Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna

33.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55054

⸱

4 stycznia 2017

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Tissue Biology, Keio University School of Medicine, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Keio University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół izolowania pęcherza słuchowego, torebki i kosteczek słuchowych od myszy po urodzeniu w celu przeprowadzenia całego wierzchowca i analizy histologicznej.

Streszczenie

U większości ssaków, kosteczki słuchowe w uchu środkowym, w tym młoteczek, kowadełko i strzemiączko, są najmniejszymi kośćmi. U myszy struktura kostna zwana pęcherzem słuchowym mieści kosteczki słuchowe, podczas gdy torebka słuchowa otacza ucho wewnętrzne, a mianowicie ślimak i kanały półkoliste. Mysie kosteczki słuchowe są niezbędne do słyszenia i dlatego cieszą się dużym zainteresowaniem badaczy w dziedzinie otolaryngologii, ale ich metabolizm, rozwój i ewolucja są bardzo istotne dla innych dziedzin. Zmieniony metabolizm kości może wpływać na funkcje słuchu u dorosłych myszy, a różne myszy z niedoborem genów wykazują zmiany w morfogenezie kosteczek słuchowych w macicy. Chociaż mysie kosteczki słuchowe są małe, ich manipulacja jest możliwa, jeśli zrozumie się ich anatomiczną orientację i strukturę 3D. Tutaj opisujemy, jak rozciąć pęcherz słuchowy i torebkę myszy po urodzeniu, a następnie wyizolować poszczególne kosteczki słuchowe poprzez usunięcie części pęcherza. Omawiamy również, jak osadzić bullę i kapsułkę w różnych orientacjach, aby wytworzyć parafinę lub zamrożone sekcje odpowiednie do przygotowania podłużnych, poziomych lub czołowych odcinków młoteczka. Na koniec wyliczamy różnice anatomiczne między kosteczkami słuchowymi myszy i człowieka. Metody te byłyby przydatne w analizie patologicznych, rozwojowych i ewolucyjnych aspektów kosteczek słuchowych i ucha środkowego u myszy.

Wprowadzenie

Trzy kosteczki słuchowe ucha środkowego, a mianowicie młoteczek, kowadełko i strzemiączko, tworzą specyficzny dla ssaków łańcuch słuchowy, który przekazuje dźwięk z błony bębenkowej do ucha wewnętrznego, czyli ślimaka 1,2. Funkcję słuchu można ocenić u myszy, mierząc progi słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR) 3-6, a wibracje młoteczka za błoną bębenkową można monitorować za pomocą laserowej wibrometrii dopplerowskiej (LDV) 7. Łącząc pomiary ABR, LDV i otoemisji akustycznej produktu zniekształceń (DPOAE), przewodzeniowy ubytek słuchu można odróżnić od upośledzenia czuciowo-nerwowego 8.

Zwierzęce modele chorób uszu są potrzebne, biorąc pod uwagę znaczenie słuchu i zdrowia uszu dla dobrego samopoczucia pacjentów w każdym wieku. Na przykład zapalenie ucha środkowego jest niezwykle powszechną infekcją ucha obserwowaną u niemowląt i dzieci, a ciężkie, ostre zapalenie ucha środkowego i jego powikłania mogą wystąpić, jeśli stan ten nie jest leczony odpowiednimi środkami przeciwdrobnoustrojowymi 9. Mysie modele zapalenia ucha środkowego mogą okazać się przydatne w zrozumieniu patogenezy i opracowaniu metod leczenia 10,11.

Mysie kosteczki słuchowe, które (z wyjątkiem goniale części młoteczka) powstają w wyniku kostnienia śródchrzęstnego 12,13, są bardzo istotne dla badania metabolizmu i morfogenezy kości. Po pierwsze, ich niewielkie rozmiary pozwalają na analizę kości z nienaruszoną okostną w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii rentgenowskiej lub fluorescencyjnej 14. Po drugie, nieprawidłowy metabolizm kości, taki jak nadmierna lub niedostateczna resorpcja kości lub upośledzone interakcje między komórkami kostnymi 15, może być analizowany jako potencjalny czynnik przyczyniający się do utraty słuchu 3,4,7. Po trzecie, nieprawidłowa morfogeneza kosteczek słuchowych jest zgłaszana u kilku myszy z niedoborem genu, takich jak zwierzęta pozbawione Hoxa2 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, Goosecoid (Gsc) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, Fgfr1 29, receptory hormonów tarczycy (Thra, Thrb) 5, Bcl2 30 i inne 1,31, lub u myszy z nadekspresją Hoxa2 32. Wreszcie, pomimo niewielkich rozmiarów, dostępne są struktury związane z kosteczkami słuchowymi, takie jak mięśnie 33 i stawy 34,35.

Kosteczki mysie są mniejsze niż kosteczki ludzkie, ale warto zauważyć, że środkowe ucho myszy nie jest miniaturową wersją swojego ludzkiego odpowiednika. Na przykład u myszy tętnica strzemiączkowa, która przechodzi przez pierścień strzemiączka, utrzymuje się przez całe życie 36, podczas gdy u ludzi zarodkowa tętnica strzemiączkowa zanika podczas ciąży. Ponadto morfologia młoteczka myszy różni się od morfologii kości ludzkiej (patrz ryc. 6). U myszy pęcherz słuchowy (bębenkowy) otacza wypełnioną powietrzem jamę ucha środkowego, podczas gdy u ludzi komórki powietrzne wyrostka sutkowatego złożone z kości beleczkowej w kości skroniowej mieszczą kosteczki słuchowe, a nie pęcherz 37. U obu gatunków torebka słuchowa (torebka uszna, błędnik kostny) otacza ślimak i kanały półkoliste ucha wewnętrznego. Biologia porównawcza i ewolucyjna ucha środkowego została poddana obszernemu przeglądowi 38-40.

Poniższy protokół najpierw opisuje, jak rozdzielić pęcherz słuchowy i torebkę, które składają się głównie z ucha środkowego i ucha wewnętrznego. Protokół ten pokazuje również, jak odizolować młoteczek, kowadełko i strzemiączko od pęcherza słuchowego. Na koniec pokazano, jak zorientować pęcherz słuchowy i torebkę do osadzenia w ramach przygotowań do wycięcia tkanek kosteczek słuchowych.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach wykonywane w tym badaniu są zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Keio (IACUC - numer zatwierdzenia: 09221) i są zgodne z Wytycznymi Instytucjonalnymi dotyczącymi Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie Keio dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach. Próbki ludzkie zostały wyizolowane ze zwłok przekazanych Wydziałowi Anatomii Szkoły Medycznej Uniwersytetu Keio i zostały wykorzystane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.

1. Izolacja pęcherza słuchowego i kapsułki

  1. Myszy należy poddać eutanazji w słoiku zawierającym platformę nad ręcznikami papierowymi nasączonymi izofluranem lub sewofluranem, aż do ustania wentylacji oddechowej na dłużej niż minutę, a następnie wykonać zwichnięcie szyjki macicy. Uważaj, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu myszy z nasączonymi ręcznikami papierowymi.
  2. Wykonaj małe poprzeczne nacięcie po grzbietowej stronie szyi i rozciągnij skórę w kierunku głowy i ogona, używając obu rąk, aby odsłonić leżącą pod spodem tkankę mięśniową szyi.
  3. Odetnij głowę myszom w okolicy szyjki macicy za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych o długości 14 cm.
  4. Złuszcz skórę całkowicie w kierunku nosa. Odetnij całą skórę razem z pyskiem i siekaczami.
  5. Włóż nożyczki do ust i odetnij mięśnie żwaczy po obu stronach.
  6. Ostrożnie otwórz szczękę i usuń razem język i dolną szczękę.
  7. Za pomocą ostrych nożyczek podziel czaszkę i podstawę czaszki na dwie połowy wzdłuż płaszczyzny strzałkowej (ryc. 1A, B).
  8. Za pomocą kleszczy usuń półkule mózgowe i móżdżkowe oraz pień mózgu. Bulla słuchowa i torebka znajdują się po stronie móżdżku i pnia mózgu. Należy zauważyć, że pęcherz słuchowy jest bardziej boczny w stosunku do torebki słuchowej (ryc. 1C, D).
  9. Wyciąć pęcherz i torebkę z otaczającą ją kością czaszki (ryc. 1E).
  10. Przenieść próbkę do naczynia zawierającego sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o pH 7,4 w temperaturze pokojowej.
  11. Pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym użyj kleszczy, aby rozsunąć otaczające kości i nożyczek, aby przeciąć poluzowaną granicę wokół pęcherza i torebki (ryc. 1F). Usunięte otaczające kości to kości podstawno-potyliczne (granica brzuszna), zewnątrzpotyliczna (granica brzuszno-tylna), nadopotylicza (granica tylna), międzyciemieniowa, ciemieniowa (granica grzbietowa), łuskowa (granica grzbietowo-przednia), alisphenoidalna (granica przednia) i podstawno-brzuszna (granica przednio-brzuszna). Należy zauważyć, że wyrostek rylcowy (Sp), który podtrzymuje otwór bębenkowy trąbki Eustachiusza 41, różni się od wyrostka rylcowatego kości skroniowej.

2. Izolacja kosteczek słuchowych: młoteczka, kowadełka i strzemiączka

  1. młoteczek
    1. Używając zarówno małych nożyczek, jak i kleszczy, usuń część zewnętrznego przewodu słuchowego boczną w stosunku do bruzdy bębenkowej, tak aby błona bębenkowa była widoczna (ryc. 2A, B).
    2. Usuń część błony bębenkowej i kości bębenkowej w pobliżu wyrostka krzyżówkowego (apofiza oczokątna, patrz Dyskusja), zarówno na ścianie brzusznej (kropkowanej), jak i tylnej (#) (ryc. 2C). Młoteczek i mięsień napinacza błony bębenkowej powinny być teraz odsłonięte (ryc. 2D, E).
    3. Podnieś młoteczek (ryc. 2F) i przetnij mięsień napinacza błony bębenkowej ściętą krawędzią igły 27 G (ryc. 2G). Należy zauważyć, że manubrium kostki mocno przylega do błony bębenkowej, jak to ma miejsce u innych ssaków.
    4. Ostrożnie odłącz błonę bębenkową od manubrium, które jest delikatne. Usuń kość bębenkową, aby odsłonić trzy kosteczki słuchowe.
    5. Zwichnąć młoteczek z kowadełka w stawie kosteczek słuchowych (ryc. 2H).
    6. Odizoluj młoteczek, pękając przedni wyrostek w goniale.
  2. Kowadełko i strzemiączko
    1. Wyizoluj kowadełko, odcinając więzadło tylne kowadełka na krótkim podkuciu (ryc. 3A).
    2. Odizoluj strzemiączko, odcinając tętnicę strzemiączkową w pobliżu strzemiączka za pomocą skośnej krawędzi igły 27 G (ryc. 3B, C). W razie potrzeby przeciąć igłą ścięgno mięśnia strzemiączkowego w wyrostku mięśniowym strzemiączka.
    3. Włóż igłę do szycia (lub szpilkę do znakowania) w otwór zasłonowy strzemiączka i podnieś strzemiączka. Po zdjęciu strzemiączka owalny otwór okienny powinien być wyraźnie widoczny (ryc. 3D).

3. Osadzanie pęcherza słuchowego i kapsuły

  1. Preparat do zatapiania w blokach parafinowych
    1. Odizolować pęcherz i kapsułkę zgodnie z opisem w punkcie 1.
    2. Odciąć przedni koniec pęcherza (wyrostek rylcowaty) nożyczkami, zanurzyć bulla i kapsułkę w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS w temperaturze 4 °C i pozwolić utrwalaczowi wejść do pęcherza. Jeśli powietrze zostanie uwięzione w pęcherzu, usuń je za pomocą igły i strzykawki. Pozostawić bulla i kapsułkę w utrwalaczu w temperaturze 4 °C O/N na rotatorze probówkowym.
      Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    3. Umyj raz za pomocą PBS.
    4. Odwapnić pęcherz i kapsułkę przez tydzień w temperaturze 4 °C w 10% dwuwodnej soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA-2Na), 100 mM zasady Tris, pH 7,0, w probówce o pojemności 2 ml. Zmieniaj bufor co drugi dzień.
    5. Umyj raz za pomocą PBS. Próbki można przechowywać w 70% etanolu w wodzie o temperaturze 4 °C. Opcjonalnie przenieść do 70% etanolu za pomocą serii alkoholi o gradowanej zawartości alkoholu (30%, 50%, 70% w wodzie).
    6. Na procesorze tkanek odwodnić próbki w stopniowanej serii roztworów etanolu (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, każda 1 godzina), oczyścić w ksylenie (4 razy, każda 1 godzina w temperaturze 40 °C) i naciekać próbki stopionym woskiem parafinowym42. Opcjonalnie zastąp ksylen dostępnym w handlu roztworem do oczyszczania tkanek (np. Histo-Clear).
    7. Rozładuj próbki z procesora i wyjmij je z kaset.
    8. Na konsoli do zatapiania tkanek umieść próbki w foremkach wypełnionych stopionym woskiem parafinowym. Przejdź do osadzania (sekcja 4).
  2. Preparat do zatapiania w zamrożonych blokach (metoda foliowa Kawamoto)43
    1. Odizolować pęcherz i kapsułkę zgodnie z opisem w punkcie 1.
    2. Odciąć przedni koniec pęcherza (wyrostek rylcowy) nożyczkami, zanurzyć pęcherz i kapsułkę w utrwalaczu (2% lub 1% PFA zamiast 4% w PBS w celu zachowania antygenowości) w temperaturze 4 °C. Jeśli powietrze jest uwięzione w bulli, usuń je za pomocą igły i strzykawki. Pozostawić bulla i kapsułkę w utrwalaczu w temperaturze 4 °C O/N na rotatorze probówki.
    3. Szybko umyć bulla i kapsułkę w PBS i natychmiast zanurzyć w płynnym związku do zatapiania w krioterapii w temperaturze 4 °C.
    4. Ważne: Usuń pęcherzyki powietrza, jeśli występują, w uchu środkowym i zewnętrznym poprzez aspirację igłą i dodanie masy osadzającej za pomocą kleszczy. Przejdź do osadzania (sekcja 4).

4. Orientacja próbki i osadzanie

UWAGA: Cała bulla i kapsuła muszą być ułożone w określonej orientacji podczas osadzania, aby wyciąć pożądane sekcje. Procedury opisane poniżej służą do cięcia młoteczka w różnych orientacjach.

  1. Przekrój podłużny (przystrzałkowy) młoteczka
    1. Połóż boczną stronę pęcherza lub zewnętrznego przewodu słuchowego w ciepłej parafinie (lub związku kriogenicznym). Dostosuj orientację tak, aby szyjka i blaszka poprzeczna młoteczka były równoległe do poziomego dna naczynia do zatapiania (Rysunek 4A - C). Należy zauważyć, że błona bębenkowa jest nachylona pod kątem około 30° do pionu w głowie myszy (ryc. 4A; Rysunek 59 w Kampen44).
  2. Poziome przecięcie młoteczka
    1. Umieść grzebień grzbietowy poziomo w ciepłej parafinie (lub związku do zatapiania w krio). Dostosuj orientację pęcherza i kapsułki tak, aby szyjka i blaszka poprzeczna młoteczka były prostopadłe do dna naczynia do osadzania (Rysunek 4D - F).
  3. Przekrój czołowy (przekroje poprzeczne) błony bębenkowej i bębenkowej 5
    1. Umieść manubrium z kostki w ciepłej parafinie (lub związku do zatapiania w krio) tak, aby było prostopadłe do dna naczynia do zatapiania.
  4. Schłodzić blok do temperatury odpowiedniej do utwardzenia wosku parafinowego na konsoli do zatapiania tkanek (alternatywnie należy użyć środka do zatapiania w suchym lodzie / kąpieli heksanowej).
  5. Przetwarzaj tkanki, blokuj i wycinaj skrawki za pomocą rutynowych procedur. Na przykład skrawki parafiny barwić hematoksyliną i eozyną (H&E), safraniną O (dla chrząstki) lub dla aktywności fosfatazy kwasowej odpornej na winian (TRAP) (dla osteoklastów) 3 lub za pomocą immunohistochemii. Nieodwapnione kriosekcje nadają się do znakowania kości przy użyciu fluorochromów 14, barwienia czerwienią alizarynową wapnia i immunofluorescencji 42.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia metodę izolacji kosteczek słuchowych z pęcherzyka słuchowego myszy. Najpierw pęcherzyk i torebka są wypreparowywane z czaszki jako jeden element (Rysunek 1). Wypreparowany pęcherzyk jest następnie wykorzystywany do przygotowania młoteczka (Rysunek 2) oraz kowadełka i strzemiączka (Rysunek 3). Punktami orientacyjnymi pęcherzyka słuchowego i torebki są wyrostek stylopodny na przednim końcu pęcherzyka, grzebień grzbietowy, przedni kanał półkolisty oraz dołek podłukowy (Rysunek 1F). Obrazowanie mikrotomografią komputerową (CT) ujawnia kosteczki w pęcherzyku słuchowym, a także optymalne orientacje dla sekcjonowania tych kosteczek w płaszczyźnie podłużnej i poziomej (Rysunek 4).

W celu wykonania podłużnych skrawków parafiny młoteczka, pęcherzyk oraz torebka zostały odwapnione w EDTA w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień, zatopione w bloku parafinowym w orientacji pokazanej na Rysunku 4 A - C, pocięte na skrawki o grubości 4 µm, a następnie zabarwione H&E. Młoteczek przytwierdzony do błony bębenkowej w pęcherzyku słuchowym wykazał trwającą kostnienie chrzęstne w dniu P14 (Rysunek 5A). Aby zwizualizować tworzenie nowej kości, myszy w dniu P20 podano dootrzewnowo kalceinę (30 µg/g masy ciała), a pęcherzyk i torebkę wyizolowano 24 h później, w dniu P21. Próbkę bez odwapniania zamrożono i wykonano kriosekcje o grubości 6 µm przy użyciu folii adhezyjnej zgodnie z metodą Kawamoto 43. Po barwieniu jąder komórkowych DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), skrawki obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym. Sygnały kalceiny (zielone) ujawniły tworzenie nowej kości w młoteczku (m), pęcherzyku i torebce (Rysunek 5B). W celu wykonania skrawków poprzecznych młoteczka, pęcherzyk słuchowy wyizolowany od 5-tygodniowej myszy zamrożono bez odwapniania (orientację przedstawiono na Rysunku 4D - F), wykonano kriosekcje o grubości 6 µm metodą Kawamoto i zabarwiono H&E. Poprzeczne skrawki wyrostka krótkiego młoteczka (mPB) ukazują również ślimaka (Rysunek 5C).

Widok przyśrodkowy prawych kosteczek słuchowych wyizolowanych z myszy P31 wykazuje typowe cechy mysiego młoteczka, mianowicie: „ślizgowe, przypominające skrzydło mewy” (lub przypominające perski miecz 45) trzoneczek, wyraźny wyrostek krótki (apofiza kolista, patrz Dyskusja) oraz blaszkę poprzeczną (Rycina 6). Należy zauważyć, że wyrostek przedni (processus anterior) uległ złamaniu podczas procedury sekcji w okolicy goniale i został oddzielony od pierścienia bębenkowego (ektotympanika). Ta reprezentatywna próbka wykazuje nienaruszony staw młoteczkowo-kowadełkowy pomiędzy młoteczkiem a kowadełkiem, natomiast staw kowadełkowo-strzemiączkowy jest zwichnięty. Wykrywalne są przyczepy ścięgniste do wyrostków mięśniowych młoteczka i strzemiączka (Rycina 6A, gwiazdki).

Rycina 6B porównuje kosteczki słuchowe myszy i człowieka przy tym samym powiększeniu. Różnice międzygatunkowe, poza rozmiarem, obejmują następujące cechy. Trzonek młoteczka u myszy ma kształt skrzydła, natomiast u ludzi kształt maczugi. Kąt między osią anatomiczną (lub osią obrotu, linią przechodzącą przez wyrostek przedni młoteczka i wyrostek krótki kowadełka) a trzonkiem jest u myszy znacznie mniejszy i oba elementy są prawie równoległe, w przeciwieństwie do ludzi, gdzie są one niemal prostopadłe 6,46-48. W przypadku kosteczek ludzkich badania wibrometryczne wykazują, że staw kowadełkowo-młoteczkowy jest ruchomy, a nie funkcjonalnie utrwalony 49. Młoteczek myszy wykazuje szeroką, cienką i płaską blaszkę poprzeczną, która nie występuje u ludzi 47. U myszy processus anterior zrasta się z kośćmi błoniastymi, mianowicie goniale i pierścieniem błonnym, podczas gdy u ludzi processus anterior jest zredukowany do małej kostnej skiełki 41. Strzemiączka myszy i człowieka również się różnią: u myszy odnoga przednia jest zakrzywiona, a odnoga tylna bardziej prosta, natomiast u ludzi odnoga przednia jest bardziej prosta niż odnoga tylna. Warto zauważyć, że główka młoteczka w stosunku do wielkości ciała jest masywnie powiększona u gatunków takich jak kret złoty, co wykazuje znaczną zmienność w relacjach allometrycznych „najmniejszych” kości 48.

Schemat sekwencji preparowania anatomicznego ilustrujący różne obszary mózgu i nerwy czaszkowe.
Rysunek 1. Preparowanie bąbla słuchowego i kapsuły. (A) Czaszka myszy P31 jest podzielona na połowę prawą i lewą. A, przednio; P, tylno; L, lewo; R, prawo. (B) Powierzchnia przyśrodkowa prawej połowy przekrojonej i odartej ze skóry głowy. Cx, kora mózgowa; Cb, móżdżek; Bs, pień mózgu. D, grzbietowo; V, brzusznie. (C) Usuwanie mózgu za pomocą pęsety. (D) Widok przyśrodkowy kapsuły słuchowej w prawej czaszce. Grzebień grzbietowy (groty strzałek) znajduje się między środkową jamą czaszki (mcf) a tylną jamą czaszki (pcf) i oddziela powierzchnie grzbietowo-przednią i brzuszno-tylną kapsuły słuchowej. Pasek skali, 2 mm. (E) Powiększenie bąbla słuchowego i kapsuły (widok przyśrodkowy). Co, ślimak; VII, nerw twarzowy; VIII, nerw przedsionkowo-ślimakowy; AC, przedni (górny) kanał półkolisty; Sf, dołek podłukowy, w którym znajduje się paraflocculus móżdżku. Pasek skali, 1 mm. (F) Mikrografia wyizolowanego bąbla słuchowego i kapsuły (widok przyśrodkowy). Sp, wyrostek rylcowaty. Pasek skali, 1 mm. (A - E), mysz P31. (F), mysz P33. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Anatomia mięczaka: opisane obrazy z sekcji pokazujące struktury wewnętrzne; diagram badawczy o charakterze edukacyjnym.
Rycina 2. Sekcja młoteczka. (A) Widok brzuszno-boczny prawej byczyny słuchowej i torebki. Sulcus tympanicus (ST, przerywana strzałka) to miejsce przyczepu błony bębenkowej. Kość boczna względem ST jest częścią ucha zewnętrznego, a kość przyśrodkowa względem ST tworzy podłogę jam słuchowych. A, przedni; P, tylny; D, grzbietowy; V, brzuszny. (B) Widok po usunięciu przewodu słuchowego zewnętrznego, odsłaniający błonę bębenkową (TM), w tym pars flaccida (Pf) i pars tensa (Pt). (C) Usunięcie fragmentów kości bębenkowej (linie kropkowane i #) w pobliżu procesu krótkiego młoteczka (mPB). m, młoteczek; mM, trzonek młoteczka. Strzałka, pęcherzyk powietrza w jamie ucha środkowego widoczny przez błonę bębenkową. (D) Odsłonięty młoteczek. Wskazano główkę młoteczka. Linia kropkowana oznacza powierzchnię stawową kowadełka. (E) Ścięgno mięśnia napinacza błony bębenkowej (TT) przyczepione do młoteczka. (F) Mięsień napinacza błony bębenkowej jest naciągany podczas unoszenia młoteczka. *, wyrostek mięśniowy. (G) Przecięcie mięśnia napinacza błony bębenkowej za pomocą igły. (H) Trzy kosteczki słuchowe po usunięciu błony bębenkowej. Staw młoteczkowo-kowadełkowy jest zwichnięty. m, młoteczek; i, kowadełko; s, strzemiączko; Go, goniale (zrośnięty z młoteczkiem i pierścieniem bębenkowym, TR). Wszystkie paski skali, 0.5 mm. (A, H), mysz P33. (B - G), mysz P31. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy z oznakowanymi strukturami ślimaka, schemat części ucha wewnętrznego, nauka o słuchu.
Rycina 3. Disekcja kowadełka i strzemiączka. (A) Kowadełko i strzemiączko po usunięciu młoteczka. Tętnica strzemiączkowa (SA) przechodzi przez strzemiączko (s). Linia przerywana wskazuje powierzchnię stawową kowadełka. Należy zauważyć, że krótka odnoga (iCB, crus breve) kowadełka (i) jest utrwalona przez więzadło tylne (nie pokazano). Gwiazdka: wyrostek mięśniowy strzemiączka. (B) Strzemiączko po usunięciu kowadełka. Końcówka igły jest używana do przecięcia tętnicy strzemiączkowej (SA). Strzałka: kierunek przepływu krwi. Linia przerywana wskazuje powierzchnię stawową strzemiączka. (C) Tętnica strzemiączkowa zostaje usunięta ze strzemiączka. X wskazuje przecięty koniec tętnicy strzemiączkowej (SA). (D) Okno owalne (Ow, fenestra ovalis lub fenestra vestibuli) jest widoczne po usunięciu strzemiączka. Rw: okno okrągłe (fenestra rotunda lub fenestra cochleae). Paski skali: 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopowe obrazowanie fluorescencyjne; schematy przekrojów podłużnych i poprzecznych; analiza strukturalna.
Rysunek 4. Orientacja pęcherzyka słuchowego i torebki podczas zatapiania w celu wykonania przekrojów podłużnych (parasagitalnych, A - C) i poprzecznych (D - E) młoteczka. (A - C) Szyjka i blaszka poprzeczna młoteczka są umieszczone równolegle do dna naczynia do zatapiania. (A) Widok z boku: obraz mikro-CT pokazujący zatopienie prawego młoteczka w pęcherzyku (pseudokolor niebieski). Młoteczek i kowadełko są zaznaczone pseudokolorem zielonym. Linia przerywana: pożądana płaszczyzna cięcia. Linia ciągła: dno naczynia do zatapiania. m, malleus (młoteczek); groty strzałek, grzebień grzbietowy. M, przyśrodkowo; L, bocznie; D, grzbietowo; V, brzusznie. (B) Widok z góry: obraz mikro-CT. Należy zauważyć, że przedni koniec pęcherzyka (wyrostek rylcowaty) został usunięty. i, incus (kowadełko). (C) Widok z góry: mikrografia (wykonana z filtrem barwnym). AC, przedni (górny) kanał półkolisty; Sf, dołek podłukowy; Sp, wyrostek rylcowaty. A, przednio; P, tylno; D, grzbietowo; V, brzusznie. (D - F) Processus brevis (wyrostek krótki) młoteczka jest umieszczony prostopadle do dna naczynia do zatapiania. (D) Widok z boku: obraz mikro-CT pokazujący zatopienie prawego młoteczka. Linia przerywana: pożądana płaszczyzna cięcia. Linia ciągła: dno naczynia do zatapiania. (E) Widok z góry: obraz mikro-CT. mM, manubrium mallei (trzonek młoteczka). (F) Widok z góry: mikrografia (wykonana z filtrem barwnym). Paski skali, 1 mm. Obrazy mikro-CT uzyskano przy rozdzielczości woksela 5 μm, zgodnie z wcześniejszym opisem 7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazy histologiczne: parafina H&E, krio kalceina, rozwój kości, analiza przekrojów, badanie naukowe.
Rycina 5. Histologia. (A) Barwienie H&E. Przekrój podłużny (parasagitalny) zatopionego w parafinie prawego młoteczka (m) w pęcherzyku słuchowym (linia przerywana) w dniu P14. TM, błona bębenkowa. (B) Markowanie kości kalceiną. Przekrój podłużny zamrożonego, nieodwapnionego lewego młoteczka (m) w pęcherzyku słuchowym w dniu P21. Kontrastowanie, DAPI. (C) Barwienie H&E. Przekrój poziomy zamrożonego, nieodwapnionego lewego wyrostka krótkiego młoteczka (mPB) w pęcherzyku słuchowym i torebce (mysz w wieku 5 tygodni). Co, ślimak. Paski skali, 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat anatomiczny przedstawiający opisane sekcje kostne; strukturę głowy i szyi; sekcję eksperymentalną.
Rysunek 6. Widok przyśrodkowy kosteczek słuchowych. (A) Prawe kosteczki słuchowe myszy P31. A, przedni; P, tylny; D, grzbietowy; V, brzuszny. Pasek skali, 1 mm. główka młoteczka (Caput mallei, Capitulum mallei); szyjka (Collum mallei); blaszka (transversal lamina); mM (Manubrium mallei); czarna gwiazdka (wyrostek mięśniowy młoteczka); mPA (Processus anterior, Processus gracilis); mPB (processus brevis); trzon kowadełka (Corpus incudis); iCB (Crus breve, krótka noga, krótki wyrostek); iCL (Crus longum, długa noga, długi wyrostek); iPL (Processus lenticularis, wyrostek soczewkowaty, Sylvian apophysis); główka strzemiączka (Caput stapedis); biała gwiazdka (wyrostek mięśniowy strzemiączka); sCA (Crus anterius, noga przednia); sCP (Crus posterius, noga tylna); podstawa (Basis stapedis, stopka); sOF (obturator foramen, otwór międzyodnogowy). (B) Prawe kosteczki słuchowe 76-letniej kobiety (uprzejmość Katedry Anatomii Wydziału Medycznego Uniwersytetu Keio). Kosteczki myszy P31 (prawy dolny róg) są przedstawione w tym samym powiększeniu, co kosteczki ludzkie. Zakrzywione strzałki wskazują kąt między osią anatomiczną a trzonkiem (linie przerywane). Pasek skali, 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy metodę przydatną do izolacji pęcherza słuchowego i torebki u myszy po urodzeniu. Przed P12 tkanki są delikatne i mogą ulec uszkodzeniu podczas izolacji. Po P12 pęcherz słuchowy i torebkę można łatwo odizolować od otaczających tkanek. Wypreparowanie pęcherza z głowy przed cięciem ma kilka zalet. Po pierwsze, kawitacja poporodowa i wzrost pęcherza słuchowego zachodzą najaktywniej od P6 i kończą się do P14 50. Tkanka mezenchymalna między błoną bębenkową a ścianą ślimaka jest zastępowana powietrzem w procesie kawitacji. Powstające powietrze w jamie ucha środkowego może utrudniać kontakt tkanek z płynami podczas utrwalania, odwapniania i osadzania. Łatwiej jest usunąć powietrze z izolowanego pęcherza słuchowego, odcinając przedni koniec (wyrostek rylcowy), niż próbując to zrobić w nieizolowanym pęcherzu. Po drugie, orientacja młoteczka (i błony bębenkowej) nie jest pionowa w głowie. Dlatego łatwiej jest podzielić młoteczek na pożądane płaszczyzny, osadzając izolowaną pęcherz słuchowy i torebkę w danej orientacji.

Po wyizolowaniu pęcherze słuchowe i kapsułki są przydatne do wielu analiz. Na przykład mikrotomografia rentgenowska o wysokiej rozdzielczości może ujawnić morfologię mikrostruktury kości, taką jak naczynia włosowate osteogenne w młoteczku 14. Mikroskop stereofluorescencyjny jest potężnym narzędziem do wizualizacji struktur w ocenie myszy reporterowych wyrażających białka fluorescencyjne w uchu środkowym lub wewnętrznym 33. Ponadto można podjąć różne metody znakowania fluorescencji in vivo lub ex vivo i wykrywania immunofluorescencji całej góry. Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego jest również przydatna do analizy trójwymiarowej 51. Chociaż nie zostało to tutaj opisane, za pomocą tego protokołu można również ocenić różne struktury anatomiczne związane z pęcherzem słuchowym i torebką, takie jak nerwy obwodowe, naczynia krwionośne i błona bębenkowa w uchu środkowym.

Należy pamiętać, że cięcie parafinowe wymaga odwapnienia tkanek kostnych przed osadzeniem i dlatego nie pozwala na analizę mineralizacji. Natomiast metoda filmu Kawamoto 43 stosowana do przygotowania zamrożonych skrawków może być wykonywana bez odwapniania i nadaje się do badań mineralizacji przy użyciu technik znakowania kości in vivo lub specjalnego barwienia, takiego jak barwienie alizaryną. Warunki kriosekcji powinny być zoptymalizowane w zależności od wieku myszy. Na przykład w przypadku starszych próbek myszy zaleca się mniej niską temperaturę wewnątrz komory kriostatu, aby zminimalizować uszkodzenia sekcji.

U myszy prawidłowym terminem dla wydatnego półkulistego występu młoteczka jest "apofiza orbicular apophysis". Niemniej jednak termin "processus brevis" jest szeroko stosowany do określenia apofizy orbikularnej od ponad dwóch dekad, szczególnie wśród biologów zajmujących się rozwojem myszy 16,20,22-25. "Processus brevis" pierwotnie odnosił się do wyrostka bocznego (processus lateralis), który różni się od apofizy oczolnej. U ludzi wyrostek boczny przypominający lekką stożkową projekcję tworzy ogólną linię przyczepu do błony bębenkowej, rozciągającą się od manubrium (niewidoczna na rycinie 6B, widok przyśrodkowy). U myszy wyrostek boczny jest również projekcją manubrium na przeciwległym końcu do baldachimu 48. Pars flaccida błony bębenkowej znajduje się powyżej bocznego wyrostka młoteczka. Apofiza oczodołu nie jest widoczna w ludzkim młoteczku.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Masakiemu Yodze i Elise Lamar za krytyczne przeczytanie manuskryptu, Kazumasie Takenouchi za pomoc w histologii, Mari Fujiwarze za pomoc w mikroskopii i Makoto Morikawie za pomoc w fotografowaniu kosteczek słuchowych ludzi i myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzia/Sprzęt
Ręcznik papierowyDaio Paper Corporation703347można kupić od innych dostawców
Szklany słoikRóżnemożna kupić od innych dostawców
Nożyczki chirurgiczne 14 cmFine Science Tools (FST)91400-14można kupić u innych dostawców
Bardzo drobne nożyczki prosteFine Science Tools (FST)14084-08można kupić u innych dostawców
Kleszcze drobne kątowe 45° Narzędzia Nauki Precyzyjnej (F.S.T.)11063-07można kupić u innych dostawców Mikroskop
preparacyjnyNikonSMZ800Ndo rutynowej sekcji
Mikroskop preparacyjnyNikonSMZ18do filmów 
Igła iniekcyjna 27 GTERUMONN-2719S
(1 mL)TERUMOSS-01T
ZnacznikRóżne
Rotator rurowy RT-50TAITEC0000165-000można kupić u innych dostawców
CryostatLeicaCM3050Shttp://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/
TC-65 Ostrze wolframoweLeica14021626379do twardej metody Kawamoto
Pojemniki ze stali nierdzewnejLeicado twardej metody Kawamoto
Kriofilm typu IICLeicado twardej metody Kawamoto
Szkiełko pokryte silanem (New Silane II)Muto Pure Chemicals511617można kupić od innych dostawców
Szkło nakrywkoweMatsunamimożna kupić od innych dostawców
Procesor tkanekSakura FinetekVIP-5można kupić od innych dostawców
System konsoli do osadzania tkanekSakura FinetekTissue-Tek TEC 5 można kupić od innych sprzedawców
Mikrotom przesuwny do parafinyYamato Kohki IndustrialREM-710można kupić u innych dostawców
Path Blade+pro do tkanek twardychMatsunamiPB3503Cdo sekcji parafinowej
Micro-CTRIGAKUR_mCT2http://www.rigaku.com/en
Mikroskop fluorescencyjnyKEYENCEBZ-9000
Nazwa Company<strong>Numer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
IsofluraneMaruishi pharmaceutical Co. Ltd
NaClwako191-01665dla PBS
KClwako285-14dla PBS
Na2HPO4 12H2Owako196-02835dla PBS
KH2PO4wako287-21dla PBS
Paraformaldehyd (PFA, klasa EM)TAABP001
EDTA-2Nawako15111-45
Trizma baseSigmaT1503-1KG
Super Cryoembedding MediumLeicado twardej metody Kawamoto
Suchy lódRóżnedo twardej metody Kawamoto
Hexanewako080-03423do twardej metody Kawamoto
Super Cryomouting Medium typ R2Leicado twardej metody Kawamoto
ParafinaSakura Finetek781001A0107
Histo-ClearNDSHS-200
CalceinDOJINDO340-00433
Hematoksylina wako131-09665
Eosinwako051-06515
Strzykawka

Bibliografia

  1. Mallo, M. Formation of the middle ear: recent progress on the developmental and molecular mechanisms. Dev Biol. 231, 410-419 (2001).
  2. Manley, G. A. An evolutionary perspective on middle ears. Hear Res. 263, 3-8 (2010).
  3. Kanzaki, S., Ito, M., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Resorption of auditory ossicles and hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. Bone. 39, 414-419 (2006).
  4. Kanzaki, S., Takada, Y., Ogawa, K., Matsuo, K. Bisphosphonate therapy ameliorates hearing loss in mice lacking osteoprotegerin. J Bone Miner Res. 24, 43-49 (2009).
  5. Cordas, E. A., et al. Thyroid hormone receptors control developmental maturation of the middle ear and the size of the ossicular bones. Endocrinology. 153, 1548-1560 (2012).
  6. Dong, W., Varavva, P., Olson, E. S. Sound transmission along the ossicular chain in common wild-type laboratory mice. Hear Res. 301, 27-34 (2013).
  7. Kanzaki, S., et al. Impaired vibration of auditory ossicles in osteopetrotic mice. Am J Pathol. 178, 1270-1278 (2011).
  8. Qin, Z., Wood, M., Rosowski, J. J. Measurement of conductive hearing loss in mice. Hear Res. , (2009).
  9. Klein, J. O. Is acute otitis media a treatable disease? N Engl J Med. 364, 168-169 (2011).
  10. Rosch, J. W., et al. A live-attenuated pneumococcal vaccine elicits CD4+ T-cell dependent class switching and provides serotype independent protection against acute otitis media. EMBO Mol Med. 6, 141-154 (2014).
  11. Li, X., et al. Otitis media in sperm-associated antigen 6 (Spag6)-deficient mice. PLoS One. 9, e112879(2014).
  12. Rodríguez Vázquez, J. F., Mérida Velasco, J. R., Jiménez Collado, J. A study of the os goniale in man. Acta Anat (Basel). 142, 188-192 (1991).
  13. Tucker, A. S., Watson, R. P., Lettice, L. A., Yamada, G., Hill, R. E. Bapx1 regulates patterning in the middle ear: altered regulatory role in the transition from the proximal jaw during vertebrate evolution. Development. 131, 1235-1245 (2004).
  14. Matsuo, K., et al. Osteogenic capillaries orchestrate growth plate-independent ossification of the malleus. Development. 142, 3912-3920 (2015).
  15. Matsuo, K. Cross-talk among bone cells. Curr Opin Nephrol Hypertens. 18, 292-297 (2009).
  16. Rijli, F. M., et al. A homeotic transformation is generated in the rostral branchial region of the head by disruption of Hoxa-2, which acts as a selector gene. Cell. 75, 1333-1349 (1993).
  17. Mallo, M., Gridley, T. Development of the mammalian ear: coordinate regulation of formation of the tympanic ring and the external acoustic meatus. Development. 122, 173-179 (1996).
  18. O'Gorman, S. Second branchial arch lineages of the middle ear of wild-type and Hoxa2 mutant mice. Dev Dyn. 234, 124-131 (2005).
  19. Santagati, F., Minoux, M., Ren, S. Y., Rijli, F. M. Temporal requirement of Hoxa2 in cranial neural crest skeletal morphogenesis. Development. 132, 4927-4936 (2005).
  20. Satokata, I., Maas, R. Msx1 deficient mice exhibit cleft palate and abnormalities of craniofacial and tooth development. Nat Genet. 6, 348-356 (1994).
  21. Zhang, Z., et al. Malleal processus brevis is dispensable for normal hearing in mice. Dev Dyn. 227, 69-77 (2003).
  22. Houzelstein, D., Cohen, A., Buckingham, M. E., Robert, B. Insertional mutation of the mouse Msx1 homeobox gene by an nlacZ reporter gene. Mech Dev. 65, 123-133 (1997).
  23. Martin, J. F., Bradley, A., Olson, E. N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages. Genes Dev. 9, 1237-1249 (1995).
  24. Yamada, G., et al. Targeted mutation of the murine goosecoid gene results in craniofacial defects and neonatal death. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  25. Rivera-Pérez, J. A., Mallo, M., Gendron-Maguire, M., Gridley, T., Behringer, R. R. Goosecoid is not an essential component of the mouse gastrula organizer but is required for craniofacial and rib development. Development. 121, 3005-3012 (1995).
  26. Coré, N., et al. Tshz1 is required for axial skeleton, soft palate and middle ear development in mice. Dev Biol. 308, 407-420 (2007).
  27. Li, C., Scott, D. A., Hatch, E., Tian, X., Mansour, S. L. Dusp6 (Mkp3) is a negative feedback regulator of FGF-stimulated ERK signaling during mouse development. Development. 134, 167-176 (2007).
  28. Hwang, C. H., Wu, D. K. Noggin heterozygous mice: an animal model for congenital conductive hearing loss in humans. Hum Mol Genet. 17, 844-853 (2008).
  29. Calvert, J. A., et al. A missense mutation in Fgfr1 causes ear and skull defects in hush puppy mice. Mamm Genome. 22, 290-305 (2011).
  30. Carpinelli, M. R., et al. Anti-apoptotic gene Bcl2 is required for stapes development and hearing. Cell death dis. 3, e362(2012).
  31. Chapman, S. C. Can you hear me now? Understanding vertebrate middle ear development. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1675-1692 (2011).
  32. Kitazawa, T., et al. Distinct effects of Hoxa2 overexpression in cranial neural crest populations reveal that the mammalian hyomandibular-ceratohyal boundary maps within the styloid process. Dev Biol. 402, 162-174 (2015).
  33. Wang, L., et al. Scleraxis is required for differentiation of the stapedius and tensor tympani tendons of the middle ear. J Assoc Res Otolaryngol. 12, 407-421 (2011).
  34. Amin, S., Tucker, A. S. Joint formation in the middle ear: lessons from the mouse and guinea pig. Dev Dyn. 235, 1326-1333 (2006).
  35. Amin, S., Matalova, E., Simpson, C., Yoshida, H., Tucker, A. S. Incudomalleal joint formation: the roles of apoptosis, migration and downregulation. BMC Dev Biol. 7, 134(2007).
  36. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of anatomy. 201, 15-29 (2002).
  37. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. Ch. 22, Special senses: ear. Comparative Anatomy and Histology: A Mouse and Human Atlas. Treuting, P. M., Dintzis, S. M. 22, Academic Press. 419-432 (2012).
  38. Mallo, M., Schrewe, H., Martin, J. F., Olson, E. N., Ohnemus, S. Assembling a functional tympanic membrane: signals from the external acoustic meatus coordinate development of the malleal manubrium. Development. 127, 4127-4136 (2000).
  39. Anthwal, N., Joshi, L., Tucker, A. S. Evolution of the mammalian middle ear and jaw: adaptations and novel structures. Journal of anatomy. 222, 147-160 (2013).
  40. Takechi, M., Kuratani, S. History of studies on mammalian middle ear evolution: a comparative morphological and developmental biology perspective. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 314, 417-433 (2010).
  41. Henson, O. W. Jr Ch. 3, Comparative Anatomy of the Middle Ear. Handbook of Sensory Physiology. Keidel, W. D., Neff, W. D. Vol. 1, Auditory System. Anatomy, Physiology (Ear), Springer. Berlin Heidelberg. 39-110 (1974).
  42. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , Humana Press. (2003).
  43. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
  44. Kampen, P. N. V. Gegenbaurs Morphologiesches Jahrbuch. 34, W. Engelmann. 321-722 (1905).
  45. Lee, J. H., Park, K., Kang, T. C., Choung, Y. H. Three-dimensional anatomy of the temporal bone in normal mice. Anat Histol Embryol. 38, 311-315 (2009).
  46. Fleischer, G. Evolutionary principles of the mammalian middle ear. Adv Anat Embryol Cell Biol. 55, 3-70 (1978).
  47. Lavender, D., Taraskin, S. N., Mason, M. J. Mass distribution and rotational inertia of "microtype" and "freely mobile" middle ear ossicles in rodents. Hear Res. 282, 97-107 (2011).
  48. Mason, M. J. Of mice, moles and guinea pigs: functional morphology of the middle ear in living mammals. Hear Res. 301, 4-18 (2013).
  49. Willi, U. B., Ferrazzini, M. A., Huber, A. M. The incudo-malleolar joint and sound transmission losses. Hear Res. 174, 32-44 (2002).
  50. Richter, C. A., et al. Defects in middle ear cavitation cause conductive hearing loss in the Tcof1 mutant mouse. Hum Mol Genet. 19, 1551-1560 (2010).
  51. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61, 382-395 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Disekcja bąbelka słuchowegoizolacja kostek słuchowychanatomia ucha środkowegoprzygotowanie przekrojów parafnowychzatapianie przekrojów mrożonychtechnika analizy histologicznejkostki słuchowe myszydisekcja torebki słuchowejzwichnięcie stawów kostek słuchowychprotokół utrwalania tkanek
Rozwarstwienie pęcherza słuchowego u myszy po urodzeniu: izolacja kości ucha środkowego i analiza histologiczna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.