Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

14.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55078

⸱

12 stycznia 2017

 ,  , 
1Department of Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Health System, 2Department of Urology, National University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Streszczenie

Ten protokół opisuje generowanie guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J przy użyciu mysiej linii komórkowej raka pęcherza moczowego MB49, która została zmodyfikowana do wydzielania ludzkiego antygenu specyficznego dla prostaty (PSA), oraz procedurę potwierdzania implantacji guza. Krótko mówiąc, myszy są znieczulane za pomocą leków do wstrzykiwań i zmuszane do leżenia w pozycji grzbietowej. Mocz jest usuwany z pęcherza moczowego i powoli wkrapla się 50 μl poli-L-lizyny (PLL) w tempie 10 μl/20 s za pomocą cewnika dożylnego 24 G. Pozostawia się go w pęcherzu moczowym na 20 minut poprzez zatkanie cewnika. Cewnik jest usuwany, a PLL jest usuwany poprzez delikatny nacisk na pęcherz. Następnie wkrapla się linię komórkową raka pęcherza moczowego myszy (1 x 105 komórek/50 μL) w ilości 10 μL/20 s. Cewnik jest zakorkowany, aby zapobiec przedwczesnej ewakuacji. Po 1 godzinie myszy są reanimowane lekiem odwracającym, a pęcherz jest opróżniany. Powolne tempo wkraplania jest ważne, ponieważ zmniejsza refluks pęcherzowo-moczowodowy, który może powodować powstawanie guzów w górnych drogach moczowych i nerkach. Linia komórkowa powinna być dobrze zawieszona, aby zmniejszyć zlepianie się komórek, ponieważ może to prowadzić do nierównych rozmiarów guza po implantacji.

Ta technika indukuje nowotwory z dużą skutecznością. Wzrost guza jest monitorowany przez wydzielanie PSA z moczem. Monitorowanie markerów PSA jest bardziej wiarygodne niż obrazowanie ultradźwiękowe lub fluorescencyjne w wykrywaniu obecności guzów w pęcherzu moczowym. Guzy u myszy na ogół osiągają maksymalny rozmiar, który negatywnie wpływa na zdrowie o około 3-4 tygodnie, jeśli nie są leczone. Monitorując wzrost guza, możliwe jest odróżnienie myszy, które zostały wyleczone, od tych, którym nie udało się wszczepić guzów. Mając do dyspozycji tylko analizę punktu końcowego, można błędnie założyć, że ten ostatni został wyleczony przez terapię.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest generowanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego i monitorowanie implantowanych guzów tak dokładnie, jak to możliwe, tak aby myszy bez implantacji guza nie były uważane za wyleczone w końcowej analizie. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiona metoda zmniejszy zapotrzebowanie na dużą liczbę myszy do analizy eksperymentalnej i zapewni większą dokładność w określaniu wyników terapeutycznych.

Opracowanie ortotopowego modelu raka jest ważne, ponieważ podskórne wszczepianie komórek nowotworowych nie podsumowuje środowiska klinicznego choroby ani nie umożliwia rozwoju strategii terapeutycznych. Architektura pęcherza moczowego pozwala na wkraplanie terapii raka pęcherza moczowego bezpośrednio do pęcherza moczowego przy minimalnych skutkach ogólnoustrojowych. Dlatego modele zwierzęce, które podsumowują to środowisko, takie jak model ortotopowy, są ważne dla oceny nowych terapii. Wnioski wyciągnięte z dowolnej konfiguracji eksperymentalnej są zależne od ograniczeń modelu.

Opracowano kilka technik do wytwarzania ortotopowych guzów pęcherza moczowego u myszy. Polegają one na uszkodzeniu warstwy glikozaminoglikanu w pęcherzu moczowym, umożliwiając wszczepienie komórek nowotworowych. Stosowane techniki obejmują elektrokoagulację, w wyniku której powstaje pojedynczy punkt uszkodzenia w ścianie pęcherza moczowego, co prowadzi do rozwoju guza w jednym miejscu pęcherzamoczowego 1,2. Jednak wskaźnik powodzenia implantacji guza za pomocą elektrokoagulacji zależy od operatora i waha się od 10 do 90% i obejmuje niebezpieczeństwo przebicia ściany pęcherza moczowego, co prowadzi do rozwoju guzów w jamie otrzewnej. Kauteryzacja chemiczna odbywa się przy użyciu azotanu srebra, który uszkadza ścianę pęcherzamoczowego 3. Podobnie kwas został użyty do uszkodzenia ściany pęcherzamoczowego 4. Trypsyna była również stosowana do uszkadzania pęcherzamoczowego 5. Metody te mogą prowadzić do rozwoju więcej niż jednego guza pęcherza moczowego. Ponadto istnieje niebezpieczeństwo poważnego uszkodzenia pęcherza, jeśli chemikalia pozostaną w zbyt długim kontakcie ze ścianą pęcherza. Metoda opracowana przez Ninalga i wsp. wykorzystuje dodatnio naładowane cząsteczki poli-L-lizyny (PLL)6 do pokrycia ściany pęcherza moczowego; Dzięki temu ujemnie naładowane komórki nowotworowe mogą przyklejać się do warstwy glikozaminoglikanu w pęcherzu moczowym. Ta metoda na ogół powoduje rozwój więcej niż jednego guza w pęcherzu moczowym, ale implantacja guza wynosi 80 - 100%4,7. Technicznie jest to również najłatwiejsza procedura do wykonania. Aby upewnić się, że rozwijające się guzy mają dość równą wielkość, ważne jest, aby komórki nowotworowe nie były grupowane w duże grudki przed implantacją.

Aby ocenić skuteczność terapeutyczną, najlepiej przeprowadzić to badanie na myszach z guzami o dość podobnej wielkości. Dlatego ważny jest dobry system wykrywania, który może określić ilościowo wielkość guza wkrótce po implantacji. Do oceny nowotworów zastosowano kilka strategii. Należą do nich rezonans magnetyczny (MRI)8-10, fluorescencja11, bioluminescencja12,13, ultrasonografia14 i test immunoenzymatyczny (ELISA)15,16. Podczas gdy rezonans magnetyczny i ultradźwięki nie wymagają modyfikacji komórek nowotworowych, istnieje zapotrzebowanie na czuły sprzęt i środki kontrastowe do MRI. Testy oparte na fluorescencji, luminescencji i ELISA wymagają modyfikacji komórek nowotworowych w celu ekspresji białek markerowych, które można wykryć tymi metodami. Do luminescencji wymagany jest substrat do wykrywania aktywności lucyferazy; W związku z tym istnieje dodatkowy krok i zwiększony koszt. Zarówno luminescencja, jak i fluorescencja wymagają specjalistycznego sprzętu. Aby wytworzyć fluorescencję, wymagana jest cyklizacja białka zielonej fluorescencji (GFP), która jest katalizowana przez tlen cząsteczkowy. Tak więc ekspresja GFP może być zmienna w masie guza w zależności od dostępu do tlenu, co czyni go raczej niewiarygodnym markerem17. Inną strategią jest modyfikacja linii komórkowej MB49 raka pęcherza moczowego w celu wydzielania ludzkiego swoistego antygenu swoistego dla prostaty (PSA)15,16 jako markera zastępczego. Markery te stanowią również alternatywny sposób potwierdzania obecności guza po zakończeniu eksperymentu, co czyni je alternatywą dla immunohistochemii. W pracy przedstawiono metodę ortotopowej implantacji guza PLL i przedstawiono porównanie systemów wykrywania nowotworów, a mianowicie ELISA, fluorescencji i obrazowania ultradźwiękowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace związane ze zwierzętami są zgodne z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami (IACUC) dotyczącymi wykorzystywania i obchodzenia się ze zwierzętami (numer protokołu 084/12) na Narodowym Uniwersytecie Singapuru.

1. Hodowla komórek MB49-PSA in vitro i pomiar wydzielania PSA

  1. Utrzymuj mysie komórki raka pęcherza moczowego MB49-PSA15 w kompletnym zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mmol/L L-glutaminą i 0,05 mg/ml penicyliny-streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Dodać 200 μg/ml higromycyny B, aby utrzymać ciśnienie selekcyjne komórek wydzielających PSA.
  2. W celu określenia wydzielania PSA należy umieścić 1 x 106 komórek na 6-dołkowej płytce hodowlanej i inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 48 godzin.
  3. Dwa dni później należy pobrać supernatant do pomiaru PSA.
    1. Za pomocą pipety Pasteura przenieść supernatant do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Wirować przez 5 minut przy 250 x g, aby usunąć pływające komórki i zanieczyszczenia. Jeżeli oznaczanie PSA jest przeprowadzane w innym dniu, supernatant należy przechowywać w temperaturze -30 °C w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Jeśli nie, natychmiast przejdź do następnego kroku.
    3. Określ stężenie PSA za pomocą zestawu PSA ELISA7 niedostępnego dla człowieka.
  4. Wylicz posiane komórki.
    1. Za pomocą pipety Pasteura delikatnie umyj komórki 1 ml DMEM. Zassać i całkowicie usunąć nośnik.
    2. Dodaj 1 ml świeżego podłoża i delikatnie zeskrob skrobakiem do komórek, aby usunąć komórki z dołka.
    3. Przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej i dokładnie je zawiesij, aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki.
    4. Zmieszać równe objętości zawiesiny komórkowej i 0,4% roztwór błękitu trypanowego. Policz żywe komórki (które nie pobierają barwnika) za pomocą hemocytometru.
  5. Oblicz wyrażenie PSA jako ng PSA/ml pożywki/106 komórek. Ekspresja PSA komórek MB49-PSA do implantacji u myszy wynosi 80 - 120 ng / ml / 106 komórek.

2. Określanie czułości pomiarów PSA za pomocą testu ELISA i analizy PCR w czasie rzeczywistym

  1. Płytka komórek MB49-PSA w kompletnych pożywkach DMEM na 6-dołkowej płytce hodowlanej z różnymi ilościami rodzicielskich komórek MB49, tak aby na basenik przypadało maksymalnie 1 x 106 komórek (tj. 100, 101, 102, 103, 104, 105 lub 106 Komórki MB49-PSA są hodowane z 106, 105, 104, 103, 102, 101 lub 100 MB49).
  2. Dzień później należy pobrać supernatant do pomiaru PSA, jak opisano w kroku 1.3. Określ stężenie PSA za pomocą zestawu PSA ELISA7 niedostępnego dla człowieka.
  3. Wyodrębnij RNA z komórek.
    1. Poddać komórki lizie bezpośrednio na płytce, dodając 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA.
    2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej. Dodać 0,2 ml chloroformu i energicznie wirować próbki przez 15 sekund. Inkubuj je przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną (0,5 ml) do świeżej probówki, nie naruszając interfazy.
    4. Dodaj 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant, nie naruszając osadu RNA na dnie probówki.
    5. Umyj granulkę raz 1 ml 75% etanolu. Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć cały etanol i pozostawić granulki do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
    6. Rozpuść RNA w 30 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 60 °C w celu zwiększenia rozpuszczalności.
    7. Określić ilościowo RNA, mierząc absorbancję za pomocą spektroskopii ultrafioletowej (UV) przy 260 nm (A260). Aby ocenić czystość RNA, należy zmierzyć absorbancję przy 280 nm (A280) i obliczyć stosunek A260/A280, który powinien wynosić powyżej 1,6.
  4. Odwrotna transkrypcja cDNA z 2 μg RNA.
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną na lodzie i przenieść ją do probówek o pojemności 0,2 ml.
    2. Krótko odwirować probówki, aby odwirować zawartość i usunąć pęcherzyki powietrza.
    3. Załadować probówki do termocyklera i przeprowadzić odwrotną transkrypcję w następujących warunkach: 60 min w 37 °C, a następnie 5 min w 95 °C. Po zakończeniu cyklu należy przechowywać próbki cDNA w temperaturze 4 °C.
    4. Próbki należy przechowywać w temperaturze -30 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  5. Wykonaj analizę PCR w czasie rzeczywistym pod kątem PSA i cytoplazmatycznej beta aktyny. Beta aktyna służy do normalizacji próbek. Wykonaj test na 100 ng odwróconej transkrypcji RNA na 96-dołkowej płytce. Oznaczyć wszystkie próbki w trzech powtórzeniach. Wykonać 40 cykli o następujących parametrach: 2 min w 50 °C, 10 min w 95 °C, 15 s w 95 °C dla denaturacji i 1 min w 60 °C. Ustaw najniższą granicę wykrywalności na progu cyklu (CT) wynoszącym 35; w związku z tym każda próbka o wartości CT powyżej 35 jest uważana za niewykrywalną.

3. Utrzymanie rakotwórczości linii komórkowej MB49-PSA

UWAGA: Długotrwały wzrost in vitro prowadzi do utraty rakotwórczości. Aby utrzymać rakotwórczościę, linia komórkowa MB49-PSA przechodzi przez mysz co najmniej raz na 2 lata.

  1. Komórek.
    1. Zbieraj wykładniczo rosnące komórki, delikatnie je zeskrobując sterylnym skrobakiem do komórek. Zmieszać równe objętości zawiesiny komórkowej i 0,4% roztwór błękitu trypanowego. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Nie należy wszczepiać implantu, jeśli więcej niż 20% komórek jest martwych.
    2. Oblicz wymaganą ilość żywych komórek (1 x 107 komórek/ml) i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórek w ślepej pożywce DMEM. Powtórz mycie trzy razy, aby usunąć wszelkie ślady FBS przed implantacją.
    3. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie, aż myszy będą gotowe do implantacji.
  2. Wszczepić komórki nowotworowe podskórnie myszom na boku grzbietowym.
    1. Znieczulij 4- do 6-tygodniową mysz C57BL6/J za pomocą mieszaniny środków znieczulających ketaminy i medetomidyny (odpowiednio 75 mg/kg i 1 mg/kg), wstrzykniętych dootrzewnowo w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała.
    2. Ogol prawą flankę, aby odsłonić skórę.
    3. Za pomocą kleszczy podnieś skórę, aby oddzielić ją od leżącego poniżej mięśnia i wstrzyknij podskórnie 0,1 ml zawiesiny komórek (1 x 106 komórek) za pomocą igły 24 G. Podczas wyjmowania igły należy ścisnąć miejsce wstrzyknięcia przez 5 do 10 sekund, aby komórki nowotworowe nie wyciekły z miejsca wstrzyknięcia.
    4. Ożywić mysz za pomocą podskórnego wstrzyknięcia atipamezolu (1 mg/kg) w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała.
  3. Monitoruj wzrost guza co dwa dni, mierząc średnicę guza za pomocą suwmiarki. Objętość guza oblicza się za pomocą wzoru v = (ab2)/2, gdzie "a" to najdłuższy wymiar, a "b" to szerokość prostopadła, obie w mm.
  4. Gdy objętość guza wynosi co najmniej 50 mm3 (około 7 dni), należy poddać mysz eutanazji za pomocą CO2. Wyciąć masę guza za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek w warunkach aseptycznych i umieścić w DMEM.
  5. Na 6-dołkowej płytce hodowlanej zmiel guz na małe kawałki za pomocą sterylnych skalpeli. Użyj tłoka strzykawki o pojemności 1 ml jako "tłuczka", aby dalej rozdzielić guz.
  6. Dodać 3 ml kompletnego DMEM i utrzymywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Gdy komórki przylgną do płytki (od jednego do dwóch dni), usuń pożywkę, zanieczyszczenia i nieprzylegające komórki, delikatnie odsysając sterylną pipetą Pasteura. Umyć dwukrotnie DMEM. Uważaj, aby nie przeszkadzać komórkom.
  8. Dodaj 1 ml DMEM i zbierz komórki, zeskrobując je skrobakiem do komórek. Aby wybrać i namnażać pojedyncze kolonie, policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 1 komórkę na dołku na 96-dołkowej płytce hodowlanej. Hodowla komórek w DMEM z 200 μg/ml higromycyny B w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Zmieniaj pożywkę i antybiotyk co 4 - 5 dni. Monitoruj komórki, aż osiągną około 80-90% zlewania się. Ponownie nanieś komórki na 24-dołkową płytkę hodowlaną, pipetując w celu usunięcia komórek z dołka.
  10. Gdy komórki na 24-dołkowej płytce hodowlanej zlegną się ze sobą, usuń je przez zeskrobanie skrobakiem do komórek i umieść je na 6-dołkowej płytce hodowlanej.
  11. Przebadaj różne klony pod kątem wydzielania PSA, zgodnie z opisem w kroku 1. Kriokonserwuj klon o najwyższym wydzielaniu PSA i wykorzystaj go do przyszłych eksperymentów na myszach.

4. Wszczepienie guza

UWAGA: Każdej myszy wszczepia się 1 x 10 komórek5 MB49-PSA w 50 μL ślepego podłoża DMEM w pęcherzu. Ze względu na martwą przestrzeń w cewniku, zawsze przygotuj dodatkową objętość (co najmniej 100 μl więcej na mysz). Alternatywnym podejściem byłoby użycie strzykawki wypełnionej powietrzem, jak opisano przez Kasmana i wsp.5 zamiast napełnionej strzykawki.

  1. Komórek.
    1. Na dzień przed implantacją, gdy komórki są w około 80% zlewne, należy przejść komórki nowotworowe MB49-PSA w kompletnym pożywce DMEM (uzupełnionej 10% FBS, 2 mmol/L L-glutaminą, 0,05 mg/ml penicyliny-streptomycyny i 200 μg/ml higromycyny B) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w stosunku podziału 1:2.
    2. W dniu zabiegu należy pobrać komórki, delikatnie je zeskrobując sterylnym skrobakiem do komórek. Zmieszać równe objętości zawiesiny komórkowej i 0,4% roztwór błękitu trypanowego. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Nie należy wszczepiać implantu, jeśli więcej niż 20% komórek jest martwych.
    3. Oblicz wymaganą ilość żywych komórek (2 x 106 komórek/ml) i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórek w ślepej pożywce DMEM. Powtórz mycie trzy razy, aby usunąć wszelkie ślady FBS przed implantacją.
    4. Utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie, aż myszy będą gotowe do implantacji.
  2. Pozwól 4- do 6-tygodniowym samicom myszy C57BL/6J zaaklimatyzować się przez tydzień przed zabiegiem. Wszystkie prace na zwierzętach muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylne warunki.
    1. Zważyć każdą mysz i wstrzyknąć znieczulenie (75 mg/kg ketaminy i 1 mg/kg medetomidyny) dootrzewnowo w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała. Masa ciała powinna wynosić od 17 do 22 g. Potwierdź znieczulenie, obserwując brak reakcji po uszczypnięciu palca u nogi.
    2. W celu identyfikacji oznacz ucho za pomocą dziurkacza do uszu.
    3. Roztwór Hartmanna lub związek mleczanu sodu wstrzykiwać dootrzewnowo w ilości 0,1 ml na 10 g masy ciała co 1 - 2 godziny w celu nawodnienia.
    4. Nałóż sterylną maść okulistyczną na oba oczy za pomocą sterylnej bawełnianej bawełnianej bawełny, ponieważ odruch mrugania zostaje utracony w znieczuleniu, a oczy wysychają. W razie potrzeby zastosuj ponownie.
    5. Połóż myszy w pozycji leżącej na ręcznikach papierowych na wierzchu okładu grzewczego (aktywowanego przez kontakt z powietrzem), aby utrzymać temperaturę ciała i przyklej tylne nogi taśmą.
  3. Palcem delikatnie uciskaj dolną część brzucha i zbieraj mocz z pęcherza do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Ta próbka służy jako podstawowa wartość PSA w moczu.
  4. Pobrać sterylną poli-L-lizynę (PLL) do strzykawki o pojemności 1 ml i założyć cewnik dożylny o rozmiarze 24 z usuniętym trzonkiem igły. Nałóż lubrykant na końcówkę cewnika i wprowadź cewnik przez cewkę moczową do pęcherza moczowego za pomocą kleszczy do prowadzenia cewnikowania. Zatrzymaj się, gdy poczujesz opór. UWAGA: Badacze powinni omówić ze swoim personelem weterynaryjnym potrzebę stosowania żelu nawilżającego ze środkiem znieczulającym do wkraplania dopęcherzowego oraz stosowania leków przeciwbólowych po zabiegu.
  5. Wkraplać 50 μl PLL powoli, w tempie 10 μl co 20 s, aby uniknąć refluksu pęcherzowo-moczowodowego18. Pozostaw cewnik w pęcherzu moczowym na 20 minut z korkiem, aby zapobiec wyciekowi.
  6. Po 20 minutach wyjmij cewnik i opróżnij pęcherz z całej zawartości, delikatnie naciskając dolną część brzucha. Za pomocą pustej strzykawki o pojemności 1 ml wypłukać pozostałą zawartość z cewnika.
  7. Dokładnie wymieszać komórki MB49-PSA przez pipetowanie i pobrać je do strzykawki o pojemności 1 ml. Załóż cewnik i nałóż lubrykant. Wkraplanie 50 μl z 1 x 105 komórek w wolnym tempie 10 μl co 20 s. Wymienić korek na cewniku. Podaj myszom kontrolnym 50 μl soli fizjologicznej.
  8. Po 1 godzinie wyjmij cewniki i opróżnij pęcherz z wszelkiej zawartości. Usuń taśmę z tylnych nóg i umieść myszy na ich brzusznych stronach. Oceń myszy, wstrzykując podskórnie lek odwracający działanie (1 mg/kg atipamezolu) w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała.
  9. Monitoruj myszy, aż zaobserwuje się ruchliwość. Wróć myszy do ich klatek.
  10. Po zakończeniu protokołu wykrywania guza (sekcje 5, 7 lub 8) należy poddać myszy eutanazji za pomocą CO2 . Pośmiertne wykrywanie guza opisano w punkcie 6.

5. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą testu ELISA

UWAGA: Obecność i wzrost guza jest monitorowany u myszy poprzez pomiar wydzielania PSA w moczu. Badacze powinni skonsultować się ze swoim personelem weterynaryjnym w sprawie monitorowania zdrowia i dobrostanu zwierząt po implantacji guza oraz humanitarnych punktów końcowych.

  1. Istnieją dwie metody zbierania moczu od myszy.
    1. Zbieraj mocz przez noc, umieszczając pojedynczą mysz w indywidualnej klatce metabolicznej zaprojektowanej do oddzielania moczu od kału. Jeśli zestaw nie ma chłodzenia, dodaj inhibitor proteazy (100 μl) do probówki do moczu, aby zapobiec degradacji PSA przez noc. Jednak liczba dostępnych klatek metabolicznych ogranicza użyteczność tej metody zbierania moczu.
    2. Tam, gdzie logistycznie niemożliwe jest użycie klatek metabolicznych (takich jak w pomieszczeniach ABSL2), należy zebrać punktowy mocz za pomocą palca, aby delikatnie wywrzeć nacisk na dolną część brzucha, podczas gdy myszy są znieczulane, jak opisano w kroku 4.2.1. Zwykle odbywa się to przed rozpoczęciem terapii. Z naszego doświadczenia wynika, że 1 godzinę po znieczuleniu można pobrać co najmniej 150 μl moczu.
  2. Zebrany mocz natychmiast umieść na lodzie. Krwiomocz może być widoczny od drugiego tygodnia po implantacji guza. Silnie zhemolizowane próbki mogą wpływać na analizę ELISA. Dlatego mocz należy umieścić na lodzie i szybko przetworzyć po pobraniu.
  3. Odwirować probówki moczowe o stężeniu 6 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek lub zanieczyszczeń.
  4. Aby znormalizować różnicę w wydalaniu moczu między myszami, należy podwielokrotnić mocz do nowych probówek i przechowywać je w temperaturze -30 °C do czasu wykonania analiz PSA przy użyciu zestawu ELISA7 i kreatyniny przy użyciu zestawu do oznaczania7. Mimo że myszy nie wytwarzają PSA, za pomocą testu ELISA wykrywa się niski poziom niespecyficznego wiązania. Aby próbki zostały uznane za dodatnie, próg musi być ustawiony na wartości większe niż u normalnych myszy + 3 odchylenia standardowe (SD)15.

6. Wykrywanie obecności guza za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

  1. Po zakończeniu należy wypreparować jamę brzuszną myszy i zlokalizować pęcherz moczowy. Wytnij pęcherz i umieść go w kriowiale. Natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.
  2. Ekstrahować RNA poprzez homogenizację tkanek w odczynniku do ekstrakcji RNA.
  3. Wykonaj odwrotną transkrypcję i analizę PCR w czasie rzeczywistym w kierunku PSA, jak opisano powyżej w sekcji 2.

7. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

  1. Oznacz 1 x 10 ogniw7 MB49-PSA barwnikiem fluorescencyjnym bliskiej podczerwieni19.
  2. Ponownie płytkować i zbierać znakowane komórki w dniach 4, 7, 11, 14, 18 i 21, aby sprawdzić, czy komórki zachowują żywotność i fluorescencję za pomocą cytometrii przepływowej20.
  3. Wszczepić znakowane komórki MB49-PSA do pęcherzy moczowych myszy, jak opisano powyżej w sekcji 4.
  4. Monitoruj wzrost guza za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego co dwa dni.
  5. W dniu obrazowania zważyć i znieczulić myszy za pomocą mieszaniny środków znieczulających ketaminy i medetomidyny (odpowiednio 75 mg/kg i 1 mg/kg), wstrzykniętych dootrzewnowo w ilości 0,1 ml na 10 g masy ciała.
  6. Ogol okolice brzucha, aby odsłonić skórę.
  7. Umieść myszy w komorze obrazowania i uzyskaj obrazy pęcherzy za pomocą oprogramowania dostarczonego z systemem obrazowania.
  8. Reanimować myszy, wstrzykując podskórnie lek odwracający działanie (1 mg/kg atipamezolu) w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała.

8. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości

  1. Guzy implantów u myszy, jak opisano powyżej w sekcji 4.
  2. Co dwa dni monitoruj wzrost guza za pomocą obrazowania ultradźwiękowego.
  3. W dniu obrazowania zważyć i znieczulić myszy za pomocą mieszaniny środków znieczulających ketaminy i medetomidyny (odpowiednio 75 mg/kg i 1 mg/kg), wstrzykniętych dootrzewnowo w ilości 0,1 ml na 10 g masy ciała.
  4. Ogol okolice brzucha, aby odsłonić skórę.
  5. Wkraść 100 μl sterylnego 0,9% soli fizjologicznej do pęcherza moczowego za pomocą cewnika dożylnego o rozmiarze 24. Sól fizjologiczna rozszerzy pęcherz i poprawi widoczność podczas obrazowania ultrasonograficznego.
  6. Umieść mysz na platformie ultradźwiękowej i nałóż żel przewodzący na dolną część brzucha.
  7. Opuść ręczną sondę do skóry i uzyskaj obrazy pęcherza moczowego w trybie B na platformie obrazowania21.
  8. Reanimuj myszy, wstrzykując podskórnie lek odwracający działanie (1 mg/kg atipamezolu) w dawce 0,1 ml na 10 g masy ciała.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stwierdzono, że sekrecja PSA z komórek MB49 różni się w zależności od zastosowanej pożywki wzrostowej. Komórki MB49-PSA hoduje się w pożywce DMEM, ponieważ prowadzi to do zwiększonej sekrecji PSA (Rycina 1A). W celu określenia czułości testu PSA ELISA oraz real-time PCR, różne liczby komórek MB49 wydzielających PSA zmieszano z komórkami rodzicielskimi MB49. PSA ELISA wykrywa minimum 1 x 105 komórki wydzielające PSA/1 x 106 komórki (Rysunek 1B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najbardziej krytycznymi krokami w protokole są: 1) skuteczne utrzymanie rakotwórczości linii komórkowej; 2) zapewnienie mierzalnego wydzielania PSA przed implantacją komórek nowotworowych u myszy; 3) generowanie zawiesiny jednokomórkowej do implantacji w celu zmniejszenia zmienności wielkości guza; oraz 4) wkraplanie komórek w powolnym tempie, aby zapobiec refluksowi pęcherzykowo-moczowodowemu, co powoduje zagnieżdżenie się komórek nowotworowych w nerce.

Po przedłużonym pasażu in vitro

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) przyznanego profesorowi Kesavan Esuvaranathan.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa MB49-PSAN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Pożywka Modified Eagle's Medium (DMEM) firmy DulbeccoBiowestL0102
Płodowa surowica bydlęca (FBS) PołudniowoamerykańskaBiowestS1810
Płodowa surowica bydlęca (FBS) Południowoamerykańska, PremiumBiowestS181B
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutaminaBiowestX0550
Penicylina-StreptomycynaBiowestL0022
Hygromycyna BInvitrogen10687-010
wolny zestaw PSA (ludzki) ELISAAbnovaKA0209
TRIzol Odczynnik do ekstrakcji RNA Zestaw
z inhibitorem RNazyApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
Test ekspresji genów TaqMan – Mouse ActbApplied Biosystems4331182
Test ekspresji genów Mm00607939_s1 TaqMan – Ludzkie KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J samice myszyIn Vivos4 - 6 tyg
Znieczulenie (75 mg / kg ketaminy i 1 mg / kg medetomidyny)Lokalna apteka
Lek odwracający (1 mg / kg Atipamezol)Lokalna apteka
Uderzenie w uchoMikroskopia elektronowa Nauki72893-01
Roztwór Hartmanna lub związek mleczan soduB Maść
- Duratears sterylna maść nawilżająca do oczuAlcon
Heat pack - Ogrzewacze do rąk HotHandsHeatmax Inc
Introcan Cewnik Certo IVB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Galaretka smarującaLokalna apteka
Roztwór poli-L-lizyny, 0,01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche4693159001
Quantichrom Zestaw do oznaczania kreatyniny SystemytestoweDICT-50 
Barwnik fluorescencyjny - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt i oprogramowanie
7500 Zastosowany system PCR w czasie rzeczywistym Oprogramowanie Biosystems
7500 v2.3Applied Biosystems
Tecniplast Regał pionowy na 12 klatek
BD FACSCanto I system Oprogramowanie BD Biosciences
BD FACSDiva v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo Suwmiarka Nauki Przyrodnicze 
Oprogramowanie Living Image v3.1Caliper Nauki przyrodnicze 
System obrazowania Vevo 2100 Dźwięki wizualne 
do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności Ambion 15596026 . okulistyczna Braun Klatka metaboliczna System obrazowania

Bibliografia

  1. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  2. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  3. Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
  4. Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
  5. Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).
  6. Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
  7. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684(2011).
  8. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
  9. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
  10. Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).
  11. Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
  12. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
  13. Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
  14. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
  15. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
  16. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  17. Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
  18. Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).
  19. Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075(2007).
  20. Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
  21. Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718(2015).
  22. Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
  23. Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
  24. Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
  25. Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
  26. Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
  27. Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
  28. Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
  29. Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ortotopowe wszczepianie guzakom rki MB49 PSAmonitorowanie poziomu PSA w moczuinstylacja poli L lizynyrak p cherza moczowego u myszyocena terapii wewn trz p cherzowejanaliza cytometrycznadetekcja metod ELISAmonitorowanie wzrostu guza
Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.