Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Podsumowanie

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Streszczenie

Charakterystyka oddziaływań molekularnych pod względem podstawowych parametrów wiązania, takich jak powinowactwo wiązania, stechiometria i termodynamika, jest niezbędnym krokiem w naukach podstawowych i stosowanych. Termoforeza w mikroskali (MST) jest czułą metodą biofizyczną pozwalającą uzyskać te ważne informacje. Opierając się na efekcie fizycznym zwanym termoforezą, który opisuje ruch cząsteczek przez gradienty temperatury, technologia ta pozwala na szybkie i precyzyjne określenie parametrów wiązania w roztworze i pozwala na swobodny wybór warunków buforowych (od buforu do lizatów/surowic). MST wykorzystuje fakt, że niezwiązana cząsteczka wykazuje inny ruch termoforetyczny niż cząsteczka, która jest w kompleksie z partnerem wiążącym. Ruch termoforetyczny ulega zmianie w momencie interakcji molekularnej z powodu zmian rozmiaru, ładunku i powłoki hydratulacyjnej. Porównując profile ruchu różnych stosunków molekularnych dwóch partnerów wiążących, można określić informacje ilościowe, takie jak powinowactwo wiązania (pM do mM). Nawet trudne interakcje między cząsteczkami o małych rozmiarach, takimi jak aptamery i małe związki, mogą być badane przez MST. Korzystając z dobrze zbadanej interakcji modelowej między aptamerem DNA DH25.42 a ATP, manuskrypt ten dostarcza protokół do scharakteryzowania interakcji aptamer-mała cząsteczka. Badanie to pokazuje, że MST jest bardzo czuły i pozwala na mapowanie miejsca wiązania aptameru DNA o masie 7,9 kDa z adeniną ATP.

Wprowadzenie

Oddziaływania między cząsteczkami stanowią podstawę natury. Dlatego naukowcy w wielu dziedzinach badań podstawowych i stosowanych starają się zrozumieć fundamentalne zasady różnego rodzaju oddziaływań molekularnych. Mikrotermeforeza (MST) umożliwia naukowcom szybką, precyzyjną i kosztowo efektywną charakterystykę oddziaływań molekularnych w roztworze przy zachowaniu kontroli jakości i swobodnym wyborze buforów. Istnieje już ponad 100 publikacji z samego 2016 roku wykorzystujących MST, opisujących różne rodzaje analiz, w tym przesiewanie bibliotek, walidację zdarzeń wiązania, testy konkurencji oraz eksperymenty z wieloma partnerami wiązania^1-8. W ogóle MST p....

Protokół

1. Przygotowanie zapasu roboczego aptameru

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i rozpuść oligonukleotyd (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekwencja z pozycji^{referencyjnej 18}) w wodzie, osiągając końcowe stężenie 100 μM.
2. Przygotować roztwór roboczy aptameru, rozcieńczając podstawowy oligonukleotyd do 200 nM z buforem wiążącym (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl₂; 0,01% Tween20).
3. Inkubować mieszaninę przez 2 minuty w temperaturze 90 °C, pozostawić próbkę do natychmiastowego ostygnięcia na lodzie i użyć próbki w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie serii rozcieńcz....

Wyniki

W niniejszym badaniu zastosowano technikę MST w celu charakterystyki miejsca wiązania aptameru DNA DH25.42¹⁸ z ATP. W przeciwieństwie do innych badań charakteryzujących oddziaływanie ATP lub małych cząsteczek naśladujących ATP z białkami znakowanymi losowo jednym lub wieloma fluoroforami^38-40, badanie to obejmuje znakowaną wersję aptameru ssDNA o masie 7,9 kDa z jedną cząsteczką Cy5 na końcu 5´. Do mapowania miejsca wiązania w cząsteczce ATP wykorzystano różne pochod.......

Dyskusja

Kontrole jakości:

Niespecyficzne przywieranie/adsorpcja materiału próbki do powierzchni, a także efekty agregacji, mają ogromny wpływ na jakość danych dotyczących powinowactwa. Jednak tylko kilka najnowocześniejszych technologii oferuje dokładne i szybkie opcje monitorowania i unikania tych efektów. MST oferuje zintegrowane kontrole jakości, które wykrywają i pomagają przezwyciężyć te problemy, umożliwiając stopniową optymalizację konfiguracji technicznej. Ważne informacje na temat efektów przywi.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
		wiążący aptamer	20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20
Fluorescencyjnie znakowany aptamer ATP	IDT, Leuven, Belgia		sekwencja: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Niemcy	A2383	10 mM roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -20 & deg; C
ADP	Sigma Aldrich, Niemcy	A2754	10 mM roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -20 ° C
AMP	Sigma Aldrich, Niemcy	A2252	10 mM roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -20 ° C
Adenine	Sigma Aldrich, Niemcy	A8626	10 mM roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -20 & deg; C
SAM	Sigma Aldrich, Niemcy	A7007	10 mM roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -20 & deg; C
dATP	Sigma Aldrich, Niemcy	11934511001	roztwory podstawowe 10 mM przechowywane w temperaturze -20 ° C
CTP	Sigma Aldrich, Niemcy	C1506	10 mM roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -20 & deg; C
GTP	Sigma Aldrich, Niemcy	G8877	10 mM roztwory podstawowe przechowywane w temperaturze -20 ° C
Monolit NT.115	NanoTemper Technologies, Monachium, Niemcy	MO-G008	Niebiesko-czerwony Kanał Urządzenie MST ze standardowym detektorem, Monolith NT115 pico to urządzenie MST z detektorem o wysokiej czułości
Kapilary Monolith NT.115 Standard	NanoTemper Technologies, Monachium, Niemcy	MO-K002
Probówki Eppendorf PCR	Eppendorf, Niemcy	30124537
Oprogramowanie sterujące Monolith. 2.1.33, preinstalowane na urządzenie	NanoTemper Technologies, Monachium, Niemcy
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Monachium, Niemcy
Kaleidagraph 4.5.2	Oprogramowanie

Bufor Synergy