Artykuł metodologiczny

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55058

⸱

12 grudnia 2016

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Streszczenie

Dzięki tej metodzie, kolejne kriosekcje są pobierane, aby umożliwić zarówno zastosowania mikroskopowe do histologii tkanek, jak i wzbogacanie RNA do ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Zazwyczaj trudno jest osiągnąć odpowiednią homogenizację małych próbek mięśni szkieletowych, ponieważ objętości mogą być zbyt małe dla wydajnych zastosowań mielenia, ale bez wystarczającego zakłócenia mechanicznego gęsta architektura tkankowa mięśni ogranicza przenikanie odczynników buforowych, ostatecznie powodując niską wydajność RNA. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, skrawki 30 μm są zbierane i łączone, co pozwala na kriosekcję, a następnie homogenizację igłową w celu mechanicznego przerwania mięśnia, zwiększając powierzchnię narażoną na penetrację bufora. Podstawowym ograniczeniem tej techniki jest to, że wymaga ona kriostatu i ma stosunkowo niską przepustowość. Jednak wysokiej jakości RNA można uzyskać z małych próbek połączonych kriosekcji mięśni, dzięki czemu metoda ta jest dostępna dla wielu różnych mięśni szkieletowych i innych tkanek. Co więcej, technika ta umożliwia dopasowane analizy (np. histopatologia tkanek i ekspresja genów) z sąsiednich regionów pojedynczego mięśnia szkieletowego, dzięki czemu pomiary mogą być bezpośrednio porównywane między zastosowaniami w celu zmniejszenia niepewności doświadczalnej i zmniejszenia liczby replikacyjnych eksperymentów na zwierzętach niezbędnych do pozyskania małej tkanki do wielu zastosowań.

Wprowadzenie

Celem tej techniki jest umożliwienie wielu analiz eksperymentalnych za pomocą różnych modalności, takich jak histologia i ekspresja genów, z pojedynczej małej tkanki źródłowej mięśni szkieletowych. Zastosowania mikroskopowe są najbardziej wrażliwe na metody konserwacji próbek, które muszą być dokładnie kontrolowane, aby ograniczyć tworzenie się artefaktów kryształów lodu podczas krioprezerwacji. W związku z tym opracowanie metody opiera się na zamrożonym mięśniu piszczelowym przednim (TA) częściowo pokrytym żywicą zatopioną w kąpieli 2-metylobutanowej chłodzonej ciekłym azotem o temperaturze -140 °C jako materiale źródłowym zarówno do mikroskopii immunofluorescencyjnej, jak i analiz ekspresji genów.

Potrzeba użycia tego samego materiału źródłowego do różnych podejść technicznych jest szczególnie ważna w eksperymentach opartych na iniekcjach domięśniowych, gdzie lewy i prawy mięsień reprezentują różne warunki, jeden eksperymentalny i jeden kontrolny. Na przykład w badaniach nad regeneracją mięśni jednemu mięśniowi wstrzykuje się toksynę, aby spowodować rozległe uszkodzenie tkanki, podczas gdy mięsień przeciwległy służy jako kontrola, której wstrzykuje się nośnik1. Podobnie, badania nad terapią genową w zaburzeniach mięśni zwykle rozpoczynają się od walidacji wektora terapii genowej przez wstrzyknięcie domięśniowe w celu porównania z pustym wektorem, niepowiązanym wektorem lub kontrolą nośnika po stronie przeciwnej2. W związku z tym nie jest możliwe pozyskanie każdego mięśnia TA do innego zastosowania.

Typowe strategie radzenia sobie z tym problemem to: i) użycie innej grupy mięśni do każdej aplikacji, ii) użycie dodatkowych myszy, lub iii) odcięcie kawałka mięśnia dla każdej aplikacji. Jednak znaczne różnice między grupami mięśniowymi utrudniają porównywanie danych z oddzielnych zastosowań, a dodatkowe zwierzęta zwiększają koszty i są słabo uzasadnione, jeśli istnieją inne alternatywy. Podział mięśnia po rozbiorze w celu uzyskania różnych zastosowań jest w wielu przypadkach najlepszą opcją. Jednak kawałki mięśni są często zbyt małe, aby można było użyć sproszkowania w ciekłym azocie lub technik mielenia mechanicznego do homogenizacji2-5. Ponieważ mięśnie są wysoce strukturalną tkanką wypełnioną macierzą zewnątrzkomórkową i białkami kurczliwymi, nieodpowiednia homogenizacja mechaniczna prowadzi do niskiej wydajności późniejszego DNA, RNA lub białka. Opisana tutaj metoda pozwala na wykorzystanie niewielkich ilości tkanki z jednego mięśnia źródłowego w wielu zastosowaniach, a włączenie kriosekcji i trituracji igłowej poprawia homogenizację mechaniczną w celu uzyskania lepszej wydajności RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgia zgodnie z protokołem użytkowania zwierząt A2013 07-016 (Beedle).

1. Kriokonserwacja nieutrwalonych mięśni szkieletowych

  1. preparat
    1. Pokrój korek na małe kwadraty (około 1 cm x 1 cm) za pomocą żyletki, napisz na korku markerem z cienką końcówką, który jest odporny na 2-metylobutan, aby zidentyfikować źródłową mysz i mięsień, i wykonaj bardzo płytkie cięcie (około 1 mm) na górnej powierzchni. Włóż plastikowe szkiełko nakrywkowe do nacięcia, aby użyć go do orientacji tkanki. Powtarzaj, aż korek będzie gotowy do kriokonserwacji każdej tkanki.
    2. Otrzymaj ciekły azot, 2-metylobutan, żywicę do zatapiania, termometr niskotemperaturowy, korki, narzędzia do preparowania i mysz badawczą.
      UWAGA: Ciekły azot to sprężony gaz, który może eksplodować po podgrzaniu. Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić fartuch laboratoryjny, rękawice niskotemperaturowe i ochronę twarzy; Kontakt ze skórą lub oczami może spowodować oparzenia lub odmrożenia. 2-metylobutan jest łatwopalnym, toksycznym zagrożeniem dla zdrowia i środowiska. Nosić środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary ochronne), otworzyć pojemnik na materiał wyjściowy w dygestorium, przenieść niewielką ilość potrzebną do zamrożenia (zwykle od 200 do 400 ml) do osobnego pojemnika, który można szczelnie zamknąć, i unikać wdychania.
    3. Eutanazja myszy zatwierdzoną metodą eutanazji w znieczuleniu. Krótko mówiąc, włóż mysz do komory inhalacyjnej z 2,5% izofluranem w tlenie z waporyzatora izofluranu, odczekaj 20 sekund po tym, jak mysz przestanie się poruszać, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu pedałowania. Gdy odruch pedałowania jest ujemny, poddaj badanej myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy6,
      UWAGA: Metody eutanazji wymagają zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję etyczną.
    4. Usuń skórę pokrywającą dystalną kończynę tylną i przetnij dystalne ścięgna przednie tuż nad kostką za pomocą precyzyjnych nożyczek preparacyjnych. Chwyć dystalne ścięgna cienkimi kleszczami i delikatnie pociągnij w górę i w kierunku kolana, jednocześnie przecinając powięź boczną, aby uwolnić mięsień. Wyciągnij mięsień prostopadle do kolana i wykonaj ostatnie cięcie, aby wyciąć mięsień TA7.
      UWAGA: Mięsień TA jest tutaj używany jako przykład, ale każdy mięsień szkieletowy myszy lub serce może być zastąpiony TA w tym protokole, jeśli jest to odpowiednie dla celów eksperymentalnych użytkownika. Jedynym ograniczeniem jest to, że tkanka musi być wystarczająco mała, aby osiągnąć szybką kriokonserwację na całej swojej głębokości; Zalecany jest maksymalny rozmiar tkanki 1 cm x 1 cm.
    5. Powtórz na przeciwnej nodze i wypreparuj wszelkie inne tkanki do pobrania. Wykonaj sekcję tak szybko, jak to możliwe, aby ograniczyć degradację tkanek przed krioprezerwacją.
    6. Ustaw każdy mięsień na odcinkach poprzecznych na wstępnie oznakowanym korku. Ustaw mięsień prostopadle do korka, tak aby dystalne ścięgno dotykało korka, a górna część mięśnia rozciągała się, utrzymywana pionowo przez szkiełko nakrywkowe.
    7. Należy zakonserwować wszystkie tkanki do analizy histologicznej tak szybko, jak to możliwe po sekcji, najlepiej w ciągu 5 minut, ale na pewno nie więcej niż 15 minut, które upłynęły od eutanazji zwierzęcia źródłowego.
  2. Kriokonserwacja
    1. Rozpocząć schładzanie kąpieli kriokonserwacyjnej na pięć minut przed zakończeniem sekcji. Wlać 2-metylobutan do otwartej metalowej zlewki na głębokość około 3 cm. Wlej ciekły azot do izolowanego pojemnika na głębokość od 2 do 4 cm. Umieść zlewkę 2-metylobutanu w ciekłym azocie; Azot zacznie wrzeć. Unikać rozpryskiwania azotu w zlewce 2-metylobutanowej.
      ostrożność: Przygotuj zamrażarkę w dygestoriach lub dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
    2. Włóż termometr niskotemperaturowy do 2-metylobutanu, aby monitorować temperaturę i często mieszaj widelcem, aby zapewnić równomierne chłodzenie. Kontynuować mieszanie i schładzać, aż 2-metylobutan osiągnie -140 °C, dodając w razie potrzeby nowy ciekły azot do kąpieli zewnętrznej.
      UWAGA: -140 °C to optymalna temperatura, aby zminimalizować artefakty kryształów lodu w mięśniach prążkowanych; inne tkanki mogą być najlepiej przechowywane w różnych temperaturach (np. mózg, -90 °C).
    3. Żywicę do zatapiania należy nakładać tylko na dolne 35 - 50% mięśnia, gdzie styka się z korkiem i natychmiast wrzucać korek do 2-metylobutanu w temperaturze -140 °C. Szybko powtórzyć dla maksymalnie 8 tkanek na partię do zamrożenia. Mieszaj przez 30 sekund, skrobając dno zlewki, aby upewnić się, że tkanki nie zamarzną w krzepnącym 2-metylobutanie.
    4. Użyj widelca, łyżki cedzakowej lub dużych kleszczy, aby wyciągnąć każdy korek tkankowy z 2-metylobutanu. Szybko zdjąć szkiełko nakrywkowe, wklepać nadmiar 2-metylobutanu do zlewki, a następnie wrzucić korek tkankowy do zewnętrznej kąpieli azotowej. Powtórzyć te czynności dla wszystkich pozostałych korków w zlewce.
    5. Próbki należy przenieść w ciekłym azocie lub na suchym lodzie do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania.
    6. Jeśli pozostaną jakiekolwiek tkanki do krioprezerwacji, powtórz kroki od 1.2.3 do 1.2.4. W razie potrzeby dodać dodatkowy 2-metylobutan do zlewki lub ciekły azot do kąpieli zewnętrznej i ponownie schłodzić do temperatury -140 °C. Zużyty 2-metylobutan należy usunąć jako odpad niebezpieczny.

2. Zbieraj kriosekcje do zastosowań histologicznych i RNA

  1. preparat.
    1. Wstępnie zważyć probówkę bez autoklawowanych DNaz/RNaz na wadze analitycznej. Następnie przenieś go do komory kriostatu, aby wstępnie schłodzić. Powtarzaj, aż probówki będą gotowe do pobrania wszystkich zbiorczych próbek kriosekcji.
    2. W przypadku sekcji mięśni szkieletowych należy upewnić się, że temperatura komory kriostatu wynosi od -21 do -22 °C za pomocą wewnętrznego termostatu. Przenieść wszelkie pojemniki z tkankami do pokrojenia do komory i pozostawić pojemnik(-i) do wyrównania do temperatury kriostatu przez co najmniej 15 minut przed otwarciem.
    3. Włóż nowe jednorazowe ostrze kriostatu. Alternatywnie wyjmij istniejące ostrze, spryskaj roztworem odkażającym RNazę, spłucz ddH2O i ponownie włóż do kriostatu do ostygnięcia. Spryskaj czystą chusteczkę 70% etanolem i ostrożnie wytrzyj ostrze i ostrze clampplatforma.
      1. Spryskaj czystą chusteczkę roztworem do odkażania RNazy i wytrzyj szczoteczki do kriostatu. Spryskaj chusteczkę ddH2O, ponownie wytrzyj szczotki i umieść je w komorze kriostatu na czystej powierzchni.
        ostrożność: Ostrze kriostatu powinno być zakryte osłoną noża, gdy nie jest używane. Ponadto roztwór do odkażania RNazy jest toksyczny i zamarza, tworząc osad w zimnej komorze kriostatu. Dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie i unikać jego używania w komorze kriostatu.
    4. W komorze kriostatu umieść kroplę o wielkości dziesięciocentówki (około 300 μl) żywicy do zatapiania na uchwycie na ciepłą próbkę, umieść korek na chusteczce na żywicy, dociśnij, a następnie umieść uchwyt w szynie zamrażającej lub na elemencie do szybkiego zamrażania, jeśli jest dostępny.
    5. Po zestaleniu się żywicy do zatapiania (białej) dodaj dodatkową żywicę do zatapiania na wierzchu korka, wokół dolnych 35% tkanki i wciśnij ekstraktor ciepła w żywicę do zatapiania, aby szybko zamrozić, aby lepiej ustabilizować tkankę. Odczekaj 5 minut przed cięciem, aby żywica w pełni stwardniała.
    6. Upewnij się, że próbka clamp jest w najbardziej cofniętej pozycji, najdalej od ostrza. Włóż uchwyt na próbkę tkanki do zacisku próbki.
  2. Przygotowanie kriosekcji.
    1. Poluzuj uchwyt uchwytu ostrza, ustaw kąt przyłożenia ostrza na 10° (lub kąt odpowiedni dla używanego uchwytu ostrza) i ponownie dokręć. Zwolnij hamulec i obróć pokrętło, aby opuścić mięsień w kierunku ostrza. Oszacuj najbliższą odległość między tkanką a ostrzem, a następnie odsuń tkankę od ostrza i włącz hamulec pokrętła ręcznego.
    2. Poluzuj dźwignię regulacji wysokości i przesuń uchwyt ostrza odpowiednio do przodu lub do tyłu, jeśli koniec chusteczki znajduje się w odległości większej niż około 2 mm od ostrza lub jeśli ostrze uderza w tkankę. Ponownie dokręć i opuść chusteczkę, aby sprawdzić odległość od ostrza. Powtarzaj regulacje, aż ostrze znajdzie się w odległości od 1 do 2 mm od końca tkanki według oceny wizualnej.
    3. Opuść tkankę w kierunku ostrza i oceń kąt tkanki dla odcinków poprzecznych. Zablokuj pokrętło ręczne i zwolnij próbkę clamp dźwignia. Popchnij próbkę clamp w lewo lub w prawo, aż pozioma orientacja tkanki będzie prostopadła do ostrza.
    4. Popchnij próbkę clamp w górę lub w dół, aby wyregulować orientację "y" tak, aby sekcje tkanki były prostopadłe do długiej osi mięśnia. Dokręcić próbkę clamp dźwignia.
    5. Użyj kursu i precyzyjnego posuwu do przodu, aby przesunąć próbkę, aż dotknie ostrza. Jeśli szukasz przekrojów z określonej głębokości tkanki, zresetuj sumę grubości przekroju do zera (górna część tkanki).
    6. Ustaw kriostat na funkcję przycinania z grubością przekroju 30 μm. Wycinaj i odrzucaj sekcje, aż zostanie osiągnięta wstępnie wybrana głębokość pobierania tkanek (np. 400 μm od góry).
  3. Zbierz kriosekcje do ekstrakcji RNA.
    1. Otwórz rurkę do zbierania sekcji i umieść ją w pobliżu uchwytu ostrza. Użyj wstępnie schłodzonej, czystej szczotki, aby podnieść każdą sekcję podczas cięcia z ostrza i przenieść kriosekcję do tuby. Powtarzać tę czynność, aż połączone skrawki ważą 30 mg lub zostanie osiągnięta pożądana głębokość tkanki.
      UWAGA: W przypadku dorosłej myszy piszczelowej przedniej pobranie z tkanki o głębokości około 400 do 4,000 μm zwykle daje 25 - 40 mg. Nie zaleca się używania metalowych kleszczyków do przenoszenia skrawków do rurki zbiorczej, ponieważ skrawki mają tendencję do przyklejania się i zbrylania na metalowej powierzchni.
    2. Jeśli zatopiona żywica otacza kriosekcję mięśni, zablokuj hamulec ręczny i użyj żyletki, aby zgolić małe kawałki żywicy, aż wokół górnej części mięśnia pozostanie tylko cienka warstwa. Zawsze tnij żywicę z ostrzem odchylonym od mięśnia.
      UWAGA: Cienka warstwa żywicy osadzającej nie wpływa znacząco na dalszy preparat RNA. Jeśli obecna jest grubsza żywica do zatapiania, użyj szczotek, aby oderwać ją od mięśnia przed przeniesieniem kriosekcji do probówki zbiorczej.
    3. Alternatywnie, złóż sekcje na nośniku ostrzy i przenieś luzem do probówki zbiorczej.
      UWAGA: Jednak ta metoda jest zwykle wolniejsza, a sekcje są bardziej podatne na sklejanie się i zbijanie, co może zmniejszyć wydajność homogenizacji igłowej w późniejszych etapach.
    4. Szybko umieść rurkę do kriosekcji w wadze analitycznej i zapisz masę probówki. Natychmiast umieścić probówkę z powrotem w zimnej komorze kriostatu, aby utrzymać temperaturę sekcji w pobliżu -20 °C. Obliczyć masę połączonych sekcji.
      UWAGA: Jeśli izolacja RNA nastąpi innego dnia, przechowuj zbiorczą probówkę do kriosekcji w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  4. Zbierz kriosekcje do histologii.
    1. Naciśnij przycisk grubości przekroju, aby uzyskać dokładne cięcie i użyj strzałek, aby ustawić grubość przekroju kriostatu na 7 μm (lub inną odpowiednią grubość sekcji, zwykle od 6 do 10 μm).
      UWAGA: Do zastosowań histologicznych należy używać cieńszych skrawków (od 6 do 10 μm), aby zapewnić, że odczynniki barwiące mogą wniknąć w głąb wycinka tkanki. Podczas kriosekcji można pobrać cienkie skrawki z dowolnej głębokości, ale preferowane są głębsze sekcje, ponieważ żywica osadzająca, która zwiększa się wraz z głębokością tkanki, nie pogarsza barwienia histologicznego.
    2. Wytnij i odrzuć od 4 do 7 odcinków, aby uzyskać spójną, równą powierzchnię tkanki. Zanotuj głębokość tkanki.
    3. Wytnij sekcję i ustaw ją na powierzchni nośnika ostrza. Podnieś sekcję, szybko i delikatnie dotykając ciepłym (w temperaturze pokojowej) szkiełkiem mikroskopowym do sekcji na uchwycie ostrza. Przywróć szkiełko do temperatury pokojowej. Kontynuuj, aż zostanie uzyskana liczba żądanych szkiełek. Zanotuj końcową głębokość tkanki.
      UWAGA: Zaleca się pobranie drugiego (zduplikowanego) odcinka dla każdej tkanki.
    4. Po zakończeniu sekcji włącz hamulec koła ręcznego, przywróć próbkę do najbardziej wysuniętej do tyłu pozycji i wyjmij uchwyt na tkankę. Użyj elementu grzewczego kriostatu, aby stopić żywicę do zatapiania przytrzymującą korek tkankowy na uchwycie próbki. Usuń korek na chusteczkę, osusz chusteczką i wróć do przechowywania.
    5. Powtórzyć czynności od kroku 2.1.2 dla każdej pozostałej tkanki. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 20 minut po zamontowaniu ostatniej chusteczki. Następnie należy użyć szkiełek do barwienia histologicznego lub immunofluorescencyjnego lub zamrozić w temperaturze -80 °C w pudełku ze szkiełkami, aż będą potrzebne.

3. Izolacja RNA z kriosekcji zbiorczych

  1. Ekstrakcja RNA
    1. Przenieś probówkę (probówki) z połączonymi kriosekcjami do lodu. Natychmiast dodać odczynnik do ekstrakcji organicznego RNA w proporcji około 1 ml odczynnika na 50 mg masy kriosekcji, zwykle 600 μl na probówkę.
      ostrożność: Odczynniki izolujące RNA są toksyczne, i drażniące. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapewnić bezpieczną obsługę.
    2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 18 wciągnij płyn do ekstrakcji RNA i przepłucz ścianki probówki, aż cała tkanka zostanie zawieszona w roztworze. Staraj się zminimalizować pęcherzyki powietrza podczas homogenizacji igły.
    3. Użyj końcówki igły, aby zetrzeć i rozproszyć wszelkie zbrylone kriosekcje i kawałki przylegające do ścianki probówki. Rozcierać w celu homogenizacji, przepuszczając próbkę w górę iw dół przez igłę przez pięć pociągnięć, a następnie zwrócić próbkę do lodu. Powtórz oba kroki od trzech do pięciu razy lub tyle razy, ile jest to konieczne, aby rozbić wszystkie grudki i łatwo przepuścić próbkę przez igłę.
    4. Usuń igłę o rozmiarze 18 i zastąp ją igłą o rozmiarze 22. Ostrożnie rozcierać próbkę przez pięć pociągnięć, a następnie umieścić próbkę z powrotem w lodzie. Powtórzyć rozcieranie trzy do czterech razy, aby uzyskać bardzo drobno zdyspergowany homogenat tkankowy.
      UWAGA: Jeśli cząstki tkanki zaczną blokować igłę podczas pobierania próbki, usuń całą próbkę ze strzykawki i przełącz się z powrotem na igłę o rozmiarze 18 w celu dalszej homogenizacji. Aby uzyskać maksymalną wydajność, można dodać dodatkowy etap tarcia za pomocą igły o rozmiarze 25 lub 26. Jednak igła może się zatkać, więc istnieje ryzyko rozlania próbki.
    5. Przenieść próbkę z lodu do temperatury pokojowej. Inkubować przez 5 minut, aby rozbić kompleksy molekularne.
    6. W dygestorium dodać 0,1 ml 1-bromo-3-chloropentanu (BCP) na 1 ml użytego odczynnika do izolacji RNA (krok 3.1.1), zwykle 60 μl na probówkę. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 15 sekund (nie wirować). Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 2 do 3 minut. Następnie wirować przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C.
      ostrożność: BCP jest łatwopalny i toksyczny. Trzymaj się dygestorium i załóż rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
    7. Ostrożnie zbierz górną fazę wodną (bezbarwną) zawierającą RNA i przenieś ją do czystej probówki. Dodaj równą objętość 70% etanolu (w wodzie DEPC) i wiruj do mieszania. Inkubować w temperaturze pokojowej do 10 min.
      UWAGA: środkowa faza interfazowa i dolna faza fenolu-BCP mogą być przetwarzane odpowiednio na genomowe DNA i białko, zgodnie z instrukcjami producenta lub zbierane w pojemniku na odpady niebezpieczne fenol-BCP w celu odpowiedniego usunięcia.
  2. Oczyszczanie RNA.
    1. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wiązania, przemywania i elucji próbki z niewielkimi zmianami8. Na przykład:
    2. Umieścić porcję wody wolnej od DNaz/RNaz w łaźni lub inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu wstępnego ogrzania zgodnie z krokiem 3.2.4.
    3. Dodać próbkę RNA z ppkt 3.1.8 powyżej do kolumny oczyszczającej i odwirowywać próbkę przez 15 sekund przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej. Wlej przepływ z powrotem do tej samej kolumny i ponownie odwiruj. Powtórz jeszcze jeden raz, aby zmaksymalizować wiązanie RNA, a następnie odrzuć końcowy przepływ.
    4. Czynności prania należy wykonywać zgodnie z instrukcjami producenta8. Nanieść 700 μl buforu do przemywania (bez etanolu) na kolumnę, wirować przez 15 sekund przy 12 000 x g i odlać przepływ.
    5. Dodać 500 μl buforu do przemywania (z etanolem) do kolumny, wirować przez 15 sekund przy 12 000 x g i odrzucić przepływ. Powtórz ten krok jeden raz.
    6. Wiruj pustą kolumnę przez 1 minutę przy 12 000 x g, aby wysuszyć membranę.
    7. Przenieś kolumnę wirową do czystej probówki wolnej od RNaz i DNaz. Dodać 40 μl wstępnie podgrzanej wody wolnej od DNaz/RNaz (z 3.2.1) do środka membrany kolumny. W temperaturze pokojowej inkubować przez 2 minuty, a następnie wirować przez 2 minuty przy 12 000 x g.
      UWAGA: Objętość elucji 40 μl wynosi około 1,3 μl na mg oryginalnej tkanki na 30 mg połączonych kriosekcji. Dostosuj objętość elucji odpowiednio do różnych początkowych mas tkanek, ale nie należy zmniejszać poniżej 32 μl. Druga elucja, przy użyciu około 0,7 μl na mg oryginalnej tkanki, może być dodana w celu zwiększenia całkowitej wydajności RNA.
    8. Przeanalizować RNA (elucję kolumnową) pod kątem stężenia i czystości za pomocą spektrofotometru, elektroforezy i/lub bioanalizatora. Przechowuj RNA w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie on potrzebny do dalszych zastosowań, takich jak odwrotna transkrypcja dla ilościowego PCR4.
      UWAGA: Przed użyciem RNA w dalszych zastosowaniach zaleca się leczenie DNazą. Zabieg ten można przeprowadzić na niektórych kolumnach oczyszczających RNA przed etapem płukania, w tym konkretnym momencie po elucji kolumny lub na podwielokrotności RNA jako pierwszy krok w dowolnym dalszym zastosowaniu. RNA powinno być stabilne przez kilka lat.

4. Analiza histologiczna za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego kriosekcji mięśni

  1. Prosty protokół immunofluorescencyjny.
    1. Użyj pisaka hydrofobowego, aby zakreślić grupę sekcji na każdym slajdzie. Delikatnie wrzuć PBS do zakreślonego obszaru (około 80 μl dla małej powierzchni do 500 μl dla dużej powierzchni), uważając, aby nie dotknąć tkanek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W przypadku korzystania z zamrożonych szkiełek wyjmij szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 do 30 minut w celu rozmrożenia i wyschnięcia, a następnie postępuj jak powyżej. Potrzebne są co najmniej dwa preparaty: jeden szkiełko doświadczalne do inkubacji w przeciwciałie pierwszorzędowym i drugorzędowym; i jeden szkiełko kontrolne, dla którego wykluczone jest przeciwciało pierwszorzędowe, kontrola "tylko wtórna".
    2. Przechyl szkiełko, aby wylać PBS. Dodaj 5% surowicy osła w PBS (roztwór blokujący) do zakreślonego obszaru; Uważaj, aby sekcje mięśniowe nie wyschły. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut (lub do kilku godzin w komorze wilgotnościowej).
    3. Przygotuj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, aby przeanalizować regenerację mięśni. Wymieszaj roztwór blokujący z przeciwciałem eMHC (1:40) i przeciwciałem ColVI (1:1,000). Przygotuj około 150 μl, 300 μl lub 500 μl odpowiednio dla małych, średnich lub dużych powierzchni szkiełkowych. Wirować przez 5 sekund, a następnie wirować przez 2 minuty przy 15 000 x g, aby osad był granulowany.
    4. W przypadku szkiełek doświadczalnych przechylić szkiełko, aby wylać roztwór blokujący, a następnie dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z ppkt 4.1.3. W przypadku wtórnego szkiełka kontrolnego przechylić szkiełko, aby wylać roztwór blokujący, a następnie dodać świeży roztwór blokujący (bez przeciwciał). Szkiełka inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Podczas pipetowania roztworów przeciwciał na szkiełka podstawowe zawsze wyciągaj płyn z górnej części probówki z pierwotnym roztworem przeciwciała, nie przerywaj osadu na dnie probówki.
    5. Końcówka przesuwa się, aby wylać roztwór. Dodaj PBS kroplami do zakreślonego obszaru każdego szkiełka do umycia, końcówkę do wylania, a następnie dodaj więcej PBS i inkubuj przez 3 do 5 minut. Powtórz w sumie trzy prania.
      UWAGA: Czas prania jest dość elastyczny i w razie potrzeby można go wydłużyć do 20 minut. Ogólnie rzecz biorąc, liczba zmian w rozwiązaniu jest ważniejsza niż czas.
    6. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych dla wszystkich szkiełek (w tym szkiełka kontrolnego wtórnego) przy użyciu rozcieńczenia 1:500 czerwonych i zielonych przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem w celu wykrycia mysich IgG1 (eMHC) i króliczych IgG (ColVI) oraz rozcieńczenia 1:10 000 barwienia jądrowego DAPI.
      1. Na przykład zmieszaj 1 μl DAPI z 9 μl ddH2O, aby uzyskać rozcieńczenie DAPI w stosunku 1:10. Następnie, aby uzyskać końcową objętość 500 μl, dodaj 1,0 μl anty-mysiej IgG1-czerwonej + 1,0 μl anty-króliczej IgG-zielonej + 0,5 μl 1:10 DAPI do 447,5 μl roztworu blokującego. Wirować do mieszania i wirowania przez 2 minuty przy 15 000 x g, aby osad był granulowany.
        UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby wszystkie przeciwciała drugorzędowe pochodziły od tego samego gatunku gospodarza.
    7. Przechyl szkiełka, aby wylać ostatnie pranie PBS. Dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciała, aby pokryć wszystkie tkanki. Przykryj szkiełka, aby chronić je przed światłem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      UWAGA: Wszystkie przeciwciała drugorzędowe powinny zostać zwalidowane pod kątem minimalnej reaktywności krzyżowej z innymi gatunkami w eksperymentach z podwójnym znakowaniem.
    8. Umyć szkiełka podstawowe zgodnie z opisem w ppkt 4.1.5. Po ostatnim praniu przechyl szkiełko, aby wylać PBS i umieść szkiełko na chusteczce. Dodaj 3 do 4 kropli wodnego podłoża montażowego po jednej stronie.
    9. Ustaw krawędź szklanego szkiełka nakrywkowego tylko do zewnętrznej krawędzi nośnika montażowego. Za pomocą kleszczy powoli opuść szkiełko nakrywkowe w kierunku tkanek, a następnie zwolnij szkiełko nakrywkowe i delikatnie wklep je na miejsce. Na koniec delikatnie dociśnij każdy róg szkiełka nakrywkowego, aby go ustabilizować.
    10. Chronić szkiełka przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania nałóż cienką warstwę lakieru do paznokci wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec wysychaniu szkiełka.
  2. Ocena histologiczna.
    1. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego z odpowiednimi filtrami do wykrywania eMHC (czerwony); ColVI (zielony); i jądra barwione DAPI (niebieskie), zwykle przy użyciu obiektywu 20X1,5.
    2. Upewnij się, że sygnał fluorescencyjny z szkiełek doświadczalnych różni się od wtórnego szkiełka kontrolnego, aby zademonstrować specyficzność wykrywania eMHC i ColVI4.
      UWAGA: włókna regenerujące eMHC powinny być widoczne od około 2 do 7 dni po urazie mięśni i nieznacznie u myszy z dystrofią mięśniową. Kolagen VI jest obecny w macierzy zewnątrzkomórkowej otaczającej włókna mięśniowe, naczynia krwionośne i nerwy oraz w większych wiązkach tkanki łącznej około- i epimysium. Barwienie jądrowe DAPI jest przydatne do identyfikacji włókien mięśniowych z jądrami centralnymi w porównaniu z jądrami obwodowymi, co wskazuje na regenerację włókien i obecność komórek naciekających. Martwicze lub uszkodzone włókna mogą słabo barwić się mysim przeciwciałem wtórnym IgG z powodu wykrycia endogennej IgG, która przenika do włókien przez uszkodzone błony mięśniowe.
    3. Aby określić ilościowo regenerację, należy wykonać nakładające się na siebie zdjęcia mikroskopowe z każdym filtrem fluorescencyjnym na całym obrazie. Scal obrazy eMHC, ColVI i DAPI dla każdej lokalizacji, a następnie wyrównaj obrazy, aby zrekonstruować mapę całego odcinka1,5.
    4. Korzystając z oprogramowania analitycznego, policz liczbę włókien dodatnich eMHC i liczbę wszystkich włókien, aby obliczyć ostatnią regenerację (100*(# włókna eMHC+/# całkowita liczba włókien)). Należy również policzyć liczbę włókien jądrkowanych centralnie spośród wszystkich włókien, aby zmierzyć regenerację w dłuższym okresie czasu (100*(# włókna CN+/# włókna ogółem))1,5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

RNA z krioprzekrojów mięśni charakteryzuje się wysoką jakością i zapewnia wydajność wystarczającą dla większości zastosowań

Analizy szesnastu preparatów RNA z mięśni szkieletowych przedstawiono w Tabeli 1, wykorzystując od 19,4 do 41 mg połączonego mięśnia piszczelowego przedniego (TA) od 8 myszy kontrolnych. Zarówno lewy (L), jak i prawy (R) mięsień TA zostały przygotowane w eksperymentach nad regeneracją, w który...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby osiągnąć najlepsze wyniki tą metodą, podczas kriokonserwacji tkanek należy ograniczać żywicę do dolnej jednej trzeciej lub połowy mięśnia, ponieważ nadmiar żywicy spowolni zbieranie połączonych kriosekcji i może zwiększyć zanieczyszczenie żywicą zatapiającą się w izolacji RNA. Ważna jest również szczególna uwaga podczas homogenizacji igieł, aby zmaksymalizować wydajność i zminimalizować prawdopodobieństwo zatkania igły. Protokół może być modyfikowany za pomocą strzykawki Luer-Lok w celu ochrony przed utratą próbki, j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre i Junna Luan zapewnili pomoc techniczną. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer AR065077. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponosi autor i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KorekVWR Scientific23420-708Pokrój na małe kwadraty ostrym ostrzem.
Szkiełko nakrywkowe z tworzywa sztucznegoFisher Scientific12-547Służy do orientacji mięśni podczas zamrażania.
Termometr niskotemperaturowyVWR Scientific89370-158
2-metylobutanSigmaM32631-4LUwaga: niebezpieczna substancja chemiczna. Przechowywać w łatwopalnej szafce.
Żywica do zatapiania: "cryomatrix"Thermo Fisher Scientific6769006Cryomatrix można zastąpić innymi żywicami do zatapiania.
CryostatThermo Fisher Scientificmicrom HM550 z jednorazowym nośnikiem ostrzyKażdy działający kriostat powinien być wystarczający do przestrzegania protokołu.
Jednorazowe ostrze do kriostatuThermo Fisher Scientific 3052835Użyj odpowiedniego ostrza lub noża do kriostatu, który ma być używany.
Roztwór do odkażania RNAza: "RNase Zap"Thermo Fisher ScientificAM9780
Waga analitycznaMettler ToledoXS64
Pędzelmalarski Daler Rowney214900920Służy do obsługi kriosekcji. Można go znaleźć w sklepach z prostymi artykułami plastycznymi.
ŻyletkaVWR Scientific55411-050
Szkiełko mikroskopoweOdczynnik do
TRIzolThermo Fisher Scientific15596026Uwaga: TRIzol jest niebezpieczną substancją chemiczną. Uwaga: Do ekstrakcji RNA z mięśni szkieletowych zalecane są wyłącznie odczynniki do ekstrakcji organicznej.
Igła o rozmiarze 18 VWRScientificBD305185
Igła o rozmiarze 22 IgłaVWR ScientificBD305155
Igła o rozmiarze 26VWR ScientificBD305115Opcjonalnie. Może być stosowany do trzeciej rundy trituracji próbki w protokole ekstrakcji RNA.
Strzykawka 1 mlVWR Scientific BD309659W przypadku próbek o bardzo wysokiej wartości zalecana jest strzykawka Luer-Lok (np. , VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentan (BCP)SigmaB9673
Do 70% etanolu w wodzie DEPC: 200-procentowy alkoholDecon Laboratories, Inc.+M18027161MWymieszaj 35 ml 200 proof alkoholu + 15 ml wody DEPC. 
Dla 70% etanolu w wodzie DEPC: woda uzdatniona DEPCThermo Fisher ScientificAM9922Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 ml DEPC water.
Zestaw do oczyszczania RNA: Minizestaw PureLink RNAThermo Fisher Scientific12183018AKońcowe etapy przygotowania RNA.
Woda wolna od DNaz/Rnaz Można również użyć wody uzdatnionej przezGibco10977
Spektrofotometr: Nanodrop 2000Thermo Fisher ScientificNanoDrop 2000
Dnase IThermo Fisher ScientificAM2222Poddaj oczyszczone RNA działaniu w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń DNA przed ich zastosowaniem.
Długopis hydrofobowyThermo Fisher Scientific8899
Dulbecco's PBSGibco14190PBS do protokołu immunofluorescencji.
Surowica osłaJackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121Uwodnić normalną surowicę osła zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie rozcieńczyć podwielokrotność do 5% w celu uzyskania immunofluorescencji. Można również użyć normalnej koziej surowicy.
Przeciwciało eMHCUniversity of Iowa Developmental Studies Hybridoma BankF1.652
Przeciwciało Collagen VIFitzgerald Industries#70R-CR009x
Osioł anty-królik AlexaFluor488Thermo Fisher ScientificA21206
Koza anty-mysia IgG1 AlexaFluor546Thermo Fisher ScientificA21123
DAPI (4',6- diamidino-2-fenyloindol)Thermo Fisher ScientificD1306
Wodne media montażowe: PermafluorThermo Fisher ScientificTA-030-FMUżywaj wyłącznie mediów montażowych przeznaczonych do zastosowań fluorescencyjnych o właściwościach zapobiegających blaknięciu.
Szkiełko nakrywkoweszklane VWR Scientific16004-314Służy do montażu szkiełek na końcu protokołu immunofluorescencji
Oprogramowanie do analizy obrazu: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express lub bardziej zaawansowane produktyFreeware ImageJ powinny również działać do ręcznego liczenia. Bardziej zaawansowane oprogramowanie z możliwością segmentacji może pozwolić na częściową automatyzację procesu; np. , ImageProPremier.
Scalanie i mapowanie obrazów sekcji: PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659 został wycofany. Inne opcje dla kardiotoksyny to EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; lub Ge Script # RP17303; Nie zostały one jednak potwierdzone.
zestaw do odwrotnej transkrypcji: System syntezy pierwszej nici w indeksie górnym IIIThermo Fisher Scientific18080051Można stosować dowolne zwalidowane, wysokiej jakości odczynniki do odwrotnej transkrypcji.
Standardowy PCR: System polimerazy GoTaq FlexiPromegaM8298Można zastosować dowolny zwalidowany, wysokiej jakości system polimerazy Taq. Jeśli sekwencjonowanie DNA ma być stosowane do jakiegokolwiek zastosowania po PCR, należy zamiast tego użyć systemu PCR o wysokiej wierności.
SYBR greenThermo Fisher ScientificS7585Do stosowania w qPCR, gdy nie używa się dedykowanej mieszanki qPCR master. Stosować z SuperROX (do instrumentów Applied Biosystems) oraz polimerazą i GoTaq Flexi.
ROX: SuperROX, 15 mMBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROX jest bardziej stabilny w reakcji PCR, dlatego jest preferowany do stosowania jako pasywny barwnik referencyjny qPCR zamiast ROX (karboksy-X-rodamina). Do qPCR z instrumentami Applied Biosystems
PCR w czasie rzeczywistymApplied Biosystems7900HT
ekstrakcji organicznej RNA 48311600 VWR: DEPC.

Bibliografia

  1. Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
  2. Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
  3. Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
  4. Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
  5. Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20(2016).
  6. AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx 1-102 (2013).
  7. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
  8. Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211(2010).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).
  10. Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
  11. Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
  12. Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
  13. Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).
  14. Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
  15. Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
  16. Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
  17. Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
  18. Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja RNAanaliza histologicznahomogenizacja tkanekhomogenizacja ig owapo czone skrawki mro onemi sie piszczelowy przedni myszysekcjonowanie tkanek

Powiązane artykuły