforowych i przy stężeniach wymaganych do wiązania, odczyty fluorescencji dla wzorców nie różniły się odtwarzalnie od tego fluoroforu.
  6. Dodać 100 μl heparyny fluoresceinowej do odpowiednich studzienek testowych w płytce pokrytej awidyną i studzienek wzorcowych do stężenia zarówno na płytce pokrytej awidyną, jak i niepowlekanej. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Przechowuj talerze w ciemności (lub przykryte folią).
  7. Za pomocą czytnika płytek zapisać początkową emisję fluorescencji heparyny w studzienkach kontrolnych obu płytek oraz początkową (całkowitą) emisję fluorescencji z dołków z unieruchomionym GFP-TMEM184A lub GFP na płytce pokrytej awidyną. W razie potrzeby wyreguluj wzmocnienie instrumentu, aby zapewnić wykrywanie heparyny fluorescencyjnej między najniższym a najwyższym stężeniem.
    UWAGA: Upewnij się, że czytnik płytek odczytuje dołki od góry i odczytuje w optymalnym miejscu w studzienkach, jeśli jest to regulowane. W przypadku omawianego badania optymalna lokalizacja znajdowała się w około 75% w dół studni. Informacje dostępne za pomocą czytnika płytek powinny zawierać sugestie, które są unikalne dla danego czytnika płytek w odniesieniu do odczytywania próbek związanych na czarnych płytkach.
  8. Usunąć niezwiązaną heparynę fluorescencyjną ze studzienek z unieruchomionym GFP-TMEM184A lub GFP i umieścić w odpowiednich studzienkach w niepowlekanej czarnej płytce. Natychmiast odczytaj emisję fluorescencji.
  9. Dodaj 100 μl świeżego 0,2% CHAPS/PBS z powrotem do studzienek, z których usunięto heparynę fluoresceinową, i odczytaj emisję fluorescencji.
  10. Powtórz kroki 8.8 - 8.9 3x.
    UWAGA: Te odczyty z powlekanej płytki wskazują na heparynę fluoresceinową pozostającą w studzienkach GFP lub GFP-TMEM184A. Jeżeli w trzeciej próbce niezwiązanej stwierdzono znaczną fluorescencję, należy przeprowadzić dodatkowe płukanie. Jeśli fluorescencja będzie nadal usuwana przy każdym praniu, wiązanie liganda może mieć niskie powinowactwo i warunki powinny zostać ponownie ocenione. Końcowy odczyt stanowi odczyt związany heparyną.
  11. Zapisać emisję fluorescencji z pobranych, niezwiązanych próbek na płytce niepowlekanej, uzyskując liczby dla każdego prania. Są to odczyty "niezwiązane".
  12. Wykorzystać całkowite wartości emisji heparyny uzyskane w ppkt 8.7 w celu potwierdzenia prawidłowych poziomów heparyny dodanej do każdego dołka. Odejmij średnie odczyty tła od wartości.
    UWAGA: Studzienki bez heparyny fluoresceinowej służą jako tło ze względu na przeciwciało, GFP i bufor. Uśrednij powtórzenia tła, aby uzyskać wartość tła. Odejmij średnie odczyty tła od odczytów związanych i niepowiązanych, aby uzyskać wartości rzeczywiste.
  13. Zastosuj wykres emisji w funkcji całkowitej dodanej heparyny fluoresceinowej, aby określić skalę emisji w funkcji ilości heparyny.
    UWAGA: Samo przeciwciało lub przeciwciało i antygen powodowały pewne wygaszenie fluorescencji. W związku z tym heparynę całkowitą oznaczono na podstawie całkowitej dodanej heparyny, jak podano w ppkt 8.7.
  14. Wykreślić skorygowaną heparynę związaną w stosunku do dodanej heparyny dla potrójnych powtórzeń zarówno w przypadku GFP-TMEM184A, jak i w przypadku GFP.
  15. Oznaczyć wolny ligand, dodając niezwiązane odczyty ze wszystkich płukań dla określonego stężenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choć teoretycznie transfekcja dowolnego konstruktu DNA do komórek mogłaby zostać przeprowadzona przy użyciu lipofilnych odczynników do transfekcji, wcześniejsze doniesienia wskazują na bardziej efektywną transfekcję konstruktów GFP do komórek śródbłonka przy użyciu elektroporacji12. Przedstawiony tutaj protokół zazwyczaj pozwalał na uzyskanie ekspresji konstruktu GFP w ponad 80% użytych pierwotnych komórek śródbłonka oraz komórek mięśni gładkich. Do zaprojektowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj protokoły zostały zaprojektowane w celu dostarczenia dowodów potwierdzających identyfikację TMEM184A jako receptora heparyny w komórkach naczyniowych1. Techniki knockdown są rutynowo stosowane jako jeden z mechanizmów potwierdzających identyfikację nowych białek. Jednak pewna utrata funkcji po knockdown zazwyczaj nie jest wystarczającym dowodem na to, że białko kandydujące jest rzeczywiście właściwym receptorem (lub innym funkcjonalnym białkiem). Ważne jest również, aby mieć do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w laboratorium Lowe-Krentz są wspierane przez granty badawcze HL54269 z National Institutes of Health dla LLK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
GFP-TMEM184A konstruktOriGeneRG213192
Rodamin-HeparynaCreative PEGWorksHP-204Światłoczuły
Fluoresceina-HeparynaCreative PEGWorksHP-201Światłoczuły
MowiolEMD Millipore475904-100GM
Paraformaldehyd (PFA, bez metanolu)Thermo Sci Pierce Biotech, dostępne za pośrednictwem Fisher ScientificPI28908 w FisherUse in Dygestoria
Płytki neutrawidyczne Reacti-bind (czarne 96-dołkowe naczynia pokryte Avidinem)Thermo Sci Pierce Biotech, za pośrednictwem Fisher ScientificPI15510 w FisherZwróć uwagę na okres trwałości
Czarne 96-dołkowe płytkiCorning Life Sciences Plastic, zakupione za pośrednictwem Fisher Scientific064432 w Fisher
Komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych A7r5 liniaATCCCRL 1444Może być wymieniona na MEM medium1
BAOEC bydlęce komórki śródbłonka aortyCell Applications, Inc.B304-05Hodowla zgodnie z zaleceniami początkowymi, może być wymieniona na pożywkę MEM w celu kontynuacji hodowli1,7
BAOSMC komórki mięśni gładkich aorty bydlęcejCell Applications, Inc.B354-05Hodowla zgodnie z zaleceniami początkowymi, może być wymieniona na pożywkę MEM w celu kontynuacji hodowli1
RAOEC szczurze komórki śródbłonka aortyCell Applications, Inc.R304-05a Kulturazgodnie z zaleceniami początkowymi, może być wymieniona na pożywkę MEM w celu kontynuacji hodowli7
Biotynylowany anty-GFPThermo Sci Pierce Biotech, za pośrednictwem Fisher ScientificMA5-15256-BTIN
Koraliki pokryte streptawidynąSigmaS1638
HeBSDostępne w Bio-RadMożna przygotować w laboratorium. pH wynosi 6,8
TMEM184A przeciwciała przeciwko N-końcachSanta Cruz Biotechnologysc292006Znane tylko TMEM184A przeciwciała przeciwko regionowi N-końcowemu.
TMEM184A przeciwciało przeciwko C-końcowiUzyskane od ProSci Inc, Poway, CA Pro Sci 5681ProSci stosowany w Ryc. 1< / silnych>
przeciwciałach GFPSanta Cruz Biotechnologysc9996Stosowanych w Ryc. 5< / silnych>
przeciwciałach drugorzędowych, znakowanych TRITC lub Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA711 025 152 (osły anty-królik, TRITC)
715 165 150 (osły anty-myszy, Cy3)		Minimalna reaktywność krzyżowa w celu zminimalizowania niespecyficznych zabarwień.
CHAPSZakupiony od SigmaC5849Należy pamiętać, że ten konkretny numer katalogowy został wycofany.  Dostawca udzieli informacji na temat wymiany.
Obrazowanie na żywo Czasze 35 mmMatTek (Ashland MA)P35G-1.0 – 20 mm - C
Mikroskop konfokalnyZeissLSM 510 Meta z 63-krotną soczewką olejowąUżywany do obrazów i obrazowania na żywo w Rysunki 1, 2 i 3
mikroskop konfokalnyNikonC2+ konfokalny z 60-krotnym obiektywem olejowymUżywany do obrazów w Rysunek 5
Mikroskop konfokalnyZeissZeiss LSM 880 z 63-krotną soczewką olejowąUżywany do obrazów w Rysunek 2C
Sprzęt do elektroporacjiBio-RadGene Pulser X-Cell System
Kuwety do elektroporacjiDostępne w MidSciEC2LMożna również uzyskać od dostawcy sprzętu
Czytnik płytekTECAN TECAN Infinite® m200 Pro czytnik płytOdczyty w środku studni, a nie na powierzchni.
Program komputerowy do pomiaru intensywności barwieniaObraz Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
Program i informacje dostępne on-line		Można użyć dowolnego odpowiedniego programu. Zobacz https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html, aby uzyskać dodatkowe informacje   
Roztwór trypsyny do hodowli komórkowychSigmaT4174zakupiony jako 10x roztwór

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
  2. Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
  3. Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
  4. Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268(2016).
  5. Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395(2016).
  6. Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
  7. Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
  8. Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
  9. Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
  10. Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
  11. Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, Pt 2 461-469 (1995).
  12. Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
  13. Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733(2012).
  14. Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
  15. Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
  16. Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
  17. Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
  18. Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Konstrukt GFP TMEM184Amikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnaelektroporacjarodamina heparynatest kolokalizacjitest wi zaniakom rki naczyniowelokalizacja bia ek

Powiązane artykuły