Oceny insektycydów są często skierowane przeciwko dorosłym owadom, a nie niedojrzałym stadiom. W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny insektycydów przeciwko jajom pluskiew z porównaniem do pierwszego stadium nimfalnego pluskwy. Protokoły te można dostosować do innych owadów w celu oceny skuteczności insektycydów w stadiach życia niebędących dorosłymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda oceny skuteczności insektycydów przeciwko pluskwom, Cimex lectularius, jajom i pierwszym stadium rozwojowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Standardowe oceny toksyczności insektycydów przeciwko szkodnikom owadzim przeprowadzane są głównie na dorosłych owadach. Oceny opierają się na krzywej dawka-odpowiedź lub stężenie-odpowiedź, w której śmiertelność wzrasta wraz ze wzrostem dawki lub stężenia insektycydu. Standardowe testy stężenia śmiertelnego (LC50) i dawki śmiertelnej (LD50), które skutkują 50% śmiertelnością badanej populacji, mogą stanowić wyzwanie dla oceny toksyczności insektycydów w stosunku do stadiów życia owadów niebędących dorosłymi osobami, takich jak jaja i wczesne stadia rozwojowe lub nimfalne. Jednak informacje te są niezbędne do zrozumienia skuteczności insektycydów na wszystkich etapach życia pluskiew, co wpływa na wysiłki związane z kontrolą i leczeniem. Protokół ten wykorzystuje standardowy test biologiczny zanurzania zmodyfikowany dla jaj pluskiew oraz kontaktowy test owadobójczy do leczenia pierwszych stadiów nimfalnych. Testy te dają krzywą stężenie-odpowiedź w celu dalszego ilościowego określenia wartości LC50 do oceny insektycydów.
Wprowadzenie
Pluskwy są znaczącym szkodnikiem miejskim, który może powodować utratę krwi, podrażnienia skóry, bezsenność, depresję i niepokój u swoich ludzkich gospodarzy 1,2,3,4,5,6. Koszty eliminacji i zwalczania pluskiew są wysokie i często wymagają wielu wizyt w domu przez firmę zajmującą się zwalczaniem szkodników7. Wielokrotne wizyty są zwykle wymagane ze względu na tajemnicze zachowanie pluskiew i trudności związane z ich zabijaniem. W szczególności jaja pluskiew są trudne do kontrolowania ze względu na ich mały rozmiar i ochronę zarodka przez skorupkę jaja.
Obecnie, powszechną praktyką wielu firm zajmujących się zwalczaniem szkodników w całych Stanach Zjednoczonych jest leczenie domu z pluskwami za pomocą chemicznego środka owadobójczego. Powszechnie wiadomo, że jaja są trudne do kontrolowania, dlatego wiele firm wprowadziło dwutygodniowe ramy czasowe na ponowne leczenie8. Dzięki temu jaja pluskiew mają wystarczająco dużo czasu na wyklucie się, dzięki czemu pojawi się pierwsze stadium rozwojowe i rzekomo łatwiej będzie je zabić środkami owadobójczymi. Brakuje jednak badań oceniających skuteczność płynnych środków owadobójczych przeciwko jajom pluskiew i pierwszym stadium choroby.
Jaja owadów zostały udokumentowane jako najtrudniejszy etap życia do zwalczania u miejskich szkodników owadzich, innych niż pluskwy, a także wielu szkodników rolniczych. Większość tych trudności przypisuje się skorupce jaja, podczas gdy kilka badań wykazało oporność na insektycydy. Odporność w stadium jajowym została udokumentowana u Triatoma infestans9, Pediculus humanus capitis10, Plutella xylostella11, Rhyzopertha dominica12, Cimex lectularius13, oraz wielu przechowywanych chrząszczy produktowych (tj. Oryzaephilus surinamensis, Tribolium castaneum, Cryptolestes ferrugineus i Rhyzopertha dominica). 14Rozwój odporności w stadium jajowym i w stadiach niedojrzałych, a także powikłania związane z przenikaniem insektycydów przez skorupkę jaja, wymagają przeprowadzenia testów biologicznych skuteczności insektycydów na tych etapach życia.
Ten protokół krok po kroku określa skuteczność insektycydów w jaju i pierwszym stadium rozwojowym pluskiew pospolitych, Cimex lectularius. Oba te protokoły są testami stężenie-odpowiedź, które umożliwiają ilościowe określenie wartości LC50. Testy stężenie-odpowiedź są powszechnie stosowane w badaniach toksykologicznych, jednak protokół ten został dostosowany do łatwego leczenia grup jaj pluskiew i pierwszych stadiów choroby. Testy te można dostosować do jaj różnych gatunków owadów i niedojrzałych etapów życia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Ten protokół zawiera dwa testy insektycydowe do oddzielnego leczenia jaj pluskiew i pierwszych stadiów. Oba protokoły zostały przeprowadzone przy użyciu tych samych środków owadobójczych, jednak protokoły musiały zostać dostosowane, aby zapewnić ekspozycję na insektycydy i łatwo manipulować próbkami.
1. Test insektycydowy do zanurzania jaj
- Wyciągnij pokryte, dobrze odżywione dorosłe samice pluskiew z kolonii i umieść samice (5-10) na szalce Petriego z bibułą filtracyjną. Wykonać co najmniej dziesięć powtórzeń, aby upewnić się, że będzie wystarczająca ilość jaj do przeprowadzenia testu insektycydowego. Sprawdź, czy samice codziennie składają jaja.
- Po złożeniu jaj wyjmij samice z szalki Petriego (6 cm × 5 cm) i codziennie umieszczaj je na nowych szalkach Petriego z nową bibułą filtracyjną i zapisuj datę na starej i nowej szalce Petriego.
- Pozwól jajom dojrzewać od 4 do 5 dni przed rozpoczęciem testu. Podatność na insektycydy zmienia się podczas rozwoju embrionalnego, dlatego ważne jest, aby kontrolować wiek jaj. Utrzymuj wszystkie etapy życia w fotoperiodzie 12:12 L:D, wilgotności względnej 60% i temperaturze 27 °C.
- Gdy jaja odpowiednio się zestarzeją, delikatnie usuń jaja pluskiew z bibuły filtracyjnej za pomocą kleszczyków z miękką końcówką. Delikatnie zeskrob spód jajka przymocowanego do bibuły filtracyjnej za pomocą kleszczy, a następnie delikatnie chwyć bez wywierania dużego nacisku na jajko, aby ograniczyć rzucanie jaj pluskiew.
- Umieść usunięte jaja pluskiew w odpowiednich grupach wewnątrz plastikowych szalek Petriego. Ogranicz elektryczność statyczną spowodowaną rzucaniem jajami pluskiew, pocierając spód każdej szalki Petriego na zewnątrz arkuszem do zmiękczania tkanin. Traktuj grupy jaj pluskiew (5-10 jaj na grupę) na raz. Rozważ jedną grupę jako powtórzoną próbę i użyj co najmniej pięciu (lub więcej) powtórzeń do tego testu.
- Przygotuj seryjne rozcieńczenia insektycydów, aby uzyskać zakres 5 różnych stężeń (0,21-21 μl/ml dla imidachloprydu (0,1%)/β-cyflutryny (0,5%) i roztwór kontrolny z rozpuszczalnikiem (woda z kranu). Dodać 20 ml każdego stężenia, aby uzyskać wystarczającą objętość do testu zanurzania.
- Probówki wirówkowe (50 ml) należy przeciąć przyśrodkowo na linii 35 ml za pomocą narzędzia obrotowego z osprzętem do cięcia koła, a następnie wyciąć otwór w nasadce probówki wirówkowej (średnica = 2,54 cm) za pomocą tego samego narzędzia obrotowego z akcesorium do kamienia szlifierskiego z tlenku glinu. Podczas cięcia pozostaw 5 cm na krawędzi nasadki, aby nasadka bezpiecznie wkręciła się w rurkę (Rysunek 1).
- Pokrój drobne oczka w kwadraty wystarczająco duże, aby zmieściły się w nasadce (~5 cm2). Mocno przykręć siatkę, eliminując wszelkie nierówności, do probówek wirówkowych za pomocą nasadki probówki wirówkowej.
- Umieść grupę jaj pluskiew (jedną replikę) za pomocą pędzla na siatce wewnątrz probówki wirówkowej. Zanurz grupę pluskiew w pociętej probówce wirówkowej w stężeniu insektycydu na 5 sekund.
- Wyjmij probówkę wirówkową z roztworu środka owadobójczego. Wysuszyć siatkę z jajami w środku, umieszczając probówkę wirówkową bezpośrednio na tkance laboratoryjnej.
- Wyjmij grupę jaj z probówki wirówkowej za pomocą małego pędzla o drobno włosiu i umieść je na czystej szalce Petriego z czystą bibułą filtracyjną.
- Rejestruj śmiertelność jaj (niepowodzenie wyklucia) przez 14 dni, aby upewnić się, że wszystkie jaja miały wystarczająco dużo czasu na wyklucie.
- Skorygowana dla śmiertelności w leczeniu kontrolnym przy użyciu wzoru Abbotta (% śmiertelności testowej -% śmiertelności kontrolnej/ 100 - śmiertelność kontrolna x 100).
- Wstaw zarejestrowaną śmiertelność wraz z odpowiednimi stężeniami do oprogramowania analitycznego15, aby obliczyć wartości LC50.
2. Pierwszy test insektycydowy w stadium rozwojowym
- Oddziel grupę dobrze odżywionych pluskiew (5 dorosłych samców i 5 dorosłych samic), najlepiej karmionych 1 dzień wcześniej, i umieść je na szalce Petriego (6 cm × 5 cm) z bibułą filtracyjną przewidzianą do krycia i składania jaj. Pozwól dorosłym pluskwom łączyć się w pary i składać jaja przez około 7-9 dni. Do karmienia używaj sztucznego systemu karmienia, który cyrkuluje gorącą wodę w szklanych rurkach otaczających krew16. Do tego badania użyj zdefibronowanej krwi królika.
- Usuń dorosłe osobniki z szalek Petriego (6 cm × 5 cm) i pozwól, aby z jaj wykluły się pierwsze stadium rozwojowe na szalkach Petriego. Jaja pluskiew wykluwają się w temperaturze pokojowej po około 7-9 dniach.
- Zbierz niekarmione pierwsze osobniki w tym samym wieku za pomocą pędzla. Wiek można określić, usuwając codziennie pierwsze stadium rozwoju i rejestrując dzień, w którym się wykluły. Umieść je na nowych, czystych szalkach Petriego do czasu przeprowadzenia testu insektycydowego. Nimfy w pierwszym stadium nie są bardzo odporne na środki osuszające, dlatego test insektycydowy należy zakończyć tak szybko, jak to możliwe.
- Do oznaczenia należy przygotować seryjne rozcieńczenia imidachloprydu/β-cyflutryny, aby uzyskać zakres 5 różnych stężeń i roztwór kontrolny z samym rozpuszczalnikiem. Do tych badań użyto preparatów oznaczonych jako środki do zwalczania pluskiew w Stanach Zjednoczonych, dlatego rozpuszczalnikiem była woda (zgodnie z etykietą).
- Odpipetować 150 μl porcji każdego stężenia insektycydu i wody dla grupy kontrolnej na indywidualne bibuły filtracyjne (#1; średnica 4,2 cm). Rozprowadź środek owadobójczy na całej bibule filtracyjnej za pomocą pipetry, nakładając kropelki na całą krawędź i środek bibuły filtracyjnej.
- Ubite bibuły filtracyjne należy układać pojedynczo na poszczególnych panelach płyty pilśniowej (7 cm2).
- Uwolnij grupy pierwszych stadiów (od 5 do 10 na grupę) na poszczególne bibuły filtracyjne, będąc jeszcze zwilżonymi środkiem owadobójczym i przykryj pierwsze stadia odwróconym dnem szalki Petriego.
- Umieść ciężarek na szalce Petriego, aby zapobiec ucieczce pierwszych pluskiew w stadium rozwojowym z leczonej powierzchni.
- Rekordowa śmiertelność pluskiew w pierwszym stadium rozwoju po 24 godzinach ekspozycji na wszystkie stężenia insektycydów.
- Skorygowana dla śmiertelności w leczeniu kontrolnym przy użyciu wzoru Abbotta (% śmiertelności testowej -% śmiertelności kontrolnej/ 100 - śmiertelność kontrolna x 100).
- Wstaw zarejestrowaną śmiertelność i stężenia do oprogramowania analitycznego15, aby obliczyć wartości LC50.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jaja zanurzono w 5 różnych stężeniach imidacloprydu/β-cyflutryny (µL/mL). Pierwsze stadia larwalne umieszczono na powierzchniach traktowanych pięcioma różnymi stężeniami imidacloprydu/β-cyflutryny (Rycina 2).
Wykorzystano trzy różne populacje C. lectularius: Harlan, Richmond oraz Epic Center (Tabela 1). Szczep Harlan jest wrażliwy na insektycydy pyretrynowe i został pozyska...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowym krokiem w tym teście jest upewnienie się, że żadne jaja, które są usuwane z powierzchni, nie zostaną uszkodzone przed testem. Wiele owadów przytwierdza swoje jaja do podłoża, dlatego może być konieczne przeprowadzenie wstępnego testu, aby upewnić się, że usunięcie nie powoduje śmiertelności. Test ten można przeprowadzić z kilkoma powtórzeniami grupy poddanej działaniu środka (pluskwy usunięte z bibuły filtracyjnej) w porównaniu z grupą kontrolną (pluskwy nie usunięte). Podobne niskie wskaźniki śmiertelności (l...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Molly Stedfast za pomoc w rozcieńczaniu i formułowaniu pestycydów. Dziękujemy również Troyowi Andersonowi za wskazówki dotyczące analizy probitowej i Zachary'emu Adelmanowi za pomoc w projektowaniu eksperymentalnym. Badania te były częściowo wspierane przez Fundację Entomologiczną oraz przez fundusze stypendialne Virginia Pest Management.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szalki Petriego | Fisher Scientific Inc. | 08-757-105 | |
| Bibuła filtracyjna | Whatman | 1001-042 | |
| Kleszcze do wagi piórkowej | Fisher Scientific Inc. | 4750 | |
| Temprid SC (imidachlopryd/bifentryna) | Bayer CropScience | ||
| Transport GHP (acetamipryd/bifentryna) | FMC Corp. | ||
| Probówka | 06-443-18 | 50 mL; z gwintem płaskim | |
| Drobne oczka | 7250C | ||
| KimWipe | 06-666A | 11 cm x 21 cm | |
| Mały pędzel | Dowolny mały pędzel | ||
| Panele | Wystarczy drewno kompozytowe lub dachówka ze sklepu dla majsterkowiczów | ||
| Metal Ciężarki | Każdy rodzaj metalowej, która utrzyma ciężar szalki Petriego na powierzchni |
Bibliografia
- Sabou, M., et al. Bed bugs reproductive life cycle in the clothes of a patient suffering from Alzheimer's disease results in iron deficiency anemia. Parasite. 20, (2013).
- Reinhardt, K., Kempke, D., Naylor, R. A., Siva-Jothy, M. T. Sensitivity to bites by the bedbug, Cimex lectularius. Med. Vet. Entomol. 23, 163-166 (2009).
- Leverkus, M., et al. Bullous allergic hypersensitivity to bed bug bites mediated by IgE against salivary nitrophorin. J. invest. entomol. 126, 91-96 (2006).
- Fletcher, C. L., Ardern-Jones, M. R., Hay, R. J. Widespread bullous eruption due to multiple bed bug bites. Clin. Exp. Dermatol. 27, 74-75 (2002).
- Pritchard, M. J., Hwang, S. W. Severe anemia from bedbugs. Can. Med. Assoc. J. 181, 287-288 (2009).
- Goddard, J., de Shazo, R. Psychological effects of bed bug attacks (Cimex lectularius L). Am. J. Med. 125, 101-103 (2012).
- Harlan, H. J. Bed bugs 101: the basics of Cimex lectularius. Am. Entomol. 52, 99-101 (2006).
- Pinto, L. J., Cooper, R., Kraft, S. K. Bed Bug Handbook: The Complete Guide to Bed Bugs and Their Control. , Pinto & Associates, Inc.. Mechanicsville, MD, USA. (2007).
- Toloza, A. C., et al. Differential patterns of insecticide resistance in eggs and first instars of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) from Argentina and Bolivia. J. Med. Entomol. 45, 421-426 (2008).
- Cueto, G. M., Zerba, E. N., Picollo, M. I. Evidence of pyrethroid resistance in eggs of Pediculus humanus capitis (Phthiraptera: Pediculidae) from Argentina. J. Med. Entomol. 45, 693-697 (2008).
- Ho, S. H., Goh, P. M. Deltamethrin as a potential ovicidal pyrethroid against Plutella xylostella L. Toxicol. let. 22, 161-164 (1984).
- Bell, C. H., Hole, B. D., Evans, P. H. The occurrence of resistance to phosphine in adult and egg stages of strains of Rhyzopertha dominica (F.)(Coleoptera: Bostrichidae). J. Stored Prod. Res. 13, 91-94 (1977).
- Campbell, B. E., Miller, D. M. Insecticide Resistance in Eggs and First Instars of the Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). Insects. 6, 122-132 (2015).
- Price, L. A., Mills, K. A. The toxicity of phosphine to the immature stages of resistant and susceptible strains of some common stored product beetles, and implications for their control. J. Stored Prod. Res. 24, 51-59 (1988).
- Robertson, J. L., Preisler, H. K., Russel, R. M. PoloPlus: Probit and Logit Analysis User's Guide. , LeOra Software. Petaluna, CA, USA. (2003).
- Montes, C., Cuadrillero, C., Vilella, D. Maintenance of a laboratory colony of Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) using an artificial feeding technique. J. Med. Entomol. 39, 675-679 (2002).
- Brogdon, W. G., McAllister, J. C. Simplification of adult mosquito bioassays through use of time-mortality determinations in glass bottles. J. Am. Mosq. Control. Assoc. 14, 159-164 (1998).
- Katarzyna, K., Saddler, A., Koella, J. C. Effects of age and larval nutrition on phenotypic expression of insecticide-resistance in Anopheles mosquitoes. PLoS One. 8 (3), (2013).
- Outram, I. Factors affecting the resistance of insect eggs to sulphuryl fluoride-II: the distribution of sulphuryl-35 S fluoride in insect eggs after fumigation. J. Stored. Prod. Res. 3, 353-358 (1967).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
