Artykuł metodologiczny

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

DOI:

10.3791/55101

⸱

3 stycznia 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston, 3Delaware Biotechnology Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten szczegółowy protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do produkcji sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego osadzonych w hydrożelach PEGDA. W tym miejscu opisujemy tworzenie wirtualnych masek, które pozwalają na sterowanie laserem sterowane obrazem; fotopolimeryzacja mikroformowanego hydrożelu PEGDA, odpowiedniego do wytwarzania sieci mikroprzepływowych i przepływu sterowanego ciśnieniem; ustawienie i użycie dostępnego na rynku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego w połączeniu z femtosekundowym impulsowym laserem Ti:S w celu wywołania degradacji hydrożelu; oraz obrazowanie wytworzonych sieci mikroprzepływowych przy użyciu form fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej. Znaczna część protokołu koncentruje się na prawidłowej konfiguracji i implementacji oprogramowania mikroskopu i mikroskopu makro, ponieważ są to kluczowe kroki w użyciu komercyjnego mikroskopu do celów produkcji mikroprzepływowej, która zawiera szereg zawiłości. Komponent sterowany obrazem tej techniki pozwala na implementację stosów obrazów 3D lub modeli 3D generowanych przez użytkownika, umożliwiając w ten sposób kreatywne projektowanie mikroprzepływowe i wytwarzanie złożonych układów mikroprzepływowych o praktycznie dowolnej konfiguracji. Metody opisane w niniejszym protokole, mające oczekiwany wpływ na inżynierię tkankową, mogą pomóc w wytwarzaniu zaawansowanych biomimetycznych konstruktów mikrotkanek dla urządzeń narządowych i urządzeń typu human-on-a-chip. Naśladując złożoną architekturę, krętość, rozmiar i gęstość naczyń krwionośnych in vivo, można odtworzyć w tych konstruktach podstawowe procesy transportu biologicznego, co prowadzi do dokładniejszego modelowania in vitro farmakokinetyki leków i choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ naczyniowy, składający się zarówno z układu limfatycznego, jak i sercowo-naczyniowego, tworzy bardzo gęste sieci, które są niezbędne do transportu składników odżywczych i tlenu oraz do usuwania produktów przemiany materii. W związku z tym komórki znajdujące się w unaczynionych tkankach nigdy nie znajdują się dalej niż 50-100 μm od naczynia1. Zdolność do odtworzenia architektury naczyniowej in vivo in vitro ma kluczowe znaczenie dla dokładnego modelowania procesów transportowych in vivo przy użyciu konstrukcji inżynieryjnych. W związku z niedawnym dążeniem do opracowania urządzeń typu organ-on-a-chip2 do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków3,4 i modelowania chorób5,6, metody tworzenia sieci mikroprzepływowych, które rekapitulują transport in vivo w syntetycznych lub naturalnych hydrożelach, cieszą się dużym zainteresowaniem. Aby poprawić biomimikrę mikrotkanek stosowanych w tych urządzeniach, opracowaliśmy sterowaną obrazem, laserową metodę degradacji hydrożelu, która wykorzystuje trójwymiarowe (3D) stosy obrazów natywnego naczynia krwionośnego jako szablony do generowania naczyniowych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach PEGDA7. Protokół ten przedstawia zastosowanie dostępnego na rynku laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w femtosekundowy laser impulsowy do wytwarzania biomimetycznych sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego w hydrożelach PEGDA poprzez degradację sterowaną obrazem na bazie lasera.

Obecne podejścia do fluidyzacji hydrożeli obejmują indukcję naczyniotwórczych8-10 lub angiogennych10-12 technik samoorganizacji komórek śródbłonka i mikrofabrykacji w celu stworzenia predefiniowanych kanałów do śródbłonka13-16. Podczas gdy sieci samoorganizujące się podsumowują gęstość i złożoną architekturę mikrokrążenia, często są one bardziej przepuszczalne niż sieci in vivo 11,17,18, co może być problematyczne w modelowaniu transportu do zastosowań przesiewowych leków. Samoorganizujące się sieci składają się z fizjologicznie istotnych naczyń o rozmiarach kapilary, ale mogą być trudne do zintegrowania z przepływem płynu objętościowego ze względu na ograniczenia w generowaniu większych naczyń wielkości tętniczki. Ponieważ nie ma bezpośredniej kontroli nad montażem tych sieci, ostateczna architektura może się różnić w zależności od próbki, co utrudnia wielokrotne tworzenie sieci o tych samych właściwościach przepływu i transportu płynów.

Aby wygenerować 3D, osadzone w hydrożelu sieci mikroprzepływowe o powtarzalnej geometrii i dobrze zdefiniowanej architekturze, opracowano szereg technik mikrofabrykacji, w tym modułowy montaż13, druk 3D materiałów ofiarnych16, montaż bezpośredniego zapisu14 i druk dookólny15. Stosując te metody, architektura mikroprzepływowa, a tym samym właściwości przepływu i transportu płynów, mogą być wielokrotnie wytwarzane w wielu konstrukcjach. Głównym ograniczeniem tych podejść jest jednak niemożność stworzenia sieci mikroprzepływowych o cechach kapilarnych, od 4 do 10μm19. Większość technik mikrowytwarzania jest często ograniczona do elementów o średnicy od 150 do 650 μm13,16. Niektóre istniejące techniki są w stanie generować sieci hierarchiczne z kanałami w szerokim zakresie średnic, od 10 do 300 μm dla montażu bezpośredniego zapisu14 i od 18 do 600 μm dla drukowania dookólnego15, ale ich zdolność do generowania gęstych sieci lub wytwarzania wielu sieci mikroprzepływowych w bliskiej odległości w ramach jednego konstruktu7 jest ograniczona.

Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, opracowaliśmy sterowaną obrazem, laserową technikę degradacji hydrożelu, która pozwala na powtarzalne wytwarzanie biomimetycznych, hierarchicznych sieci mikroprzepływowych, które podsumowują architekturę mikrokrążenia in vivo. W tym celu laser impulsowy o długości fali 790 nm i napaści 140 femtosekund (fs) pracujący z częstotliwością 80 MHz jest skanowany rastrowo w żądanych lokalizacjach 3D w hydrożelu, zgodnie z obrazami naczyń krwionośnych in vivo. Spekulujemy, że proces degradacji przebiega poprzez indukowany laserem optyczny rozkład wody, wynikające z tego tworzenie się plazmy, następującą po niej szybką termoelastyczną ekspansję wody i lokalną degradację hydrożelu w miarę rozszerzania się wody20. Mechanizm ten różni się nieznacznie od laserowej degradacji hydrożeli na bazie białek21-24. W przeciwieństwie do PEGDA, która ma niski przekrój wielofotonowy, białka często mają duży przekrój wielofotonowy i dlatego ulegają degradacji w wyniku pęknięcia chemicznego wywołanego absorpcją wielofotonową23. Aby wygenerować sterowane obrazem sieci mikroprzepływowe, migawka laserowa jest kontrolowana przez wirtualne maski pochodzące z obrazu, które składają się z mozaiki obszarów zainteresowania9 definiujących architekturę mikroprzepływową. Korzystając z tego podejścia, wykazaliśmy zdolność do wytwarzania biomimetycznych sieci mikroprzepływowych 3D pochodzących z naczyń krwionośnych, które rekapitulują gęstą i krętą architekturę naczyń krwionośnych in vivo, w celu lokalnej kontroli porowatości hydrożeli poprzez zmianę ilości energii dostarczanej podczas degradacji. Udało nam się również wygenerować dwie niezależne sieci mikroprzepływowe, które przeplatają się w bliskiej odległości (15 μm), ale nigdynie łączą się bezpośrednio7. Wykazaliśmy również zdolność do endotelializacji mikrokanałów zdegradowanych laserowo poprzez funkcjonalizację po degradacji za pomocą sekwencji peptydowej ligującej integryny, argininy-glicyny-kwasu asparaginowego-seryny (RGDS), w celu promowania adhezji komórek śródbłonka i tworzenia światła7.

Dzięki temu protokołowi, generowanie złożonych sieci mikroprzepływowych w hydrożelach PEGDA jest możliwe dzięki sterowanej obrazem, laserowej degradacji za pomocą komercyjnie dostępnego mikroskopu dostępnego na wielu kampusach uniwersyteckich. Ponieważ proces degradacji jest kierowany przez cyfrowe, wirtualne maski, ta technika wytwarzania jest podatna na kreatywne projektowanie sieci mikroprzepływowych, co pozwala na jej wykorzystanie w szerokiej gamie zastosowań. Przewidujemy, że opisana tu metoda będzie najkorzystniejsza w projektowaniu biomimetycznych urządzeń narządowych i human-on-a-chip, zdolnych do replikacji procesów transportu biologicznego, istotnych w modelowaniutransportu leków2. Ta technika wytwarzania może być również interesująca dla generowania modeli chorób in vitro, w tym przerzutów raka5,6 i modeli bariery krew-mózg25. Ponieważ degradacja hydrożelu na bazie lasera była wcześniej wykorzystywana do tworzenia ścieżek do kierowania wzrostem neuronów21-23, sterowane obrazem rozszerzenie tej techniki może okazać się przydatne w zaawansowanych strategiach inżynierii tkankowej do pozycjonowania komórek w zdefiniowanych przez użytkownika układach przestrzennych 3D.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie masek wirtualnych

UWAGA: Stos obrazów 3D mikrokrążenia mózgu myszy został wybrany jako model mikroprzepływowy dla tego protokołu, po wybraniu ze znacznie większego zestawu danych zawierających obrazy całego mikrokrążenia mózgu myszy. Obrazy mikronaczyniowe uzyskano za pomocą mikroskopii skaningowej z ostrzem nożowym (KESM)26,2; podobne dane mikronaczyniowe są powszechnie dostępne w atlasie mózgu myszy KESM28.

  1. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania obrazu29, a następnie otwórz i przytnij stos obrazów 3D TIF natywnego układu krwionośnego, tak aby żądana sieć mikroprzepływowa, która ma zostać wygenerowana w hydrożelu, zmieściła się w oknie 450 μm x 450 μm x 1,5 mm (x by y przez z). Aby to zrobić, narysuj kwadrat wokół żądanego obszaru i kliknij "Obraz" → "Przytnij". Usuń plasterki w kierunku z, klikając "Obraz" → "Duplikuj" i wpisz żądany zakres plasterków.
    UWAGA: Gwarantuje to, że pożądane cechy mieszczą się w polu widzenia (x na y) (531,2 x 531,2 μm w przypadku korzystania z obiektywu 20X (NA1.0) do zanurzenia w wodzie o rozmiarze ramki 2,884 x 2,884 piksela i powiększeniu 0,8 przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego) oraz odległości roboczej (z) obiektywu do zanurzenia w wodzie 20X (NA1.0). Jeśli nie jest znane, pole widzenia dla innych systemów można określić, uzyskując obraz z żądanym obiektywem i ustawieniami.
  2. Obróć stos obrazów tak, aby obiekty były przede wszystkim wyrównane do kierunku skanowania rastrowego lub kierunku x, klikając "Obraz" → "Przekształć" → "Obróć". Skraca to czas potrzebny na produkcję.
  3. Przeskaluj przycięty stos obrazów tak, aby rozmiar piksela odpowiadał lub przekraczał ustawienia używane do degradacji w mikroskopie konfokalnym (0,184 μm/piksel w przypadku korzystania z 20-krotnego (NA1,0) obiektywu zanurzonego w wodzie o rozmiarze klatki 2,884 na 2,884 pikseli i powiększeniu 0,8). Aby to zrobić, kliknij "Obraz" → "Dostosuj" → "Rozmiar" i wpisz "2446" jako "Szerokość" (tj. 450 μm lub rozmiar obrazu podzielony przez 0,184 μm/piksel).
  4. Próg/binaryzuj stos obrazów, wpisując "Ctrl + Shift + T". Odznacz "Ciemne tło" i kliknij "zastosuj" → "ok". Zakończ proces, klikając "Obraz" → "Tabele przeglądowe" → "Odwróć LUT".
  5. Korzystając z niestandardowego algorytmu (kod źródłowy jest dostępny w materiale uzupełniającym do przywoływanego rękopisu) w oprogramowaniu do programowania9, dopasuj binaryzowane (białe) cechy do mozaiki czworokątów o pojedynczej wysokości piksela równoległych do kierunku skanowania rastrowego (kierunek x), aby wygenerować obszary zainteresowania (ROI), które kierują pozycją lasera i migawką9, 7,30,31,32.
    UWAGA: Algorytm niestandardowy9 konwertuje każdą pojedynczą płaszczyznę w stosie obrazów TIF na plik zabezpieczeń na poziomie wiersza.
  6. Zmień rozszerzenie plików zabezpieczeń na poziomie wiersza na . OVL do stosowania podczas degradacji.

2. Konfiguracja laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Podczas gdy inne laserowe mikroskopy skaningowe wyposażone w lasery impulsowe mogą być używane, ustawienia i protokół tutaj opisują użycie laserowego mikroskopu skaningowego (LSM) w połączeniu z jego oprogramowaniem.

  1. Przy włączonym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym otwórz oprogramowanie mikroskopu i kliknij "Start System". Wybierz obiektyw "W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" w zakładce "Konserwacja".
  2. Ustawianie konfiguracji "Wizualizacja hydrożelu"
    1. W zakładce "Akwizycja" upewnij się, że linia lasera (laser argonowy 514 nm) jest wybrana i włączona w oknie "Laser". UWAGA: Ten kanał służy do obrazowania hydrożelu za pomocą fluorescencji eozyny Y w celach orientacyjnych7.
    2. W oknie "Imaging Setup" ustaw "Mode" na "Channel Mode", ustaw "Przełącz ścieżkę co" na "Frame" i wybierz "Track1".
    3. W oknie "Ścieżka światła" należy wybrać tylko detektor fluorescencyjny Ch1 o zakresie od 516 do 735 nm, filtr rozdzielacza wiązki głównej (MBS) 458/514 na linii światła widzialnego oraz płytkę w linii światła niewidzialnego. Usuń zaznaczenie detektora lampy fotopowielacza jasnego pola, "T-PMT".
    4. W oknie "Tryb akwizycji" sprawdź, czy wybrany jest właściwy obiektyw i ustaw "Tryb skanowania" na "Ramka", "Rozmiar ramki" na "2884" w X i Y, "Krok linii" na "1", "Uśrednianie liczb" na "1", "Tryb uśredniania" na "Linia", "Metoda uśredniania" na "Średnia", "Głębia bitowa" na "16 bitów" i "Kierunek" na "<->" do skanowania dwukierunkowego.
    5. W oknie "Tryb akwizycji" ustaw "Prędkość" zgodnie z potrzebami i ustaw "Corr X" i "Y" na "0.05" lub dostosuj w razie potrzeby dla konkretnego używanego mikroskopu. Usuń zaznaczenie opcji "HDR".
    6. W oknie "Tryb akwizycji" upewnij się, że "Obszar skanowania" wyświetla "Rozmiar obrazu" "531.2 μm x 531.2 μm" i "Rozmiar piksela" "0.18", z "Zoom" ustawionym na "0.8"; ustaw wszystkie inne wartości "Obszaru skanowania" na zero.
    7. W oknie "Kanały" wybierz "Ścieżka1" jako detektor fluorescencyjny Ch1. Wybierz linię laserową "514", z procentową mocą "10.0", "Otworkiem" "1AU", początkowym "Wzmocnieniem (Master)" "800", "Przesunięciem cyfrowym" "0" i "Wzmocnieniem cyfrowym" "1".
      UWAGA: Dostosuj te ustawienia w razie potrzeby dla konkretnego używanego mikroskopu.
    8. Zapisz tę konfigurację jako "Wizualizacja hydrożelu".
  3. Ustawianie konfiguracji "Tworzenie kanałów"
    1. W zakładce "Akwizycja" upewnij się, że linia lasera (790 nm 140 fs impulsowy laser Ti:S) jest wybrana i włączona w oknie "Laser". Ustaw "Korekcja GDD" na "4000", aby uzyskać maksymalną moc wyjściową przy 790 nm.
    2. Ustaw okno "Imaging Setup" (Ustawienia obrazowania) zgodnie z opisem w kroku 2.2.2.
    3. W oknie "Ścieżka światła" upewnij się, że nie wybrano żadnych detektorów fluorescencyjnych, z filtrem MBS 458/514/561/633 na linii światła widzialnego i filtrem MBS 760+ na linii światła niewidzialnego. Usuń zaznaczenie detektora lampy fotopowielacza jasnego pola, "T-PMT".
    4. W oknie "Tryb pozyskiwania" sprawdź, czy na liście znajduje się właściwy cel. Ustaw "Prędkość" na "3" i wszystkie inne ustawienia zgodnie z opisem w kroku 2.2.4.
    5. W oknie "Kanały" wybierz "Track1" jako detektor T-PMT. Wybierz linię lasera "790", z procentową mocą "100.0", początkowym "Wzmocnieniem (Master)" wynoszącym "800", "Przesunięciem cyfrowym" wynoszącym "0" i "Wzmocnieniem cyfrowym" wynoszącym "1".
    6. W oknie "Etap" wyzeruj etap, klikając "ustaw zero". Zaznacz lokalizację, klikając "Oznacz". Ma to kluczowe znaczenie dla przesyłania masek wirtualnych do makra mikroskopu w kroku 3.
    7. W oknie "Szeregi czasowe" ustaw "Cykle" jako "1", a "Interwał" jako "0".
    8. W oknie "Wybielacz" zaznacz pole "Rozpocznij wybielanie po # skanach" i ustaw je na wartość "0 z 1". Wybierz "Różne prędkości skanowania" z wartością "3" (co odpowiada czasowi przebywania piksela wynoszącemu 8,96 μs/piksel). Wybierz "Bezpieczny wybielacz dla GaAsP".
    9. W sekcji linii laserowej w oknie "Wybielacz" wybierz linię lasera 790 i ustaw procent mocy na "100.0". Pozostaw wszystkie inne pola w oknie wybielacza niezaznaczone. Zapisz ustawienia wybielacza w oknie "Wybielacz".
    10. Zapisz tę konfigurację jako "Tworzenie kanału".
      UWAGA: Okna "Z-Stack", "Regions", "Focus" i "Stage" są również ważne dla tego protokołu, ale nie muszą być ustawiane ani dostosowywane podczas początkowej konfiguracji.

3. Tworzenie receptury i wgrywanie wirtualnych masek do oprogramowania mikroskopu i makro

  1. Gdy laserowy skaningowy mikroskop konfokalny jest nadal uruchomiony, a oprogramowanie mikroskopu jest nadal włączone, wybierz tylko okno "Regiony" (obok przycisku "Rozpocznij eksperyment") w konfiguracji "Tworzenie kanałów".
  2. Aby upewnić się, że maski prawidłowo ładują się do makra mikroskopu, ustaw procentową moc w oknie "Kanały" na "0.2", a "Prędkość" w oknie "Tryb akwizycji" na "8" i kliknij "Snap" w lewym górnym rogu ekranu.
  3. Sprawdź, czy rozmiar obrazu nadal wynosi "531.2 μm x 531.2 μm", z rozmiarem piksela "0.18", w zakładce "Informacje" obrazu. Jeśli te wartości nie są poprawne, sprawdź ponownie wartości "Rozmiar ramki" i "Powiększenie".
  4. KRYTYCZNE: Sprawdź, czy położenia X i Y w oknie "Stage" są wyzerowane i czy pozycja jest zaznaczona przed otwarciem makro mikroskopu. Patrz krok 2.3.6.
  5. Aby otworzyć makro mikroskopu, wpisz "Alt+F8", kliknij "Załaduj" i wybierz odpowiednią wersję. Szczegółowe informacje znajdują się w Wykazie konkretnych materiałów/wyposażenia. W oknie "Macro Control" otworzy się długa lista makr podrzędnych.
  6. W oknie "Macro Control" kliknij "Uruchom", aby otworzyć makro mikroskopu, a następnie zamknij okno "Macro Control".
    UWAGA: Alternatywne wersje mikroskopu makro mogą nie być kompatybilne z degradacją hydrożelu na bazie lasera przy użyciu tego protokołu.
  7. W zakładce "Zapisywanie" makra mikroskopu podaj dowolną "Podstawową nazwę pliku", wybierz "Wyjście pojedynczego pliku" i wybierz folder "Plik tymczasowy". Ustaw "Otwórz folder tymczasowy" na lokalizację "1", wybierz "Pojedynczy tymczasowy folder obrazów" i nazwij przepis w "Przechowuj/Zastosuj przepis" z zaznaczoną opcją "Przywołaj listę lokalizacji". Kliknij "Sklep", aby początkowo utworzyć przepis.
  8. Na karcie "Akwizycja" makra mikroskopu upewnij się, że "Konfiguracja skanowania" jest zgodna z nazwą nadaną konfiguracji oprogramowania mikroskopu ustawionej w kroku 2.3. Ustaw "liczbę punktów czasowych w bloku" na "1", z "interwałem" "0". Upewnij się, że opcja "Oznaczone Z - Wierzchołek stosu Z" jest podświetlona na zielono. Wszystkie inne ustawienia domyślne są w porządku, tak jak są.
  9. W zakładce "Czas" makra mikroskopu upewnij się, że opcja "Opóźnienie oczekiwania" jest podświetlona na zielono, ustaw "Powtórzenia eksperymentu" i "Powtórzenia grupowe" na "1" i "Interwał oczekiwania przed blokiem tylko w pierwszej lokalizacji" na "0". Wszystkie inne ustawienia domyślne są w porządku, tak jak są.
    UWAGA: Pole "Powtórzenia grupowe" (a nie "Powtórzenia eksperymentu") to miejsce, w którym można ustawić liczbę skanów laserowych w danym regionie (tj. powtórzeń przepisu).
  10. W zakładce "Lista Z" makra mikroskopu określone są płaszczyzny degradacji w kierunku z. Ustaw odstępy z "dZ" na "1 μm", z ustawioną "liczbą pozycji" tak, aby odpowiadała liczbie masek wirtualnych, które mają być używane.
  11. Kliknij przycisk "Utwórz stos Z", aby "Lista Z" pojawiła się na liście rozwijanej "Lista lokalizacji" w dolnej części okna. Sprawdź, czy liczba lokalizacji i odstępy z są prawidłowe oraz czy lokalizacje X i Y są wyzerowane.
    UWAGA: Jeśli tak nie jest, nie przechowuj przepisu; Zamknij makro mikroskopu i powtórz krok 2.3.6 przed ponownym otwarciem mikroskopu makro i ponownym ustawieniem receptury.
    UWAGA: Zamiast na przykład zamiast 100 masek rozmieszczonych w odstępach 1 μm każda, korzystne może być posiadanie 50 masek, z których każda jest używana dwukrotnie i oddalonych od siebie o 1 μm, aby uzyskać równoważną strukturę mikroprzepływową, ponieważ ładowanie pojedynczych masek do mikroskopu makro może być czasochłonne.
  12. W zakładce "Wybielacz" makra mikroskopu wszystkie maski muszą być załadowane i dopasowane do określonej numerowanej lokalizacji na "Liście lokalizacji". Aby rozpocząć, zaznacz pole "Wybielacz" i upewnij się, że "Config." jest zgodne z nazwą ustawień wybielacza w oknie "Wybielacz" na głównym ekranie oprogramowania mikroskopu (patrz krok 2.3.8). Ustaw "Opóźnienie oczekiwania po wybielaniu" na "0", odznacz "miejsce" i pozostaw pole "ROI" puste.
  13. Nie zmieniaj niczego w zakładkach "Lokalizacja", "Kafelek", "Siatka", "Autofokus", "Bloki" i "Opcje" z ustawień domyślnych.
  14. Aby załadować maski do makra mikroskopu, wybierz tylko okno "Regiony" w oprogramowaniu mikroskopu i otwórz kartę "Wybielacz" makro mikroskopu. W oknie "Regiony" kliknij "Załaduj" i wybierz . Plik OVL dla maski na dole stosu z, który jest degradowany.
    UWAGA: Pierwszym miejscem na "liście Z" jest spód stosu z, a makro mikroskopu dociera do górnej części stosu z, czyli hydrożelu.
  15. Gdy lista ROI pojawi się w oknie "Regiony", kliknij przycisk strzałki, aby wyświetlić ROI maski w polu view (na obrazie uchwyconym w kroku 3.2). Sprawdź, czy zwroty akcji mieszczą się w polu widzenia.
  16. Aby zapisać załadowaną maskę w makrze mikroskopu, nadaj masce nazwę i numer w polu "Dodaj bieżący region do listy ROI" na karcie "Wybielacz", a następnie kliknij przycisk "Dodaj bieżący region do listy ROI". Nazwa i numer pojawią się na liście rozwijanej "ROI" wraz z innymi maskami (w tym maskami z innych wcześniej utworzonych przepisów). Usuń maskę w oknie "Regiony" w oprogramowaniu mikroskopu.
  17. Powtórz kroki 3.14 i 3.16, aby przesłać i zapisać wszystkie maski w makrze mikroskopu.
  18. Aby przypisać przesłane maski do każdej lokalizacji Z, podświetl pozycję 1 w rozwijanej liście "Lista lokalizacji". Wybierz odpowiedni zwrot z inwestycji z listy rozwijanej "ROI". Upewnij się, że pole "Wybielacz" jest zaznaczone u góry zakładki "Wybielacz" w makro mikroskopu.
  19. Powtórz krok 3.18 dla wszystkich pozycji w rozwijanej liście "Lista lokalizacji", a następnie kliknij "Sklep" w zakładce "Zapisywanie", aby zapisać przepis w ostatecznej formie.

4. Fotopolimeryzacja hydrożelu PEGDA

  1. Wytwarzanie sterylnego buforowanego roztworu soli fizjologicznej HEPES (HBS) z trietanoloaminą (TEOA)
    1. Do 1-litrowej zlewki dodać 500 ml DI H2O. Za pomocą mieszadła wymieszać 2,922 g chlorku sodu, 1,196 g HEPES i 7,5 ml TEOA w dygestorium.
    2. Doprowadzić do pH 8,3 za pomocą 1 N roztworu wodorotlenku sodu, dodając kroplami za pomocą pipety Pasteura.
    3. Sterylnie przefiltruj roztwór przez próżniowy kubek filtracyjny 0,2 μm do 500 ml autoklawizowanej szklanej butelki na pożywkę. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przymocuj pierścień dwustronnego kleju z podkładem do specjalistycznej szalki Petriego o średnicy 60 mm z 20-milimetrowym otworem wyciętym w dnie. Pozostawiając podłoże na pierścieniu samoprzylepnym, wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza spomiędzy szalki Petriego a kleju.
  3. Przygotuj materiały. Wydobyć zsyntetyzowany33 3,4 kDa PEGDA z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej. Włącz źródło światła białego co najmniej 15 minut przed fotopolimeryzacją hydrożeli.
  4. W dygestorium dodać 1 ml HBS z TEOA do pokrytej folią, bursztynowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml (używanej w celu zapobiegania ekspozycji fotoinicjatora na światło, eozyny Y). Dodać 10 μl 1 mM soli disodowej eozyny Y w DI H2O.
  5. W dygestorium ekstrahować niewielką objętość 1-winylo-2-pirolidynonu (NVP) do szklanej zlewki za pomocą pipety Pasteura. Z tej objętości odpipetować 3,5 μl NVP do bursztynowej probówki wirówkowej z HBS, TEOA i eozyną Y.
  6. Do drugiej, pokrytej folią, bursztynowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml (używanej w celu zapobiegania błędnej fotoaktywacji roztworu prepolimeru) dodać 10 mg PEGDA o pojemności 3,4 kDa. Dodać 0,2 ml roztworu HBS, TEOA, eozyny Y, NVP, aby uzyskać 5% w/v roztworu prepolimeru PEGDA. Wirować, aż PEGDA całkowicie się rozpuści. Za pomocą miernika mocy i różdżki detektora wyreguluj natężenie źródła światła białego na 95 mW.
  7. Budowa formy z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS)
    1. Zbuduj formę PDMS7 na większej powierzchni (szkło, naczynie do hodowli tkankowych z polistyrenu) dla łatwości obsługi i zmontuj formy tak, aby formowane hydrożele mieściły się w okręgu o średnicy 20 mm.
    2. Aby wygenerować hydrożel w kształcie prostokąta o grubości 500 μm, umieść dwie przekładki PDMS o grubości 500 μm na powierzchni PDMS, aby utworzyć dwie zdefiniowane krawędzie hydrożelu.
    3. Dołącz przekładkę PDMS 300 μm, aby nadać głębinie o głębokości 300 μm na powierzchni hydrożelu, co jest pomocne przy wprowadzaniu płynów.
  8. Odpipetować 60 μl 5% w/v roztworu prepolimeru PEGDA na formę PDMS. Należy uważać, aby podczas pipetowania nie pojawiły się pęcherzyki powietrza.
  9. Wyśrodkuj i umieść [3-(metakryloyloksy)propylo]trimetoksysilan (TMPSA) funkcjonalizowany 7, 40 mm średnicy, #1,5 szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu roztworu. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe spoczywa na podkładkach dystansowych PDMS 500 μm. Hydrożel zwiąże się z metakryloowanym szkiełkiem nakrywkowym i zapobiegnie unoszeniu się hydrożelu w roztworze.
  10. Umieść PDMS, roztwór prepolimeru PEGDA i szkiełko nakrywkowe pod białym źródłem światła na 3 minuty.
  11. Przepłynąć DIH 2O między formą a szkiełkiem nakrywkowym, aby oddzielić hydrożel od PDMS. Spłukać hydrożel środkiem DIH2O. Osuszyć brzegi szkiełka nakrywkowego chusteczką laboratoryjną. Uważaj, aby nie dotknąć ani nie ssącz wody z hydrożelu.
  12. Po usunięciu podłoża z kleju przyklej szkiełko nakrywkowe do przygotowanej szalki Petriego i delikatnie usuń pęcherzyki powietrza spomiędzy kleju a szkła. Zanurzyć hydrożel na szalce Petriego za pomocą DI H2O.
    UWAGA: Forma PDMS może być ponownie wykorzystana do produkcji dodatkowych hydrożeli, jeśli zostanie przepłukana DI H2O, wysuszona azotem i utrzymywana w stanie wolnym od kurzu.

5. Wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzących z naczyń krwionośnych za pomocą degradacji opartej na laserze

  1. Przy włączonym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym i oprogramowaniu mikroskopu wybrać obiektyw "W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC VIS-IR M27 75mm" w zakładce "Konserwacja". W zakładce "Akwizycja" upewnij się, że niezbędne linie laserowe (laser argonowy 514 nm i laser impulsowy Ti:S 790 nm 140 fs) są włączone i rozgrzane.
  2. Ustawianie hydrożelu w celu utworzenia kanału wlotowego
    1. Zamontuj hydrożel i szalkę Petriego na wkładzie stolika i umieść wkładkę stolika na stoliku mikroskopu. Napełnij szalkę Petriego co najmniej 5 ml DIH 2O. Wyśrodkuj hydrożel i elementy studzienki na oko przed opuszczeniem obiektywu zanurzenia w wodzie do DI H2O.
      UWAGA: Nie zgniataj hydrożelu obiektywem - oba nigdy nie powinny się stykać!
    2. Aby znaleźć hydrożel, przejdź do konfiguracji "Wizualizacja hydrożelu" z kroku 2.2. Kliknij "Na żywo", aby włączyć linię laserową i zbliżyć obiektyw do hydrożelu, aż będzie widoczny sygnał eozyny Y (wykryty przez detektor fluorescencyjny Ch1) z górnej części hydrożelu.
      UWAGA: Aby łatwo znaleźć hydrożel, można zwiększyć procentową moc lub otworzyć otwór. Jednak gdy cel skupi się na hydrożelu, zmniejsz procentową moc, aby chronić detektor fluorescencyjny i zmniejsz otwór z powrotem do 1AU, aby uniknąć przesycenia detektora i dokładnie znaleźć powierzchnię hydrożelu.
    3. W oknie "Etap" zaznacz położenie górnej i dolnej części hydrożelu oraz dna studzienki.
      UWAGA: Wartości z w tym miejscu pomogą w określeniu grubości hydrożelu i głębokości studni.
    4. Użyj joysticka, aby przesunąć się X i Y, aby znaleźć krawędź studni. Umieść hydrożel po prawej stronie ekranu, tak aby studzienka znajdowała się po lewej stronie lub odwrotnie. Pozwól, aby hydrożel wypełnił nie więcej niż dwie trzecie pola widzenia.
    5. Upuść płaszczyznę ostrości o 150 μm w dół do hydrożelu, ustawiając "Rozmiar kroku" na "150" w oknie "Ostrość" i klikając strzałkę w dół obok pola "Pozycja Z". W razie potrzeby powtórz krok 5.2.4.
      UWAGA: Położenie x, y i z wlotu zależy wyłącznie od konstrukcji masek wirtualnych.
    6. KRYTYCZNE: Wyzeruj lokalizację X i Y w oknie "Stół montażowy", usuń wszystkie inne zaznaczone lokalizacje i zaznacz tylko tę lokalizację.
      UWAGA: Jeśli ten krok nie zostanie wykonany, makro mikroskopu nie przywróci prawidłowo lokalizacji w wcześniej zapisanej recepturze, a hydrożel nie ulegnie degradacji w żądanym miejscu.
  3. Tworzenie kanału wlotowego
    1. "Przyciągnij" obraz i narysuj prostokątny obszar, który będzie wlotem do sieci naczyniowej, za pomocą przycisku prostokąta w oknie "Regiony".
      UWAGA: Upewnij się, że część obszaru rozciąga się do studni, aby zapewnić, że wlot połączy studnię z siecią naczyniową.
    2. Obok ROI wygenerowanego w oknie "Regiony" wybierz "Akwizycja" i odznacz "Wybielacz" i "Analiza".
    3. Zapisz konfigurację "Wizualizacja hydrożelu", odznacz "Regiony" i zmień konfigurację na "Tworzenie kanałów", ustawioną w kroku 2.3. W konfiguracji "Tworzenie kanałów" ponownie wybierz "Regiony".
      UWAGA: Przełączając się między konfiguracjami "Wizualizacja hydrożelu" i "Tworzenie kanałów", pamiętaj o odznaczeniu regionów w lewym górnym rogu ekranu. Czasami skalowanie regionów może się nieoczekiwanie zmieniać między konfiguracjami, jeśli nie zostanie to zrobione.
    4. W konfiguracji "Tworzenie kanałów" upewnij się, że wybrane są tylko "Regiony" i "Z-Stack". W oknie "Z-Stack" kliknij przycisk "Center" u góry, a następnie przycisk "Center" nad "Offset", aby ustawić środek stosu Z jako bieżącą pozycję Z. W zależności od tego, jak duży ma być wlot, ustaw liczbę "Plasterków" z "Interwałem" "1". Rozmiar stosu Z zostanie wyświetlony pod "Zakresem".
    5. Sprawdź, czy "Prędkość" w oknie "Tryb akwizycji" jest ustawiona na "3" i czy "Procent mocy" w oknie "Kanały" jest ustawiony na "100". Zapisz konfigurację i kliknij przycisk "Rozpocznij eksperyment".
      UWAGA: Makro mikroskopu nie jest wymagane do degradacji tego samego prostego kształtu na wielu płaszczyznach, jak to ma miejsce w przypadku generowania kanału wlotowego. Makro jest wymagane tylko podczas degradacji różnych regionów na każdej pojedynczej płaszczyźnie i służy do przechowywania masek wirtualnych w przepisie.
    6. Aby uwidocznić hydrożel podczas degradacji, zwiększ "Wzmocnienie (Master)" w oknie "Kanały", jeśli obszar w polu view jest, lub zmniejsz "Gain (Master)", jeśli obszar jest biały.
      UWAGA: Tworzenie się pęcherzyków w tym miejscu wskazuje na degradację hydrożelu indukowaną laserem.
    7. Aby zdegradować wlot wiele razy, a nie tylko raz, dostosuj "Cykle" w oknie "Szeregi czasowe".
    8. W konfiguracji "Wizualizacja hydrożelu" kliknij "na żywo", aby upewnić się, że wlot został utworzony.
  4. Przygotowanie hydrożelu do wytworzenia sieci mikroprzepływowej
    1. W oknie "Regiony" załaduj dowolny plik . OVL ze stosu z wirtualnego stosu masek i kliknij przycisk strzałki, aby zobaczyć ROI w polu view.
    2. Kliknij "Na żywo", aby zeskanować na żywo konfigurację "Wizualizacja hydrożelu" i użyj joysticka lub okna "Stage", aby ustawić hydrożel w X i Y, tak aby wlot łączył się z właściwym miejscem w sieci naczyniowej.
      UWAGA: Upewnij się, że ROI wirtualnej maski nieznacznie pokrywają się z wcześniej uformowanym wlotem.
    3. Upuść płaszczyznę ostrości o 50 μm w dół od poprzedniego wyśrodkowanego położenia Z lub 200 μm od powierzchni hydrożelu, używając opcji "Rozmiar kroku" w oknie "Ostrość" i klikając strzałkę w dół obok pola "Pozycja Z". Będzie to pierwsza pozycja w mikroskopie makro.
      UWAGA: Rzeczywista odległość, jaką należy przemieścić w kierunku z, zależy od projektu sieci. Upewnij się, że żądana sieć nie wystaje poza górną lub dolną powierzchnię hydrożelu w kierunku z.
    4. KRYTYCZNE: Wyzeruj lokalizacje X i Y w oknie "Etap", usuń wszystkie inne zaznaczone lokalizacje i zaznacz tylko tę lokalizację.
      UWAGA: Będzie to punkt wyjścia w mikroskopie makro. Receptura powróci do powierzchni hydrożelu.
    5. "Przyciągaj" obraz w konfiguracji "Wizualizacja hydrożelowa", usuń i odznacz "Regiony", a następnie zapisz konfigurację.
  5. Generowanie sieci mikroprzepływowej
    1. Zmień konfigurację na "Tworzenie kanałów" i wybierz tylko okna "Szeregi czasowe" i "Bielenie". Sprawdź, czy ustawienia okien "Szeregi czasowe" i "Wybielanie" są takie, jakie zostały pierwotnie ustawione w krokach 2.3.7 i 2.3.8.
    2. Ustaw "Prędkość" w oknie "Tryb akwizycji" na "8", a procentową moc linii laserowej na "0,2" w oknie "Kanały". Zapisz konfigurację.
    3. Otwórz makro mikroskopu, wykonując krok 3.5. Na karcie "Zapisywanie" makra wybierz wcześniej wykonany przepis z kroku 3 i kliknij "Zastosuj".
      UWAGA: Nie klikaj "Sklep", bo przepis zostanie nadpisany!
    4. Sprawdź ustawienia na wszystkich kartach i upewnij się, że maski wirtualne (. OVL) są nadal poprawnie powiązane z lokalizacjami Z na liście rozwijanej. Sprawdź również, czy pierwsze położenie Z jest zgodne z zaznaczonym miejscem w oknie "Stolik" oprogramowania mikroskopu.
      UWAGA: Wbrew intuicji, druga lokalizacja na liście rozwijanej będzie fizycznie znajdować się nad pierwszą lokalizacją, ponieważ makro mikroskopu będzie przesuwać się od dołu hydrożelu (najdalej od obiektywu) do górnej części hydrożelu (najbliżej obiektywu).
    5. Zapisz ponownie konfigurację "Tworzenie kanału", a następnie kliknij "Aktualizuj" w makrze mikroskopu. Kliknij "Nie", aby "Zastąpić bieżącą listę lokalizacji?", a następnie kliknij "Start" w makrze mikroskopu, aby rozpocząć przepis.

6. Wizualizacja sieci mikroprzepływowej

  1. Aby wyświetlić hydrożel i utworzoną sieć mikroprzepływową po degradacji, zamknij makro mikroskopu. Przełącz się na konfigurację "Wizualizacja hydrożelu", aby view sygnał eozyny Y hydrożelu; Zdegradowana sieć będzie wyglądać na ciemną.
    UWAGA: Degradacji hydrożelu nie można zobaczyć, gdy makromikroskop jest uruchomiony.
  2. Aby zobaczyć konkretnie sieć mikroprzepływową, użyj konfiguracji "Wizualizacji hydrożelu" przy niższej mocy lasera, aby umożliwić obrazowanie wprowadzonego dekstranu znakowanego fluoresceiną (FITC), który ma jaśniejszy sygnał niż natywny sygnał eozyny Y hydrożelu.
  3. Przed wprowadzeniem znakowanego fluorescencyjnie dekstranu należy odsączyć wodę ze studni do hydrożelu za pomocą tkanki laboratoryjnej. Odpipetować 10 μl 5 mg/ml 2,000 kDa znakowanego FITC dekstranu w DI H2O (wstępnie przefiltrowany przez filtr strzykawkowy 0,2 μm).
    UWAGA: Użyj dowolnego dekstranu o wielkości 2,000 kDa lub większej, aby zapobiec dyfuzji do żelu. W przypadku obrazowania trwającego dłużej niż 30 minut należy użyć etapu inkubacji o wilgotności 60% (lub wyższej), aby zapobiec wysychaniu hydrożelu i parowaniu wody z roztworu dekstranu znakowanego FITC.
  4. Usuń hydrożel i szalkę Petriego ze sceny i oznacz szalkę Petriego, aby umożliwić łatwą lokalizację utworzonej sieci naczyniowej podczas późniejszych eksperymentów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wygenerowania trójwymiarowej, naczyniowej sieci mikroprzepływowej, wykorzystaliśmy stos obrazów 3D naczyń mózgowych myszy, które zostały uzyskane za pomocą mikroskopii skaningowej (KESM)26,27. Wybrany region 3D z większego zestawu danych mikrokrążeniowych został przekształcony w serię wirtualnych masek do tworzenia sieci mikroprzepływowych sterowanych obrazem, jak opisano powyżej. Po wytworzeniu powstałą sieć mikroprzepływową poddano perfuzji roztworowi dekstranu o masie 2000 kDa znakowanego FITC i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stos obrazów układu naczyniowego in vivo, który zdefiniował architekturę sieci (ryc. 1A i C) oraz wytworzoną sieć mikroprzepływową (ryc. 1B i D) wykorzystano do wygenerowania projekcji Z (ryc. 1A i B) oraz renderingów 3D (ryc. 1C i D). Porównanie obrazów pokazuje, że sterowana obrazem, laserowa degradacja hydrożelu umożliwia wytwarzanie biomimetycznych sieci mikroprzepływowych 3D, które podsumowują rozmiar, krętość i złożoną architekturę naczyń krwionośnych in vivo. Technika ta jest podatna na wytwarzanie sieci zawierających szeroki zakres średnic; na rysunku 1 wygenerowano kanały o średnicy od 3,3 do 28,8 μm. Zauważ, że większa prostokątna struktura w lewym górnym rogu rysunku 1B i w lewym rogu rysunku 1D jest kanałem wlotowym wprowadzającym przepływ do sieci.

figure-results-1
Rysunek 1: Sieć mikroprzepływowa wywodząca się z naczyń krwionośnych. Seria wirtualnych masek, pochodzących ze stosu obrazów unaczynienia mózgu myszy (A i C), została wykorzystana do wytworzenia biomimetycznej sieci mikroprzepływowej 3D osadzonej w hydrożelu PEGDA (B i D) poprzez sterowaną obrazem degradację opartą na laserze. Sieć mikroprzepływową perfundowano dekstranem znakowanym FITC o masie 2000 kDa i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Projekcje Z (A i B) oraz renderingi 3D (C i D) obu sieci wykazują zdolność do generowania sieci mikroprzepływowych, które podsumowują gęstość, organizację i ogólną architekturę układu naczyniowego in vivo. Strzałka (D) oznacza prostokątny wlot utworzony w celu wprowadzenia dekstranu. Podziałka skali reprezentuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wdrożyliśmy dwie metody, głowice ciśnieniowe i pompy strzykawkowe, aby zainicjować przepływ płynów w tych wbudowanych sieciach mikroprzepływowych. Na przykład wyprodukowano prostokątny kanał o wymiarach 30 na 30 μm, aby połączyć dwie studzienki w mikroformowanym hydrożelu PEGDA (rysunek 2A), z przepływem płynu napędzanym przez głowicę ciśnieniową7. Wytworzona w lewej studni głowica ciśnieniowa indukowała przepływ przez mikrokanał do studni po prawej stronie. Na rysunku 2A zaobserwowano początkowy front dekstranu o mocy 70 kDa znakowanego tetrametylorodaminą (TRITC) za pomocą mikroskopii poklatkowej. Później, na rysunku 2B, fluorescencyjna kula z polistyrenu o średnicy 10 μm przepływała z lewej studni, przez kanał, do studni po prawej. Dzięki czasowi przepływu kontrolowanemu przez objętość płynu obecnego w mikroformowanej studzience na wlocie oraz natężeniu przepływu kontrolowanym przez gradient hydrostatyczny generowany między studnią wlotową i wylotową, przepływ napędzany głowicą ciśnieniową w hydrożelach mikroformowanych zapewnia prostą metodę indukcji przepływu, bez potrzeby stosowania zewnętrznej obudowy lub pompy strzykawkowej.

figure-results-2
Rysunek 2: Przepływ sterowany ciśnieniem w mikroformowanym hydrożelu PEGDA. PEGDA została poddana mikroformowaniu w celu utworzenia hydrożelu zawierającego dwie studzienki połączone wbudowanym mikrokanałem. W lewej studni wytworzono głowicę ciśnieniową, aby zainicjować przepływ znakowanego TRITC dekstranu o stężeniu 70 kDa (A1-A3) i kuli polistyrenowej o grubości 10 μm (B1-B3) przez prostokątny kanał o wymiarach 30 na 30 μm z jednej studzienki do drugiej. Podziałka skali reprezentuje 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Alternatywnie, aby wygenerować stały przepływ płynu w sieciach mikroprzepływowych, przepływ napędzany pompą strzykawkową może być zainicjowany przez fotopolimeryzację hydrożelu wewnątrz wtórnego urządzenia mikroprzepływowego z portami wlotowymi i wylotowymi do połączenia pompy strzykawkowej. Na rysunku 3A pokazano dostępne na rynku, prefabrykowane urządzenie mikroprzepływowe z 1-milimetrowym pasmem hydrożelu fotopolimeryzowanego na całej szerokości urządzenia7. Degradacja oparta na laserze została zaimplementowana w celu wytworzenia kanałów i sieci mikroprzepływowych w umieszczonych hydrożelach przy użyciu tego samego protokołu, który opisano tutaj dla hydrożeli wolnostojących. Przepływ generowany przez pompę strzykawkową można zobaczyć na rysunku 3B, gdzie cylindryczny kanał o średnicy 20 μm został wykonany w hydrożelu umieszczonym w urządzeniu mikroprzepływowym. W tym kanale o średnicy 20 μm pojedyncze fluorescencyjne kulki polistyrenowe o średnicy 2 μm można łatwo rozdzielić bez przepływu płynu (rysunek 3B1), podczas gdy po zastosowaniu natężenia przepływu 5 μl/s kulki poruszają się w polu widzenia, o czym świadczą smugi (rysunek 3B2). To samo podejście zastosowano do indukowania przepływu przez sieć 2D pochodzącą z naczyń krwionośnych w celu monitorowania przepływu znakowanego TRITC dekstranu o stężeniu 65 kDa przez sieć i dyfuzji do otaczającego hydrożelu (Figura 3C).

figure-results-3
Rysunek 3: Przepływ napędzany pompą strzykawkową w hydrożelach PEGDA polimeryzowanych w obudowach mikroprzepływowych. W dostępnym na rynku, prefabrykowanym urządzeniu mikroprzepływowym (A) z mikrokanalikiem o wymiarach 17 x 3,8 x 0,53 mm (x,y,z) znajduje się fotopolimeryzowany hydrożel PEGDA o wymiarach 1 x 3,8 x 0,53 mm (x,y,z), oznaczony czarną strzałką. Cylindryczny kanał o średnicy 20 μm został zdegradowany przez hydrożel, a kulki z polistyrenu o średnicy 2 μm zostały przepompowane przez urządzenie (B). Kule są wyraźnie rozdzielone bez przepływu płynu (B1), ale pojawiają się jako smugi przy natężeniu przepływu 5 μL/s (B2). W innym hydrożelu w domie, sieć 2D pochodząca z naczyń krwionośnych została wyprodukowana i znakowana TRITC, dekstran 65 kDa został przepompowany przez sieć (C). Mikroskopia poklatkowa została wykorzystana do monitorowania fluorescencyjnego dekstranu, gdy wypełniał kanały i dyfundował do otaczającego hydrożelu. Białe strzałki w (B) i (C) wskazują kierunek przepływu płynu. Pasek kalibracji w (C) wskazuje intensywność dekstranu fluorescencyjnego. Podziałki reprezentują 20 μm w (B1) i (B2) oraz 50 μm w (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe znaczenie dla zastąpienia standardowych funkcji oprogramowania mikroskopu w celu umożliwienia użycia wirtualnych masek do degradacji laserowej sterowanej obrazem, makro mikroskopu musi być starannie skonfigurowane i manipulowane. Sposób, w jaki oprogramowanie mikroskopu łączy się z mikroskopem makro, może być czasami sprzeczny z intuicją, dlatego włożono wiele wysiłku w określenie optymalnych ustawień w obu programach, aby opracować tę metodę. Zaleca się ogólne zrozumienie podstaw korzystania z laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, zwłaszcza w przypadku okien "Stage" i "Focus" w celu znalezienia i prawidłowego ustawienia hydrożelu w wymiarach x, y i z, przed przystąpieniem do degradacji laserowej. Ponadto wykonanie kanału wlotowego ma kluczowe znaczenie dla protokołu; Zawieszone formy fluorescencyjne muszą być w stanie przedostać się do systemów mikroprzepływowych w celu pomyślnego obrazowania i charakteryzacji sieci. Należy zauważyć, że protokół ten ma zastosowanie do określonego skaningowego mikroskopu konfokalnego ze skaningiem laserowym skonfigurowanego z określonym laserem impulsowym femtosekundowym, z uruchomionymi określonymi wersjami oprogramowania mikroskopu i mikroskopu makro (patrz szczegóły w Wykazie określonych materiałów/sprzętu). Odkryliśmy, że nowsze wersje mikroskopu makro nie mają niezbędnej kontroli i funkcjonalności potrzebnej do sterowania laserowego sterowanego obrazem. Chociaż można stosować inne platformy mikroskopowe i impulsowe źródła laserowe, protokół ten dotyczy konkretnie tego systemu i będzie wymagał modyfikacji w zależności od zaimplementowanej platformy, źródła lasera i oprogramowania. Zasady leżące u podstaw tego protokołu nadal jednak obowiązują.

Potencjalna modyfikacja tego protokołu polega na zmianie składu hydrożelu. W tym przypadku wykorzystaliśmy hydrożele PEGDA o stężeniu 5% wag., 3,4 kDa, ale degradacja laserowa (do celów innych niż generowanie sieci mikroprzepływowych) została zaimplementowana w celu degradacji zarówno syntetycznych, jak i naturalnych hydrożeli, w tym PEGylowanego fibrynogenu21,22, hydrożeli białka jedwabiu23 i kolagenu24. Regulacja mocy lasera, prędkości skanowania, odstępów między warstwami Z i liczby powtórzeń pomoże w określeniu optymalnych parametrów wytwarzania sieci mikroprzepływowych w innych preparatach hydrożelowych.

Jednym z obecnych ograniczeń tej techniki jest całkowita objętość hydrożelu, który może ulec degradacji w rozsądnym czasie. Aby utworzyć otwarte puste przestrzenie lub cechy mikroprzepływowe w hydrożelu, czas przebywania lasera musi wynosić co najmniej 8,96 μs/piksel (lub prędkość skanowania laserowego 0,021 μm/μs) przy użyciu fluencji lasera 37,7 nJ/μm2. Przy tych ustawieniach degradacja naczyń w objętości 0,014 mm3 zajmuje 1,4 godziny (jak pokazano na rysunku 1). Przy czasie przebywania lasera wynoszącym 4,48 μs/piksel lub niższym, dostarczana energia nie jest wystarczająca do pełnej degradacji zastosowanej tutaj formuły hydrożelowej. Wdrożenie innego składu hydrożelu mogłoby przezwyciężyć to ograniczenie. Stosowanie żeli fotolabilnych, które zawierają składniki wrażliwe na światło34-36 lub hydrożeli o dużych przekrojach wielofotonowych21-24 są dobrymi opcjami, które umożliwiłyby użycie mniejszej ilości energii i skutkowałyby szybszą degradacją. Ze względu na ograniczenia wymiarowe, w hydrożelu7 zastosowano elementy o głębokości do 1,5 mm. Osiągalna głębokość zależy od odległości roboczej obiektywu i może być zwiększona za pomocą obiektywów o bardzo dużej odległości roboczej zoptymalizowanych pod kątem obrazowania in vivo . Najmniejszy zmierzony kanał7 utworzony przy użyciu obiektywu 20X (NA1.0) zanurzonego w wodzie miał szerokość 3,3 μm i głębokość 8,9 μm, co jest na równi z rozmiarem najmniejszych kanałów wygenerowanych na rysunku 1. Podczas gdy inne laboratoria używały niższych obiektywów NA21,23,24, przewidujemy, że sieci mikroprzepływowe o mniejszych cechach mogą być generowane przy użyciu wyższych obiektywów NA kosztem zmniejszonej odległości roboczej. Ostatecznie jednak rozdzielczość techniki jest funkcją funkcji rozproszenia punktowego skupionej wiązki laserowej, właściwości skanowania laserowego, ilości energii dostarczanej przez laser oraz właściwości absorpcji lasera przez degradowany materiał.

Ponadto właściwości lasera (prędkość, fluencja, odstępy między wirtualnymi maskami i liczba powtórzeń) muszą być zoptymalizowane w oparciu o właściwości hydrożelu (gęstość usieciowania, masa cząsteczkowa makromeru/monomeru, procent wagowy i rodzaj hydrożelu: na bazie białka vs. syntetyczny), ponieważ będą one z natury zmieniać interakcje z laserem, a tym samym ostateczną rozdzielczość procesu. Ze względu na to, że na dostarczaną energię wpływa również zastosowany cel, przy przełączaniu między celami wymagana jest dodatkowa optymalizacja. Jeśli chodzi o związane z tym koszty, wymagany jest dostęp do mikroskopu z laserem impulsowym i chociaż można używać wielu różnych obiektywów, te o wysokim NA i dużej odległości roboczej (do obrazowania in vivo ) mogą być drogie.

Poza opisanym tutaj protokołem, sieci mikroprzepływowe wygenerowane przy użyciu tej techniki mogą być również funkcjonalizowane za pomocą peptydów adhezyjnych po kanale w celu wywołania adhezji komórek śródbłonka i tworzenia światła7. Dodatkowo, włączenie degradowalnych przez komórki sekwencji peptydowych do materiału sypkiego9 przed degradacją kanału może pozwolić na badanie migracji komórek do hydrożelu i przez niego. W celu ciągłej fluidyzacji sieci mikroprzepływowej w hydrożelu, hydrożele mogą być fotopolimeryzowane w większych urządzeniach lub obudowach fluidycznych, jak pokazano na rysunkach 2 i 37.

Generowanie sieci naczyniowych poprzez samoorganizację naczyniopochodną lub angiogenną8-12 zapewnia proste podejście do indukowania unaczynienia w stosunkowo dużej objętości hydrożelu. Chociaż takie podejście skutkuje perfuzyjnymi sieciami fluidycznymi, trudno jest bezpośrednio kontrolować rozmiar, zawiłość, gęstość i ogólną architekturę sieci. Ze względu na to ograniczenie, profil przepływu i szybkości ścinania w układzie naczyniowym mogą się różnić w zależności od eksperymentu. Alternatywnie, techniki mikrowytwarzania13-16 pozwalają na bezpośrednią kontrolę nad architekturą sieci, ale często są ograniczone przez ich niezdolność do generowania małych, kapilarnych kanałów lub wytwarzanie gęstych sieci, które naśladują architekturę naczyniową in vivo. Podczas gdy opisana tutaj technika degradacji hydrożelu oparta na laserze została na nowo wykorzystana do generowania mikroprzepływów, jednocześnie pokonuje zarówno kontrolę architektoniczną, jak i ograniczenia oparte na rozmiarze istniejących metod mikrowytwarzania, umożliwiając tworzenie biomimetycznych sieci mikroprzepływowych 3D, które podsumowują gęstość, krętość, zakres rozmiarów i ogólną architekturę in vivo unaczynienie. Co więcej, w jednym hydrożelu można wygenerować wiele sieci fluidycznych, co pozwala na badanie transportu międzysieciowego7. Do zastosowań w inżynierii tkankowej, które dążą do ściślejszego odtworzenia procesów transportu in vivo in vitro, dobrze nadają się przedstawione tutaj sieci mikroprzepływowe o wysokiej rozdzielczości, osadzone w hydrożelu. Przewidujemy, że protokół ten będzie przydatny w opracowywaniu konstruktów tkankowych, które dokładniej naśladują transport in vivo, do wykorzystania jako urządzenia do badań przesiewowych leków i modele chorób in vitro.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Jeffowi Caplanowi i panu Michaelowi Moore'owi z Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center za ich wsparcie w mikroskopii konfokalnej. Dostęp do sprzętu mikroskopowego był wspierany przez National Institutes of Health (NIH) wspólne granty na oprzyrządowanie (S10 RR0272773 i S10 OD016361) oraz Federalny Program Grantów Badawczo-Rozwojowych Stanu Delaware (16A00471). Badania te były wspierane przez granty z Institutional Development Award (IDeA) z NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), American Cancer Society (14-251-07-IRG), University of Delaware Research Foundation (14A00778), Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013) oraz NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MATLABMathworksR2015anazwany "oprogramowaniem do programowania" w protokole; szczegółowe informacje na temat algorytmu
FIJI (Fiji is Just Image J)NIHwersja 1.51ao nazwie "oprogramowanie do przetwarzania obrazu" w protokole
LSM 780 Mikroskop konfokalnyZeiss nazwany"laserowo-skaningowy mikroskop konfokalny" w protokole; dla hydrożelu na bazie lasera degradacja
Zen 2010B SP1Zeisswydanie wersji 6.0o nazwie "oprogramowanie mikroskopu" w protokole; do użytku w Zeiss LSM-780
Multitime, 2010Zeissv16.0o nazwie "mikroskop makro" w protokole; do użytku w Zeiss LSM-780 (w połączeniu z Zen)
Obiektyw W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0,17 M27 75 mmZeiss421452-9880-000do użytku z Zeiss LSM-780
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S LaserCoherentnazwany w protokole "laserem impulsowym o dużej mocy"
Chlorek soduSigma-AldrichS5886-1KG
HEPESSigma-AldrichH3375-250G
Trietanoloamina (TEOA)Sigma-Aldrich90279-100MLłatwopalny; działa drażniąco na skórę i oczy; praca z w dygestoriach
Sód wodorotlenekSigma-AldrichS5881-500G
150 ml Próżniowe kubki filtracyjne z 0,2 i mikro; m Membrana PESVWR10040-460
PEGDAsyntetyzowana we własnym zakresieMetody syntezy można znaleźć w źródle 33; przechowywać pod argonem
Eozyna Y sól disodowaSigma-AldrichE6003-25G
1-winylo-2-pirolidynon (NVP)Sigma-AldrichV3409-5Gprzechowywać w atmosferze argonu; rakotwórcze; praca z w dygestoriach
3M Podwójnie powlekana taśma, 9500 sztuk, 6,0 milThomas Goldkamp37728
Flexmark 90 PFW LinerFLEXconFLX000620nośnik do obsługi podwójnie powlekanej taśmy
Model SC Ploter (obcinarka do kleju)USCutterSC631Esłuży do cięcia kleju w kształcie pierścienia do łączenia szkiełek nakrywkowych z szalkami Petriego
Szalka Petriego 60 mm z otworem 20 mmMatTek CorporationP60-20-F-NON
Oświetlacz o wysokiej intensywności (źródło światła białego)Fiber-Lite4715MS-12WB10
Miernik mocyNewport1916-Rwykrywa moc przy 524 nm podczas korzystania ze źródła światła białego
Wąska matryca Wykrywacz różdżekNewport918D-STdo użytku z miernikiem mocy
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychDow Corning3097358-1004używany do produkcji form PDMS; Zapoznaj się ze źródłem 7, aby zapoznać się z metodami
Formowane TMPSA #1.5 Szkiełka nakrywkowe, 40 mm okrągłesyntetyzowane we własnym zakresiepatrz źródło 7 dla metod
Dekstran, Fluoresceina, 2 000 000 MW, Anionowa, Lizyna FixableLife TechnologiesD7137może używać alternatywnego oznaczonego dekstransu; 2,000 kDa nie dyfunduje łatwo do 5% 3,4 kDa hydrożel PEGDA
1 ml Strzykawka, Luer-LokBD309628
Filtr strzykawkowy Acrodisc, 0,2 i mikro; m Membrana Supor, o niskim poziomie wiązania białekPallPN 4602
sticky-Slide VI0,4  Ibidi80601urządzenia mikroprzepływowe, które mogą być używane do przechowywania hydrożeli
,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
  2. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  3. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  4. Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
  5. Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
  6. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
  7. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
  8. Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
  9. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
  10. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489(2013).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
  12. Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
  13. He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
  14. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
  15. Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
  16. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  17. Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
  18. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
  19. Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
  20. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  21. Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
  22. Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
  23. Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
  24. Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
  25. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  26. Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
  27. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
  28. Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
  29. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
  31. Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
  32. Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
  33. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  36. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Degradacja laserowa sterowana obrazemwytwarzanie hydro elu PEGDAkonfiguracja mikroskopu konfokalnegolaser impulsowy femtosekundowykonfiguracja wizualizacji hydro elukonfiguracja formowania kana wgenerowanie wirtualnej maskiprzep yw sterowany g owic ci nieniow

Powiązane artykuły