Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dzięki tej metodzie, kolejne kriosekcje są pobierane, aby umożliwić zarówno zastosowania mikroskopowe do histologii tkanek, jak i wzbogacanie RNA do ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Zazwyczaj trudno jest osiągnąć odpowiednią homogenizację małych próbek mięśni szkieletowych, ponieważ objętości mogą być zbyt małe dla wydajnych zastosowań mielenia, ale bez wystarczającego zakłócenia mechanicznego gęsta architektura tkankowa mięśni ogranicza przenikanie odczynników buforowych, ostatecznie powodując niską wydajność RNA. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, skrawki 30 μm są zbierane i łączone, co pozwala na kriosekcję, a następnie homogenizację igłową w celu mechanicznego przerwania mięśnia, zwiększając powierzchnię narażoną na penetrację bufora. Podstawowym ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona kriostatu i ma stosunkowo niską przepustowość. Jednak wysokiej jakości RNA można uzyskać z małych próbek połączonych kriosekcji mięśni, dzięki czemu metoda ta jest dostępna dla wielu różnych mięśni szkieletowych i innych tkanek. Co więcej, technika ta umożliwia dopasowane analizy (np. histopatologia tkanek i ekspresja genów) z sąsiednich regionów pojedynczego mięśnia szkieletowego, dzięki czemu pomiary mogą być bezpośrednio porównywane między zastosowaniami w celu zmniejszenia niepewności doświadczalnej i zmniejszenia liczby replikacyjnych eksperymentów na zwierzętach niezbędnych do pozyskania małej tkanki do wielu zastosowań.
Wprowadzenie
Celem tej techniki jest umożliwienie wielu analiz eksperymentalnych za pomocą różnych modalności, takich jak histologia i ekspresja genów, z pojedynczej małej tkanki źródłowej mięśni szkieletowych. Zastosowania mikroskopowe są najbardziej wrażliwe na metody konserwacji próbek, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby ograniczyć tworzenie się artefaktów kryształów lodu podczas krioprezerwacji. W związku z tym opracowanie metody opiera się na zamrożonym mięśniu piszczelowym przednim (TA) częściowo pokrytym żywicą zatopioną w kąpieli 2-metylobutanowej chłodzonej ciekłym azotem o temperaturze -140 °C jako materiale źródłowym zarówno do mikroskopii immunofluorescencyjne....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgia zgodnie z protokołem użytkowania zwierząt A2013 07-016 (Beedle).
1. Kriokonserwacja nieutrwalonych mięśni szkieletowych
- preparat
- Pokrój korek na małe kwadraty (około 1 cm x 1 cm) za pomocą żyletki, napisz na korku markerem z cienką końcówką, który jest odporny na 2-metylobutan, aby zidentyfikować źródłową mysz i mięsień, i wykonaj bardzo płytkie cięcie (około 1 mm) na górnej powierzchni. Włóż plastikowe szkiełko nakrywkowe do nacięcia, aby użyć go do orientacji tkanki. Powtarzaj, aż korek będzie got....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
RNA z krioprzekrojów mięśni charakteryzuje się wysoką jakością i zapewnia wydajność wystarczającą dla większości zastosowań
Analizy szesnastu preparatów RNA z mięśni szkieletowych przedstawiono w Tabeli 1, wykorzystując od 19,4 do 41 mg połączonego mięśnia piszczelowego przedniego (TA) od 8 myszy kontrolnych. Zarówno lewy (L), jak i prawy (R) mięsień TA zostały przygotowane w eksperymentach nad regeneracją, w który.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby osiągnąć najlepsze wyniki tą metodą, podczas kriokonserwacji tkanek należy ograniczać żywicę do dolnej jednej trzeciej lub połowy mięśnia, ponieważ nadmiar żywicy spowolni zbieranie połączonych kriosekcji i może zwiększyć zanieczyszczenie żywicą zatapiającą się w izolacji RNA. Ważna jest również szczególna uwaga podczas homogenizacji igieł, aby zmaksymalizować wydajność i zminimalizować prawdopodobieństwo zatkania igły. Protokół może być modyfikowany za pomocą strzykawki Luer-Lok w celu ochrony przed utratą próbki, j.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre i Junna Luan zapewnili pomoc techniczną. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer AR065077. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponosi autor i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Korek | VWR Scientific | 23420-708 | Pokrój na małe kwadraty ostrym ostrzem. |
| Szkiełko nakrywkowe z tworzywa sztucznego | Fisher Scientific | 12-547 | Służy do orientacji mięśni podczas zamrażania. |
| Termometr niskotemperaturowy | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-metylobutan | Sigma | M32631-4L | Uwaga: niebezpieczna substancja chemiczna. Przechowywać w łatwopalnej szafce. |
| Żywica do zatapiania: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Cryomatrix można zastąpić innymi żywicami do zatapiania. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 z jednorazowym nośnikiem ostrzy | Każdy działający kriostat powinien być wystarczający do przestrzegania protokołu. |
| Jednorazowe ostrze do kriostatu | Thermo Fisher Scientific 3052835 | Użyj odpowiedniego ostrza lub noża do kriostatu, który ma być używany. | |
| Roztwór do odkażania RNAza: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Waga analityczna | Mettler Toledo | XS64 | |
| Pędzel | malarski Daler Rowney | 214900920 | Służy do obsługi kriosekcji. Można go znaleźć w sklepach z prostymi artykułami plastycznymi. |
| Żyletka | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Szkiełko mikroskopowe | Odczynnik do | ||
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Uwaga: TRIzol jest niebezpieczną substancją chemiczną. Uwaga: Do ekstrakcji RNA z mięśni szkieletowych zalecane są wyłącznie odczynniki do ekstrakcji organicznej. |
| Igła o rozmiarze 18 VWR | Scientific | BD305185 | |
| Igła o rozmiarze 22 Igła | VWR Scientific | BD305155 | |
| Igła o rozmiarze 26 | VWR Scientific | BD305115 | Opcjonalnie. Może być stosowany do trzeciej rundy trituracji próbki w protokole ekstrakcji RNA. |
| Strzykawka 1 ml | VWR Scientific BD309659 | W przypadku próbek o bardzo wysokiej wartości zalecana jest strzykawka Luer-Lok (np. , VWR BD309628). | |
| 1-bromo-3-chloropentan (BCP) | Sigma | B9673 | |
| Do 70% etanolu w wodzie DEPC: 200-procentowy alkohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Wymieszaj 35 ml 200 proof alkoholu + 15 ml wody DEPC. |
| Dla 70% etanolu w wodzie DEPC: woda uzdatniona DEPC | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water. |
| Zestaw do oczyszczania RNA: Minizestaw PureLink RNA | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Końcowe etapy przygotowania RNA. |
| Woda wolna od DNaz/Rnaz | Można również użyć wody uzdatnionej przez | Gibco | 10977 |
| Spektrofotometr: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Poddaj oczyszczone RNA działaniu w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń DNA przed ich zastosowaniem. |
| Długopis hydrofobowy | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS do protokołu immunofluorescencji. |
| Surowica osła | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Uwodnić normalną surowicę osła zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie rozcieńczyć podwielokrotność do 5% w celu uzyskania immunofluorescencji. Można również użyć normalnej koziej surowicy. |
| Przeciwciało eMHC | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Przeciwciało Collagen VI | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Osioł anty-królik AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Koza anty-mysia IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6- diamidino-2-fenyloindol) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Wodne media montażowe: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Używaj wyłącznie mediów montażowych przeznaczonych do zastosowań fluorescencyjnych o właściwościach zapobiegających blaknięciu. |
| Szkiełko nakrywkowe | szklane VWR Scientific | 16004-314 | Służy do montażu szkiełek na końcu protokołu immunofluorescencji |
| Oprogramowanie do analizy obrazu: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express lub bardziej zaawansowane produkty | Freeware ImageJ powinny również działać do ręcznego liczenia. Bardziej zaawansowane oprogramowanie z możliwością segmentacji może pozwolić na częściową automatyzację procesu; np. , ImageProPremier. |
| Scalanie i mapowanie obrazów sekcji: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 został wycofany. Inne opcje dla kardiotoksyny to EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; lub Ge Script # RP17303; Nie zostały one jednak potwierdzone. |
| zestaw do odwrotnej transkrypcji: System syntezy pierwszej nici w indeksie górnym III | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Można stosować dowolne zwalidowane, wysokiej jakości odczynniki do odwrotnej transkrypcji. |
| Standardowy PCR: System polimerazy GoTaq Flexi | Promega | M8298 | Można zastosować dowolny zwalidowany, wysokiej jakości system polimerazy Taq. Jeśli sekwencjonowanie DNA ma być stosowane do jakiegokolwiek zastosowania po PCR, należy zamiast tego użyć systemu PCR o wysokiej wierności. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | Do stosowania w qPCR, gdy nie używa się dedykowanej mieszanki qPCR master. Stosować z SuperROX (do instrumentów Applied Biosystems) oraz polimerazą i GoTaq Flexi. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX jest bardziej stabilny w reakcji PCR, dlatego jest preferowany do stosowania jako pasywny barwnik referencyjny qPCR zamiast ROX (karboksy-X-rodamina). Do qPCR z instrumentami Applied Biosystems |
| PCR w czasie rzeczywistym | Applied Biosystems | 7900HT |
Bibliografia
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
- Bartoli, M., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
