Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

26.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55057

⸱

6 stycznia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology/Medical Oncology, University Medical Center Göttingen

W tym artykule

Podsumowanie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Streszczenie

Uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), w tym małych egzosomów pochodzenia endosomalnego (Exos, średnica < 100 nm) i dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej (MVs, średnica > 100 nm) jest podstawowym procesem komórkowym, który zachodzi we wszystkich żywych komórkach. Pęcherzyki te transportują białka, lipidy i kwasy nukleinowe specyficzne dla komórki, z której pochodzą, a badania in vitro podkreśliły ich znaczenie jako mediatorów komunikacji międzykomórkowej. EV zostały z powodzeniem wyizolowane z różnych płynów ustrojowych, a zwłaszcza EV we krwi zostały zidentyfikowane jako obiecujące biomarkery raka lub chorób zakaźnych. Aby umożliwić badanie subpopulacji MV we krwi, przedstawiamy protokół standaryzowanej izolacji i charakterystyki MV z próbek krwi obwodowej. MV są granulowane z próbek osocza antykoagulowanych EDTA przez wirowanie różnicowe i zwykle mają średnicę 100 - 600 nm. Ze względu na ich większy rozmiar można je łatwo badać za pomocą cytometrii przepływowej, techniki rutynowo stosowanej w diagnostyce klinicznej i dostępnej w większości laboratoriów. Podano kilka przykładów testów kontroli jakości wyizolowanych MV oraz przedstawione zostaną markery, które można wykorzystać do dyskryminacji różnych subpopulacji MV we krwi.

Wprowadzenie

W ostatnich latach wiele badań in vitro wykazało, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej. Żywe komórki stale zrzucają pęcherzyki, które różnią się wielkością, zawartością i biogenezą. Najlepiej przebadanymi EV są egzosomy, które pochodzą z układu endosomalnego, gdzie są przechowywane jako pęcherzyki śródświetlne w ciałach wielopęcherzykowych. Gdy te ostatnie połączą się z błoną plazmatyczną, zawarte w nich pęcherzyki są uwalniane jako egzosomy (Exos, średnica 30 - 100 nm1). Drugą populacją EV, która cieszy się coraz większym zainteresowaniem w ostatnich latach, są duże mikropęcherzyki (MVs, średnica 100 - 1000 nm), które wyrastają bezpośrednio z błony komórkowej 2.

Oba typy pęcherzyków są otoczone dwuwarstwą lipidową i zawierają kwasy nukleinowe, np. DNA, mRNA lub miRNA 3-5, oraz mnóstwo białek, które mogą przenosić do sąsiednich komórek. Podczas gdy ogólnie rzecz biorąc, skład białkowy pęcherzyków odzwierciedla stan komórki pochodzenia, niektóre białka wydają się być selektywnie ukierunkowane i wzbogacone na EVs 1. Głównym zainteresowaniem badawczym jest scharakteryzowanie EV z nieprawidłowych i chorych komórek w celu zdefiniowania specyficznych sygnatur EV, które mogą pozwolić na wykorzystanie EV jako nowych biomarkerów. Szczególnie w przypadku raka, w którym często sam guz nie jest łatwo dostępny, płynne biopsje ukierunkowane na specyficzne dla guza EV we krwi mogą umożliwić monitorowanie odpowiedzi na terapię lub pomóc w scharakteryzowaniu guza pierwotnego bez konieczności wykonywania inwazyjnych procedur 6.

Rzeczywiście, EV zostały już pomyślnie wyizolowane z różnych płynów ustrojowych, w tym moczu 7, płynu mózgowo-rdzeniowego 8, mleka matki 9 czy krwi 10. W kilku badaniach zidentyfikowano zmiany w liczbie i składzie EV w różnych chorobach człowieka. Na przykład u pacjentów z sepsą liczba prokoagulantów MV jest znacznie zwiększona w porównaniu z osobami zdrowymi 11. Również u pacjentów z ciężką malarią mózgową można zaobserwować wzrost całkowitej liczby MV we krwi, a liczba MV pochodzących z płytek krwi koreluje z głębokością śpiączki i małopłytkowością 12. Inne badania donoszą o podwyższonej liczbie pęcherzyków pochodzących ze śródbłonka u pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym lub niewydolnością serca, aw przypadku tej ostatniej koreluje to z wyższym prawdopodobieństwem zdarzeń sercowo-naczyniowych 13,14.

Szczególnie w przypadku raka, EV we krwi są obecnie omawiane jako nowe biomarkery o wartości diagnostycznej i prognostycznej. Poziomy MV wyrażających białka związane z nowotworem, takie jak MUC1, EGFR lub FAK, wydają się być podwyższone we krwi pacjentek z rakiem piersi 15,16. Ostatnie badania wykazały, że egzo pochodzące z krwi zawierające antygeny specyficzne dla nowotworu, takie jak Glypican-1 w przypadku raka trzustki lub Del-1 w przypadku raka piersi, umożliwiają wczesne wykrycie choroby z wysoką swoistością i czułością 17,18. Dodatkowo, egzoskopy guza pochodzące z surowicy mogą zawierać DNA, które można wykorzystać do wykrywania mutacji, takich jak KRAS i p53, co sugeruje ich zastosowanie do przewidywania terapii 19. Ostatnie postępy wykazały, że analiza Exo we krwi pacjentów z glejakiem przy użyciu specyficznego chipa mikroprzepływowego umożliwia monitorowanie terapii 20. Podsumowując, odkrycia te sugerują, że analiza subpopulacji pęcherzyków specyficznych dla choroby dostarcza cennych informacji na temat diagnozy, rokowania, a także opcji terapeutycznych i sukcesu.

Jednak izolacja i analiza Exos z krwi jest czasochłonna, wymaga specjalnego sprzętu laboratoryjnego i dlatego nie nadaje się jeszcze do rutynowej diagnostyki klinicznej. W przeciwieństwie do tego, MV można izolować znacznie szybciej, a ze względu na ich większy rozmiar można je łatwo analizować za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności łączenia ich z kulkami lateksowymi, jak jest to konieczne w przypadku Exos 18,21. W związku z tym przedstawiamy protokół, który można wykorzystać do standaryzowanej izolacji MV z próbek krwi, a następnie scharakteryzowania subpopulacji MV za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten pozwoli na dalsze badania i dogłębną charakterystykę profili MV w dużych grupach pacjentów, co będzie wymagane w celu wykorzystania MV w codziennej diagnostyce klinicznej.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem ludzi zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (zatwierdzenie nr 3/2/14). Przy wyborze pacjentów należy pamiętać, że kilka czynników, takich jak wiek, płeć, obecne schematy leczenia i wiele innych, może wpływać na skład MV we krwi i dlatego należy je wziąć pod uwagę przed pobraniem próbki 22,23.

1. Przygotowanie próbek osocza

  1. Pobrać 1-2 probówki krwi na dawcę przez igłę motylkową o rozmiarze 21 do probówki do pobierania krwi próżniowej zawierającej EDTA (1,6 mg/ml krwi). Upewnij się, że probówka (rurki) została kilkakrotnie odwrócona, aby zagwarantować skuteczną antykoagulację krwi.
    UWAGA: Zalecana objętość krwi do późniejszej cytometrii przepływowej i analizy Western Blot wynosi 5 - 15 ml. Aby zapobiec degradacji i utracie MV, próbki krwi należy obchodzić < 30 minut po pobraniu krwi.
  2. Przygotować próbki osocza, odwirowując je przez 15 minut przy 1 200 x g w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Zastosować filtr zastawkowy, aby pomóc w oddzieleniu osocza (= górna warstwa) od pozostałych komórek krwi (= dolna warstwa).
  4. Przenieść osocze do probówki o pojemności 15 ml.
  5. Wirować przez 15 minut przy 1,500 x g, RT w celu osadzania większych resztek komórek i usuwania pozostałych płytek krwi.
  6. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 15 ml i bezpośrednio przystąpić do izolacji MV lub przechowywać próbki przez okres do 6 miesięcy w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Przedstawiony protokół może być również wykorzystany do izolacji MV (i Exo) z supernatantów z hodowli komórkowych. W tym celu należy hodować komórki w zbiegu 60 - 80% przez 24 - 48 godzin w pożywce hodowlanej uzupełnionej FCS zubożonym w pęcherzyki, a następnie zebrać supernatant. Wirować przez 5 minut przy 750 x g, 4 °C w celu wyczerpania pozostałych pływających komórek, napełnić supernatant nową probówką o pojemności 15 ml i ponownie wirować przez 5 minut przy 1 500 x g, 4 °C w celu osadzenia większych resztek komórek. Ten supernatant może być następnie użyty do izolacji MV zgodnie z opisem w kroku 2.1 - 2.16.

2. Izolacja MV

  1. Przenieść próbkę osocza do odpowiedniej probówki wirówkowej. W razie potrzeby napełnić probówkę PBS w celu rozcieńczenia próbki i zapobieżenia zapadaniu się cienkościennych probówek podczas procedury wirowania.
  2. Wirować przez 35 minut przy 14 000 x g, 4 °C.
  3. Zdekantować supernatant, trzymać probówki odwrócone do góry nogami i położyć na ręczniku papierowym. Odczekać 3 - 5 minut, aż cały pozostały supernatant zostanie zanurzony w ręczniku i tym samym usunięty z próbki.
  4. Zawiesić osad MV w 1 000 μl PBS, przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 35 minut przy 14 000 x g, 4 °C w wirówce stołowej.
  5. Aspirowany supernatant.
  6. Zawiesić granulat MV w 50 - 500 μL PBS, w zależności od wielkości granulatu. Alternatywnie, należy poddać lis MV bezpośrednio, np. w buforze RIPA (150 mM NaCl/ 0,1% SDS/ 0,5% Na-deoksycholanu/ 1% Triton X-100/ 50 mM Tris, pH 7,2) w celu późniejszej analizy Western Blot. Przechowywać MV w temperaturze -20 °C. Pozostaną stabilne przez kilka miesięcy, ale unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  7. Opcjonalnie: Określić stężenie białka MV za pomocą testu białkowego (np. metoda Bradforda lub Lowry'ego) w celu oceny wydajności MV lub dawki MV do kolejnych eksperymentów.
  8. Jeżeli z próbek osocza mają zostać wyizolowane dodatkowe Exo, zdekantować supernatant z etapu 2.3 do probówki ultrawirówkowej i wirować przez 2 godziny przy 110 000 x g, 4 °C. Zdekantować supernatant zgodnie z opisem w kroku 2.3, ponownie zawiesić osad Exo w 1 000 μl PBS i przenieść do małych (1,5 ml) probówek do ultrawirowania.
    1. Ultrawirować przez 2 godziny w temperaturze 110 000 x g, 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad Exo w 50 - 75 μl PBS lub buforze RIPA.

3. Charakterystyka MV za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Przenieść 15 μl PBS+1% zubożonej w pęcherzyki płodowej surowicy cielęcej (FCS) w probówce do cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Zubożony w pęcherzyki FCS przygotowuje się przez odwirowanie dezaktywowanego termicznie (30 min w 56 °C) FCS przez 18 godzin przy 110 000 x g i przefiltrowanie supernatantu przez filtr 0,2 μm, jak opisano wcześniej 24.
  2. Dodać 5 μg (w przypadku niskich plonów stosuje się również 3 μg) MV w PBS.
  3. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania na powierzchni MV, a tym samym zmniejszenia barwienia tła.
  4. Dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Przed użyciem należy miareczkować ilość przeciwciała użytego do barwienia, aby określić optymalne stężenie i zagwarantować niski stosunek sygnału do szumu. Należy również pamiętać o dołączeniu jednej probówki z niebarwionymi MV jako kontroli ujemnej i jednej probówki MV barwionych pasującym przeciwciałem kontrolnym izotypu o tym samym stężeniu (np. jeśli stosuje się 1 μg przeciwciała, należy również użyć 1 μg przeciwciała kontrolnego izotypu) w celu ilościowego określenia barwienia tła.
    UWAGA: Możliwe jest również wykonanie wielokolorowej cytometrii przepływowej poprzez dodanie wielu przeciwciał sprzężonych z różnymi fluorochromami.
  5. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  6. Dodać 250 μl PBS i przystąpić do pomiaru próbki za pomocą cytometru przepływowego.
    1. W przypadku, gdy próbki nie mogą być natychmiast zmierzone, dodać 150 μl PBS i 50 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w celu utrwalenia próbek i przechowywania w temperaturze 4 °C. UWAGA: PFA jest toksyczny. Używać rękawic i odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
  7. Zmniejsz próg cytometru przepływowego do najniższej możliwej wartości i wyszukaj populację MV za pomocą wykresu rozproszenia do przodu (FSC) w funkcji rozrzutu bocznego (SSC) w skali logarytmicznej. Bramka na populacji MV i oceń sygnał fluorescencyjny na odpowiednim histogramie.

4. Charakterystyka MV za pomocą Western Blotting

  1. Zawiesić osad MV bezpośrednio w odpowiednim buforze do lizy (np. buforze RIPA).
    1. W przypadku gdy osad MV został już ponownie zawieszony w PBS, należy go rozcieńczyć co najmniej 1:1 w odpowiednim buforze do lizy (np. buforze RIPA).
  2. Oznaczyć stężenie białka w próbce MV, np. za pomocą testu Lowry'ego.
  3. Przygotować 10 - 20 μg MV w 22,5 μl buforze RIPA. Następnie dodać 7,5 μl 4x Laemmli bufor ładujący i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  4. Załaduj próbki na żel poliakryloamidowy i wykonaj elektroforezę oraz immunoblotting zgodnie ze standardowymi protokołami.
  5. Po przeniesieniu białek na błonę należy wykonać barwienie Pąskiem jako kontrolę obciążenia zgodnie ze standardowymi protokołami.
  6. Odbarwić membranę w TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Membrana blokowa przez 30 min do 1 h w RT w 5% BSA w TBST.
  8. Inkubować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  9. Umyć membranę TBST 3 x 5 min.
  10. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w rozcieńczeniu 1:10 000 w 5% BSA. Uwaga: W przypadku silnych sygnałów tła użyj mleka w proszku zamiast BSA.
  11. Umyć membranę środkiem TBST 3x 5 min.
  12. Opracowanie membrany z odczynnikiem do wykrywania ECL i wykrycie sygnałów na foliach chemiluminescencyjnych lub systemie obrazowania chemiluminescencyjnego.
    UWAGA: W celu odróżnienia MV od Exos można użyć białek takich jak tubulina, aktynina-4 lub mitofilina, które powinny być głównie obecne na MV 16,25. Należy zwrócić uwagę, że większość przeciwciał tetraspaninowych (np. CD9, CD81), stosowanych jako markery Exos, nie działa w warunkach redukujących i dlatego powinny być przygotowywane w nieredukującym buforze ładującym, a następnie ogrzewane przez 10 minut w temperaturze 70 °C.

Wyniki

Aby określić wydajność izolacji MV zgodnie z opisanym protokołem, obliczono ilość MV wyizolowanych z próbek krwi 10 dawców. Wydajność MV, oceniana za pomocą metody Lowry’ego, wynosiła od 10 do 30 µg ze średnią wynoszącą 19.2 µg liczba MV na ml krwi (Tabela 1). Stężenie cząstek określone za pomocą analizy śledzenia nanocząsteczek (NTA) mieściło się w zakresie od 1,66 x 109 do 2,36 x 1010 ze średnią wynoszącą 5,9 x 109 cząsteczek na mL próbki osocza (Tabela 2). Dalsza charakterystyka MV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawniła populację pęcherzyków o średnicy > 100 nm, które były otoczone dwuwarstwą lipidową i nie zawierały żadnych organelli komórkowych (Rysunek 1A). NTA potwierdziła, że rozmiar wyizolowanych MV wynosił od 100 do 600 nm (Rycina 1B) oraz średnia wielkość MV wynosiła 201 nm (Rysunek 1C). Barwienie typowych markerów dla MV i Exo metodą Western blotting wykazało, że wyizolowane MV były dodatnie w kierunku tubuliny i wykazywały jedynie niewielką ekspresję CD9 oraz CD81, podczas gdy Exo były ujemne w kierunku tubuliny i wzbogacone w CD9 oraz CD81 (Rysunek 2).

Analiza wyizolowanych pęcherzyków błonowych (MV) metodą cytometrii przepływowej (Rysunek 3A) ujawniło zdefiniowaną populację pęcherzyków, którą można było wyodrębnić za pomocą tych samych parametrów, które są zazwyczaj stosowane w przypadku MV izolowanych z nadsączków hodowli komórkowych, i która była wyraźnie różna od sygnału tła uzyskanego podczas pomiaru PBS + 1% FCS pozbawionego pęcherzyków bez dodania MV (Rycina 3B). Aby przeanalizować różne populacje mikrogałeczek (MV) obecne we krwi, MV barwiono za pomocą uznanych markerów dla poszczególnych populacji komórek krwi, np., CD62P dla mikro pęcherzyków (MV) pochodzenia płytkowego, CD45 dla MV pochodzenia leukocytarnego, CD235a dla MV pochodzenia erytrocytarnego oraz CD62E dla MV pochodzenia komórek śródbłonka (Rycina 4). Charakterystyka ta wykazała, że odsetek subpopulacji MV różnił się pomiędzy badanymi próbkami krwi dawców, podczas gdy w większości próbek głównym źródłem MV wydawały się być płytki krwi.

Analiza mikro pęcherzyków metodą elektroforezy; mikrografia elektronowa, wykres rozkładu wielkości, wykres średnicy średniej.
Rysunek 1: Rozkład wielkości MV wyizolowanych z krwi obwodowej. A, Wyizolowane MV zwizualizowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. B, Reprezentatywna analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA) MV ilustrująca rozkład wielkości pęcherzyków. C, Średnią wielkość MV z 10 niezależnych preparatów zmierzono za pomocą NTA (średnia). Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Western blot dla CD81, tubuliny i CD9; mikropęcherzyki a egzosomy, analiza ekspresji białek.
Rysunek 2: Charakterystyka wyizolowanych MV metodą Western blotting. Różnicową ekspresję białek w wyizolowanych MV i egzosomach od dwóch dawców zwizualizowano za pomocą techniki Western blotting. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza mikroprocesomieni (MV) metodą cytometrii przepływowej; wykresy rozproszenia, histogram fluorescencji od dawców.
Rysunek 3: Analiza MV metodą cytometrii przepływowej. A, MV są najpierw wizualizowane na wykresach rozproszenia światła w przód (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC) w celu wyznaczenia bramki dla odpowiedniej populacji MV. Następnie MV te są charakteryzowane pod kątem interesującego antygenu przy użyciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, skierowanych przeciwko temu antygenowi. B, Typowe wykresy FSC względem SSC dla MV wyizolowanych z osocza dwóch dawców. Dla porównania, po prawej stronie przedstawiono typowy wykres dla MV pochodzących z komórek nowotworowych linii A549 (rak płuca), wyizolowanych z nadsączu hodowli komórkowych, a także kontrolę negatywną z zastosowaniem wyłącznie PBS + 1% FCS pozbawionego pęcherzyków, bez obecności MV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Histogramy cytometrii przepływowej; markery CD62P, CD45, CD235a, CD62E; analiza liczby MV od dawcy.
Rycina 4: Charakterystyka wyizolowanych MV za pomocą cytometrii przepływowej. MV od trzech dawców poddano charakterystyce w kierunku ekspresji uznanych markerów komórek krwi (kolor czerwony) przy użyciu cytometrii przepływowej. Odpowiednie kontrole izotypowe przedstawiono w kolorze szarym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

PróbkaMV/ml krwi [µg]
#129.4
#210.3
#315.2
#431.1
#518.8
#622.7
#719.1
#818.7
#915.0
#1011.9

Tabela 1: Wydajność białka MV z próbek krwi obwodowej. Przedstawiono ilość MV na mL krwi obwodowej pobranej od 10 dawców. Wydajność MV została określona za pomocą metody Lowry'ego.

PróbkaMV/ml osocza [liczba cząsteczek]
#16,42E+09
#22,36E+10
#31,88E+09
#46,51E+09
#53,48E+09
#64,57E+09
#72,09E+09
#81,66E+09
#92,54E+09
#106,20E+09

Tabela 2: Wydajność cząsteczek MV z próbek krwi obwodowej. MV zostały wyizolowane z próbek osocza 10 dawców, a liczbę cząsteczek określono za pomocą analizy śledzenia nanocząsteczek. Przedstawiono wartość średnią z trzech niezależnych pomiarów.

Dyskusja

Ostatnie badania nad EV we krwi wykazały, że skład i liczba EV zmieniają się w trakcie przyczyn wielu chorób. W związku z tym analiza i dalsza charakterystyka tych EV są bardzo interesujące w celu dalszej oceny ich potencjalnego wykorzystania jako biomarkerów choroby do diagnozy i prognozowania lub do oceny odpowiedzi na terapię. Przedstawiony przez nas protokół pozwala na izolację pęcherzyków o średnicy do 600 nm, które nie zawierają żadnych organelli komórkowych. Obserwacje te są zgodne z obecną definicją MV i wykluczają obecność ciał apoptotycznych 2. Korzystając z Western Blotting, byliśmy w stanie wykazać, że izolowane MV wykazują wysoką ekspresję tubuliny, podczas gdy tetraspaniny CD9 i CD81, które są często używane jako markery egzo, były tylko nieznacznie wyrażone. Potwierdza to, że MV różnią się od Exo i pasują do niedawnej dogłębnej charakterystyki i porównania obu populacji EV za pomocą proteomiki 25.

Podczas pobierania próbek krwi bardzo ważne jest, aby czas między nakłuciem żyły a przygotowaniem osocza był jak najkrótszy, aby zapobiec degradacji MV. Co więcej, długotrwałe przechowywanie próbek krwi może prowadzić do aktywacji komórek krwi, powodując zwiększone wydzielanie MV i ostatecznie apoptozę, co skutkuje uwolnieniem ciał apoptotycznych. Innym ważnym czynnikiem związanym z izolacją MV jest zapobieganie zanieczyszczeniu preparatów MV białkami osocza lub mniejszymi Exo. Dlatego tak ważne jest, aby usunąć jak najwięcej supernatantu po odkręceniu MV przy 14 000 x g. Ponieważ osad jest normalnie widoczny i ściśle przylega do ścianki probówki, supernatant można łatwo usunąć za pomocą końcówki pipety. W przeciwieństwie do Exo, które mają tendencję do tworzenia agregatów podczas przygotowania przez ultrawirowanie z dużą prędkością i często są trudne do ponownego zawieszenia, problem ten nie występuje w przypadku MV.

Z naszych badań wynika, że możliwe jest scharakteryzowanie subpopulacji MV obecnych we krwi za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż granica wykrywalności większości cytometrów przepływowych wynosi około 200 - 300 nm, MV mierzono w sposób powtarzalny w próbkach od dawców i kultur komórkowych o tych samych parametrach analizy i bramkach, które wyraźnie pozwalały na ich odróżnienie od sygnałów tła. Ważne jest, aby przed pomiarami sprawdzić, czy PBS używany do analiz nie zawiera żadnych cząstek zanieczyszczających, które mogłyby powodować wysokie tło podczas cytometrii przepływowej (rysunek 3). Chociaż niektóre mniejsze MV mogą nie być wychwycone w podejściu cytometrii przepływowej, wykryliśmy MV ze wszystkich głównych populacji komórek krwi (np. Płytek krwi, czerwonych krwinek, leukocytów, komórek śródbłonka). W naszych analizach wykorzystaliśmy standardowe markery dla różnych komórek krwi, które wcześniej zostały znalezione na MV 26-29. Należy zauważyć, że w celu uzyskania możliwie najlepszych wyników za pomocą cytometrii przepływowej, ilość i stężenie wszystkich przeciwciał należy miareczkować na próbce MV wyrażającej interesujący nas antygen. Jeżeli określone subpopulacje MV we krwi zostaną zidentyfikowane z wyższą swoistością, możliwe jest przeprowadzenie podwójnego barwienia przeciwko dwóm różnym antygenom obecnym na odpowiednich MV i uwzględnienie tylko wszystkich podwójnie dodatnich MV do kolejnych analiz 23. Obecnie prowadzone są prace nad określeniem standardowego zakresu subpopulacji MV we krwi osób zdrowych 23,30. Badania te wykazały już, że MV pochodzenia płytkowego stanowią największą populację MV we krwi, co jest zgodne z naszymi obserwacjami.

Jedną z zalet cytometrii przepływowej do charakteryzowania próbek MV jest to, że metoda ta jest już dobrze znana do celów diagnostycznych w większości ośrodków klinicznych, co pozwoliłoby na możliwe wykorzystanie MV jako biomarkerów w codziennej diagnostyce klinicznej. Wcześniejsze badania nad EV we krwi, które koncentrowały się głównie na mniejszych egzo, opierają się albo na określonych procedurach sortowania w celu selektywnej analizy pożądanej populacji docelowej egzo 31,32 , albo wymagają czasochłonnego (2 dni) procesu izolacji ze sprzężeniem egzoenzymów z kulkami lateksowymi przed analizą 18. Nasze własne, niepublikowane obserwacje sugerują, że analiza cytometryczna przepływowa MV z preparatów krwi pełnej pozwala nawet na wykrycie MV, takich jak MV pochodzące z nowotworu, bez żadnych takich procesów selekcji.

Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół pozwala na szybką izolację MV z próbek krwi obwodowej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego, a następnie ich charakterystykę za pomocą cytometrii przepływowej i Western Bloting. Cały proces można przeprowadzić w ciągu około 2 godzin, co ułatwi przyszłe badania nad profilami MV we krwi pacjentów, które są niezbędne do oceny potencjału MV jako biomarkerów choroby.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Meike Schaffrinski za doskonałą pomoc techniczną. Za pomoc w pobraniu próbek krwi obwodowej (wszystkie z Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Getyndze) serdecznie dziękujemy następującym osobom: Henrietta Vida (Oddział Medycyny Transfuzjologicznej), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Oddział Chirurgii Ogólnej, Wisceralnej i Dziecięcej), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Oddział Neurochirurgii), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Oddział Otorynolaryngologii, Chirurgii Głowy i Szyi" oraz wszystkich pracowników interdyscyplinarnego Zakładu Onkologii Krótkoterminowej. Dziękujemy Dirkowi Wenzelowi (Instytut Chemii Biofizycznej im. Maxa Plancka, Getynga) za pomoc w mikroskopii elektronowej MV.

Badanie zostało sfinansowane przez niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF) w ramach projektu MetastaSys (grant nr 0316173) oraz Niemiecką Pomoc w Raku (grant nr 109615).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła motylkowa (rozmiar 21)Hospira Deutschland GmbH490P29201
Albumina surowicy bydlęcej Frakcja VRoth8076.3Dla 10x TBS zważ 24,2 g zasady Tris i 80 g NaCl, ad 1 L H2O i dostosuj pH do 7,6
Dla 1x TBS-T wymieszaj 100 ml 10x TBS z 900 ml H2O i dodaj 1 ml Tween-20
CD235a-PEBeckman CoulterA07792Użyj 5 i mikro; l do barwienia
CD45-FITCBeckman Coulter7782użyj 5 &mikro; l do barwienia
CD62E-PEBiolegend336008użyć 0,8 &mikro; g do barwienia
CD62P-PEBiolegend304905użyciu 0,1 i mikro; g do barwienia
przeciwciała CD81Biolegend3495011:2,000 w 5% BSA w TBS-T; stosować warunki nieredukcyjne dla przeciwciała Western Blotting
CD9Immunotools212700911:1,000 w 5% BSA w TBS-T; stosować warunki nieredukcyjne dla obrazowania chemiluminescencji Western Blotting
ImageQuant LAS-4000DC Fujitsu Life Sciences
IIBio-Rad
Odczynnik do wykrywania ECLVacutainery GE HealthcareRPN2232
EDTA do pobierania krwiSarstedt01.1605.001
FACSCanto IIBD Biosciences
płodowa surowica cielęca (FCS)Invitrogen10091148inaktywowany termicznie (30 min, 56 & C)
filtr 0,22 i mikro; mSarstedt83.1826.001
Wtórne przeciwciało przeciw myszom sprzężone z HRPSanta CruzSC-2005użyj 1:10 000 w 5% mleku w proszku w TBS-T
Sprzężone z HRP wtórne przeciwciało przeciw królikowiSanta CruzSC-2004użyj 1:10 000 w 5% mleku w proszku w TBS-T
4x bufor ładujący Laemmli, Roti-Load 1RothK929.1
mikrofuga SIGMA 1-15KSigma Mleko w proszku Laborzentrifugen
3 L-RHeraeus
PBS, bez Ca i MgPan biotechP04-36500
strzykawka do perfuzora 50 mlBraun8728844F
Roztwór barwiący Ponceau-S RotorPanReac AppliChemA2935,0500
Sw32.1 Ti do ultrawirowania (6 x 17 mL)Beckman Rotor Coulter
TLA-120.2 do ultrawirowania (10 x 1,5 mL)Beckman Probówki Coulter
do cytometrii przepływowej (5 ml, okrągłodenne)BD Biosciences352054
probówki do ultrawirowania (15 ml)Beckman Coulter344061
do ultrawirowania (11*34 mm)Beckman Coulter343778
Przeciwciało tubulinoweMillipore05-8291:5,000 w 5% BSA w TBST
ultrawirówka Optima L-80 XPBeckman Coulter
TL-100zaworowy Beckman Coulter
Seraplas V15Sarstedt53,428
Zestaw do oznaczania białek 5000112 (Blotting-Grade Blocker, odtłuszczone mleko w proszku)BioRad 170-6404 multifuge NanoSight LM10 NanoSight Ltd.Probówki do ultrawirowania Ultrawirówka Filtr

Bibliografia

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (0), (2015).
  3. Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
  4. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180(2011).
  5. Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
  6. Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
  7. Pisitkun, T., Shen, R. -F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  8. Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10(2009).
  9. Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  10. Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  11. Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
  12. Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415(2010).
  13. Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
  14. Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
  15. Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
  16. Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
  17. Moon, P. -G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
  18. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  19. Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
  20. Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
  21. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
  22. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2 (0), (2013).
  23. Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
  24. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3 (0), (2014).
  25. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
  26. Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
  27. Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
  28. Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
  29. Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
  30. Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
  31. Rupp, A. -K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
  32. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mikrop cherzyk wcytometria przep ywowawirowanie r nicoweledzenie nanocz stekWestern blottransmisyjna mikroskopia elektronowaanaliza bia ekcharakterystyka p cherzyk wbiomarkery krwi
Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.