Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Podsumowanie

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Streszczenie

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia wieloskładnikowych hydrożeli do hodowli komórek płuc in vitro. Zaczynając od zdrowej en bloc tkanki płucnej świni, szczura lub myszy, tkanka jest perfundowana i zanurzana w kolejnych detergentach chemicznych w celu usunięcia resztek komórkowych. Porównanie histologiczne tkanki przed i po przetworzeniu potwierdza usunięcie ponad 95% dwuniciowego DNA, a barwienie alfa galaktozydazą sugeruje, że większość resztek komórkowych została usunięta. Po decelularyzacji tkanka jest liofilizowana, a następnie kriomielona na proszek. Proszek matrycy jest trawiony przez 48 godzin w kwaśnym roztworze do wytrawiania pepsyny, a następnie neutralizowany w celu utworzenia roztworu preżelu. Żelowanie roztworu preżelu może być wywołane przez inkubację w temperaturze 37 °C i może być stosowane natychmiast po neutralizacji lub przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni. Powłoki można formować przy użyciu roztworu preżelu na nieobrobionej płytce do mocowania komórek. Komórki mogą być zawieszone w żelu wstępnym przed samoorganizacją w celu uzyskania kultury 3D, posianej na powierzchni utworzonego żelu, z którego komórki mogą migrować przez rusztowanie, lub posianej na powłokach. Zmiany w przedstawionej strategii mogą mieć wpływ na temperaturę, wytrzymałość lub rozmiary fragmentów białka. Poza tworzeniem hydrożelu, sztywność hydrożelu można zwiększyć za pomocą genipiny.

Wprowadzenie

Tłumaczenie wyników in vitro na potrzeby kliniczne jest jednym z najtrudniejszych problemów, przed którymi stoją badacze biomedyczni. Badania in vitro nad plastikowymi hodowlami tkankowymi są łatwiejsze, wygodniejsze i utrzymują wysoką żywotność komórek. ¹ Takie podejście jest rozsądnym punktem wyjścia, ale wyniki mają ograniczone przełożenie kliniczne. Coraz częściej laboratoria wykorzystują konstrukty trójwymiarowe, które zastępują tradycyjne metody dwuwymiarowe. Dostępne są recenzje dla wielu środowisk trójwymiarowych, od rusztowań biologicznych po rusztowania polimerowe. ^2,3

Struktury biologiczne mogą naśladować cechy środowisk in vivo, ponieważ zawierają wiele składników białkowych i glikozaminoglikanu natywnej matrycy i zapewniają znajome miejsca wiązania dla komórek, do których mogą się przyczepić i rozpoznać. Wykazano, że materiały pochodzące z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są zdolnymi rusztowaniami do przyczepiania się i proliferacji komórek. ⁴ Jednym z wyzwań, które ogranicza stosowanie platform hydrożelowych ECM, są ich z natury słabe właściwości mechaniczne po żelowaniu. Tkanka natywna często ma właściwości mechaniczne, które są wielkości wyższe niż hydrożele. Nietoksyczne środki sieciujące mogą zwiększać właściwości mechaniczne hydrożeli, aby lepiej naśladować rodzime środowisko tkankowe. Genipin jest nietoksycznym, naturalnym środkiem sieciującym pochodzącym z roślin gardenii, posiadającym zdolność do ścisłego dostosowywania właściwości mechanicznych ECM do zmian stężenia genipiny^5,6.

Prawie wszystkie komórki w ciele istnieją i organizują się na ECM, które albo produkują, albo utrzymują. Nowe skupienie się na uniwersalnym znaczeniu ECM w organizacji, stanie i funkcji każdego narządu lub układu zapoczątkowało produkcję platform opartych na matrycach do badań in vitro. Podśluzówka jelita cienkiego świni jest najszerzej przebadanym rusztowaniem pochodzenia naturalnego i jest używana do regeneracji ścięgien, więzadeł, mięśni szkieletowych⁴, a nawet kości⁷. Matryce z innych narządów i gatunków dawców również wykazały dobry potencjał regeneracji tkanek. Zastosowanie obcych komponentów ECM powoduje minimalne problemy z immunomodulacją. Po wyeliminowaniu materii komórkowej gospodarza, pozostały ECM będzie podobny pod względem zawartości aminokwasów i organizacji do wszystkich innych gatunków ssaków⁸. Coraz częściej mówi się, że najlepszym sposobem badania interakcji między komórką a ECM in vitro jest wykorzystanie rusztowań ECM specyficznych dla narządów. Każdy narząd zapewnia unikalną kompozycję białek i proteoglikanów, aby stworzyć nisze komórkowe. Nisze zapewniają strukturalny, funkcjonalny, a nawet enzymatyczny rozkład macierzy zewnątrzkomórkowej, przyczyniając się do sygnalizacji biofizycznej. Aby uzyskać mikrośrodowisko in vitro najbardziej zbliżone do mikrośrodowiska in vivo, zastosowanie ECM specyficznego dla tkanek zoptymalizowałoby nisze komórkowe do badań.

Celem tego protokołu jest dostarczenie metody tworzenia hydrożelowego rusztowania unikalnego dla ECM płuc. Metoda ta stanowi platformę do badań in vitro nad interakcjami komórka płuca z ECM.

Protokół

rozwiązanie	Sterylny filtr	Wskazówki
DiH2O	tak	DiH2O; Sterylne z filtrem
0,1% roztwór Triton X-100	tak	Pod wyciągiem dodać 100 μl roztworu Triton-X 100 do 100 ml DiH2O i mieszać aż do rozpuszczenia; sterylny filtr.
2% roztwór deoksycholanu	tak	Pod wyciągiem dodać 2 g roztworu deoksycholanu sodu na 100 ml DiH2O i mieszać aż do rozpuszczenia; Sterylny filtr
1 M NaCl	tak	Dodać 58,44 g NaCl do 1 l DiH2O; mieszać aż do rozpuszczenia; sterylny filtr
Rozwiązanie DNazy	tak	Dodać 12 000 jednostek DNazy do 1 L DiH2O; Dodać 0,156 g MgSO4 (bezwodny) i 0,222 g CaCl2; mieszać aż do rozpuszczenia; sterylny filtr
Pbs	tak	Kombajn 27,2 g Na2HPO4 · 7H2O (dwuzasadowy siedmiowodny), 80 g NaCl i 2 g KCl z 10 L DiH2O; mieszać aż do rozpuszczenia; dostosować pH do 7,4; sterylny filtr

Tabela 1: Roztwory wymagane do decelularyzacji tkanek. Wykonaj powyższe rozwiązania dla procesu decelularyzacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Na jedno płuco świni potrzeba około 2,5 l.

1. Tworzenie hydrożelu

1. Decelularyzacja płuc świń (na podstawie odniesień^9,10)
   1. Uzyskać en bloc normalne płuco świni z rzeźni, z nienaruszonym sercem i naczyniami krwionośnymi.
   2. Użyj nożyczek do tkanek lub skalpela, aby wypreparować serce, przecinając naczynia krwionośne jak najbliżej serca, pozostałe naczynia krwionośne zostaną wykorzystane w późniejszych krokach do perfuzji.
   3. Ostrożnie wypreparuj tkankę łączną otaczającą tchawicę, oskrzela i naczynia krwionośne za pomocą skalpela lub nożyczek.
      UWAGA: Określ najlepsze płuco do użycia w pozostałej części zabiegu, wybierając płuco bez dużych nacięć lub nakłuć przez opłucną oraz dużej ilości niedodmy lub niedrożności naczyń, które mogą utrudniać skuteczność procesu decelularyzacji.
   4. Odetnij nieoptymalne płuco, pozostawiając jak najwięcej oskrzeli przyczepionych do tchawicy (serce, tkanka łączna i płaty usuniętego płuca mogą zostać usunięte). Powinno pozostać jedno płuco połączone z tchawicą i układem naczyniowym.
      UWAGA: W razie potrzeby zachowaj skrawki do histologii. ⁹
   5. Zamknij odłączone oskrzela za pomocą klamer lub szwu, aby zapobiec nadmiernemu przepływowi wstecznemu.
   6. Przygotować roztwory do decelularyzacji i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą potrzebne (tabela 1).
   7. Za pomocą ręcznej pompki kaniulowanej w celu dopasowania do tętnicy płucnej, wykonaj 3-krotną perfuzję tkanki płucnej wodą DI zarówno przez tętnicę płucną, jak i tchawicę. Za każdym razem najpierw ukrwić naczynia krwionośne. Zacznij od około 1 l do układu krwionośnego i 1,5 l do tchawicy na każdą perfuzję, ale w miarę usuwania resztek komórkowych więcej płynu może być przetłaczane przez system.
   8. Perfuzja zarówno naczyń krwionośnych, jak i tchawicy za pomocą roztworu Triton X-100.
   9. Zanurzyć tkankę płucną w roztworze Triton X-100 na 24 godziny w temperaturze 4 °C.
   10. Ukrwić naczynia krwionośne i tchawicę 3 razy wodą DI w celu spłukania.
   11. Perfuzja zarówno naczyń krwionośnych, jak i tchawicy roztworem deoksycholanu.
   12. Zanurzyć skrawki tkanki w deoksycholanie na 24 godziny w temperaturze 4°C.
   13. Ukrwić naczynia krwionośne i tchawicę 3 razy wodą DI w celu spłukania.
   14. Perfuzja zarówno naczyń krwionośnych, jak i tchawicy roztworem NaCl.
   15. Zanurzyć tkankę w przefiltrowanym roztworze NaCl na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   16. Ukrwić naczynia krwionośne i tchawicę 3 razy wodą DI w celu spłukania.
   17. Ukrwić zarówno naczynia krwionośne, jak i tchawicę roztworem DNazy.
   18. Zanurzyć tkankę w przefiltrowanym roztworze DNazy na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   19. Perfuzja zarówno układu krwionośnego, jak i tchawicy 5 razy za pomocą PBS.
   20. Wyciąć zauważalną tkankę chrzęstną, tchawicę i wszystkie kanaliki o średnicy 2 mm lub większej (znajdujące się głównie wokół wnęki i przyśrodkowej części płuc) z przewodzenia dróg oddechowych, pozostawiając tylko strefy oddechowe (głównie obszary obwodowe).
   21. Wypreparuj tkankę na odcinki o długości 1 cala lub mniejsze. Orientacja tkanki nie ma znaczenia dla tego kroku.
   22. Odlej nadmiar płynu i umieść chusteczkę w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Zamrozić tkankę w temperaturze -80 °C.
       UWAGA: W razie potrzeby zachowaj skrawki do badania histologicznego, aby zapewnić usunięcie komórek i resztek komórkowych. Do charakterystyki używamy H&E, α-galaktozydazy, pikogreenu, hydroksyproliny, ninhydryny, błękitu alciańskiego, SDS-PAGE i spektrometrii mas. ⁹
2. Przetwarzanie płuc
   1. Zdjąć pokrywki z zamrożonych probówek zawierających pozbawioną komórek tkankę płucną.
   2. Umieść bibułę filtracyjną na otworze rurki i zabezpiecz gumką.
      UWAGA: Probówkę i zawartość należy nadal zamrozić, w przeciwnym razie umieścić w temperaturze -80 °C do momentu zamrożenia.
   3. Liofilizuj tkankę, aż cały nadmiar płynu zniknie, używając liofilizatora zgodnie ze wskazówkami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowy do zmielenia.
   4. Przed rozpoczęciem dodaj ciekły azot do młyna zamrażarki, aby schłodzić izolację i elementy wewnętrzne do warunków pracy.
   5. Wyjmij magnetyczny pręt młyna z rurki młyna i dodaj chusteczkę do przykrycia dna.
   6. Wymień listwę młynka i dodaj luźno upakowaną chusteczkę. Belka młyna powinna nadal poruszać się swobodnie.
   7. Zamknij rurkę młyna i umieść w młynie zamrażarki.
   8. Napełnij ciekły azot do linii maksymalnego napełnienia.
   9. Zamrażarka zmielić całą tkankę na drobny proszek (około 5 minut, szybkość zaklinania ~600 ^min-1), w cylindrze z poliwęglanu z udarem ze stali nierdzewnej, a także zatyczkami końcowymi ze stali nierdzewnej za pomocą młyna zamrażarki zgodnie ze wskazówkami producenta. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.
3. Tworzenie mikroporowatego żelu (8 mg/ml) (na podstawie pozycji^9,11)
   1. Dodać 1% (w/v) decelularizowanego proszku i 0,1% (w/v) pepsyny do 0,01 M HCl, pod stałym mieszaniem (powinno być w stanie zobaczyć przepływ na najwyższym poziomie cieczy), w temperaturze pokojowej, przez 48 godz.
      UWAGA: Proszek jest naładowany statycznie, więc dodanie HCl po proszku daje możliwość zmycia nadmiaru ze ścianek rurki.
   2. Po trawieniu przez 48 godzin umieścić roztwór i odczynniki na lodzie na 5 minut.
   3. Używając schłodzonego 10% (v/v) 0,1 M NaOH i 11,11% (v/v) 10x PBS (aby doprowadzić cały roztwór do 1x stężenia), doprowadzić strawiony roztwór białkowy do fizjologicznego pH 7,4,
      UWAGA: Roztwór można teraz przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. W razie potrzeby przeprowadzić kinetykę żelowania za pomocą reometrii⁹.

2. Sieciowanie hydrożeli w celu poprawy wytrzymałości mechanicznej

1. Roztwory 1%, 0,1% i 0,01% w/v roztworu sieciującego genipinę przygotowano poprzez rozpuszczenie niezbędnej ilości proszku genipiny w 10% DMSO.
2. Wiruj roztwór co 15 minut przez 1 godzinę.
3. Dodać roztwór genipiny, aby przykryć hydrożele ECM (100 μl na każde dołek płytki 96-dołkowej), które zostały wcześniej zebrane w części 1.3.4.
4. Pozostaw każdy hydrożel ECM do usieciowania na 24 godziny w temperaturze 37 °C.
5. Spłucz hydrożel ECM 3 razy za pomocą PBS, aż roztwór myjący przestanie być niebieski. Usieciowane hydrożele będą następnie gotowe do dalszej charakterystyki i badań nad kulturami komórkowymi.

3. Hodowla komórkowa z mikroporowatym żelem

1. Dwuwymiarowa powłoka
   1. Używając roztworu z ppkt 1.3.3, dodać 20 μl roztworu preżelu do każdego dołka z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej niepoddanej działaniu środka.
   2. Wstaw do lodówki na noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić adsorpcję białka na płytce.
   3. Odessać roztwór żelu wstępnego i spłukać PBS.
   4. Komórki pasażowe⁹.
   5. Dodaj 10 000 komórek/cm² do studzienek.
   6. Zwiększyć ilość pożywki do 100 μl na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C.
2. Trójwymiarowa hodowla komórkowa⁹
   1. Używając roztworu z ppkt 1.3.3, zawiesić granulowane komórki do stężenia 1 000 000 komórek/ml roztworu preżelu.
   2. Szybko dozuj 16 μl zawiesiny komórek preżelu do każdego dołka 96-dołkowej płytki, aby utworzyć hydrożel o grubości ~500 μm do hodowli komórek 3D.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby powstał żel.
   4. Dodać 100 μl pożywki na wierzch uformowanych hydrożeli i inkubować w temperaturze 37 °C.
3. Trójwymiarowa hodowla komórkowa na żelach o zmiennej sztywności
   1. Używając roztworu z ppkt 1.3.3, odpipetować 100 μl roztworu preżelu do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.
   2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut do powstania żelu.
      Uwaga: W tym miejscu można zastosować kroki sieciowania z części 2.
   3. Komórki pasażowe⁹.
   4. Dodaj 10 000 komórek/cm² do studzienek.
   5. Zwiększyć ilość pożywki do 100 μl na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C.

Wyniki

Korzystając z tej metody, wyprodukowaliśmy hydrożele z normalnych płuc świń, szczurów i myszy (Rysunek 1). Przetworzone płuca dostarczają szacunkowo odpowiednio 5 mg, 40 mg i 10 g proszku ECM. Przegląd procesu przedstawiono na rysunku 2. Kluczowe wizualizacje podczas procesu obejmują: biały wygląd płuc po wypłukaniu deoksycholanu; po utworzeniu żelu wstępnego roztwór powinien być nieprzezroczysty, a roztwór powinien wydawać się jednorodny przez wiele mies...

Dyskusja

Jednym z integralnych aspektów biologii jest samoorganizacja cząsteczek w hierarchiczne struktury, które wykonują określone zadanie. ¹³ W laboratorium samoorganizacja zależy od wielu czynników, takich jak stężenie soli, pH i czas trawienia. Jak pokazano, samoorganizujący się hydrożel powstaje, gdy rozpuszczone białka wracają do temperatury fizjologicznej. Powstały hydrożel jest zdolny do promowania przyczepiania się i proliferacji komórek in vitro.

Odpowiedź komórkowa na sy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Stosować w dygestoriach z ochroną oczu i rękawicami.
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750-100g	Stosować w kapturze z ochroną oczu i rękawicami.
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	M7506-500g	Brak
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C1016-500g	Brak
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	Brak
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	Stosować z ochroną oczu i rękawicami.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	Stosować w dygestoriach z ochroną oczu i rękawicami.
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	BP359-500	Stosować z ochroną oczu i rękawicami.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Stosować w dygestorium z ochroną oczu i rękawicami.
PBS 10x	Quality Biological	119-069-151	Brak
PBS	VWR	45000-448	Brak
Bibuła filtracyjna	Whatman	8519	N/A
Pompka ręczna	Fisher Scientific	10-239-1	/A
Zlewka podyplomowa	VitLab	445941	Nie dotyczy
Cryomill	SPEX	6700	Używać rękawic kriogenicznych i oczu ochrona.
Liofilizator	FTS FlexiDry		Używaj rękawiczek.
Reometr	Discovery	HR-2	Używać rękawic i ochrony oczu.