Zastosowanie techniki miękkiego nakładki agarowej do badań przesiewowych pod kątem związków hamujących wytwarzanych przez bakterie

Podsumowanie

Opisujemy prostą metodę badania kultur bakteryjnych pod kątem produkcji związków hamujących inne bakterie.

Streszczenie

Technika nakładania miękkiego agaru została pierwotnie opracowana ponad 70 lat temu i była szeroko stosowana w kilku obszarach badań mikrobiologicznych, w tym w pracy z bakteriofagami i bakteriocynami, białkowymi środkami przeciwbakteryjnymi. Takie podejście jest stosunkowo niedrogie, przy minimalnym zapotrzebowaniu na zasoby. Technika ta polega na nakrapianiu supernatantu ze szczepu dawcy (potencjalnie zawierającego toksyczny związek) na zestaloną miękką nakładkę agarową, która jest zasiana testowym szczepem bakteryjnym (potencjalnie wrażliwym na toksyczny związek). Wykorzystaliśmy tę technikę do przesiewania biblioteki szczepów Pseudomonas syringae pod kątem zabijania wewnątrzgatunkowego. Łącząc to podejście z etapem wytrącania i celowanymi delecjami genów, można różnicować wiele toksycznych związków wytwarzanych przez ten sam szczep. Dwa czynniki antagonistyczne powszechnie wykrywane przy użyciu tej techniki to bakteriofagi i bakteriocyny. Te dwa czynniki można rozróżnić za pomocą dwóch prostych testów dodatkowych. Przeprowadzanie seryjnego rozcieńczania supernatantu zawierającego bakteriofaga spowoduje, że liczba pojedynczych blaszek stanie się mniejsza przy większym rozcieńczeniu, podczas gdy seryjne rozcieńczenie supernatantu zawierającego bakteriocynę spowoduje powstanie strefy oczyszczania, która staje się jednolicie bardziej mętna przy większym rozcieńczeniu. Dodatkowo, bakteriofag wytworzy strefę oczyszczania, gdy zostanie zauważony na świeżej miękkiej nakładce agarowej wysianej tym samym szczepem, podczas gdy bakteriocyna nie wytworzy strefy oczyszczania po przeniesieniu na świeży miękki trawnik agarowy, ze względu na rozcieńczenie bakteriocyny.

Wprowadzenie

Ostatnio pojawiło się duże zainteresowanie pogłębieniem naszego zrozumienia ekologii mikrobiologicznej (szczególnie mikrobiomów różnych środowisk), a także nowych związków przeciwbakteryjnych do wykorzystania w zwalczaniu patogenów opornych na antybiotyki^1,2. Tematem łączącym te zainteresowania jest zrozumienie antagonistycznych interakcji między szczepami bakterii w ich naturalnym środowisku. Istnieje wiele sposobów, w jakie bakterie antagonizują konkurentów³. Bakteriocyny, zróżnicowana grupa białkowych, przeciwbakteryjnych związków, od dawna są badane pod kątem ich roli w pośredniczeniu w antagonizmie międzybakteryjnym, przy czym dwa z najczęściej badanych gatunków to Pseudomonas aeruginosa^4,5 i Escherichia coli⁶, ważne patogeny dla ludzi. Oprócz bakteriocyn, indukowane profagi mogą również działać jako czynniki antykonkurencyjne, umożliwiając szczepowi inwazję w niszę, która jest już skolonizowana⁷. Pseudomonas syringae jest patogenem roślinnym, o którym wiadomo, że wytwarza szereg środków przeciwdrobnoustrojowych, w tym bakteriocyny jednobiałkowe⁸ , bakteriocyny pochodzące z ogona bakteriofaga⁹ (zwane tailocynami), a także niebiałkowe metabolity wtórne¹⁰. Ostatnio pojawiło się zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób te środki przeciwdrobnoustrojowe wpływają na ekologię tego organizmu, a także w jaki sposób można je wykorzystać do zwalczania chorób roślin¹¹.

Powszechnie stosowaną metodą badania zarówno bakteriocyn, jak i bakteriofagów jest technika nakładania miękkiego agaru. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Gratię w 1936 roku, aby pomóc w zliczeniu bakteriofagów^12,13.

Tutaj opisujemy zastosowanie metody miękkiego agaru, w połączeniu z ukierunkowaną manipulacją genetyczną i wytrącaniem glikolu polietylenowego (PEG), w rozróżnianiu trzech różnych środków przeciwdrobnoustrojowych (bakteriofag, bakteriocyna o wysokiej masie cząsteczkowej i bakteriocyna o niskiej masie cząsteczkowej) wytwarzanych przez pojedynczy szczep bakterii. Zaletą tego podejścia jest to, że jest ono stosunkowo proste i tanie, dlatego pomimo tego, że jest zdecydowanie "low-tech", nadal jest szeroko stosowane.

Protokół

1. Przygotowanie supernatantu do badania aktywności

1. Przygotować roztwór podstawowy mitomycyny C o stężeniu 0,5 mg/ml, rozpuszczając odpowiednią ilość w sterylnym buforze 0,1 M_MgSO4 (np. 1 mg mitomycyny C/2 ml buforu). Przechowywać bulion w temperaturze 4 °C w pojemniku zabezpieczonym przed światłem (mitomycyna C jest wrażliwa na światło).
2. Zaszczepić pojedynczą kolonię P. syringae w 3 ml bulionu King's Medium B (KB)¹⁴. Inkubować przez noc z wytrząsaniem (200 obr./min) w temperaturze pokojowej (21-25 °C).
3. Następnego ranka rozcieńczyć kulturę bulionową w proporcji 1/100 w 3 ml świeżego bulionu KB. Inkubować przez 3-4 godziny z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej. Dodać mitomycynę C (0,5 μg/ml, stężenie końcowe). Inkubuj kulturę przez noc, wstrząsając w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Mitomicyna C powoduje dwuniciowe pęknięcia DNA, stymulując w ten sposób odpowiedź SOS komórki, prowadząc do produkcji zarówno bakteriofagów, jak i bakteriocyn.
4. Osad 1-2 ml kultur indukowanych mitomycyną C przez odwirowanie przy 20 000 x g przez 5 minut w mikrowirówce stołowej.
5. Usunąć i wysterylizować supernatanty hodowlane, przepuszczając supernatant przez filtr o wielkości porów 0,22 μm lub traktując supernatant chloroformem (100 μl chloroformu na 1 ml supernatantu).
   1. Jeśli używasz chloroformu, mieszaj mieszaninę przez 15 sekund i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po inkubacji odwirować mieszaninę przy 20 000 x g przez 5 min.
      UWAGA: Chloroform skutecznie zabija komórki poprzez solubilizację ich błon. Zaletą stosowania chloroformu w porównaniu ze sterylizacją filtrów jest to, że jest ona tańsza i łatwiejsza do zwiększenia w przypadku przetwarzania wielu (>20) próbek jednocześnie. Może istnieć możliwość, że dana czynność zabijania zostaje utracona w wyniku poddania działaniu chloroformu w wyniku podziału na fazę organiczną.
   2. Usunąć górną, wodną fazę za pomocą pipety o pojemności 1 ml do świeżej, sterylnej probówki o pojemności 1,5 lub 2,0 ml. Należy uważać, aby nie przenieść żadnej dolnej warstwy chloroformu (lepiej jest usunąć mniej fazy wodnej, aby uniknąć przeniesienia).
   3. Przenieść przeniesiony supernatant bez korka w dygestorium, aby umożliwić odparowanie pozostałości chloroformu (kilka godzin). Przechowywać supernatanty w temperaturze 4 °C.

2. Separacja i koncentracja związków bakteriobójczych o dużej masie cząsteczkowej przez wytrącanie glikolu polietylenowego (PEG)

1. Do sterylnego supernatantu dodać NaCl i PEG 8000 odpowiednio do 1 M i 10% stężeń końcowych. Kilkakrotnie odwracać próbkę, aż zarówno NaCl, jak i PEG całkowicie się rozpuszczą. Próbki należy inkubować w łaźni lodowej przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki wirówkowej powinien uformować się osad. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w żądanej objętości (np. 1/10 lub 1/100 pierwotnej objętości supernatantu) buforu (10 mM Tris, 10 mM_MgSO4, pH 7,0) przez wielokrotne pipetowanie.
3. Usunąć resztki PEG przez dwie sekwencyjne ekstrakcje równą objętością chloroformu.
   1. Połączyć chloroform z zawieszonym osadem i wirować przez 10 do 15 sekund, a następnie odwirować mieszaninę przy 20 000 x g przez 5 minut. Przenieś górną, wodną fazę do świeżej probówki do mikrofuge. Powtarzaj tę ekstrakcję, aż nie będzie widoczna biała granica między fazą wodną a organiczną (zwykle łącznie 2 ekstrakcje). Pozostawić resztki chloroformu do odparowania z wyekstrahowanych supernatantów w dygestorium.

3. Przygotowanie nakładki i testowanie supernatantów do aktywności

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu P. syringae w celu zbadania wrażliwości w 3 ml KB, inkubować przez noc z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
2. Następnego ranka ponownie rozcieńczyć kulturę w proporcji 1/100 do świeżego KB. Inkubować 3-4 godziny z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej.
3. Przygotuj wysterylizowany agar wodny przez autoklawowanie zawiesiny 0,35-0,7% (w/v) agaru w ultraczystej wodzie.
   UWAGA: Zapas agaru z miękką wodą można stopić w kuchence mikrofalowej i wielokrotnie używać, świeża nakładka nie musi być przygotowywana do każdego eksperymentu. Jeśli agar wodny jest ponownie używany, bardzo ważne jest, aby upewnić się, że jest całkowicie stopiony po podgrzaniu w kuchence mikrofalowej. Jeśli nie, nakładka będzie miała ziarnistą teksturę po zestaleniu, co utrudni interpretację. Jeśli tak się stanie, topić agar w kuchence mikrofalowej przez kilka minut dłużej niż wcześniej.
4. Przed użyciem należy przechowywać stopiony miękki agar w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść 3 ml miękkiego agaru do sterylnej probówki hodowlanej. Umieść probówkę hodowlaną w łaźni wodnej, aby utrzymać ją w stanie stopionym.
5. Aby wlać nakładkę, najpierw pozwól stopionemu agarowi ostygnąć (powinien być ciepły, ale nie gorący w dotyku), ale nie pozwól mu zastygnąć.
6. W sterylnym kapturze zaszczepij 100 μl kultury szczepu testera do miękkiego agaru i zwiruj w celu wymieszania. Obracaj kulturę ręcznie przez 10-15 sekund, a następnie wylej na dolny agar (agar KB). Przechyl płytkę we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że miękki agar równomiernie pokrywa dolny agar.
   UWAGA: Dolny agar może być dowolnym zestalonym (1,5% agarem) podłożem, na którym szczep testowy rośnie energicznie. W przypadku standardowej szalki Petriego o średnicy 100 mm użyj ~20 ml stopionej pożywki. Dolny agar można przygotować z kilkutygodniowym wyprzedzeniem (jeśli utrzymuje się go w temperaturze 4 °C bez suszenia) lub można go przygotować tego samego dnia. Jeśli zostanie przygotowana tego samego dnia, w którym wykonana jest nakładka, najlepiej zrobić to przed wykonaniem kroku 3.4.
7. Przykryj płytkę i pozwól jej zastygnąć na 20-30 minut. Uważaj, aby nie naruszyć płytki podczas krzepnięcia.
8. Po zestaleniu naniec 2-5 μl supernatantu (wygenerowanego w sekcjach 1 i 2 powyżej) na nakładkę. Pozostawić płytki do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Obserwuj i zapisuj wyniki następnego dnia rano.
   UWAGA: Może być użyteczne wykonanie i wykrycie na podstawie seryjnego rozcieńczenia supernatantu. Umożliwi to naukowcom rozróżnienie między działaniem bakteriofagów a usuwaniem bakteriocyny. W takim przypadku zaleca się wykonanie rozcieńczeń 1:5 lub 1:10.

Wyniki

Połączenie metody nakładania miękkiego agaru oraz wytrącania PEG może być wykorzystane do identyfikacji i charakterystyki różnych czynników przeciwdrobnoustrojowych produkowanych przez ten sam szczep. Rysunek 1 przedstawia dwa szczepy P. syringae (A i B), których wzrost jest hamowany przez trzeci szczep tego samego gatunku. Te dwa szczepy są jednak hamowane przez różne bakteriocyny. Strefa zahamowania wzrostu szczepu A wykazuje ostrą krawędź, podczas gdy strefa zahamowania szczepu B jest większa i posiada rozmazaną krawędź. Manipulacje genetyczne w szczepie produkującym, które specyficznie dezaktywują albo tailocynę (brak tailocyny), albo bakteriocynę o niskiej masie cząsteczkowej (brak bakteriocyny), potwierdzają, że szczepy A i B są wrażliwe na odrębne bakteriocyny. Rysunek 2 pokazuje, że zabijanie pośredniczone przez bakteriofagi można odróżnić od innych niereplikujących się czynników przeciwdrobnoustrojowych poprzez porównanie serii rozcieńczeń. Ponieważ zarówno bakteriocyny, jak i profagi mogą być indukowane traktowaniem mitomycyną C, działanie tych dwóch czynników może być do siebie bardzo zbliżone (szczególnie jeśli aktywowany fage jest liczny). W przypadku oczyszczania pośredniczonego przez bakteriofagi, rozcieńczenie supernatantu doprowadzi do powstania pojedynczych plaków (stref przejaśnienia), podczas gdy oczyszczanie pośredniczone przez bakteriocyny nie doprowadzi do powstania takich plaków.

Rysunek 1: Fenotypowe rozróżnianie wielu czynników przeciwdrobnoustrojowych produkowanych przez ten sam szczep. Szczep A jest wrażliwy na bakteriocynę o wysokiej masie cząsteczkowej (tailocynę), ale nie na alternatywną bakteriocynę o niskiej masie cząsteczkowej, o czym świadczy brak strefy zahamowania wzrostu w przypadku szczepu pozbawionego tailocyny, przy jednoczesnym wystąpieniu tej strefy dla szczepu pozbawionego bakteriocyny. Odwrotnie, szczep B jest niewrażliwy na tailocynę, lecz wrażliwy na bakteriocynę o niskiej masie cząsteczkowej. Tailocyna jest skutecznie odzyskiwana po wytrącaniu PEG, podczas gdy bakteriocyny o niższej masie cząsteczkowej nie są. WT = typ dziki. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Różnice między niemultiplikującymi środkami przeciwdrobnowymi a bakteriofagami. (A) Rozcieńczenie wysokiego miana bakteriofagów prowadzi do powstania pojedynczych plaków, które stają się mniej liczne (wysokie miano na górze, niskie miano na dole). (BRozcieńczanie bakteriocyn prowadzi do jednorodnie mniejszego przejaśnienia, które nie rozdziela się na pojedyncze placki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisana tutaj technika nakładania miękkiego agaru jest szeroko stosowana od wielu dziesięcioleci przez badaczy zainteresowanych bakteriofagami lub bakteriocynami. Główną zaletą tego podejścia jest to, że jest proste, tanie i stosunkowo łatwe w interpretacji. Łącząc nakładkę z miękkim agarem z wytrącaniem PEG i seryjnym rozcieńczaniem, środki przeciwdrobnoustrojowe można podzielić na środki o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej oraz środki replikacyjne i niereplikacyjne (tj. odpowiednio bakteriofag i tailocyna). Wreszcie, włączenie ukierunkowanej manipulacji genetycznej (delecji i komplementacji) przypuszczalnych loci bakteriocyny lub profagów może mocno ustalić tożsamość danego antagonistycznego związku. Niedawno zastosowaliśmy tę metodę do opisania nowej bakteriocyny pochodzącej z bakteriofagów, rozpowszechnionej wśród szczepów Pseudomonas syringae ⁹.

Pożywki wzrostowe i warunki wskazane w tym protokole działają dobrze w przypadku Pseudomonas syringae i prawdopodobnie wystarczą dla innych bakterii Gram-ujemnych, które rosną energicznie w tych warunkach. Jednak naukowcy korzystający z tej metody będą chcieli zoptymalizować czas, pożywkę hodowlaną, metodę indukcji i temperaturę inkubacji dla swojego systemu. Parametry krytyczne obejmują indukcję kultury produkcyjnej w fazie wzrostu logarytmicznego, a także wysiewanie miękkiej nakładki agarowej wystarczającą kulturą w fazie logarytmicznej, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie bakterii, ale nie nadmierną hodowlę, która zasłania potencjalne strefy oczyszczania. Istnieje wiele bakteriocyn, które nie są indukowane w ramach odpowiedzi SOS, ale raczej są indukowane przez systemy quorum sensing oparte na peptydach (w szczególności bakteriocyny Gram-dodatnie¹⁵), dlatego badacz może chcieć przebadać kilka różnych metod indukcji (takich jak modyfikacja zawartości składników odżywczych w pożywce indukującej lub umożliwienie przedłużonej inkubacji szczepu produkcyjnego).

W przypadku stosowania tej techniki, miękka nakładka agarowa musi być dokładnie stopiona i utrzymywana w temperaturze 55-60 °C przed dodaniem szczepu siewnego. Przeprowadziliśmy kilka eksperymentów, w których miękki agar nie został dokładnie stopiony (choć wizualnie wydawało się, że jest) i zaowocował nałożeniem o ziarnistym wyglądzie. Wyniki z ziarnistej nakładki mogą być nadal ogólnie interpretowane, jednak zależy to od siły hamowania (słabsze hamowanie będzie trudniejsze do zaobserwowania). Ostatnią, mylącą zmienną, którą należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tej techniki, jest to, że temperatura stopionego agaru ma wystarczająco dużo czasu na ostygnięcie przed inokulacją szczepem wysiewającym, aby uniknąć zabicia szczepu wysiewającego. Aby uniknąć tego problemu, upewniamy się, że miękki agar jest ciepły, ale nie gorący w dotyku. Idąc tym tropem, zaobserwowaliśmy również, że jeśli damy kulturze siewnej niewystarczająco dużo czasu na zaaklimatyzowanie się w stopionym agarze, przed wylaniem nakładki, odzyskujemy ogólnie słaby wzrost bakterii, co sprawia, że interpretacja specyficznego zahamowania jest trudna lub niemożliwa do zinterpretowania. Dlatego pozwalamy na 10-15 dodatkowych sekund inkubacji między wirowaniem a nalewaniem nakładki. Kompromis między utrzymaniem agaru w stanie całkowicie stopionym (cieplejszy jest lepszy), ale nie śmiertelny dla szczepu siewnego (cieplejszy nie jest lepszy) jest prawdopodobnie musiał zostać określony przez badacza metodą prób i błędów.

Jeżeli stosuje się etap wytrącania PEG, korzystne byłoby włączenie kontroli ujemnej, w której sterylne podłoże bulionowe jest przetwarzane identycznie jak supernatant hodowlany. Zapewni to, że aktywność uśmiercająca nie jest wynikiem pozostałości PEG lub chloroformu w supernatancie próbki.

Ponieważ zarówno bakteriofagi, jak i bakteriocyny są zwykle wysoce specyficzne, nierzadko nie spotyka się widocznej aktywności zabijającej przy danej kombinacji szczepów. Może to wynikać z różnych mechanizmów oporności specyficznych dla szczepu, z których jednym jest to, że szczep testowy albo nie ma, albo ma nierozpoznaną wersję receptora potrzebnego do celowania przez daną bakteriocynę lub bakteriofaga.

Alternatywna metoda, metoda przesiewowa bakteriocyny, została opisana przez Kawai i wsp., ale ma wady i nie została powszechnie przyjęta¹⁶. W szczególności technika ta wymaga obserwacji próbek bulionu w odstępach czasu, które mogą być uciążliwe i nie pozwalają na rozróżnienie między czynnościami zabijania pochodzącymi z bakteriofagów i bakteriocyny.

Głównym ograniczeniem tej techniki jest to, że nie nadaje się ona dobrze dla organizmów, które nie rosną solidnie (a zatem nie będą miały łatwo rozpoznawalnych stref oczyszczania) lub które są siedliskiem profagów lub bakteriocyn, które nie są solidnie wytwarzane w warunkach laboratoryjnych. Zastosowanie tej techniki do wykrywania bakteriocyn wytwarzanych w próbkach środowiskowych zarówno zwiększyłoby użyteczność tej techniki, jak i ułatwiłoby lepszy wgląd w rolę bakteriocyn w środowisku naturalnym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mitomycyna C	Santa Cruz Biotechnology	sc-3514	Rakotwórczy. używać odpowiednich środków ochrony osobistej (tj. rękawic , ochrony oczu i maski na twarz), szczególnie podczas przygotowywania roztworu podstawowego.
Chloroform	Sigma-Aldrich	34854	Silnie toksyczny, zagrożenie dla układu oddechowego. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (rękawice i osłona oczu), obsługuj otwarte pojemniki w osłonie oparów chemicznych.
Glikol polietylenowy (PEG)	Amresco	0159
Agar klasy bakteriologicznej	Genesee Scientific	20-274