Method Article

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie najpierw opisujemy protokół produkcji mikroprzepływowego chipa, ze złotymi kropkami i obszarami pokrytymi fibronektyną na tym samym szklanym podłożu, który precyzyjnie kontroluje generowanie tandemowych pęcherzyków i pojedynczych komórek wzorzystych w pobliżu o dobrze zdefiniowanych lokalizacjach i kształtach. Następnie demonstrujemy generowanie pęcherzyków tandemowych za pomocą dwóch impulsowych laserów oświetlających parę złotych kropek z kilkumikrosekundowym opóźnieniem czasowym. Wizualizujemy interakcję pęcherzyka-pęcherzyk i powstawanie dżetów za pomocą szybkiego obrazowania i charakteryzujemy wynikowe pole przepływu za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV). Na koniec przedstawiamy niektóre zastosowania tej techniki do analizy pojedynczych komórek, w tym porację błony komórkowej z wychwytem makrocząsteczek, zlokalizowaną deformację błony określoną przez przemieszczenia dołączonych kulek wiążących integryny oraz wewnątrzkomórkową odpowiedź wapnia z obrazowania ratiometrycznego. Nasze wyniki pokazują, że szybki i kierunkowy przepływ strumieniowy jest wytwarzany przez tandemową interakcję pęcherzykową, która może wywierać wysoce zlokalizowane naprężenie ścinające na powierzchnię komórki hodowanej w bliskiej odległości. Co więcej, różne efekty biologiczne mogą być wywoływane poprzez zmianę siły przepływu strumieniowego poprzez dostosowanie odległości dystansu od komórki do pęcherzyków tandemowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Coraz powszechniejsze jest uznanie, że niejednorodność komórek, wynikająca ze stochastycznej ekspresji genów, białek i metabolitów, istnieje w dużej populacji komórek i służy jako podstawowa zasada w biologii, umożliwiająca adaptację i ewolucję komórek1. W związku z tym często niedokładne i niewiarygodne jest stosowanie masowych pomiarów populacyjnych w celu zrozumienia funkcji poszczególnych komórek i ich interakcji. Opracowywanie nowych technologii analizy pojedynczych komórek cieszy się zatem dużym zainteresowaniem w badaniach biologicznych i farmakologicznych i może być wykorzystane na przykład do lepszego zrozumienia kluczowych szlaków i procesów sygna....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikrofabrykacja

UWAGA: Wszystkie procedury mikrofabrykacji są wykonywane w pomieszczeniu czystym. Chromowana maska jest projektowana przed mikroprodukcją, patrz rysunek 2.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat konstrukcji kanału w układzie mikroprzepływowym i wymiary zespołów roboczych. a) Projekt maski wyrównanych mikrokanalików PDMS (zielony) i wzorów na podłożu szklanym (niebieski i czerwony). b) Powiększony obraz projektu maski w reprezentaty....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platforma mikroprzepływowa opisana w tej pracy może być używana do badania interakcji pęcherzyka-pęcherzyk i do analizy różnych efektów biologicznych wywołanych kawitacją na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy kilka przykładów, aby zademonstrować różnorodne badania eksperymentalne i testy biologiczne, które można przeprowadzić w naszym systemie eksperymentalnym. Najpierw zilustrujemy przejściowe oddziaływania pęcherzyków tandemowych z powstawaniem dżetu, wizualizację.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza pojedynczych komórek, w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek, znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat dynamicznych i często zmiennych procesów zachodzących w poszczególnych komórkach, takich jak rozwój fenotypu i odpowiedź immunologiczna23. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hodowli komórkowych w szalkach lub kolbach, systemy mikroprzepływowe umożliwiają precyzyjną kontrolę mikrośrodowiska, aż do poziomu pojedynczej komórki, w czasie rzeczywistym. W związku z tym postępy w technologii i techni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za korzystanie z obiektu clean room SMIF na Uniwersytecie Duke'a. Chcemy również podziękować Hao Qiangowi za jego pomoc w pomiarze prędkości dżetu. Autorzy dziękują Toddowi Rumbaughowi z Hadland Imaging za dostarczenie kamery Shimadzu HPV-X użytej w tym badaniu. Prace zostały częściowo sfinansowane przez NIH poprzez granty 5R03EB017886-02 i 4R37DK052985-20.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Odczynnik/Materiały
75 mm x 38 mm Zwykłe szkiełka mikroskopoweCorning2947-75X38
AcetonSigma Aldrich, Co.320110Odczynnik ACS, ≥ 99,5%
Alkohol izopropylowySigma Aldrich, Co.W292907≥ 99,7%, FCC, FG
Kwas siarkowySigma Aldrich, Co.320501Odczynnik ACS, 95,0-98,0%
Nadtlenek wodoruSigma Aldrich, Co.21676330 % wag. w H2O
Primer P-20MicrochemMCC Primer 80/20
NFR photoresistJSRNFR016D2
PhotomaskPhotoplotstoreN/A4x4 Maska bezpośredniego zapisu
MF-319 DeveloperShipley (Rohm and Haas)Microposit MF-319
1165 Photoresist RemoverDow Chemical, Co. DEM-10018073bazie 1-metylo-2-pirolidynonu
Shipley (Rohm and Haas)S1813
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Folia parafinowaHACH251764
SU-2025 fotorezystorMicrochemSU-2025
PDMSDow Corning184 SIL ELAST KIT 0,5 kg
Rurka do mikrootworówSaint-Gobain PPL Corp.S-54-HL
Metalowe kołkiNew England Small TubeNE-1300-01Cut Tube (proste), 0,025" OD x 0,017" Średnica wewnętrzna x 0,50 cala Długie
komórki HeLaZakład Hodowli Komórek Duke'a(307-CCL-2) HeLa, p.148
Bufor DPBS (1x)
DMEMThermoFisher Scientific11995065
Fibronektyna Białko bydlęce, osoczeThermoFisher Scientific33010018
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)ThermoFisher Scientific25200056
Jodek propidynyThermoFisher ScientificP21493
Mikrosfery karboksylowe 1.00  μ mPolysciences, Inc08226-15
Mikrosfery karboksylowe 2.00  μ mPolysciences, Inc18327-10
EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu)ThermoFisher Scientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid)24510
Peptyt-2000Zaawansowany BioMatrix5020-5MG
FITC Załącznik VThermoFisher ScientificA13199
Fura-2, AMThermoFisher ScientificF1221
DMSOSigma Aldrich, Co.D2650
F-127invitrogenP68660.2 µ m przefiltrowane (10% roztwór w wodzie)
Zredukowane podłoże surowicy ThermoFisher Scientific11058021
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
Plasma asherEmitechK-1050XO2 / Ar spopielanie plazmowe fotorezystu i innych materiałów organicznych
Nakładka do masekSUSS MicroTec Karl Suss MA6/BA6
Parownik wiązki elektronicznejCHA IndustriesCHA Industries Solution E-Beam
RIETrion Technology Trion Technology Phantom II(tlenek / azotek / polimer) trawienie
StereoskopAmScopeAmerican Scope SM-4TZ-FRLMikroskop stereoskopowy
Pompa strzykawkowaChemyx IncNanoJet
Inkubator do hodowli komórkowychNuAireAutoFlow NU-8500 Płaszcz wodny Inkubator CO2 Szafy
Łaźnia wodnaVWR1122s
WirówkaIECCentra CL2
Mikroskop ZeissAxio Observer Z1
Laser Nd:YAG  (Laser 1)Laser New Wave ResearchTempest
Nd:YAG  (Laser 2)Badania Nowej FaliOriona
Berkeley Nucleonics BNC 565-8c
Lampa błyskowaDyna-LiteML1000 lampa błyskowa
DRS Hadland  Kamera szybkoobrotowa Imacon 200
szybkoobrotowaShimadzuHPV-X
Vision ResearchPhantom V7.3
Kamera LaVisionDaVis 7.2
Oprogramowanie ZeissAxioCam MRc 5
System ZeissAxioVision
PTIHoribaS/N: 1705 RAM-X
OprogramowanieEasyRatio HoribaEasy Ratio Pro 2wersja 2.3.125.86
63 i razy; obiektywZeissLD Plan Neofluar
Fotorezystuł S1813 na Pożywka hodowlana ThermoFisher Scientific 14190144 bezpieczeństwa biologicznego NuAire NU-425-400 Generator opóźnienia ze światłowodemKamera Oprogramowanie PIV

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic SystemSurface PatterningCavitation BubbleTandem BubblesSingle Cell AnalysisHigh Speed ImagingParticle Image VelocimetryCell Membrane PorationIntracellular Calcium ResponseGold Dot Patterning

Related Articles