Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W tym manuskrypcie najpierw opisujemy protokół produkcji mikroprzepływowego chipa, ze złotymi kropkami i obszarami pokrytymi fibronektyną na tym samym szklanym podłożu, który precyzyjnie kontroluje generowanie tandemowych pęcherzyków i pojedynczych komórek wzorzystych w pobliżu o dobrze zdefiniowanych lokalizacjach i kształtach. Następnie demonstrujemy generowanie pęcherzyków tandemowych za pomocą dwóch impulsowych laserów oświetlających parę złotych kropek z kilkumikrosekundowym opóźnieniem czasowym. Wizualizujemy interakcję pęcherzyka-pęcherzyk i powstawanie dżetów za pomocą szybkiego obrazowania i charakteryzujemy wynikowe pole przepływu za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV). Na koniec przedstawiamy niektóre zastosowania tej techniki do analizy pojedynczych komórek, w tym porację błony komórkowej z wychwytem makrocząsteczek, zlokalizowaną deformację błony określoną przez przemieszczenia dołączonych kulek wiążących integryny oraz wewnątrzkomórkową odpowiedź wapnia z obrazowania ratiometrycznego. Nasze wyniki pokazują, że szybki i kierunkowy przepływ strumieniowy jest wytwarzany przez tandemową interakcję pęcherzykową, która może wywierać wysoce zlokalizowane naprężenie ścinające na powierzchnię komórki hodowanej w bliskiej odległości. Co więcej, różne efekty biologiczne mogą być wywoływane poprzez zmianę siły przepływu strumieniowego poprzez dostosowanie odległości dystansu od komórki do pęcherzyków tandemowych.
Wprowadzenie
Coraz częściej dostrzega się, że heterogeniczność komórkowa, wynikająca ze stochastycznej ekspresji genów, białek i metabolitów, występuje w obrębie dużej populacji komórek i stanowi fundamentalną zasadę biologiczną umożliwiającą adaptację i ewolucję komórek1. W związku z tym stosowanie pomiarów zbiorczych dla całych populacji w celu zrozumienia funkcji poszczególnych komórek oraz ich interakcji jest często niedokładne i niewiarygodne. Opracowanie nowych technologii analizy pojedynczych komórek jest zatem przedmiotem dużego zainteresowania w badaniach biologicznych i farmakologicznych i może być wykorzystane, na przykład, do lepszego zrozumienia kluczowych szlaków sygnałowych i procesów w biologii komórek macierzystych oraz terapii nowotworów2-4. W ostatnich latach pojawienie się platform mikroprzepływowych znacznie ułatwiło analizę pojedynczych komórek, umożliwiając pozycjonowanie, traktowanie oraz obserwację odpowiedzi poszczególnych komórek przy użyciu nowatorskich strategii analitycznych5.
Kawitacja odgrywa istotną rolę w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych, w tym w leczeniu nowotworów za pomocą skoncentrowanego ultradźwięków o wysokiej intensywności (HIFU)6, nieinwazyjnej fragmentacji kamieni nerkowych poprzez litotryksję fal uderzeniowych (SWL)7, dostarczaniu leków lub genów poprzez sonoporację8 oraz niedawno opisanej destrukcji komórek lub tkanek za pomocą hydrodynamicznej kawitacji pęcherzykowej9,10. Mimo to dynamiczne procesy oddziaływań pęcherzyków kawitacyjnych z tkanką biologiczną i komórkami nie są jeszcze dobrze poznane. Wynika to z losowości inicjacji kawitacji oraz dynamiki pęcherzyków generowanych przez ultradźwięki, fale uderzeniowe i lokalne ciśnienie hydrauliczne; ponadto brakuje technik umożliwiających analizę z natury złożonych i szybkich odpowiedzi komórek biologicznych, zwłaszcza na poziomie pojedynczej komórki.
Ze względu na te wyzwania nie jest zaskakujące, że w literaturze opisano bardzo niewiele badań nad oddziaływaniami pęcherzyków z komórkami w ściśle kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Na przykład, za pomocą pojedynczych pęcherzyków generowanych laserowo w kanałach mikroprzepływowych zademonstrowano porację błony pojedynczych komórek uwięzionych w zawiesinie11 oraz impulsową dużą deformację ludzkich erytrocytów12. Ta druga technika pozwala jednak na wywołanie jedynie niewielkiej deformacji w komórkach eukariotycznych ze względu na obecność jądra komórkowego13. Co więcej, monitorowanie późniejszych bioefektów podczas traktowania komórek w zawiesinie jest utrudnione. W innych badaniach opisano pobudzenie ultradźwiękowe mikropęcherzyka związanego z komórką (lub środka kontrastowego do USG) w celu wywołania poracji błony i/lub wewnątrzkomórkowych odpowiedzi wapniowych w pojedynczych komórkach przylegających8. Porację błony pojedynczych komórek przylegających można również uzyskać, stosując tandemowe pęcherzyki generowane laserowo w cienkiej warstwie cieczy zawierającej absorbujący światło roztwór błękitu trypanu14, lub za pomocą oscylującego pęcherzyka gazu generowanego przez mikrosekundowe impulsy laserowe naświetlane przez optycznie absorbujący podłoże w mikrokomorach15. W porównaniu z roztworem błękitu trypanu, optycznie absorbujące podłoże ma tę przewagę, że błękit trypanu jest toksyczny dla komórek. Co ważniejsze, pęcherzyki generowane laserowo są łatwiejsze do kontrolowania pod względem rozmiaru i lokalizacji niż pęcherzyki wzbudzane akustycznie. Niemniej jednak we wszystkich tych wcześniejszych badaniach nie kontrolowano kształtu komórek, ich orientacji ani warunków adhezji, co może mieć istotny wpływ na odpowiedź komórkową i bioefekty wywołane naprężeniami mechanicznymi16.
Aby wyeliminować te niedociągnięcia z poprzednich badań, opracowaliśmy niedawno system eksperymentalny do generowania pęcherzyków, wzorowania komórek, badania oddziaływań pęcherzyk-pęcherzyk-komórka oraz bioanaliz odpowiedzi komórkowej w czasie rzeczywistym w chipie mikrofluidycznym, wykonanym przy użyciu unikalnej kombinacji technik mikrofabrykacji. Trzy główne cechy, które odróżniają nasz system eksperymentalny od innych w tej dziedzinie, to: 1) wzorowanie złotych kropek o rozmiarach mikronowych na szklanym podłożu, co umożliwia lokalną absorpcję lasera w celu generowania pęcherzyków17; 2) wzorowanie mikronowych wysepek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) dla adhezji komórek na tym samym podłożu, aby kontrolować zarówno położenie, jak i geometrię poszczególnych komórek; oraz 3) ograniczenie wymiarowości domeny oddziaływań pęcherzyk-pęcherzyk-komórka z przestrzeni 3D do przestrzeni quasi-2D, co ułatwia wizualizację w jednej płaszczyźnie oddziaływań między pęcherzykami, pól przepływu strumieni, deformacji komórek oraz efektów biologicznych, a wszystko to zostało zarejestrowane w jednej, usprawnionej sekwencji obrazowania (Ryc. 1d).
Rysunek 1: Chip mikroprzepływowy i schematy różnych analiz. a) Zmontowany chip mikroprzepływowy z kanałami wypełnionymi niebieskim atramentem w celu wizualizacji. b) Obszar wewnątrz chipa mikrofluidycznego z ułożonymi w określony wzór komórkami i złotymi kropkami (odległość między dwiema sąsiadującymi złotymi kropkami wynosi 40 µm). W kanale można rozmieścić wiele par jednostek roboczych. c) Zbliżenie pojedynczej jednostki roboczej składającej się z pary złotych kropek oraz przytwierdzonej do obszaru wzorowania komórek komórki HeLa. d) Schemat działania urządzenia. Pojedyncza komórka przylega i rozprzestrzenia się na wyspie w kształcie litery „H” pokrytej fibronektyną. Para pęcherzyków kawitacyjnych (pęcherzyki tandemowe) z oscylacją przeciwfazową jest wytwarzana poprzez naświetlanie impulsami wiązki lasera złotych punktów (patrz Rycina 4a), co prowadzi do powstania szybkiego i zlokalizowanego strumienia skierowanego w stronę pobliskiej komórki docelowej. W zależności odległości odstępu (S), komórka może ulec deformacji, poracji w celu poboru makrocząsteczek i/lub stymulacji odpowiedzi wapniowej.d) komórki do tandemowej pęcherzyka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Platformę tę można dodatkowo łączyć z testami fluorescencyjnymi oraz funkcjonalizowanymi kuleczkami przyczepionymi do powierzchni komórek w celu badania bioefektów indukowanych kawitacją. W szczególności platforma ta umożliwia przeprowadzanie wiarygodnych i mierzalnych analiz na poziomie pojedynczej komórki. Do tej pory wykorzystywaliśmy to urządzenie do analizy deformacji błony komórkowej indukowanej tandemowymi pęcherzykami, poracji komórek i pobierania wewnątrzkomórkowego, przeżywalności, apoptozy oraz odpowiedzi wapniowej wewnątrzkomórkowej. W poniższym protokole opisujemy proces produkcji chipa oraz procedurę analizy wspomnianych wyżej różnorodnych bioefektów. Ponadto opisano również zasady działania chipa.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Mikrofabrykacja
UWAGA: Wszystkie procedury mikrofabrykacji są wykonywane w pomieszczeniu czystej strefy. Przed mikrofabrykacją projektuje się maskę chromową, zobacz Rysunek 2.
Rycina 2: Schemat projektu kanałów w chipie mikroprzepływowym oraz wymiary jednostek roboczych. a) Projekt maski dla wyrównanych mikrokanałów PDMS (zielone) i wzorów na podłożu szklanym (niebieskie i czerwone). b) Powiększony obraz projektu maski w reprezentacyjnym fragmencie układów jednostek roboczych. c) Schemat jednej jednostki roboczej pokazujący wzór komórkowy (niebieski) i parę kropek złotych (czerwone). Wszystkie skale długości znajdują się w prawym dolnym rogu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Wzorzystanie plamek złota
UWAGA: Powierzchnia każdej plamki złota została zaprojektowana tak, aby mieściła się w zakresie 25–30 µm2, by była wystarczająco duża, aby pochłaniać energię laserową do generowania pęcherzyków, ale jednocześnie wystarczająco mała, by zapobiec przyleganiu pojedynczych komórek. Schematyczny rysunek przedstawiający proces wytwarzania plamek złota pokazano na ryc. 3a.- Czyszczenie szkiełek (pod wyciągiem chemicznym)
- Przepłucz szkiełko acetonem, a następnie alkoholem izopropylowym (IPA), a następnie osusz strumieniem N2.
- Zanurz szkiełko w roztworze piranha (H2SO4:H2O2 = 4:1) na 10 min.
- Wyjmij szkiełko, przepłucz wodą z odwróconą osmozą (DI), a następnie osusz strumieniem N2.
- Wypiecz szkiełko na płytce grzejnej w temperaturze 120 °C przez 10 min.
- Przetreatuj szkiełko w popielarce plazmowej przy mocy 100 W przez 90 s.
- Nakładanie cienkiej warstwy wirowo (pod wyciągiem do spin-coatingu)
- Włącz płytę grzejną i odczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 95 °C.
- Wykonaj procedurę nakładania:
1000 obr/min przez 5 s z rampą 500 obr/min/s;
następnie 3000 obr/min przez 30 s z rampą 1000 obr/min/s. - Umocuj oczyszczone szkiełko na spin-coaterze za pomocą próżni.
- Pokryj powierzchnię szkiełka warstwą P-20 i uruchom procedurę nakładania.
- Powtórz proces nakładania dla negatywnego światłoczułego polimeru NFR.
- Wypiecz szkiełko w temperaturze 95 °C przez 60 s i odczekaj, aż ostygnie do temperatury pokojowej.
- Fotolitografia
- Umieść maskę chromową w układarce masek, upewniając się, że strona z wzorem skierowana jest w dół, ku szkiełku.
- Ustaw procedurę fotolitografii w tryb ekspozycji sztywnej z ekspozycją UV trwającą 9 s i szybko wyrównaj podłoże szklane z maską.
- Po przeprowadzeniu ekspozycji UV wypiecz szkiełko w temperaturze 95 °C przez 1 min, a następnie odczekaj, aż ostygnie do temperatury pokojowej.
- Wywoływanie
- Wywołaj wzór na szkiełku w roztworze wywoływacza przez 60 s.
- Wyjmij szkiełko z wywoływacza, przepłucz wodą DI, a następnie osusz strumieniem N2.
- Sprawdź geometrię wzoru pod mikroskopem, zmierz i zanotuj rozmiar struktury.
- Nadtrzycie złota (naparowanie wiązką elektronową) i odlanie
- Wypiecz szkiełko w temperaturze 120 °C przez 5 min i odczekaj, aż ostygnie do temperatury pokojowej.
- Oczyść szkiełko plazmą w maszynie do reaktywnego trawienia jonowego (RIE) przez 90 s przy ciśnieniu 500 Torr i mocy 100 W.
- Nadtrzyj 5 nm tytanu i 15 nm złota na szkiełko za pomocą naparzarki wiązką elektronową17.
- Zanurz szkiełko na całą noc w szklanym naczyniu zawierającym rozpuszczalnik do usuwania światłoczułego polimeru, aby usunąć złoto osadzone na wierzchu polimeru NFR.
- Wyjmij szkiełko, przepłucz acetonem, a następnie IPA, i osusz strumieniem N2.
- Osusz szkiełko na płytce grzejnej w temperaturze 115 °C, zanim oczyścisz je w popielarce plazmowej tlenowej przy mocy 100 W przez 90 s.
- Czyszczenie szkiełek (pod wyciągiem chemicznym)
- Wzorzystanie molekularne metodą odlania (MAPL)
UWAGA: Powierzchnia każdej wyspy pokrytej fibronectyną została ustalona w zakresie 700–900 µm2, aby umożliwić wystarczające rozprzestrzenianie się komórek HeLa w obszarze kwadratowym, jednocześnie minimalizując ryzyko agregacji wielu komórek na jednej wyspie. Schematyczny rysunek przedstawiający przygotowanie wysp do wzorzystania komórek pokazano na ryc. 3b.- Nakładanie wirowe
- Powtórz krok 1.1.2, ale użyj pozytywnego światłoczułego polimeru S1813 i temperatury 115 °C.
- Wyrównana fotolitografia
- Umieść maskę chromową w układarce masek, upewniając się, że strona z wzorem skierowana jest w dół, ku szkiełku z plamkami złota.
- Ustaw procedurę fotolitografii w tryb ekspozycji sztywnej z ekspozycją UV trwającą 9 s.
- Wyrównaj górną maskę z dolnym szkiełkiem, używając znaczników wyrównawczych położonych wokół krawędzi maski jako odniesienia przestrzennego.
- Sprawdź centralną część maski i upewnij się, że struktury wzoru są poprawnie wyrównane.
- Zakończ ekspozycję UV bez wypiekania po ekspozycji.
- Wywoływanie
- Powtórz krok 1.1.3, ale z czasem wywoływania 45 s przed osuszeniem na płytce grzejnej i przechowywaniem w atmosferze N2.
- Nakładanie wirowe
- Obróbka chemiczna
- Przygotuj roztwór pasywujący: 0,5 mg/mL PLL-g-PEG w buforze HEPES o stężeniu 10 mM.
- Wyjmij szkiełko z przechowywania w atmosferze N2 i oczyść je za pomocą RIE z ustawieniami parametrów: ciśnienie 500 Torr, moc 100 W, czas trwania 90 s.
- Pipetą nanieś jedną kroplę roztworu pasywującego na folię parafinową.
- Umieść folię i szkiełko tak, by roztwór był pomiędzy nimi, upewniając się, że strona z wzorem skierowana jest w dół, ku folii; unikaj powstawania pęcherzyków.
- Odczekaj 45 min, zanim wyjmiesz szkiełko z folii.
- Zanurzaj szkiełko kolejno w roztworze do usuwania światłoczułego polimeru, mieszaninie roztworu do usuwania światłoczułego polimeru i wody DI (1:1) oraz w wodzie DI, mieszając w wannie ultradźwiękowej po 90 s dla każdego zanurzenia.
- Osusz szkiełko na płytce grzejnej, aby usunąć wilgoć, przed uszczelnieniem w eksykatorze i przechowaniem w lodówce.
- Montaż chipu
- Powtórz kroki 1.1.1–1.1.4, ale użyj negatywnego światłoczułego polimeru SU8-2025 i ustawień parametrów określonych w protokole Microchem18, aby przygotować formę krzemową z fotomaszką.
- Wytwórz mikrokanał PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm, D x S x W) oraz małą płytkę PDMS (żłób o szerokości 800 µm) metodą litografii miękkiej.
- Wykonaj otwory dostępowe do mikrokanału i oczyść go najpierw taśmą, a następnie IPA.
- Zasłoń obszar wzorzysty podłoża szklanego płytką PDMS i zastosuj RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s), aby usunąć PLL-g-PEG z obszaru peryferyjnego.
- Przetreatuj mikrokanał zmniejszoną dawką RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), a następnie wyrównaj go z wzorzystym podłożem szklanym (po usunięciu małej płytki PDMS); doprowadź mikrokanał i wzorzyste podłoże szklane do konformalnego kontaktu pod stereoskopem.
Rycina 3: Schematyczne rysunki mikrowytwarzania i montażu chipu. a) Wzór kropek złota na podłożu szklanym. b) Przygotowanie podłoża szklanego do wzorcowania komórek za pomocą MAPL. c) Montaż kanału mikropłynowego z zastosowaniem wiązania plazmowego. Definicje skrótów znajdują się na Liście Materiałów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Przyłączanie komórek
UWAGA: Komórki HeLa są standardowo utrzymywane w pożywce DMEM wzbogaconej o 10% FBS oraz 1% roztwór antybiotyku/antymityku w inkubatorze do hodowli komórkowej. Schematyczny rysunek montażu chipu i przyłączania komórek przedstawiono na ryc. 3c.- Przepłucz chip roztworem buforowym PBS przez 30 min z prędkością 1 µL/min, a następnie wprowadź roztwór fibronektyny (50 µg/mL w PBS, 1 µL/min) przez 45 min.
- W międzyczasie odetnij hodowlę komórkową 0,25% roztworem trypsyny-EDTA, przepłucz komórki w pożywce, odwirowuj pojedyncze komórki i zawieś je ponownie w podgrzanej (37 °C) pożywce w stężeniu 5x106 komórek/mL.
- Wymień roztwór fibronektyny na PBS i przepłucz chip z prędkością 10 µL/min przez 5 min.
- Wstrzyknij przygotowaną zawiesinę komórkową do chipu, zatrzymaj przepływ, zaciśnij wyjście i utrzymuj chip w inkubatorze do hodowli komórkowej przez 30 min.
- Otwórz wyjście i przepłucz chip pożywką do hodowli komórkowej z prędkością 10 µL/min przez 5 min. Następnie zmniejsz prędkość przepływu pożywki do 0,75 µL/min i utrzymuj hodowlę komórkową przez 2 h w inkubatorze.
2. Generowanie pęcherzyków i wizualizacja przepływu
UWAGA: Schemat układu doświadczalnego przedstawiono na ryc. 4a dla jednoczesnej generacji pęcherzyków oraz wynikającej z tego interakcji przepływu z pojedynczą komórką hodowaną w pobliżu w kanale mikroprzepływowym.
- Generacja bąbelków tandemowych za pomocą dwóch laserów i kontrola czasu
- Umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopu odwróconego i wycechuj ogniska dwóch impulsowych laserów Nd:YAG (λ = 532 nm, czas trwania impulsu 5 ns) na parze naniesionych kropek złota oddalonych o 40 µm.
- Użyj cyfrowego generatora opóźnień, aby wyzwolić oba lasery z opóźnieniem czasowym wynoszącym około 2,5 µs, w celu wytworzenia dwóch bąbelków inicjowanych na kropkach złota.
- Dostosuj energię wyjściową lasera (~10 µJ), aby uzyskać maksymalny średnicę bąbelków w zakresie 50 ± 2 µm.
- Synchronizuj kamerę wysokoprzepływową (ekspozycja 200 ns i 2 miliony klatek na sekundę (fps)) z laserami i zarejestruj dynamikę rozszerzania się bąbelków, ich zapadania, oddziaływania międzybąbelkowego oraz tworzenia się strumienia.
- Identyfikacja prędkości strumienia
- Zanotuj położenie czubka strumienia (J1) na końcu bliższym pierwszego bąbelka (B1) i na końcu dalszym B1, począwszy od momentu powstania drugiego bąbelka (B2) aż do chwili dotknięcia J1 dalszego końca B1; zobacz schemat na ryc. 5a.
- Wykonaj liniową dopasowanie przebiegu położenia dla obu końców – bliższego (czubek strumienia) i dalszego. Oblicz nachylenie krzywej położenia czubka w funkcji czasu dla końca bliższego, aby wyznaczyć prędkość strumienia. Punkt przecięcia się dwóch linii wskazuje czas dotknięcia strumienia. Więcej szczegółów można znaleźć w odniesieniu 19.
- Wizualizacja pola przepływu wywołanego bąbelkami tandemowymi
- Przygotuj zawiesinę kulek polistyrenowych (PS) o średnicy 1 µm w wodzie dejonizowanej (2,6% wag./obj.) i wprowadź kulki do chipu mikroprzepływowego.
- Wygeneruj bąbelki tandemowe zgodnie z opisem w krokach 2.1.1–2.1.3.
- Zarejestruj dynamikę bąbelków tandemowych za pomocą kamery wideo wysokoprzepływowej z szybkością nagrywania 5 M fps i czasem ekspozycji 100 ns.
- Prześlij uzyskany sekwencję obrazów do komercyjnego oprogramowania PIV.
- Podziel każdy obraz na mniejsze okna analizy o rozmiarze 16 × 16 pikseli (px) z 75% nakładaniem.
- Zastosuj iterację wieloetapową i filtry regionalne, aby zmniejszyć błędy w obliczeniach pola prędkości, i wygeneruj mapę wektorów prędkości.
Rycina 4: Schemat układu doświadczalnego i rejestracji obrazów. a) Układ doświadczalny do generowania bańki tandemowej. b) Sekwencja czasowa stosowana do różnych typów rejestracji obrazów. FL: mikroskopia fluorescencyjna, BF: jasne pole, IFT: czas międzyklatkowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Analiza pojedynczych komórek i efekty biologiczne
UWAGA: Bąbel tandemowy powstaje obok komórek docelowych, a powstające efekty biologiczne są badane w zależności od odległości standoff. Sekwencja czasowa różnych typów pozyskiwania obrazów przedstawiona jest na Figure 4b.
- Przebicie błony i pobieranie makrocząsteczek
UWAGA: Wchłanianie makrocząsteczek pozakomórkowych przez komórkę docelową charakteryzuje się stopniową dyfuzją nieprzenikliwego przez błonę jodu propidyny (PI) przez miejsce poracji w błonie komórkowej.- Po kroku 1.5 wymień zwykły ośrodek hodowlany (czyli DMEM) z roztworem PI (100 µg/mL w DMEM) działających przy przepływie perfuzji wynoszącym 0.5 µL/min przez cały eksperyment.
- Zaprogramuj oprogramowanie sterujące mikroskopem, aby automatycznie wybierało fluorescencyjny filtr PI na obrotowej wieżyczce i zsynchronizowało czas pracy kamery CCD z wzbudzeniem fluorescencji PI w celu uzyskania obrazów fluorescencyjnych z czasem ekspozycji 200 ms.
- Po wyrównaniu dwóch ognisk laserowych do pary złotych kropek obok komórki docelowej zarejestruj zarówno obrazy w polu jasnym (BF), jak i fluorescencyjne (FL) przed podwójnym zabiegiem bańkowym.
- Za pomocą oprogramowania sterującego mikroskopy natychmiast rozpocząć rejestrowanie fluorescencyjnych obrazów w trybie timelapse dla docelowej komórki tuż po kroku 2.1, aby uchwycić historię wchłaniania jodku propidyny (PI).
- Deformacja błony
- Przygotuj 1-µm beads (1% wag./obj., aktywowane rozpuszczalnym w wodzie karbodiimidem) i funkcjonalizować je peptydem-2000 (100 µg/mL w PBS
- Po kroku 1.5 inkubuj przytwierdzone komórki z funkcjonalizowanymi kulkami w gęstości 1x109 kulek/mL przy 37 °C przez 30 min.
- Powtórz krok 2.1, aby wytworzyć bąbelki tandemowe obok komórki docelowej, i rejestruj odkształcenie komórki za pomocą kamery nadwysokiej prędkości pracującej z szybkością nagrywania 5 milionów klatek na sekundę.
- Zidentyfikuj trójkę składającą się z 3 kulek, które pozostają na płaszczyźnie obrazowania przez cały czas trwania eksperymentu, i zebrzy ich położenia jako (x1, y1) (x2, y2) oraz (x3, y3) w układzie współrzędnych eksperymentu.
- Oblicz pole powierzchni triady przed i po zabiegu tandemowej bąbelkowej za pomocą wzoru:
- Oblicz odkształcenie powierzchniowe według wzoru:
- Na podstawie współrzędnych trzech wierzchołków przed i po zabiegu tandemowej pęcherzykowej oblicz lokalną odkształcalność główną oraz odkształcalność powierzchniową zgodnie z ustalonymi protokołami20,21.
- Żywalność i apoptoza
UWAGA: FITC Annexina V znakuje komórki, w tym apoptotyczne, poprzez ekspozycję fosfotydyloseryny (zielona fluorescencja). PI znakuje jądra komórek martwych (czerwona fluorescencja). Obrazowanie w kontraście fazowym służy do dokumentacji morfologii komórek oraz wspomagania identyfikacji żywotności komórek i apoptozy.- Zanotuj położenie każdej poddanej leczeniu komórki w kanale mikropłynowym (ułatwione przez etykiety adresowe w kanale, zobacz Rycina 2b) powtarzając krok 3.1.
- Hoduj poddane obróbce komórki w pożywce do hodowli komórkowej przez kolejne 2 godziny, zanim przepłuczisz chip roztworem FITC Annexiny V przez 15 minut. Komórki dodatnie wykazują zieloną fluorescencję.
- Powtórz krok 3.3.2 po 24 godzinach od zabiegu tandemowych pęcherzyków, aby zbadać długotrwałe skutki biologiczne w komórkach docelowych.
- Odpowiedź wapniowa
- Wymieszaj 3 µL fura-2 AM roztworu macierzystego (1 mg/mL w DMSO) z 3 µL 10% (m/v) Pluronic F-127 w 500 µL zmniejszonej ilości medium surowicowego w celu przygotowania końcowego roztworu znacznikowego (6 µM).
- Po kroku 1.5 wymień pożywkę do hodowli komórek na roztwór znacznikowy i inkubuj przez 40 min w temperaturze pokojowej w ciemności (1 µL/min prędkość przepływu
- Uzupełnij kanał ośrodkiem z obniżoną zawartością surowicy (0.75 µL/min prędkość przepływu) przed rozpoczęciem eksperymentu komórkowego.
- Rozpocznij obrazowanie ratiometryczne (długość fali: 340/380 nm, czas ekspozycji: 50 ms) komórki docelowej za pomocą komercyjnego systemu PTI.
- Po 10 sekundach obrazowania ratiometrycznego komórki na poziomie spoczynkowym wygeneruj bąbelki tandemowe zgodnie z krokiem 2.1; najpierw rejestruj z czasem międzyklatkowym (IFT) 0,1 s przez 1 minutę, następnie zwiększ IFT do 1 s na kolejną minutę, a po 2 minutach dalej zwiększ do 5 s.
- Użyj oprogramowania PTI do obliczenia stosunku R = F340/F380 w obszarze zainteresowania (ROI), który jest proporcjonalny do stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisana w niniejszej pracy platforma mikrofluidyczna może być wykorzystana do badania oddziaływań pęcherzyk-pęcherzyk oraz do analizy różnorodnych bioefektów indukowanych kawitacją na poziomie pojedynczych komórek. Przedstawiamy tutaj kilka przykładów, aby zademonstrować różnorodne badania eksperymentalne i testy biologiczne, które można przeprowadzić w naszym systemie doświadczalnym. W pierwszej kolejności zilustrujemy przejściowe oddziaływania tandemowych pęcherzyków z formowaniem się s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza pojedynczych komórek, w połączeniu z obrazowaniem żywych komórek, znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat dynamicznych i często zmiennych procesów zachodzących w poszczególnych komórkach, takich jak rozwój fenotypu i odpowiedź immunologiczna23. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hodowli komórkowych w szalkach lub kolbach, systemy mikroprzepływowe umożliwiają precyzyjną kontrolę mikrośrodowiska, aż do poziomu pojedynczej komórki, w czasie rzeczywistym. W związku z tym postępy w technologii i techni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować za korzystanie z obiektu clean room SMIF na Uniwersytecie Duke'a. Chcemy również podziękować Hao Qiangowi za jego pomoc w pomiarze prędkości dżetu. Autorzy dziękują Toddowi Rumbaughowi z Hadland Imaging za dostarczenie kamery Shimadzu HPV-X użytej w tym badaniu. Prace zostały częściowo sfinansowane przez NIH poprzez granty 5R03EB017886-02 i 4R37DK052985-20.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynnik/Materiały | |||
| 75 mm x 38 mm Zwykłe szkiełka mikroskopowe | Corning | 2947-75X38 | |
| Aceton | Sigma Aldrich, Co. | 320110 | Odczynnik ACS, ≥ 99,5% |
| Alkohol izopropylowy | Sigma Aldrich, Co. | W292907 | ≥ 99,7%, FCC, FG |
| Kwas siarkowy | Sigma Aldrich, Co. | 320501 | Odczynnik ACS, 95,0-98,0% |
| Nadtlenek wodoru | Sigma Aldrich, Co. | 216763 | 30 % wag. w H2O |
| Primer P-20 | Microchem | MCC Primer 80/20 | |
| NFR photoresist | JSR | NFR016D2 | |
| Photomask | Photoplotstore | N/A | 4x4 Maska bezpośredniego zapisu |
| MF-319 Developer | Shipley (Rohm and Haas) | Microposit MF-319 | |
| 1165 Photoresist Remover | Dow Chemical, Co. | DEM-10018073 | bazie 1-metylo-2-pirolidynonu |
| Shipley (Rohm and Haas) | S1813 | ||
| PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Folia parafinowa | HACH | 251764 | |
| SU-2025 fotorezystor | Microchem | SU-2025 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0,5 kg | |
| Rurka do mikrootworów | Saint-Gobain PPL Corp. | S-54-HL | |
| Metalowe kołki | New England Small Tube | NE-1300-01 | Cut Tube (proste), 0,025" OD x 0,017" Średnica wewnętrzna x 0,50 cala Długie |
| komórki HeLa | Zakład Hodowli Komórek Duke'a | (307-CCL-2) HeLa, p.148 | |
| Bufor DPBS (1x) | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | |
| Fibronektyna Białko bydlęce, osocze | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| 0,25% Trypsyna-EDTA (1x) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Jodek propidyny | ThermoFisher Scientific | P21493 | |
| Mikrosfery karboksylowe 1.00 μ m | Polysciences, Inc | 08226-15 | |
| Mikrosfery karboksylowe 2.00 μ m | Polysciences, Inc | 18327-10 | |
| EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu) | ThermoFisher Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Sulfo-NHS (N-hydroksysulfosukcynimid) | 24510 | |
| Peptyt-2000 | Zaawansowany BioMatrix | 5020-5MG | |
| FITC Załącznik V | ThermoFisher Scientific | A13199 | |
| Fura-2, AM | ThermoFisher Scientific | F1221 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Co. | D2650 | |
| F-127 | invitrogen | P6866 | 0.2 µ m przefiltrowane (10% roztwór w wodzie) |
| Zredukowane podłoże surowicy | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Uwagi |
| Equipment | |||
| Plasma asher | Emitech | K-1050X | O2 / Ar spopielanie plazmowe fotorezystu i innych materiałów organicznych |
| Nakładka do masek | SUSS MicroTec | Karl Suss MA6/BA6 | |
| Parownik wiązki elektronicznej | CHA Industries | CHA Industries Solution E-Beam | |
| RIE | Trion Technology | Trion Technology Phantom II | (tlenek / azotek / polimer) trawienie |
| Stereoskop | AmScope | American Scope SM-4TZ-FRL | Mikroskop stereoskopowy |
| Pompa strzykawkowa | Chemyx Inc | NanoJet | |
| Inkubator do hodowli komórkowych | NuAire | AutoFlow NU-8500 Płaszcz wodny Inkubator CO2 Szafy | |
| Łaźnia wodna | VWR | 1122s | |
| Wirówka | IEC | Centra CL2 | |
| Mikroskop Zeiss | Axio Observer Z1 | ||
| Laser Nd:YAG (Laser 1) | Laser New Wave Research | Tempest | |
| Nd:YAG (Laser 2) | Badania Nowej Fali | Oriona | |
| Berkeley Nucleonics | BNC 565-8c | ||
| Lampa błyskowa | Dyna-Lite | ML1000 lampa błyskowa | |
| DRS Hadland | Kamera szybkoobrotowa Imacon 200 | ||
| szybkoobrotowa | Shimadzu | HPV-X | |
| Vision Research | Phantom V7.3 | ||
| Kamera LaVision | DaVis 7.2 | ||
| Oprogramowanie Zeiss | AxioCam MRc 5 | ||
| System Zeiss | AxioVision | ||
| PTI | Horiba | S/N: 1705 RAM-X | |
| Oprogramowanie | EasyRatio Horiba | Easy Ratio Pro 2 | wersja 2.3.125.86 |
| 63 i razy; obiektyw | Zeiss | LD Plan Neofluar |
Bibliografia
- Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
- Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (20), 7630-7635 (2012).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. H. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465 (7299), 736-745 (2010).
- Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. Microfluidic single cell analysis: from promise to practice. Curr Opin Chem Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).
- Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nat Rev Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
- Zhu, S., Cocks, F. H., Preminger, G. M., Zhong, P. The role of stress waves and cavitation in stone comminution in shock wave lithotripsy. Ultrasound Med Biol. 28 (5), 661-671 (2002).
- Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16486-16491 (2012).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med. 238 (11), 1242-1250 (2013).
- Kosar, A., Sesen, M., Oral, O., Itah, Z., Gozuacik, D. Bubbly cavitating flow generation and investigation of its erosional nature for biomedical applications. IEEE Trans Biomed Eng. 58 (5), 1337-1346 (2011).
- Li, Z. G., Liu, A. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
- Li, F. F., Chan, C. U., Ohl, C. D. Yield Strength of Human Erythrocyte Membranes to Impulsive Stretching. Biophys J. 105 (4), 872-879 (2013).
- Li, F., M, M., Ohl, C. .D. . Shear stress induced stretching of red blood cells by oscillating bubbles within a narrow gap. Bull Am Phys Soc. 58, (2013).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Phys. Rev. Lett. 105 (7), 078101(2010).
- Fan, Q., Hu, W., Ohta, A. T. Laser-induced microbubble poration of localized single cells. Lab Chip. 14 (9), 1572-1578 (2014).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Yuan, F., Sankin, G., Zhong, P. Dynamics of tandem bubble interaction in a microfluidic channel. J Acoust Soc Am. 130 (5), 3339-3346 (2011).
- Microchem, SU-8 2000 Processing Guidelines. , Available from: http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2000_5thru2015Ver4.pdf (2000).
- Yang, C. Analysis of Tandem Bubble Interaction and Jet Formation in a Microfluidic Channel. , Duke University. (2013).
- Simon, S. I., Schmid-Schonbein, G. W. Cytoplasmic strains and strain rates in motile polymorphonuclear leukocytes. Biophys J. 58 (2), 319-332 (1990).
- Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
- Yuan, F., Yang, C., Zhong, P. Cell membrane deformation and bioeffects produced by tandem bubble-induced jetting flow. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7039-E7047 (2015).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 110-119 (2012).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-kappa B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical Properties of the Red Cell Membrane: I. Membrane Stiffness and Intracellular Pressure. Biophys J. 4 (2), 115-135 (1964).
- Lim, C. T., Dao, M., Suresh, S., Sow, C. H., Chew, K. T. Large deformation of living cells using laser traps. Acta Mater. 52 (7), 1837-1845 (2004).
- Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (2), C597-C605 (2007).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophys J. 96 (12), 4866-4876 (2009).
- van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. J Control Release. 112 (2), 149-155 (2006).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound Med Biol. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Dijkink, R., et al. Controlled cavitation-cell interaction: trans-membrane transport and viability studies. Phys Med Biol. 53 (2), 375-390 (2008).
- Rau, K. R., Quinto-Su, P. A., Hellman, A. N., Venugopalan, V. Pulsed laser microbeam-induced cell lysis: Time-resolved imaging and analysis of hydrodynamic effects. Biophys J. 91 (1), 317-329 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
